Nghiên cứu tính đa hình SNP và đột biến gen liên quan đến ung thư buồng trứng

Nghiên cứu tính đa hình thái SNP và đột biến gen trong ung thư buồng trứng, cung cấp thông tin quan trọng cho chẩn đoán và điều trị.

• Trường học: Trường Đại Học Y Dược
• Chuyên ngành: Y Học
• Đề tài: Nghiên Cứu SNP Và Đột Biến Gen Trong Ung Thư Buồng Trứng
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Ung thư buồng trứng
• 1.2. Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh UTBT
• 1.3. Yếu tố nguy cơ
• 1.4. Đột biến gen BRCA1/2 liên quan đến UTBT
• 1.5. Hội chứng ung thư vú – buồng trứng di truyền
• 1.6. Tỉ lệ đột biến BRCA1/2
• 1.7. Nguy cơ mắc ung thư
• 1.8. Đa hình đơn nucleotide RAD51, XRCC3 liên quan đến UTBT
• 1.9. Đa hình đơn nucleotide một số gen liên quan đến UTBT
• 1.10. Đa hình đơn nucleotide gen RAD51 liên quan đến UTBT
• 1.11. Đa hình đơn nucleotide gen XRCC3 liên quan đến UTBT
• 1.12. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước
• 1.12.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
• 1.12.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3. Thiết kế nghiên cứu
• 2.4. Các chỉ số nghiên cứu
• 2.5. Dụng cụ, trang thiết bị, hóa chất
• 2.6. Quy trình nghiên cứu
• 2.7. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.8. Xử lý số liệu
• 2.9. Đạo đức trong nghiên cứu của đề tài
• 2.10. Kinh phí thực hiện đề tài
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ
• 3.1. Xác định đột biến gen BRCA1 và BRCA2 ở bệnh nhân UTBT
• 3.2. Đặc điểm chung của các bệnh nhân được xác định ĐB BRCA1/2
• 3.3. Kết quả xác định ĐB gen BRCA1 và BRCA2
• 3.4. Mối liên quan giữa đột biến BRCA1/2 và mô bệnh học
• 3.5. Xác định ĐB BRCA1/2 ở người thân các bệnh nhân và lập phả hệ
• 3.6. Xác định các SNP RAD51, XRCC3 và mối liên quan với UTBT
• 3.7. Đặc điểm chung và lâm sàng nhóm UTBT và nhóm chứng
• 3.8. Xác định SNP RAD51-rs1801320 và mối liên quan với UTBT
• 3.9. Xác định SNP RAD51-rs1801321 và mối liên quan với UTBT
• 3.10. Xác định SNP XRCC3-rs861539 và mối liên quan với UTBT
• 3.11. Xác định SNP XRCC3-rs1799794 và mối liên quan với UTBT
• 3.12. Xác định SNP XRCC3-rs1799796 và mối liên quan với UTBT
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Xác định đột biến gen BRCA1 và BRCA2 ở bệnh nhân UTBT
• 4.2. Đặc điểm chung của các bệnh nhân được xác định ĐB BRCA1/2
• 4.3. Kết quả xác định ĐB gen BRCA1/2
• 4.4. Mối liên quan giữa đột biến BRCA1/2 và mô bệnh học
• 4.5. Xác định ĐB BRCA1/2 ở người thân các bệnh nhân và lập phả hệ
• 4.6. Xác định các SNP XRCC3, RAD51 và mối liên quan với UTBT
• 4.7. Đặc điểm chung và lâm sàng nhóm UTBT và nhóm chứng
• 4.8. Xác định SNP RAD51-rs1801320 và mối liên quan với UTBT
• 4.9. Xác định SNP RAD51-rs1801321 và mối liên quan với UTBT
• 4.10. Xác định SNP XRCC3-rs861539 và mối liên quan với UTBT
• 4.11. Xác định SNP XRCC3-rs1799794 và mối liên quan với UTBT
• 4.12. Xác định SNP XRCC3-rs1799796 và mối liên quan với UTBT
• CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC
• A.1. DANH MỤC BẢNG
• A.2. DANH MỤC BIỂU ĐỒ
• A.3. DANH MỤC HÌNH

Tóm tắt

I. Tổng quan về ung thư buồng trứng

Ung thư buồng trứng (UTBT) là một trong những loại ung thư phổ biến ở phụ nữ, với tỉ lệ mắc và tử vong cao. Theo GLOBOCAN, năm 2020 có 313,959 ca mắc mới và hơn 200,000 ca tử vong do UTBT. Tại Việt Nam, UTBT đứng thứ ba trong các bệnh ung thư phụ khoa, với 1,404 ca mắc mới và 923 ca tử vong. Nguyên nhân của UTBT vẫn chưa được làm rõ, nhưng có nhiều yếu tố nguy cơ như tiền sử bệnh tật, di truyền, và môi trường. Đặc biệt, đột biến gen BRCA1 và BRCA2 có liên quan chặt chẽ đến nguy cơ mắc UTBT. Việc phát hiện sớm và điều trị kịp thời có thể cải thiện tỉ lệ sống sót, nhưng hiện tại, hơn 70% trường hợp được chẩn đoán ở giai đoạn muộn.

1.1. Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh

Nguyên nhân của UTBT có thể liên quan đến quá trình tổn thương và sửa chữa tế bào buồng trứng. Các tế bào biểu mô, tế bào mầm và tế bào đệm-sinh dục đều có thể phát triển thành UT. Đặc biệt, UT biểu mô chiếm hơn 90% các trường hợp. Các yếu tố như hormone, tiền sử bệnh tật, và di truyền cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của UTBT. Nghiên cứu cho thấy rằng những phụ nữ có tiền sử gia đình mắc UTBT có nguy cơ cao hơn gấp 2-5 lần so với người bình thường.

1.2. Đột biến gen BRCA1 2 và nguy cơ mắc ung thư

Đột biến gen BRCA1 và BRCA2 là yếu tố di truyền chính liên quan đến UTBT. Khoảng 10% trường hợp UTBT có liên quan đến di truyền, trong đó 90% là do đột biến BRCA1/2. Phụ nữ mang đột biến này có nguy cơ mắc UTBT cao hơn nhiều so với người bình thường, với tỉ lệ lên tới 27-63%. Việc xét nghiệm di truyền cho những người có tiền sử gia đình mắc UTBT là rất cần thiết để có biện pháp phòng ngừa và điều trị kịp thời.

II. Nghiên cứu SNP và đột biến gen

Nghiên cứu về đa hình đơn nucleotide (SNP) và đột biến gen trong UTBT đã chỉ ra rằng SNP không trực tiếp gây bệnh nhưng có thể ảnh hưởng đến nguy cơ mắc bệnh. Các SNP như rs861539, rs1799794, rs1799796 của gen XRCC3 và rs1801320, rs1801321 của gen RAD51 đã được nghiên cứu nhiều. Những SNP này có thể làm thay đổi biểu hiện của protein, từ đó ảnh hưởng đến chức năng sửa chữa DNA. Việc hiểu rõ mối liên quan giữa SNP và UTBT có thể giúp phát triển các phương pháp sàng lọc và chẩn đoán hiệu quả hơn.

2.1. Phân tích SNP RAD51 và XRCC3

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng SNP RAD51 và XRCC3 có thể liên quan đến nguy cơ mắc UTBT. Cụ thể, SNP RAD51-rs1801320 và rs1801321 đã được xác định có mối liên quan với nguy cơ mắc UTBT. Tương tự, SNP XRCC3-rs861539 cũng cho thấy sự liên quan đáng kể. Việc phân tích các SNP này có thể giúp xác định những cá nhân có nguy cơ cao, từ đó có biện pháp can thiệp kịp thời.

2.2. Tác động của SNP đến biểu hiện gen

SNP có thể ảnh hưởng đến biểu hiện gen và chức năng của protein. Nghiên cứu cho thấy rằng một số SNP có thể làm giảm khả năng sửa chữa DNA, dẫn đến tăng nguy cơ mắc UTBT. Việc hiểu rõ cơ chế này có thể giúp phát triển các liệu pháp điều trị mới và cải thiện khả năng chẩn đoán sớm. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc xác định các SNP có liên quan và cơ chế tác động của chúng đến sự phát triển của UTBT.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Ung thư buồng trứng (UTBT) là một trong những bệnh lý ác tính phổ biến và có tỷ lệ tử vong cao hàng đầu trong các ung thư phụ khoa. Theo thống kê của GLOBOCAN năm 2020, toàn cầu ghi nhận 313.959 ca mắc mới (chiếm 3,4% tổng số ung thư ở phụ nữ) và hơn 200.000 ca tử vong (chiếm 4,7%). Tỷ lệ mắc chuẩn hóa theo tuổi (ASR) của thế giới là 6,6/100.000 dân và tỷ lệ tử vong chuẩn hóa là 4,2/100.000 dân. Tại Việt Nam, ung thư buồng trứng đứng thứ ba trong các ung thư phụ khoa với ước tính 1.404 ca mắc mới (ASR là 2,4/100.000 dân) và 923 ca tử vong (ASR là 1,5/100.000 dân). Phần lớn các trường hợp (trên 70%) được chẩn đoán ở giai đoạn tiến triển (giai đoạn III hoặc IV) do triệu chứng ban đầu mơ hồ, khiến tỷ lệ sống sót sau 5 năm ở giai đoạn muộn chỉ đạt khoảng 30,2%, trong khi phát hiện ở giai đoạn sớm có thể đạt 92,6%.

Khoảng 10% các ca ung thư buồng trứng có liên quan đến yếu tố di truyền, trong đó 90% trường hợp bắt nguồn từ hội chứng ung thư vú – buồng trứng di truyền (HBOC) do đột biến trên hai gen áp chế khối u BRCA1 và BRCA2. Ở quần thể chung, nguy cơ mắc ung thư buồng trứng tích lũy suốt đời là 1,22% (tương đương 1/82 phụ nữ), nhưng tỷ lệ này tăng vọt lên 27% – 63% ở người mang đột biến gen BRCA1/2. Song song với đột biến dòng mầm, các biến thể đa hình đơn nucleotide (SNP) trên các gen tham gia cơ chế sửa chữa tổn thương đứt gãy sợi đôi DNA bằng tái tổ hợp tương đồng (như RAD51 và XRCC3) được ghi nhận có liên quan đến tính nhạy cảm và khuynh hướng di truyền mắc ung thư buồng trứng ở nhiều chủng tộc. Tuy nhiên, tại Việt Nam, các công trình trước đây chủ yếu tập trung vào đặc điểm lâm sàng, giải phẫu bệnh hoặc khảo sát đột biến BRCA1/2 đơn lẻ trên bệnh nhân ung thư vú; dữ liệu nghiên cứu kết hợp giữa đột biến gen BRCA1/2 và các biến thể SNP RAD51, XRCC3 trên bệnh nhân ung thư buồng trứng còn thiếu hụt.

Luận án "Nghiên cứu tính đa hình thái đơn nucleotid (SNP) và đột biến một số gen trong ung thư buồng trứng" được thực hiện nhằm giải quyết 2 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Xác định đột biến gen BRCA1, BRCA2 ở bệnh nhân ung thư buồng trứng và mối liên quan với mô bệnh học.
2. Xác định một số dạng đa hình thái đơn nucleotid (SNP) trên gen XRCC3, RAD51 có liên quan đến nguy cơ mắc ung thư buồng trứng.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng mục tiêu 1: 20 bệnh nhân ung thư buồng trứng được chẩn đoán xác định bằng mô bệnh học tại Bệnh viện Phụ Sản Trung Ương, đáp ứng tiêu chuẩn hội chứng HBOC (có tiền sử mắc ung thư vú và/hoặc có ít nhất một người thân mắc ung thư buồng trứng hoặc ung thư vú), cùng 17 người thân của các bệnh nhân mang đột biến được mời tham gia lập phả hệ di truyền.
• Đối tượng mục tiêu 2: Nghiên cứu bệnh – chứng gồm 380 bệnh nhân ung thư buồng trứng (xác chẩn mô bệnh học, không kèm ung thư khác) và 380 đối chứng là phụ nữ không mắc ung thư, có độ tuổi tương đồng, đến khám hoặc điều trị bệnh lành tính tại Bệnh viện Phụ Sản Trung Ương.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các hướng nghiên cứu dịch tễ học, cơ chế sinh học phân tử và di truyền học của ung thư buồng trứng trên thế giới và tại Việt Nam. Về mặt quốc tế, tỷ lệ mang đột biến BRCA1/2 ở bệnh nhân ung thư buồng trứng dao động từ 5% đến 30% tùy từng quần thể (Sekine, 2021). Nhóm phụ nữ Do Thái Ashkenazi có tần số mang đột biến cao nhất (29,3%), tiếp đến là Trung Quốc (22,4%), Ấn Độ (21,4%), Đức (20,9%), Hoa Kỳ (14,8%), Canada (13,2%), trong khi các nước Bắc Âu như Phần Lan (5,6%) hay Đan Mạch (5,8%) ghi nhận tỷ lệ thấp hơn. Các nghiên cứu kinh điển của Easton (1995) và Ford (1998) ước tính nguy cơ ung thư buồng trứng tích lũy đến 70 tuổi ở người mang đột biến BRCA1 là 63% và BRCA2 là 27%. Các công trình dịch tễ sau đó của Chen (2006) ước tính nguy cơ này là 39% đối với BRCA1; Satagopan (2002) báo cáo nguy cơ là 37% (BRCA1) và 21% (BRCA2); Mavaddat (2013) ghi nhận lần lượt là 59% (BRCA1) và 16,5% (BRCA2). Phân tích gộp của Rebbeck (2015) chỉ rõ vị trí đột biến tại vùng cụm ung thư buồng trứng (OCCR) và vùng cụm ung thư vú (BCCR) trên các exon của BRCA1 và BRCA2 có ảnh hưởng trực tiếp đến tỷ số nguy cơ (Hazard Ratio) của từng loại ung thư.

Đối với các đa hình đơn nucleotide (SNP) liên quan đến con đường tái tổ hợp tương đồng (HR):

• Gen RAD51: Levy-Lahad (2001) và Rebbeck (2011) xác nhận SNP RAD51-rs1801320 làm tăng nguy cơ ung thư buồng trứng ở người mang đột biến BRCA2. Smolarz (2013) và Romanowicz-Makowska (2012) ghi nhận kiểu gen CC của rs1801320 làm tăng nguy cơ ung thư buồng trứng tại Ba Lan nhưng không thấy liên quan với rs1801321. Ngược lại, Wang (2001) cho thấy rs1801320 làm giảm nguy cơ ung thư buồng trứng ở phụ nữ Israel.
• Gen XRCC3: Michalska (2016) báo cáo SNP rs861539 liên quan đến nguy cơ ung thư buồng trứng cấp độ I tại Ba Lan. Yuan (2014) qua phân tích gộp trên người da trắng thấy rs1799794 và rs1799796 liên quan có ý nghĩa thống kê với ung thư buồng trứng, trong khi rs861539 không liên quan. Auranen khảo sát 1.600 ca bệnh và 4.241 chứng thể thanh dịch nhận thấy rs1799796 làm giảm nguy cơ mắc bệnh, còn Quaye (2009) không tìm thấy mối liên quan của biến thể này.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu về gen BRCA1/2 trước đây chủ yếu thực hiện trên ung thư vú: Lê Thị Minh Chính (2004) khảo sát 24 bệnh nhân ung thư vú không tìm thấy đột biến 185delAG và 6174delT; Ginsburg (2010) ghi nhận 2 ca mang đột biến trong 259 bệnh nhân; Hoàng Anh Vũ (2010) phát hiện 2 đột biến R1751X và 1792X trên 50 ca; Tạ Văn Tờ (2010) phát hiện 3/150 ca ung thư vú mang đột biến BRCA1:5382insC (2%) và 2 đột biến mới (93957T>A, 160920C>G). Nghiên cứu về ung thư buồng trứng của Nguyễn Thị Ngọc Lan (2012) trên 10 bệnh nhân có hội chứng HBOC phát hiện đột biến BRCA1:c.4986+4A>T cùng các biến thể P871L, E1038G, S694=. Về SNP, Nguyễn Thị Hải Phương (2017) khảo sát XRCC3-rs1799796 trên 103 bệnh nhân ung thư buồng trứng và 103 chứng nhưng chưa thấy khác biệt có ý nghĩa thống kê; Nguyễn Thị Thu Lê (2020) nghiên cứu RAD51-rs1801320 trên 100 bệnh nhân và 100 chứng, ghi nhận kiểu gen CC làm tăng nguy cơ mắc bệnh.

Tác giả / Nhóm nghiên cứu	Đối tượng nghiên cứu	Gen / Biến thể khảo sát	Kết quả chính
Sekine (2021)	Bệnh nhân UTBT đa quần thể	BRCA1, BRCA2	Tỷ lệ đột biến dao động 5% – 30% tùy chủng tộc
Rebbeck (2015)	>30.000 ca mang đột biến	BRCA1, BRCA2	Xác định các vùng OCCR và BCCR ảnh hưởng đến tỷ số nguy cơ ung thư
Smolarz (2013)	Phụ nữ Ba Lan	RAD51 (rs1801320, rs1801321)	Kiểu gen CC của rs1801320 tăng nguy cơ UTBT; rs1801321 không liên quan
Yuan (2014)	Quần thể người da trắng	XRCC3 (rs861539, rs1799794, rs1799796)	rs1799794 và rs1799796 liên quan đến nguy cơ UTBT; rs861539 không liên quan
Nguyễn Thị Ngọc Lan (2012)	10 bệnh nhân UTBT tại VN	BRCA1	Phát hiện đột biến BRCA1:c.4986+4A>T và các biến thể P871L, E1038G
Nguyễn Thị Thu Lê (2020)	100 bệnh nhân UTBT, 100 chứng	RAD51 (rs1801320)	Kiểu gen CC của rs1801320 làm tăng nguy cơ mắc UTBT

Khoảng trống nghiên cứu được luận án lựa chọn giải quyết là đánh giá toàn diện phổ đột biến gen BRCA1/2 trên nhóm bệnh nhân ung thư buồng trứng có yếu tố gia đình (HBOC), phân tích phả hệ di truyền người thân, đồng thời tiến hành nghiên cứu bệnh – chứng với cỡ mẫu lớn (380 bệnh, 380 chứng) để xác định vai trò của 5 biến thể SNP (RAD51: rs1801320, rs1801321; XRCC3: rs861539, rs1799794, rs1799796) đối với nguy cơ mắc ung thư buồng trứng ở phụ nữ Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết về sinh học phân tử của quá trình sửa chữa tổn thương đứt gãy sợi đôi DNA (Double Strand Break - DSB) thông qua con đường tái tổ hợp tương đồng (Homologous Recombination - HR). Quá trình HR diễn ra qua 3 giai đoạn: trước tiếp hợp, tiếp hợp và sau tiếp hợp. Khi xuất hiện tổn thương DNA, protein BRCA1 tham gia nhận biết và điều phối cắt bỏ đầu sợi đơn DNA kết hợp phức hợp MRN/CtIP. Đầu 3' sợi đơn sau đó được bao phủ bởi phức hợp RPA, tiếp theo protein BRCA2 hỗ trợ RAD51 thay thế RPA để tạo thành sợi tiền tiếp hợp. Sợi nucleoprotein RAD51 xâm nhập sợi DNA kép tương đồng tạo vòng D-loop và liên kết bắt chéo kép Holliday (dHJ). Trong con đường này, hai phức hợp paralog của RAD51 đóng vai trò then chốt: phức hợp CX3 (gồm RAD51 và XRCC3) liên kết cấu trúc Holliday để ổn định chuyển đổi gen, và phức hợp BCDX2 (RAD51B, RAD51C, RAD51D, XRCC2) tạo điều kiện gắn kết và ổn định sợi nucleoprotein RAD51. Sự gián đoạn chức năng của BRCA1, BRCA2 hoặc biến đổi biểu hiện của RAD51, XRCC3 do các đa hình đơn nucleotide sẽ làm giảm khả năng sửa chữa DNA, dẫn đến mất ổn định hệ gen và tích tụ đột biến sinh ung thư.

Đặc điểm các gen và biến thể được khảo sát trong nghiên cứu:

• Gen BRCA1 (nhiễm sắc thể 17q21, 24 exon, 22 exon mã hóa, mRNA dài 7,8 kb, protein gồm 1.863 acid amin; chứa domain RING finger ở đầu N, miền exon 11-13 gắn RAD50, RAD51, PALB2, Rb, và domain BRCT ở đầu C).
• Gen BRCA2 (nhiễm sắc thể 13q12.3, 27 exon, mRNA dài 10,4 kb, protein gồm 3.418 acid amin; exon 11 mã hóa 8 mô típ lặp BRC từ BRC1 đến BRC8 tương tác trực tiếp với RAD51, miền C tận liên kết DSS1 và mang tín hiệu định hướng nhân NLS).
• Gen RAD51 (nhiễm sắc thể 15q15.1, 14 exon, mRNA 2.255 bp, protein 339 acid amin): Khảo sát 2 SNP vùng 5'UTR exon 1 là rs1801320 (135G>C) và rs1801321 (172G>T).
• Gen XRCC3 (nhiễm sắc thể 14q32.33, 10 exon, mRNA 2.574 bp, protein 346 acid amin, trọng lượng 37.850 Da): Khảo sát 3 SNP gồm rs861539 (exon 8, biến đổi nucleotide C>T làm thay đổi acid amin Threonine thành Methionine), rs1799794 (vùng 5'UTR exon 2, nucleotide A>G) và rs1799796 (intron 7, nucleotide A>G).

Phương pháp nghiên cứu thực tế:

• Thiết kế nghiên cứu mục tiêu 1: Nghiên cứu mô tả cắt ngang trên 20 bệnh nhân ung thư buồng trứng có tiêu chuẩn HBOC được chọn theo phương pháp lấy mẫu thuận tiện. Thu thập mẫu máu ngoại vi, tách chiết DNA, giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) và giải trình tự Sanger để xác định các đột biến BRCA1 và BRCA2. Mời 17 người thân của các bệnh nhân mang đột biến tham gia để kiểm chứng đột biến bằng giải trình tự Sanger và xây dựng cây phả hệ di truyền. Đánh giá tính sinh bệnh của đột biến bằng công cụ In Silico Prior và dự báo nguy cơ ung thư bằng công cụ CanRisk Tool.
• Thiết kế nghiên cứu mục tiêu 2: Nghiên cứu bệnh – chứng (case-control). Cỡ mẫu được tính toán dựa trên công thức tính cỡ mẫu ước tính tỷ số chênh (OR) từ nghiên cứu của Quaye (2009) với sai sót loại 1 $\alpha = 0,05$, sai sót loại 2 $\beta = 0,02$, hằng số $C = 7,85$, $OR = 0,65$, $p = 0,351$. Cỡ mẫu tối thiểu cho mỗi nhóm là 372 người; nghiên cứu thực tế chọn 380 bệnh nhân ung thư buồng trứng và 380 đối chứng khỏe mạnh.
• Kỹ thuật xét nghiệm phòng thí nghiệm: Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) khuếch đại các đoạn gen đích; phân tích đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (PCR-RFLP) sử dụng các enzyme cắt giới hạn đặc hiệu cho từng vị trí SNP; điện di trên gel agarose kiểm tra kích thước phân đoạn; giải trình tự Sanger đại diện kiểm chứng kết quả kiểu gen.
• Xử lý số liệu: Số liệu được phân tích theo các biến định lượng (tuổi, tuổi chẩn đoán, tuổi có kinh), biến nhị giá (tình trạng kinh nguyệt, tiền sử ung thư vú cá nhân và gia đình), biến định danh (mô bệnh học, giai đoạn FIGO, loại đột biến, kiểu gen/alen của 5 SNP). Xác định mối liên quan bằng tỷ số chênh (OR) và khoảng tin cậy 95% (CI 95%), kiểm định khi bình phương ($\chi^2$) hoặc Fisher's exact test.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 cung cấp cơ sở lý luận và tổng hợp y văn về dịch tễ học, nguyên nhân, cơ chế sinh bệnh, yếu tố nguy cơ, chẩn đoán, điều trị ung thư buồng trứng và sinh học phân tử các gen BRCA1, BRCA2, RAD51, XRCC3. Số liệu GLOBOCAN 2020 chỉ ra tỷ lệ mắc UTBT cao nhất tại Châu Âu (9,0/100.000) và Bắc Mỹ (8,1/100.000), dẫn đầu về tỷ lệ mắc là Brunei (17,4) và Samoa (15,9). Dữ liệu SEER cho thấy nguy cơ tử vong do UTBT là 0,86% (1/116). Hơn 90% khối u buồng trứng có nguồn gốc biểu mô, chia thành 2 nhóm: nhóm I tiến triển chậm từ tổn thương giáp biên (thanh dịch độ ác thấp, dịch nhầy, nội mạc tử cung, tế bào sáng; mang đột biến KRAS, BRAF, PTEN) và nhóm II tiến triển nhanh không rõ u tiền thân (thanh dịch độ ác cao chiếm 70%; mang đột biến TP53 ở 50% – 80% trường hợp). Các yếu tố làm giảm nguy cơ UTBT được ghi nhận gồm sinh con (OR giảm 0,81 cho mỗi lần sinh), thắt vòi tử cung hoặc cắt tử cung (giảm 30% – 40%), thuốc ngừa thai uống (giảm 50%), dùng aspirin (giảm 20% – 34%) và metformin.

Về chẩn đoán và phân loại, chương tổng quan trình bày phân loại FIGO phẫu thuật từ giai đoạn I đến IV, vai trò chỉ dấu sinh học CA125, HE4, mô hình siêu âm ADNEX của nhóm IOTA (độ nhạy 96,5%, độ đặc hiệu 71,3%), và chiến lược điều trị đích gồm thuốc kháng sinh mạch Bevacizumab, thuốc ức chế enzyme PARP (Olaparib, Niraparib, Rucaparib) trên bệnh nhân có khiếm khuyết tái tổ hợp tương đồng hoặc đột biến BRCA1/2. Đồng thời, chương 1 phân tích chi tiết cấu trúc protein, các miền chức năng RING, BRCT, BRC repeats, cơ sở dữ liệu BRCA Exchange (hơn 33.684 biến thể BRCA1 và 32.973 biến thể BRCA2), các đột biến "người sáng lập" tại các quần thể thế giới, vai trò của phức hợp CX3 và BCDX2 trong cơ chế tái tổ hợp tương đồng, cùng vị trí phân tử của 2 SNP gen RAD51 (rs1801320, rs1801321) và 3 SNP gen XRCC3 (rs861539, rs1799794, rs1799796).

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết phương pháp tiếp cận thực nghiệm và lâm sàng:

• Nhóm mục tiêu 1 gồm 20 bệnh nhân ung thư buồng trứng có tiêu chuẩn hội chứng HBOC và 17 người thân của các bệnh nhân mang đột biến được thu thập mẫu tại Bệnh viện Phụ Sản Trung Ương. Mẫu DNA tách chiết từ máu ngoại vi được giải trình tự thế hệ mới và giải trình tự Sanger để xác định vị trí, loại đột biến và ý nghĩa lâm sàng, kết hợp phân tích điểm chức năng bằng công cụ In Silico Prior và tính nguy cơ bằng CanRisk Tool.
• Nhóm mục tiêu 2 gồm 380 bệnh nhân ung thư buồng trứng và 380 đối chứng khỏe mạnh. Nghiên cứu xác lập quy trình kỹ thuật khuếch đại gen bằng PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen BRCA1, BRCA2 mang đột biến, các đoạn gen RAD51 (chứa rs1801320, rs1801321) và gen XRCC3 (chứa rs861539, rs1799794, rs1799796).
• Quy trình phản ứng cắt giới hạn (RFLP) với các enzyme cắt giới hạn tương ứng cho từng SNP, điện di trên gel để đọc phân đoạn alen, và giải trình tự Sanger kiểm chứng trên các mẫu đại diện.
• Chương này cũng công bố danh mục các biến số nghiên cứu, thông số vận hành thiết bị, hóa chất, địa điểm nghiên cứu và quy chuẩn đạo đức nghiên cứu y sinh học.

Chương 3: Kết quả

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm thu được từ hai nhánh nghiên cứu:

• Nhánh đột biến BRCA1/2: Xác định đặc điểm lâm sàng, tuổi khởi phát, tiền sử gia đình ở 20 bệnh nhân HBOC. Kết quả giải trình tự ghi nhận các đột biến gây bệnh và biến thể chức năng trên gen BRCA1 gồm c.1621C>T, c.4986+4A>T, c.4997dupA, c.4998C>G và trên gen BRCA2 gồm c.4022C>G, c.5453C>A. Phân tích mô bệnh học cho thấy đột biến tập trung chủ yếu ở thể ung thư biểu mô tuyến thanh dịch độ ác tính cao. Kết quả phân tích trên 17 người thân đã xác định sự di truyền đột biến dòng mầm trong các gia đình bệnh nhân (như phả hệ bệnh nhân KBT2 mang đột biến BRCA1:c.1621C>T, KBT4 mang BRCA1:c.4986+4A>T, KBT7 mang BRCA1:c.4997dupA, KBT6...). Kết quả In Silico Prior xác nhận điểm suy giảm chức năng protein của các biến thể này.
• Nhánh đa hình đơn nucleotide (SNP) trên 380 ca bệnh và 380 ca chứng: Phân tích tần số kiểu gen và alen của 5 SNP:
  1. SNP RAD51-rs1801320: Tỷ lệ phân bố kiểu gen GG, GC, CC và mối liên quan với nguy cơ mắc ung thư buồng trứng, mối liên quan với giai đoạn bệnh FIGO và phân loại mô bệnh học.
  2. SNP RAD51-rs1801321: Tỷ lệ phân bố kiểu gen GG, GT, TT và alen G, T; đánh giá tỷ số chênh OR đối với nguy cơ mắc bệnh và phân bố theo mô bệnh học.
  3. SNP XRCC3-rs861539: Tỷ lệ kiểu gen CC, CT, TT và alen C, T; xác định mối liên quan với nguy cơ mắc bệnh, giai đoạn FIGO và loại mô bệnh học.
  4. SNP XRCC3-rs1799794: Tỷ lệ phân bố kiểu gen AA, AG, GG và alen A, G; phân tích nguy cơ mắc UTBT và sự phân bố theo giai đoạn lâm sàng.
  5. SNP XRCC3-rs1799796: Tỷ lệ phân bố kiểu gen AA, AG, GG và alen A, G; đánh giá nguy cơ ung thư buồng trứng, mối tương quan với giai đoạn bệnh và đặc điểm mô bệnh học.

Chương 4: Bàn luận

Chương 4 biện giải các phát hiện nghiên cứu dựa trên đối chiếu với y văn trong nước và quốc tế:

• Về đột biến BRCA1/2: Bàn luận về phổ đột biến phát hiện được ở bệnh nhân ung thư buồng trứng người Việt Nam có tiêu chuẩn HBOC, so sánh với tỷ lệ và dạng đột biến đã công bố của Lê Thị Minh Chính, Hoàng Anh Vũ, Tạ Văn Tờ, Nguyễn Thị Ngọc Lan. Phân tích sự ưu thế của mô bệnh học ung thư biểu mô tuyến thanh dịch độ ác tính cao ở nhóm mang đột biến. Đánh giá khả năng gây bệnh của các đột biến mới và đột biến đã biết thông qua điểm chức năng In Silico Prior. Sử dụng công cụ CanRisk Tool để thảo luận về mức độ gia tăng nguy cơ ung thư vú và ung thư buồng trứng tích lũy đến 80 tuổi trên các cá thể trong phả hệ (như phả hệ bệnh nhân KBT2). Đối chiếu với hướng dẫn thực hành lâm sàng của Mạng lưới Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCCN) về chiến lược quản lý, tầm soát và chỉ định phẫu thuật cắt bỏ buồng trứng – vòi tử cung dự phòng cho người mang đột biến.
• Về các biến thể SNP RAD51 và XRCC3: Thảo luận chi tiết về sự phân bố tần số kiểu gen và alen của rs1801320, rs1801321, rs861539, rs1799794, rs1799796 tại Việt Nam so với các nghiên cứu của Smolarz (2013), Romanowicz-Makowska (2012), Wang (2001), Michalska (2016), Yuan (2014), Auranen, Quaye (2009), Nguyễn Thị Hải Phương (2017) và Nguyễn Thị Thu Lê (2020). Bàn luận về cơ chế sinh học mà các SNP vùng 5'UTR (như rs1801320, rs1801321, rs1799794) ảnh hưởng đến mức độ phiên mã/biểu hiện của mRNA, hoặc biến đổi acid amin exon 8 của XRCC3 (rs861539: Thr241Met) làm thay đổi cấu trúc không gian protein, từ đó điều hòa tính nhạy cảm đối với ung thư buồng trứng.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án đã đạt được những kết quả và đóng góp cụ thể về lý luận và thực tiễn:

Về mặt lý luận và khoa học:

• Bổ sung dữ liệu di truyền học phân tử về đột biến dòng mầm gen BRCA1 và BRCA2 trên nhóm bệnh nhân ung thư buồng trứng có yếu tố gia đình (HBOC) tại Việt Nam, xác định các đột biến cụ thể như BRCA1: c.1621C>T, c.4986+4A>T, c.4997dupA, c.4998C>G và BRCA2: c.4022C>G, c.5453C>A, khẳng định mối liên quan chặt chẽ giữa đột biến BRCA1/2 với thể mô bệnh học ung thư biểu mô thanh dịch ác tính cao.
• Thiết lập bộ dữ liệu thực nghiệm về tần số phân bố kiểu gen và alen của 5 biến thể đa hình đơn nucleotide trên hai gen sửa chữa tái tổ hợp tương đồng (RAD51: rs1801320, rs1801321; XRCC3: rs861539, rs1799794, rs1799796) trên cỡ mẫu 380 ca bệnh ung thư buồng trứng và 380 đối chứng khỏe mạnh tại Việt Nam.

Về mặt thực tiễn và ứng dụng lâm sàng:

• Xây dựng quy trình phối hợp giữa kỹ thuật PCR-RFLP, giải trình tự Sanger và công cụ tin sinh học (In Silico Prior, CanRisk Tool) phục vụ sàng lọc đột biến gen và tư vấn di truyền cho bệnh nhân ung thư buồng trứng cùng người thân trong gia đình.
• Cung cấp cơ sở khoa học để cá thể hóa chiến lược dự phòng (phẫu thuật giảm thiểu nguy cơ theo hướng dẫn NCCN) và lựa chọn điều trị đích bằng các thuốc ức chế PARP (Olaparib, Niraparib, Rucaparib) cho bệnh nhân ung thư buồng trứng mang đột biến BRCA1/2.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

• Ở mục tiêu 1, cỡ mẫu xác định đột biến BRCA1/2 còn hạn chế (20 bệnh nhân) do áp dụng tiêu chí chọn mẫu chọn lọc cao theo hội chứng HBOC và lấy mẫu thuận tiện tại một cơ sở điều trị.
• Đối tượng nghiên cứu ở cả hai mục tiêu đều được thu nhận tại Bệnh viện Phụ Sản Trung Ương, chưa bao phủ đa trung tâm trên các vùng địa lý khác nhau của Việt Nam.

Hướng nghiên cứu tiếp:

• Mở rộng xét nghiệm tầm soát đột biến gen BRCA1 và BRCA2 trên quần thể bệnh nhân ung thư buồng trứng không chọn lọc tiền sử gia đình nhằm xác định tỷ lệ đột biến chung trong cộng đồng.
• Triển khai các nghiên cứu đoàn hệ đa trung tâm quy mô lớn hơn để đánh giá sâu hơn sự tương tác giữa các SNP của hệ thống sửa chữa DNA với các yếu tố môi trường và sinh sản.
• Tiến hành nghiên cứu theo dõi dọc đánh giá thời gian sống thêm và đáp ứng điều trị thực tế của bệnh nhân mang đột biến BRCA1/2 đối với hóa chất chứa platinum và các thuốc ức chế PARP tại Việt Nam.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo cho các đối tượng chuyên môn sau:

• Nghiên cứu sinh, học viên sau đại học và giảng viên chuyên ngành Ung bướu, Phụ sản, Di truyền y học và Sinh học phân tử: Cung cấp khung tổng quan về cơ chế tái tổ hợp tương đồng, cấu trúc gen BRCA1/2, RAD51, XRCC3 và phương pháp nghiên cứu bệnh – chứng dịch tễ di truyền.
• Bác sĩ lâm sàng ung bướu và phụ sản: Hữu ích trong việc tiếp cận các tiêu chuẩn chẩn đoán hội chứng HBOC, chỉ định xét nghiệm gen, tư vấn di truyền phả hệ và định hướng sử dụng thuốc ức chế PARP hoặc phẫu thuật dự phòng theo khuyến cáo quốc tế.
• Các kỹ thuật viên và nghiên cứu viên phòng xét nghiệm sinh học phân tử: Có thể tham khảo bảng trình tự mồi PCR, điều kiện chu nhiệt, quy trình phản ứng cắt giới hạn enzyme (PCR-RFLP) và kỹ thuật giải trình tự Sanger kiểm chứng các đa hình đơn nucleotide.

Câu hỏi thường gặp

1. Nguy cơ mắc ung thư buồng trứng tích lũy suốt đời ở người mang đột biến gen BRCA1 và BRCA2 thay đổi ra sao so với người bình thường? Ở người bình thường trong cộng đồng, nguy cơ mắc ung thư buồng trứng tích lũy suốt cuộc đời là 1,22% (khoảng 1 trong 82 người). Ở những phụ nữ mang đột biến gen BRCA1 hoặc BRCA2, nguy cơ này tăng lên 27% – 63%. Cụ thể, các nghiên cứu dịch tễ ghi nhận nguy cơ tích lũy đến 70 tuổi ở người mang đột biến BRCA1 dao động từ 37% đến 63%, và ở người mang đột biến BRCA2 dao động từ 16,5% đến 27%.

2. Những đột biến cụ thể nào trên gen BRCA1 và BRCA2 đã được ghi nhận trong nghiên cứu này? Nghiên cứu đã xác định các đột biến dòng mầm trên gen BRCA1 gồm c.1621C>T, c.4986+4A>T, c.4997dupA, c.4998C>G và trên gen BRCA2 gồm c.4022C>G, c.5453C>A trên nhóm bệnh nhân ung thư buồng trứng mang hội chứng ung thư vú – buồng trứng di truyền (HBOC).

3. Hai gen RAD51 và XRCC3 tham gia vào cơ chế nào và những SNP cụ thể nào được khảo sát? Hai gen RAD51 và XRCC3 mã hóa cho các protein tham gia vào con đường tái tổ hợp tương đồng (HR) để sửa chữa đứt gãy sợi đôi DNA (DSB), trong đó RAD51 và XRCC3 kết hợp tạo thành phức hợp CX3 liên kết cấu trúc Holliday. Nghiên cứu khảo sát 5 SNP cụ thể gồm: 2 SNP trên gen RAD51 là rs1801320 (135G>C) và rs1801321 (172G>T) nằm tại vùng 5'UTR exon 1; 3 SNP trên gen XRCC3 là rs861539 (exon 8, biến đổi nucleotide C>T làm thay đổi Thr sang Met), rs1799794 (5'UTR exon 2, nucleotide A>G) và rs1799796 (intron 7, nucleotide A>G).

4. Quy mô mẫu và tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng trong nghiên cứu bệnh – chứng được xác định như thế nào? Cỡ mẫu nghiên cứu bệnh – chứng được tính toán theo công thức ước tính tỷ số chênh của Quaye (2009) với sai sót loại 1 $\alpha = 0,05$, sai sót loại 2 $\beta = 0,02$, cho ra cỡ mẫu tối thiểu là 372 người mỗi nhóm. Thực tế, nghiên cứu thu nhận 380 bệnh nhân ung thư buồng trứng (được chẩn đoán xác định bằng mô bệnh học, không kèm ung thư khác) và 380 người đối chứng (phụ nữ không mắc ung thư, tuổi tương đồng đến khám hoặc điều trị bệnh lành tính) tại Bệnh viện Phụ Sản Trung Ương.

5. Nhóm thuốc điều trị đích nào được chỉ định điều trị duy trì cho bệnh nhân ung thư buồng trứng có đột biến gen BRCA1/2? Thuốc ức chế PARP (Poly ADP ribose polymerase) gồm Olaparib, Rucaparib và Niraparib. Olaparib được chỉ định điều trị duy trì cho bệnh nhân ung thư buồng trứng biểu mô độ ác tính cao giai đoạn III và IV có đột biến gen BRCA1/2 đáp ứng sau hóa trị liệu bước 1 có chứa platinum, hoặc ung thư buồng trứng tái phát nhạy với platinum.

Kết luận

Luận án đã hoàn thành hai mục tiêu nghiên cứu thông qua thiết kế mô tả cắt ngang kết hợp nghiên cứu bệnh – chứng trên cỡ mẫu 380 ca bệnh và 380 ca chứng tại Bệnh viện Phụ Sản Trung Ương. Công trình đã làm rõ phổ đột biến gen BRCA1, BRCA2 trên nhóm bệnh nhân ung thư buồng trứng mang hội chứng HBOC, phân tích sự di truyền trong phả hệ gia đình và sự ưu thế ở thể mô bệnh học biểu mô thanh dịch ác tính cao. Đồng thời, luận án đã xác lập tần số phân bố kiểu gen, alen của 5 biến thể SNP trên hai gen RAD51 và XRCC3, cung cấp dữ liệu khoa học về di truyền phân tử phục vụ cho công tác tư vấn nguy cơ, dự phòng và chỉ định điều trị đích trong thực hành lâm sàng ung thư buồng trứng tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1. Ung thư buồng trứng 1. Dịch tễ Ung thư buồng trứng (UTBT) năm 2020 theo GLOBOCAN có 313 959 ca mắc mới đứng thứ 3 trong các UT phụ khoa, và là nguyên nhân chính của hơn 200 nghìn ca tử vong, đứng thứ 2 trong các UT phụ khoa.1 Việt Nam năm 2020 ước tính có 1 404 ca UTBT mắc mới và 923 ca tử vong do UTBT.1 Tỉ lệ mắc UTBT chuẩn theo tuổi (ASR) là 6,6 trên 100 000 người, và tỉ lệ tử vong chuẩn theo tuổi do UTBT là 4,2 trên 100 000 ca (Biểu đồ 1.1 Tỉ lệ mắc UTBT cao nhất là ở Châu Âu 9,0 và Bắc Mỹ 8,1. Mặc dù Trung quốc và Ấn độ có tỉ lệ này tương đối thấp, chỉ 5,3 và 6,7, nhưng do dân số rất lớn nên hai nước này dẫn đầu về ước tính số ca mắc mới trong năm 2020 lần lượt là 55 342 và 45 701 ca.

Dẫn đầu về tỉ lệ mắc UTBT là Brunei 17,4 và Samoa 15,9.1 Tỉ lệ mắc UT và tử vong do UT của phụ nữ thế giới và Việt Nam Trong khi đó Việt Nam nằm trong các nước có tỉ lệ mắc UTBT thấp nhất, theo GLOBOCAN 2020 là 2,4 trên 100 000 người, và tỉ lệ tử vong do UTBT là 1,5 trên 100 000 ca tử vong.2 Xu hướng thay đổi tỉ lệ mắc mới và tỉ lệ tử vong của UTBT Ước tính năm 2020 nguy cơ mắc UTBT tích lũy đến 74 tuổi của phụ nữ trên thế giới là 0,73 và nguy cơ tử vong đến 74 tuổi là 0,49. Trong khi các nguy cơ này ở người Việt Nam thấp hơn nhiều, lần lượt là 0,25 và 0,17.1 Theo dữ liệu SEER (Surveillance, Epidemiology, and End Results), nguy cơ UTBT trong suốt cuộc đời là 1,22% tương đương 1 trong 82 người. Nguy cơ khác nhau ở các sắc tộc, cao nhất ở phụ nữ da trắng và thấp nhất ở người châu mỹ bản địa và vùng Alaska. Nguy cơ tử vong do UTBT ước tính là 0,86% tương đương 1/116.2 Và các chỉ số này đang có xu hướng giảm dần (Biểu đồ 3.3 Xu hướng thay đổi tỉ lệ sống sót sau 5 năm của UTBT Tỉ lệ sống sót sau 5 năm từ khi chẩn đoán là 48,6%, nhưng nếu chẩn đoán ở giai đoạn đầu tỉ lệ này rất cao đến 92,6%, tuy nhiên số bệnh nhân giai đoạn sớm chỉ chiếm 16%.

Trong khi 58% bệnh nhân chẩn đoán ở giai đoạn muộn có tỉ lệ sống sau 5 năm chỉ 30,2%.2 Nhưng tỉ lệ này đang có chiều hướng tăng dần nhờ cải thiện chất lượng điều trị và hiệu quả các phương pháp sàng lọc, dự phòng và chẩn đoán sớm (Biểu đồ 1. Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh UTBT Nguyên nhân của UTBT vẫn chưa được làm rõ. Về lý thuyết, bề mặt biểu mô của buồng trứng liên tục chịu quá trình tổn thương - rụng trứng và sửa chữa - làm sẹo, làm tăng khả năng phát sinh ĐB gen dẫn đến việc xuất hiện UT. Những giả thuyết khác còn cho rằng sự tăng nồng độ hormon trước và trong thời kỳ rụng trứng có thể kích thích sự phát triển của các tế bào bất thường.

Các UTBT bắt nguồn từ 3 loại tế bào: tế bào biểu mô, tế bào mầm và tế bào đệm-sinh dục. Các giả thiết chủ yếu tập trung vào UT biểu mô (hơn 90%). UT biểu mô có 5 nhóm chính: UT thanh dịch ác tính cao (70%), UT dạng lạc nội mạc tử cung (10%), UT tế bào sáng (10%), UT dịch nhầy (3%), UT thanh dịch ác tính thấp (<5%). Trong các loại UT này đều có những u xu hướng ác tính không chắc chắn như các u giáp biên có những đặc điểm tế bào ác tính, nhưng lại không có dấu hiệu xâm lấn mô nền xung quanh.