Nghiên cứu đột biến gen cdh1 e-cadherin ở bệnh nhân ung thư dạ dày lan tỏa di truyền

Luận án tiến sĩ nghiên cứu đột biến gen cdh1 e cadherin trong ung thư dạ dày lan tỏa di truyền, cung cấp thông tin quan trọng cho y học.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thanh Hương
• Người hướng dẫn: PGS. Đặng Thị Ngọc Dung
• Trường học: Trường Đại học Y Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa sinh y học
• Đề tài: Nghiên cứu đột biến gen cdh1 (E-cadherin) trên bệnh nhân ung thư dạ dày lan tỏa di truyền
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Ung thư dạ dày lan tỏa di truyền
• 1.2. Lịch sử phát hiện và dịch tễ học
• 1.3. Các yếu tố nguy cơ
• 1.4. Đặc điểm lâm sàng
• 1.5. Giải phẫu bệnh
• 1.6. Chẩn đoán ung thư dạ dày lan tỏa di truyền
• 1.7. Chẩn đoán giai đoạn ung thư dạ dày. Điều trị và tiên lượng
• 1.8. Vai trò của gen CDH1 trong ung thư dạ dày lan tỏa di truyền
• 1.9. Cấu trúc và chức năng của gen CDH1
• 1.10. Cơ chế gây bệnh của gen CDH1 trong ung thư dạ dày lan tỏa di truyền
• 1.11. Đặc điểm di truyền của ung thư dạ dày lan tỏa di truyền
• 1.12. Tình hình nghiên cứu về ung thư dạ dày lan tỏa di truyền và đột biến gen CDH1 ở trên thế giới và Việt Nam
• 1.13. Quản lý bệnh ung thư dạ dày lan tỏa di truyền do đột biến gen CDH1
• 1.14. Các phương pháp phát hiện đột biến gen CDH1
• 1.15. Khuếch đại gen bằng kỹ thuật PCR
• 1.16. Kỹ thuật giải trình tự gen theo phương pháp Sanger
• 1.17. Dự đoán khả năng gây bệnh của đột biến gen CDH1 bằng phần mềm phân tích tin sinh học
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4. Thiết kế nghiên cứu
• 2.5. Cỡ mẫu nghiên cứu
• 2.6. Phương pháp thu thập mẫu
• 2.7. Các biến số nghiên cứu
• 2.8. Phương tiện nghiên cứu
• 2.9. Quy trình kỹ thuật phân tích đột biến gen CDH1
• 2.10. Thử nghiệm Clo-Test trong chẩn đoán nhiễm H.
• 2.11. Quy trình kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch
• 2.12. Xử lý và phân tích số liệu
• 2.13. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu
• 3.2. Đặc điểm về tuổi, giới, tiền sử bệnh và yếu tố nguy cơ
• 3.3. Đặc điểm lâm sàng
• 3.4. Đặc điểm tổn thương dạ dày qua nội soi
• 3.5. Phân loại giai đoạn bệnh theo TNM
• 3.6. Kết quả phân tích gen CDH1 của đối tượng nghiên cứu
• 3.7. Kết quả tách chiết DNA và phản ứng PCR khuếch đại các exon của gen CDH1
• 3.8. Kết quả phát hiện đột biến và SNP của gen CDH1
• 3.9. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của đối tượng nghiên cứu mang đột biến và SNP trên gen CDH1
• 3.10. Xác định đột biến gen CDH1 ở các thành viên trong gia đình bệnh nhân mang đột biến gen CDH1
• 3.11. Phả hệ và kết quả phát hiện đột biến gen CDH1 ở các thành viên trong gia đình
• 3.12. Đặc điểm về phả hệ và các thành viên gia đình mang đột biến gen CDH1
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu
• 4.2. Đột biến gen CDH1 trên bệnh nhân UTDD lan tỏa di truyền
• 4.3. Đột biến gen CDH1 ở các thành viên trong gia đình bệnh nhân mang đột biến gen CDH1
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về ung thư dạ dày lan tỏa di truyền

Ung thư dạ dày (UTDD) là một trong những loại ung thư phổ biến nhất, với tỷ lệ mắc cao trên toàn cầu. Theo thống kê, UTDD đứng thứ năm về số ca mắc và thứ ba về tử vong. Khoảng 10% trường hợp UTDD có tính chất gia đình, trong đó UTDD lan tỏa di truyền chiếm từ 1-3%. Đặc điểm của UTDD lan tỏa di truyền là sự xuất hiện của các tế bào ung thư kém biệt hóa, xâm lấn lớp dưới niêm mạc, dẫn đến khó khăn trong việc phát hiện sớm. Gen CDH1 có vai trò quan trọng trong việc duy trì sự bám dính tế bào thông qua protein E-cadherin. Khi có đột biến gen trên CDH1, chức năng của E-cadherin bị suy giảm, dẫn đến sự xâm lấn và di căn của tế bào ung thư. Nghiên cứu cho thấy, đột biến gen CDH1 chiếm khoảng 30-40% trong các gia đình có UTDD lan tỏa di truyền. Việc phát hiện sớm và sàng lọc các thành viên trong gia đình có nguy cơ cao là rất cần thiết để có biện pháp phòng ngừa và điều trị kịp thời.

1.1. Lịch sử phát hiện và dịch tễ học

Lịch sử phát hiện đột biến gen CDH1 bắt đầu từ năm 1998, khi Guilford và cộng sự xác định mối liên hệ giữa CDH1 và UTDD lan tỏa di truyền. Nghiên cứu này được thực hiện trên ba gia đình người Maori ở New Zealand, cho thấy sự xuất hiện của các tế bào ung thư kém biệt hóa. Từ đó, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng đột biến gen CDH1 có thể dẫn đến nguy cơ mắc UTDD cao, với tỷ lệ 67-70% ở nam giới và 56-83% ở nữ giới. Tuy nhiên, không phải tất cả những người mang đột biến gen này đều phát triển thành bệnh. Điều này cho thấy sự cần thiết phải nghiên cứu sâu hơn về cơ chế di truyền và các yếu tố nguy cơ liên quan đến UTDD lan tỏa di truyền.

II. Đặc điểm di truyền và cơ chế gây bệnh của gen CDH1

Gen CDH1 nằm trên nhiễm sắc thể 16 và mã hóa cho protein E-cadherin, có vai trò quan trọng trong việc duy trì cấu trúc và chức năng của biểu mô. Khi có đột biến gen, protein này không còn hoạt động hiệu quả, dẫn đến sự mất bám dính giữa các tế bào, tạo điều kiện cho sự xâm lấn và di căn của tế bào ung thư. Nghiên cứu cho thấy, đột biến gen CDH1 có thể xảy ra ở nhiều vị trí khác nhau trong gen, và các đột biến di truyền này có thể được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác. Việc hiểu rõ về cơ chế gây bệnh của CDH1 không chỉ giúp xác định nguy cơ mắc bệnh mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các phương pháp điều trị và phòng ngừa hiệu quả.

2.1. Cơ chế gây bệnh của gen CDH1

Cơ chế gây bệnh của gen CDH1 liên quan đến sự suy giảm chức năng của E-cadherin, dẫn đến sự mất bám dính tế bào. Điều này tạo điều kiện cho tế bào ung thư phát triển và xâm lấn vào các mô lân cận. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, sự mất bám dính giữa các tế bào là yếu tố tiên quyết trong quá trình hình thành và phát triển khối u. Hơn nữa, các đột biến di truyền trong CDH1 có thể làm tăng nguy cơ mắc các loại ung thư khác, như ung thư vú. Việc phát hiện và phân tích các đột biến gen này có thể giúp xác định các cá nhân có nguy cơ cao và từ đó có biện pháp can thiệp kịp thời.

III. Phương pháp nghiên cứu và phát hiện đột biến gen CDH1

Nghiên cứu về đột biến gen CDH1 thường sử dụng các phương pháp như PCR (Phản ứng chuỗi polymerase) và giải trình tự gen. Kỹ thuật PCR cho phép khuếch đại các đoạn gen cần thiết để phân tích, trong khi giải trình tự gen giúp xác định chính xác vị trí và loại đột biến. Các phương pháp này không chỉ giúp phát hiện đột biến gen mà còn cung cấp thông tin về các SNP (đa hình đơn nucleotide) có thể liên quan đến nguy cơ mắc bệnh. Việc áp dụng các công nghệ sinh học hiện đại trong nghiên cứu gen sẽ mở ra nhiều cơ hội mới trong việc chẩn đoán và điều trị UTDD lan tỏa di truyền.

3.1. Kỹ thuật PCR và giải trình tự gen

Kỹ thuật PCR là một trong những phương pháp chính được sử dụng để phát hiện đột biến gen CDH1. Phương pháp này cho phép khuếch đại một đoạn DNA cụ thể, giúp dễ dàng phân tích và xác định các đột biến di truyền. Sau khi khuếch đại, các mẫu DNA sẽ được giải trình tự để xác định chính xác các đột biến. Việc sử dụng các phần mềm phân tích tin sinh học cũng rất quan trọng trong việc dự đoán khả năng gây bệnh của các đột biến này. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, việc phát hiện sớm các đột biến gen có thể giúp cải thiện tiên lượng và tăng cường hiệu quả điều trị cho bệnh nhân.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tên luận án: Nghiên cứu đột biến gen CDH1 (E-cadherin) trên bệnh nhân ung thư dạ dày lan tỏa di truyền

Tác giả: Nguyễn Thị Thanh Hương | Chuyên ngành: Hóa sinh Y học (Mã số: 62720112) | Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Y Hà Nội | Năm: 2020 | Người hướng dẫn: PGS. Đặng Thị Ngọc Dung

---

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Ung thư dạ dày (UTDD) là loại ung thư phổ biến thứ 5 và là nguyên nhân gây tử vong thứ 3 ở cả hai giới theo thống kê Globocan 2018. Khoảng 10% các trường hợp UTDD mang tính chất gia đình, trong đó UTDD lan tỏa di truyền chiếm 1–3%. Đây là bệnh lý hiếm gặp, đặc trưng bởi tế bào ung thư kém biệt hóa xâm lấn lan tỏa ở lớp dưới niêm mạc, không hình thành khối u rõ ràng, do đó rất khó phát hiện sớm. Tuổi trung bình phát hiện bệnh là 38 tuổi; nếu phát hiện ở giai đoạn sớm, tỷ lệ sống trên 5 năm có thể đạt 90%, nhưng chẩn đoán muộn kéo tỷ lệ này xuống dưới 30%.

Đột biến gen CDH1 — mã hóa protein E-cadherin có vai trò bám dính và liên kết tế bào phụ thuộc canxi — được phát hiện lần đầu năm 1998 (Guilford và cộng sự) là nguyên nhân chủ yếu của UTDD lan tỏa di truyền, chiếm 30–40% các gia đình được chẩn đoán theo tiêu chuẩn cũ. Tại Việt Nam, tính đến thời điểm thực hiện luận án, chưa có nghiên cứu nào được công bố về đột biến gen CDH1 trên bệnh nhân UTDD lan tỏa di truyền, cũng như chưa có nghiên cứu lập phả hệ và phân tích đột biến ở các thành viên gia đình có nguy cơ cao.

Mục tiêu nghiên cứu

1. Phân tích đột biến gen CDH1 và đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng trên bệnh nhân ung thư dạ dày lan tỏa di truyền.
2. Xác định đột biến gen CDH1 ở các thành viên trong gia đình bệnh nhân ung thư dạ dày lan tỏa di truyền mang đột biến gen CDH1.

Đối tượng và phạm vi

• Đối tượng: Bệnh nhân được phân loại theo tiêu chuẩn IGCLC 2015 có nguy cơ UTDD lan tỏa di truyền và các thành viên gia đình của bệnh nhân xác nhận mang đột biến gen CDH1.
• Phạm vi không gian: Thực hiện tại Trường Đại học Y Hà Nội và Bệnh viện Phụ sản Trung ương.
• Phạm vi thời gian: Năm 2020 (Luận án hoàn thành năm 2020).

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước được điểm lại

Phát hiện và xác lập vai trò của gen CDH1:

• Guilford và cộng sự (1998) — nghiên cứu trong 3 gia đình người Maori ở New Zealand, lần đầu tiên xác định đột biến gen CDH1 là nguyên nhân của UTDD lan tỏa di truyền, phát hiện 3 đột biến dị hợp tử: c.2095C>T (vô nghĩa), c.2381insC (exon 15) và c.70G>T (exon 2).
• Richards và cộng sự — phân tích 8 gia đình bị UTDD ở Anh, xác định đột biến tại vị trí nối c.49–2A>G (intron 1) và đột biến vô nghĩa c.59G>A (exon 2).
• Gayther và cộng sự — mô tả thêm ba đột biến trong ba gia đình khác nhau: đột biến vô nghĩa c.2095C>T, thêm nucleotid c.1711insG, và c.1588insC (exon 11).
• Becker và cộng sự — phân tích gen CDH1 trong 26 trường hợp thể lan tỏa, 20 thể ruột và 7 hỗn hợp; kết quả đột biến gen CDH1 chiếm 50% (13/26) thể lan tỏa, 14% (1/7) thể hỗn hợp và 0% thể ruột.
• Hansford và cộng sự (2015) — ghi nhận khoảng 155 kiểu đột biến gen CDH1; dạng hay gặp nhất là thêm/mất đoạn nhỏ (35%), sai nghĩa (28%), vô nghĩa và đột biến chỗ nối exon-intron (16%), mất exon lớn (5%).

Nghiên cứu về đặc điểm di truyền và phả hệ:

• Onitilo và cộng sự (2013) — mô tả trường hợp người đàn ông 56 tuổi tại miền Tây Hoa Kỳ với đột biến dị hợp tử gen CDH1; xét nghiệm di truyền phát hiện thêm em gái, em trai, con trai và con gái cùng mang đột biến; cả hai người con cắt dạ dày dự phòng đều có hình ảnh mô bệnh học ung thư biểu mô tế bào nhẫn.
• Chun và cộng sự — phát hiện đột biến gen CDH1 ở bệnh nhân 47 tuổi, anh trai và 3 người anh em họ.
• Yelskaya và cộng sự (2016) — báo cáo trường hợp người đàn ông 50 tuổi gốc Ấn Độ và người anh trai cùng mang đột biến gen CDH1.
• Majewski và cộng sự — phát hiện đột biến gen α-E-catenin (CTNNA1) ở 2 thành viên trong một gia đình có 6 thành viên bị UTDD lan tỏa di truyền.

Nghiên cứu về SNP của gen CDH1:

• Chu và cộng sự (2014) — nghiên cứu SNP gen CDH1 trong 3 nhóm (UTDD thể lan tỏa, thể ruột, chứng); tần số alen của SNP -160C>A (rs16260) cao hơn đáng kể ở UTDD lan tỏa; kết hợp ba đa hình (-160C>A, 48+6T>C, 2076C>T và -160C>A, 1937-13T>C, 2253C>T) liên quan đến nguy cơ UTDD lan tỏa (p=0,011 và p=0,042).
• Humar và cộng sự — xác định haplotype ATT (-160A, 48+6T, 2076T) là dấu hiệu tăng nguy cơ, haplotype CTT (-160C, 48+6T, 2076T) có tác dụng bảo vệ.

Nghiên cứu về cơ chế phân tử:

• Grady và cộng sự (2000) — nghiên cứu 2 gia đình UTDD lan tỏa di truyền; trong số 6 người được nghiên cứu, 3/6 có tăng cường methyl hóa vùng promoter gen CDH1; bệnh nhân không có đột biến gen CDH1 cũng không có tình trạng tăng methyl hóa.
• Petrova và cộng sự — chứng minh vai trò của điều chỉnh E-cadherin ở bề mặt tế bào (không liên quan đến số lượng) trong quá trình di căn; đột biến sai nghĩa gen CDH1 ảnh hưởng có chọn lọc đến cơ chế điều chỉnh bề mặt tế bào.
• Lazăr và cộng sự — giảm biểu hiện E-cadherin gặp nhiều hơn ở UTDD thể lan tỏa (82,4%) so với UTDD thể ruột (31,6%).

Nghiên cứu về biểu hiện hóa mô miễn dịch:

• López — biểu hiện protein E-cadherin âm tính ở trường hợp UTDD lan tỏa mang đột biến tạo mã kết thúc sớm của gen CDH1.
• Caggiari — phát hiện đột biến mới tạo mã kết thúc sớm tại exon 9 của gen CDH1 ở người đàn ông 41 tuổi; nhuộm hóa mô miễn dịch cho thấy mất biểu hiện protein E-cadherin.

Khoảng trống luận án giải quyết

Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào về đột biến gen CDH1 ở bệnh nhân UTDD lan tỏa di truyền. Phần lớn các nghiên cứu quốc tế tập trung ở quần thể châu Âu và châu Mỹ — nơi tỷ lệ đột biến CDH1 >40% — trong khi các nước có tỷ lệ UTDD trung bình và cao (như Nhật Bản, Hàn Quốc) chỉ ghi nhận khoảng 8–15%. Việt Nam thuộc nhóm có tỷ lệ UTDD cao, do đó đặc điểm đột biến CDH1 và phổ biến lâm sàng có thể khác biệt và cần được khảo sát riêng.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Lý thuyết và khung phân tích

Luận án xây dựng trên cơ sở lý thuyết sinh học phân tử và di truyền học y học, bao gồm:

• Cấu trúc và chức năng protein E-cadherin: E-cadherin là glycoprotein 120 kD, mã hóa bởi gen CDH1 nằm tại vị trí 16q22 trên nhánh dài nhiễm sắc thể 16, gồm 16 exon trải rộng ~100 kb. Cấu trúc gồm miền ngoại bào (5 tiểu phần EC1–EC5 kết nối qua ion Ca²⁺), phân đoạn xuyên màng, và miền tế bào chất gắn với sợi actin qua phức hợp α-catenin/β-catenin.
• Cơ chế sinh ung thư liên quan E-cadherin: bao gồm con đường WNT (thông qua GSK-3, phức hợp APC–axin–GSK-3, β-catenin tự do và điều hòa gen đích Tcf/Lef-1), con đường Rho GTPase (Cdc42, Rac1, RhoA trong cơ chế di căn), và tương tác với thụ thể EGFR.
• Quy luật di truyền: UTDD lan tỏa di truyền tuân theo cơ chế di truyền gen trội trên nhiễm sắc thể thường; người mang đột biến dị hợp tử có 50% khả năng truyền đột biến cho con cái.
• Phân loại mô bệnh học: theo Lauren (thể lan tỏa/thể ruột) và WHO 2010 (ung thư biểu mô tế bào nhẫn, ung thư kém kết dính).
• Phân loại giai đoạn: theo hệ thống TNM của AJCC/UICC bản thứ 8 năm 2017.
• Tiêu chuẩn chẩn đoán lâm sàng: theo hướng dẫn đồng thuận IGCLC 2015.
• Đánh giá tác động đột biến: sử dụng công cụ tin sinh học PolyPhen-2 và Mutation Taster để dự đoán khả năng gây bệnh của đột biến sai nghĩa (được phân loại theo tiêu chí SIFT).

Thiết kế và phương pháp nghiên cứu

Luận án thuộc hướng định lượng, thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang, kết hợp phân tích di truyền phân tử và lâm sàng.

Phương pháp sinh học phân tử:

Kỹ thuật	Mục đích
PCR (Polymerase Chain Reaction)	Khuếch đại 16 exon gen CDH1 từ DNA bạch cầu
Giải trình tự Sanger	Phát hiện đột biến điểm, thêm/mất nucleotid
MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification)	Phát hiện mất/nhân đoạn lớn
PolyPhen-2 và Mutation Taster	Dự đoán khả năng gây bệnh của đột biến sai nghĩa

Phương pháp lâm sàng và mô bệnh học:

• Nhuộm hóa mô miễn dịch (HMMD) xác định biểu hiện protein E-cadherin trên tiêu bản mô dạ dày.
• Thử nghiệm Clo-Test trong chẩn đoán nhiễm H. pylori.
• Nội soi tiêu hóa ghi nhận đặc điểm tổn thương dạ dày.
• Phân loại giai đoạn theo TNM, lập phả hệ ít nhất 3 thế hệ.

Phân tích phả hệ: Phương pháp lập phả hệ gia đình theo quy ước chuẩn (hình tròn/hình vuông, ký hiệu đột biến/bình thường), theo dõi qua ít nhất 3 thế hệ.

Xử lý số liệu: Phân tích thống kê mô tả và phân tích liên quan.

Nguồn tư liệu/dữ liệu: Mẫu máu ngoại vi và mô sinh thiết dạ dày của bệnh nhân được chẩn đoán UTDD lan tỏa di truyền theo tiêu chuẩn IGCLC 2015; mẫu máu của các thành viên gia đình bệnh nhân mang đột biến; hồ sơ bệnh án lâm sàng và nội soi.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương này hệ thống hóa kiến thức về UTDD lan tỏa di truyền từ lịch sử phát hiện đến thực trạng nghiên cứu hiện tại. Các mảng nội dung chính gồm:

• Lịch sử và dịch tễ: Năm 1994, Hiệp hội tiêu hóa Hoa Kỳ báo cáo gia đình có 8 thành viên mắc UTDD qua 4 thế hệ; năm 1998, Guilford xác lập vai trò của gen CDH1. Ước tính nguy cơ mắc UTDD lan tỏa ở người mang đột biến CDH1 là 67–70% ở nam và 56–83% ở nữ đến tuổi 80; nguy cơ tích lũy ung thư vú khoảng 39–52% sau 80 tuổi.
• Các yếu tố nguy cơ: Môi trường (H. pylori — gặp trong 90% bệnh nhân UTDD; hút thuốc lá — tăng nguy cơ UTDD 1,56 lần; uống rượu >60g/ngày — tăng nguy cơ 1,6 lần theo Duell 2011; chế độ ăn nhiều muối) và di truyền (đột biến gen CDH1, CTNNA1, BRCA2, MAP3K6; methyl hóa vùng promoter; đa hình đơn nucleotid).
• Cấu trúc và cơ chế bệnh sinh CDH1: trình bày chi tiết cấu trúc 5 tiểu phần ngoại bào EC1–EC5, các con đường WNT, Rho GTPase, tương tác EGFR.
• Phân loại và chẩn đoán: Tiêu chuẩn IGCLC 1999 (tỷ lệ phát hiện đột biến 30–40%) và IGCLC 2015 cập nhật (tỷ lệ phát hiện giảm còn 10–18%); hệ thống TNM AJCC 8th 2017.
• Quản lý và điều trị: Cắt dạ dày dự phòng (tỷ lệ tử vong sau phẫu thuật 2–4% so với nguy cơ mắc bệnh lâu dài 80%); nội soi tiêu hóa định kỳ theo tiêu chuẩn Cambridge (tối thiểu 30 phút/lần, tối thiểu 30 mẫu sinh thiết).
• Các phương pháp phân tích: So sánh PCR-Sanger, MLPA, NGS, qPCR, RT-PCR, pyrosequencing; giải trình tự Sanger phát hiện đột biến điểm và thêm/mất đoạn nhỏ; MLPA phát hiện mất/nhân đoạn lớn (4% trường hợp UTDD lan tỏa di truyền).

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương trình bày đầy đủ thiết kế nghiên cứu, tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng theo IGCLC 2015, quy trình kỹ thuật chi tiết cho từng bước phân tích phân tử:

• Quy trình PCR: Thành phần phản ứng, chu kỳ nhiệt cho khuếch đại 16 exon gen CDH1; thiết kế mồi đặc hiệu cho từng exon.
• Quy trình giải trình tự Sanger: Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt riêng cho bước tổng hợp sản phẩm giải trình tự, sử dụng ddNTP có đánh dấu.
• Quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch: Các bước xử lý tiêu bản theo quy trình chuẩn.
• Quy trình lập phả hệ: Theo dõi ít nhất 3 thế hệ, ký hiệu theo quy ước (hình tròn/vuông, đậm màu/nhạt màu, mũi tên chỉ đối tượng nghiên cứu).
• Phân tích tin sinh học: Sử dụng PolyPhen-2 và Mutation Taster đánh giá khả năng gây bệnh của đột biến sai nghĩa.
• Đạo đức nghiên cứu: Được trình bày tại mục cuối chương.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu: Luận án báo cáo phân bố tuổi, giới, tiền sử cá nhân và gia đình, lý do vào viện, thời gian xuất hiện triệu chứng đầu tiên đến khi vào viện. Kết quả nội soi ghi nhận đặc điểm tổn thương dạ dày và phân loại giai đoạn TNM.

Kết quả phân tích gen CDH1: Bốn bệnh nhân UTDD lan tỏa di truyền được xác nhận mang đột biến gen CDH1 (ký hiệu B4, B732, B532, B151). Bảng tổng hợp ghi nhận đầy đủ loại đột biến và SNP tìm thấy ở từng bệnh nhân. Kết quả PCR được minh họa bằng hình ảnh điện di (exon 9 và exon 13); kết quả giải trình tự được trình bày qua sắc ký đồ Sanger cho từng vị trí đột biến.

Phân bố các SNP: Ghi nhận nhiều SNP trên bệnh nhân tham gia nghiên cứu, phân bố trên các exon và intron của gen CDH1.

Dự đoán khả năng gây bệnh: Các đột biến sai nghĩa được đánh giá bằng PolyPhen-2 và Mutation Taster; kết quả trình bày trong bảng dự đoán khả năng gây bệnh.

Đặc điểm lâm sàng nhóm mang đột biến: Mô tả đặc điểm lâm sàng, nội soi và mô bệnh học của 4 bệnh nhân B4, B732, B532, B151 mang đột biến. Ảnh vi thể mô UTDD thể lan tỏa được trình bày cho từng bệnh nhân.

Phân tích phả hệ và thành viên gia đình: Lập phả hệ cho 4 gia đình; xác định tỷ lệ mang đột biến gen CDH1 trong từng phả hệ. Đặc điểm nội soi và mô bệnh học của các thành viên gia đình mang đột biến được mô tả chi tiết.

Chương 4: Bàn luận

Chương 4 đối chiếu kết quả nghiên cứu với các công bố quốc tế trên ba mảng:

• Đặc điểm chung nhóm nghiên cứu: So sánh tuổi khởi phát, phân bố giới, tiền sử gia đình và yếu tố nguy cơ với các nghiên cứu thế giới. Nhấn mạnh đặc điểm lứa tuổi trẻ khởi phát (trung bình 38 tuổi theo y văn), triệu chứng không đặc hiệu ở giai đoạn sớm.
• Đột biến gen CDH1 trên bệnh nhân UTDD lan tỏa di truyền: Bàn luận về tỷ lệ phát hiện đột biến, loại đột biến, phân bố trên gen, so sánh với tỷ lệ 30–40% (tiêu chuẩn IGCLC cũ) và 10–18% (IGCLC 2015), kết quả dự đoán tác hại của đột biến sai nghĩa.
• Đột biến gen CDH1 ở các thành viên gia đình: Phân tích đặc điểm phả hệ, tỷ lệ lan truyền trong gia đình, ý nghĩa sàng lọc di truyền, khả năng cắt dạ dày dự phòng ở người mang đột biến chưa biểu hiện bệnh.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp về lý luận

• Bổ sung dữ liệu đầu tiên tại Việt Nam về phổ đột biến gen CDH1 trong nhóm bệnh nhân UTDD lan tỏa di truyền được chẩn đoán theo tiêu chuẩn IGCLC 2015.
• Xác định và mô tả đặc điểm các đột biến gen CDH1 và các SNP trên quần thể người Việt Nam, đóng góp vào ngân hàng dữ liệu về đột biến gen CDH1 trong khu vực.
• Cung cấp bằng chứng về khả năng lan truyền đột biến gen CDH1 trong phả hệ gia đình người Việt Nam.
• Áp dụng và đánh giá độ tin cậy của các công cụ tin sinh học (PolyPhen-2, Mutation Taster) trong dự đoán tác hại của đột biến sai nghĩa gen CDH1.

Đóng góp về thực tiễn

• Xây dựng quy trình phân tích đột biến gen CDH1 kết hợp PCR và giải trình tự Sanger có thể ứng dụng trong thực hành lâm sàng tại Việt Nam.
• Thiết lập cơ sở dữ liệu đầu tiên về phả hệ gia đình UTDD lan tỏa di truyền tại Việt Nam, phục vụ tư vấn di truyền và sàng lọc nguy cơ.
• Góp phần nâng cao nhận thức về sàng lọc di truyền sớm cho các thành viên gia đình có nguy cơ cao, từ đó định hướng can thiệp phòng bệnh (nội soi định kỳ, cắt dạ dày dự phòng).

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

Luận án đề xuất thực hiện xét nghiệm đột biến gen CDH1 cho bệnh nhân và thành viên gia đình đáp ứng tiêu chuẩn IGCLC 2015; tư vấn di truyền cho các gia đình có thành viên mang đột biến; cân nhắc cắt dạ dày dự phòng và nội soi định kỳ theo tiêu chuẩn Cambridge (tối thiểu 30 mẫu sinh thiết/lần) cho người mang đột biến chưa biểu hiện bệnh.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Từ phạm vi và thiết kế của nghiên cứu, có thể nhận thấy một số điểm cần lưu ý:

• Cỡ mẫu bệnh nhân UTDD lan tỏa di truyền xác nhận đột biến (4 trường hợp) còn nhỏ, phản ánh tính hiếm gặp của bệnh nhưng cũng giới hạn khả năng khái quát hóa kết quả.
• Nghiên cứu sử dụng phương pháp giải trình tự Sanger và MLPA; các phương pháp phát hiện đột biến thế hệ mới như NGS và pyrosequencing chưa được tích hợp, có thể bỏ sót một số dạng biến thể hiếm.
• Phân tích methyl hóa vùng promoter gen CDH1 — được đề cập như cơ chế phân tử thứ hai trong tổng quan — không được thực hiện trong nghiên cứu này, đây là hướng có thể bổ sung trong tương lai.
• Chưa đủ dữ liệu để xác định mức độ thâm nhập (penetrance) của các đột biến được phát hiện trong quần thể người Việt Nam.
• Các hướng nghiên cứu tiếp có thể mở rộng sang: phân tích NGS toàn bộ gen CDH1, khảo sát methyl hóa DNA, nghiên cứu đa trung tâm với cỡ mẫu lớn hơn, và theo dõi dọc kết quả can thiệp cắt dạ dày dự phòng ở người mang đột biến.

---

Giá trị tham khảo

Hữu ích cho:

• Bác sĩ lâm sàng chuyên khoa tiêu hóa, ung bướu và di truyền y học: phần tiêu chuẩn chẩn đoán IGCLC 2015 (Chương 1), quy trình tư vấn di truyền và phả hệ (Chương 3–4), và phác đồ nội soi theo tiêu chuẩn Cambridge.
• Nhà nghiên cứu sinh học phân tử và hóa sinh y học: quy trình kỹ thuật PCR-Sanger phân tích toàn bộ 16 exon gen CDH1, phương pháp dự đoán tác hại đột biến bằng PolyPhen-2 và Mutation Taster (Chương 2).
• Nghiên cứu sinh và học viên sau đại học ngành Hóa sinh Y học, Di truyền Y học, Ung thư học: khung lý thuyết cơ chế bệnh sinh E-cadherin (con đường WNT, Rho GTPase, EGFR), phân loại đột biến gen CDH1, và hệ thống TNM AJCC 2017 (Chương 1).
• Người làm chính sách y tế và tư vấn di truyền: dữ liệu về tỷ lệ phát hiện đột biến, nguy cơ tích lũy theo tuổi, và hiệu quả của cắt dạ dày dự phòng, làm cơ sở xây dựng chương trình sàng lọc di truyền quốc gia.

Phần đáng tham khảo nhất: Chương 1 (mục 1.6 về các tiêu chuẩn IGCLC và mục 1.7 về quản lý bệnh), Chương 3 (kết quả phân tích gen và phả hệ gia đình), và Chương 2 (quy trình kỹ thuật chi tiết).

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tỷ lệ phát hiện đột biến gen CDH1 ở bệnh nhân UTDD lan tỏa di truyền là bao nhiêu và khác nhau thế nào tùy theo tiêu chuẩn chẩn đoán?

Theo tiêu chuẩn IGCLC 1999, tỷ lệ phát hiện đột biến là 30–40%. Khi áp dụng tiêu chuẩn IGCLC 2015 (mở rộng đối tượng), tỷ lệ giảm còn 10–18%. Tại các nước có tỷ lệ UTDD cao, hầu hết các nghiên cứu cỡ mẫu nhỏ ghi nhận tỷ lệ khoảng 8–15%. Trong nghiên cứu của Hansford và cộng sự (2015) với gia đình đáp ứng tiêu chí 1, 26% trong số 84 trường hợp có đột biến gen CDH1.

2. Các dạng đột biến gen CDH1 nào được ghi nhận phổ biến nhất trong y văn quốc tế?

Theo Hansford và cộng sự (2015), trong số khoảng 155 kiểu đột biến gen CDH1 đã được phát hiện, dạng thêm hoặc mất đoạn nhỏ chiếm tỷ lệ cao nhất (35%), tiếp theo là đột biến sai nghĩa (28%), đột biến vô nghĩa và đột biến tại chỗ nối exon-intron (16%), và mất exon lớn chiếm tỷ lệ thấp nhất (5%).

3. Nguy cơ mắc UTDD lan tỏa và ung thư vú ở người mang đột biến gen CDH1 là bao nhiêu?

Ở người mang đột biến gen CDH1, nguy cơ mắc UTDD lan tỏa được ước tính là 67–70% ở nam giới và 56–83% ở nữ giới đến tuổi 80. Đồng thời, nguy cơ tích lũy ung thư vú ở nữ giới mang đột biến gen CDH1 khoảng 39–52% sau 80 tuổi.

4. Tại sao UTDD lan tỏa di truyền rất khó phát hiện sớm qua nội soi thông thường, và khuyến cáo nội soi chuẩn hóa như thế nào?

Các tế bào ung thư trong UTDD lan tỏa di truyền xâm lấn ở dạng lan tỏa, tiến triển âm thầm ở lớp dưới niêm mạc, không hình thành khối u rắn nên không có hình ảnh đại thể rõ ràng. Giai đoạn sớm biểu hiện bằng từ vài đến hàng trăm ổ tế bào nhẫn rải rác ở giai đoạn T1a mà không có di căn hạch. Theo tiêu chuẩn Cambridge, nội soi phải sử dụng ống soi ánh sáng trắng độ nét cao, thời gian tối thiểu 30 phút/lần và lấy tối thiểu 30 mẫu sinh thiết.

5. Vì sao kết quả hóa mô miễn dịch E-cadherin âm tính không được dùng để sàng lọc UTDD lan tỏa di truyền do đột biến gen CDH1?

Kết quả hóa mô miễn dịch không đủ đặc hiệu cho mục đích này vì: 60% các trường hợp UTDD không có biểu hiện protein E-cadherin và 70% UTDD có biểu hiện bất thường protein E-cadherin lại không có đột biến gen CDH1. Do đó, phương pháp hóa mô miễn dịch có độ đặc hiệu thấp để xác định đột biến dòng mầm gen CDH1 và không thể thay thế xét nghiệm giải trình tự gen trong sàng lọc.

---

Kết luận

Luận án của Nguyễn Thị Thanh Hương cung cấp dữ liệu đầu tiên về đột biến gen CDH1 trong nhóm bệnh nhân UTDD lan tỏa di truyền tại Việt Nam, kết hợp phân tích phân tử bằng PCR-Sanger với phân tích phả hệ gia đình và đánh giá lâm sàng-mô bệnh học. Nghiên cứu xác nhận đột biến gen CDH1 ở 4 bệnh nhân và mở rộng phân tích sang các thành viên gia đình có nguy cơ, góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu ban đầu cho công tác tư vấn di truyền tại Việt Nam. Kết quả nghiên cứu có giá trị tham chiếu cho các bước triển khai chương trình sàng lọc di truyền trong lĩnh vực ung thư dạ dày có yếu tố gia đình, đặc biệt trong bối cảnh Việt Nam thuộc nhóm nước có gánh nặng UTDD cao và chưa có dữ liệu nền về phổ đột biến CDH1.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư dạ dày (UTDD) là loại ung thư thường gặp, có ảnh hưởng to lớn đến sức khỏe cộng đồng. Theo thống kê của Globocan 2018, thì UTDD là loại ung thư phổ biến thứ 5 và là nguyên nhân gây tử vong thứ 3 ở cả hai giới [1]. Hầu hết UTDD là không di truyền, tuy nhiên khoảng 10% các trường hợp UTDD có tính chất gia đình, trong đó UTDD lan tỏa di truyền chiếm 1-3% [2] Ung thư dạ dày lan tỏa di truyền là bệnh lý di truyền hiếm gặp, đặc trưng bởi mô bệnh học là những tế bào ung thư kém biệt hóa, xâm lấn lan tỏa ở lớp dưới niêm mạc nên khó phát hiện sớm. Biểu hiện lâm sàng trong UTDD lan tỏa di truyền là bệnh thường khởi phát khi tuổi còn trẻ (tuổi trung bình phát hiện là 38), tiến triển nhanh, tiên lượng xấu và tỷ lệ tử vong cao, tuy nhiên nếu phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm thì tỷ lệ sống trên 5 năm có thể tăng lên 90% [3].

Trong cơ chế bệnh sinh của UTDD lan tỏa thì việc kiểm soát độ bám dính và tính di động của tế bào là một trong những yếu tố quan trọng trong quá trình tạo thành và tiến triển của khối u. Gen CDH1 quy định tổng hợp protein E-cadherin có vai trò quan trọng trong việc bám dính và liên kết tế bào phụ thuộc canxi, duy trì sự phân hóa và kiến trúc bình thường của biểu mô [4]. Khi xảy ra đột biến trên gen CDH1, dẫn đến suy giảm chức năng của E-cadherin làm giảm khả năng bám dính tế bào, gây nên hình thái bất thường về cấu trúc biểu mô và mất phân cực tế bào. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, việc mất sự bám dính giữa các tế bào với tế bào là điều kiện tiên quyết dẫn đến sự xâm lấn và di căn của tế bào ung thư [5].

Đột biến gen CDH1 được phát hiện đầu tiên vào năm 1998 bởi Guilford, thông qua phân tích đột biến ở các thành viên mắc UTDD lan tỏa khởi phát sớm trong 3 gia đình người Maori (New Zealand) [6]. Mặc dù, đã có một vài nghiên luan an 2 cứu trên thế giới về một số gen có liên quan đến UTDD lan tỏa di truyền như CTNNA1, BRCA2, MAP3K6…tuy nhiên, vai trò của các đột biến gen nói trên vẫn chưa chắc chắn vì số lượng mẫu nghiên cứu không đủ để xác định mức độ phổ biến và mức độ thâm nhập của gen [7] .Tỷ lệ phát hiện đột biến của gen CDH1 chiếm 30 – 40% trong các gia đình chẩn đoán UTDD lan tỏa di truyền [6]. Vì vậy, việc xác định đột biến gen trong UTDD lan tỏa di truyền hiện được giới hạn ở gen CDH1. Đặc điểm di truyền của bệnh là theo cơ chế di truyền gen trội trên nhiễm sắc thể thường, do đó một cá thể trong gia đình có bố hoặc mẹ mang đột biến gen thì có 50% cơ hội nhận được đột biến gen từ bố hoặc mẹ.

Vì vậy, việc sàng lọc và phát hiện sớm các thành viên gia đình của bệnh nhân mang đột biến gen CDH1 nhưng chưa biểu hiện bệnh là rất cần thiết. Từ đó, có biện pháp phòng bệnh và đưa ra những can thiệp điều trị sớm hiệu quả. Tại Việt Nam, nghiên cứu về đột biến gen CDH1 ở các bệnh nhân UTDD lan tỏa di truyền, cũng như xác định đột biến ở các thành viên gia đình có nguy cơ cao vẫn còn mới mẻ. Với những lý do trên đề tài “Nghiên cứu đột biến gen CDH1 (E-cadherin) trên bệnh nhân ung thư dạ dày lan tỏa di truyền” được thực hiện với 2 mục tiêu: 1.