Chương 1 TỔNG QUAN 1. Đặc điểm bệnh TSTTBS thể thiếu 21-OH 1.1 Định nghĩa: TSTTBS thể thiếu 21-OH là bệnh gây nên do đột biến gen CYP21A2 trên cánh ngắn của NTS số 6(6p21) là gen mã hóa để tổng hợp enzym 21-OH. Khi gen CYP21A2 bị đột biến gây giảm hoặc không tổng hợp được enzym 21-OH tham gia vào quá trình tổng hợp hormon vỏ thượng thận, dẫn đến không tổng hợp được aldosteron và cortisol làm tăng tổng hợp testosteron. Biểu hiện lâm sàng của bệnh gồm các triệu chứng của suy thượng thận cấp, rối loạn điện giải: giảm Na+, tăng K+, nam hóa ở trẻ gái, giả dậy thì sớm ở trẻ trai.
Cơ chế bệnh sinh Quá trình chuyển hóa từ cholesteron tạo thành aldosteron, cortisol và testosteron, trong đó enzym 21- OH xúc tác cho sự chuyển hóa progesteron thành deoxycorticosteron và 17-hydroxyprogesteron thành 11desoxycortisol và cuối cùng là tổng hợp cortisol và aldosteron. Khi đột biến gen CYP21A2 gây thiếu hụt enzym 21-OH sẽ dẫn đến giảm nồng độ của hai hormon này trong cơ thể. Đồng thời làm tăng tiền chất progesteron và 17-OHP dẫn đến tăng tổng hợp androgen. Ở trẻ gái do tăng testosteron ức chế sự phát triển của buồng trứng và gây nam hóa cơ quan sinh dục như: phì đại âm vật biểu hiện ngay sau khi sinh.
Ở trẻ trai gây dậy thì sớm giả. Bệnh gây tăng phát triển cơ thể ở cả hai giới.3 Vị trí, cấu trúc, chức năng gen CYP21A2 Gen CYP21A2 nằm trên cánh ngắn của NST số 6 (6p21.3), nằm trong phức hợp MHC (major histocompatibility complex) của hệ thống HLA. Mỗi gen CYP21A2 và CYP21A1P bao gồm 10 exon và có kích thước khoảng 30kb. Trình tự nucleotide của hai gen này tương đồng 98% trong các exon và khoảng gần 96% trong các intron, do vậy trong quá trình phân bào giảm nhiễm, do sự thay đổi của trình tự nucleotid hoặc do sự đột biến mất đoạn giữa hai alen hoặc nhân đoạn, chuyển đoạn một cách hoàn toàn dẫn đến thay đổi cấu trúc của gen, gen CYP21A2 bị thay thế bằng một đoạn của gen CYP21A1P.
Chức năng của gen CYP21A2 là mã hóa để tổng hợp enzym 21- OH, khi bị đột biến làm thay đổi cấu trúc của gen CYP21A2, nên không tổng hợp được enzym 21-OH, hoặc enzym 21-OH được tổng hợp không có hoạt tính dẫn đến các thể bệnh trên lâm sàng.4 Các dạng đột biến trên gen CYP21A2 Cho đến nay, trên thế giới đã ghi nhận có hơn 100 các đột biến khác nhau gây bệnh TSTTBS do thiếu hụt 21-OH, các đột biến này bao gồm các đột biến điểm, mất đoạn nhỏ, thêm đoạn nhỏ và sắp xếp lại một cách phức tạp của gen. Trong đó 10 đột biến phổ biến nhất được phát hiện gây nên những thể lâm sàng khác nhau. Đặc điểm lâm sàng và chẩn đoán Thể nam hóa đơn thuần: Trẻ trai có dậy thì sớm giả, dương vật to nhanh, có lông mu, trứng ca, giọng trầm,. tuổi xương tăng nhanh, chiều cao thấp khi ở tuổi trưởng thành.
Ở trẻ gái, âm vật to giống như dương vật, môi lớn dính vào nhau, lỗ niệu đạo ở ngay dưới âm vật, và có các dấu hiệu nam hóa rõ hơn sau này: cao nhanh, lông mu, lông nách, trứng cá, cơ bắp phát triển.ngoại hình nam, không phát triển tuyến vú và buồng trứng gây rối loạn kinh nguyệt hoặc vô kinh. Thể mất muối: trẻ mất nước mạn tính, không tăng cân, nôn nhiều, biếng ăn và bỏ bú kèm rối loạn điện giải nặng có thể dẫn đến trụy mạch và tử vong. Xét nghiệm 17-OHP và testosteron tăng. Rối loạn điện giải hạ natri máu, tăng kali máu.
Tìm thấy đột biến gen CYP21A2.2 Phát hiện người lành mang gen bệnh 1. Đặc điểm di truyền của bệnh Bệnh tuân theo quy luật di truyền đơn gen lặn, NST thường của Menden. Trong sơ đồ phả hệ có người lành mang gen bệnh. Bệnh xảy ra không liên tục qua các thế hệ mà thường xuất hiện trong cùng một thế hệ.
Tỷ lệ nam và nữ bị bệnh như nhau. Nguy hiểm của bệnh khi bố và mẹ là hai dị hợp tử (người mang gen bệnh) nhưng không có biểu hiện lâm sàng của bệnh, nhưng di truyền gen bệnh cho con; 25% con mang đồng hợp tử gen bệnh (aa) sẽ biểu hiện bệnh trên lâm sàng, 50% con mang dị hợp tử lặn (Aa) không biểu hiện bệnh trên lâm sàng. Trong quần thể tỷ lệ người bị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH là 1/14.000 trẻ sơ sinh, trong khi tỷ lệ người lành mang gen bệnh lại rất cao là 1/60- 1/83 tùy thuộc từng chủng tộc. Do vậy, khi không có biện pháp phòng bệnh tích cực thì tỷ lệ người bị bệnh sẽ tăng cao trong quần thể.
Các phương pháp phát hiện người lành mang gen bệnh Sử dụng phân tích sơ đồ phả hệ của gia đình để tìm ra người mang gen DHT bắt buộc. Phương pháp sinh hóa cho các thành viên gia đình: định lượng 17-OHP tăng ở những người mang gen. Nghiệm pháp kích thích ACTH cho kết quả có tăng nồng độ 17-OHP, cortisol so với người không mang gen. Xét nghiệm sinh học phân tử tìm gen đột biến CYP21A2.
Quản lý và tư vấn di truyền cho người lành mang gen Hồ sơ bệnh lý của bệnh nhân và các thành viên gia đình có mang gen trong mỗi gia đình, dòng họ sẽ được quản lý tại phòng tư vấn di truyền. Các thông tin về bệnh sẽ là bằng chứng khoa học chặt chẽ giúp cho các bác sĩ di truyền tư vấn tiền hôn nhân, tư vấn chẩn đoán trước sinh với các thai phụ có nguy cơ cao sinh con bị bệnh để có kế hoạch điều trị sớm với thai bị bệnh.3 Chẩn đoán trước sinh bệnh TSTTBS 1.1 Chỉ định + Vợ chồng đã được xác định là dị hợp tử mang gen CYP21A2. + Một trong hai vợ chồng bị bệnh TSTTBS, còn người kia là dị hợp tử. + Các thai phụ đã một lần sinh con bị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH khi có thai tiếp theo cần thiết chẩn đoán trước sinh.
Các phương pháp chẩn đoán trước sinh bệnh TSTTBS Trước hết cần phải lấy được tế bào của thai nhi để chiết tách DNA. Sau đó sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử. - Phương pháp chọc ối dưới siêu âm: ở tuổi thai 15-18 tuần, lượng dịch ối hút ra trung bình 10-15ml. Nguy cơ xẩy thai: <1%.
- Phương pháp sinh thiết gai rau: tiến hành tuần thai thứ 9-12, nguy cơ xẩy thai khoảng 2-3%, sẽ giúp chẩn đoán bệnh sớm hơn nhưng hiện nay thủ thuật sinh thiết gai rau chưa được thực hiện rộng rãi ở Việt Nam. - Kỹ thuật sinh học phân tử: sử dụng hai kỹ thuật: + Kỹ thuật giải trình tự gen: là một kỹ thuật phát hiện đột biến gen trực tiếp, có thể phát hiện tất cả các đột biến trên gen CYP21A2. + Kỹ thuật MLPA: phát hiện các đột biến mất đoạn, lặp đoạn, chuyển đoạn trên gen CYP21A2, kỹ thuật cho kết quả chính xác và nhanh.4 Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS ở Việt Nam Ở nước ta việc chẩn đoán xác định bệnh và điều trị bệnh TSTTBS đã được quan tâm từ lâu. Bắt đầu với luận án TSYH của Võ Kim Huệ (2000) ngoài nghiên cứu về chẩn đoán điều trị, tác giả lần đầu công bố về đột biến gen CYP21A2 do mất đoạn ở exon 6.
Năm 2001, luận văn thạc sĩ của Thái Thiên Nam tiếp tục nghiên cứu về đột biến gen và bước đầu nghiên cứu về phát hiện người lành mang gen bệnh cho thân nhân gia đình. Năm 2007, luận án TSYH của Trần Kiêm Hảo phát hiện thêm 3 đột biến điểm ngoài đột biến xóa đoạn ở bệnh nhân và gia đình của họ. Nghiên cứu phát hiện người lành mang gen bệnh cho bệnh TSTTBS thể thiếu 21-OH có đề tài của Thái Thiên Nam và Trần Kiêm Hảo, nhưng với số lượng gia đình nghiên cứu ít (<5 gia đình) và sử dụng các kỹ thuật PCR. Chẩn đoán trước sinh cho bệnh TSTTBS chưa có đề tài được công bố.
Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2. Đối tượng nghiên cứu Mục tiêu 1: 130 thành viên trong gia đình bao gồm cha, mẹ, anh, chị, em ruột bệnh nhân TSTTBS đã được phát hiện đột biến gen CYP21A2 đang theo dõi và điều trị tại Khoa Nội tiết - Chuyển hóa- Di truyền Bệnh viện Nhi Trung ương. Mục tiêu 2: 12 thai phụ là người mang gen dị hợp tử, đã sinh con bị bệnh TSTTBS và lần mang thai tiếp theo có nguyện vọng được chẩn đoán trước sinh. Địa điểm và thời gian nghiên cứu Đề tài được tiến hành tại : - Khoa Nội tiết- Chuyển hóa – Di truyền Bệnh viện Nhi Trung ương.
- Trung tâm Nghiên cứu Gen và Protein trường Đại học Y Hà Nội. - Trung tâm Chẩn đoán trước sinh Bệnh viện Phụ sản Trung ương. Trong thời gian 3 năm từ tháng 9 năm 2011 đến tháng 9 năm 2014.3 Phương pháp nghiên cứu 2.Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu tiến cứu, mô tả cắt ngang.Cỡ mẫu: tiện ích; tất cả những thành viên gia đình gồm bố, mẹ, anh, chị, em ruột của 56 bệnh nhân đủ điều kiện nghiên cứu. Tất cả các mẹ của bệnh nhân mang thai lần tiếp theo trong thời gian nghiên cứu.
56 bệnh nhân TSTTBS đã tìm thấy đột biến gen CYP21A2 Xây dựng phả hệ 130 người là thành viên gia đình (bố, mẹ, anh, chị, em ruột) Hình 2. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 2.3 Phương pháp nghiên cứu lâm sàng và kỹ thuật di truyền phân tử: Đặc điểm đối tượng NC: bệnh nhân bị TSTTBS: tuổi, giới, thể bệnh. Xây dựng phả hệ gia đình cho từng bệnh nhân, ít nhất 3 thế hệ. Các thành viên gia đình: bố, mẹ, anh, chị, em ruột bệnh nhân được khám, tư vấn và lấy máu làm xét nghiệm phân tích gen CYP21A2 bằng kỹ thuật MLPA và giải trình tự gen.
Khi có kết quả những thành viên là DHT sẽ được tư vấn di truyền để theo dõi và thực hiện các biện pháp phòng bệnh khi cần thiết.4 Phương pháp nghiên cứu lâm sàng, chọc ối và kỹ thuật di truyền phân tử: + Mỗi thai phụ có một hồ sơ theo dõi thai sản: tuổi của thai phụ và tuổi thai nhi khi chẩn đoán trước sinh. Sử dụng phương pháp chọc ối để lấy dịch ối, nuôi cấy tế bào ối, chiết tách DNA. Sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen và MLPA để xác định đột biến trên gen CYP21A2 cho thai nhi. Thông báo kết quả phân tích gen CYP21A2 của thai nhi cho gia đình.
Khi thai nhi bị bệnh sẽ giải thích để gia đình lựa chọn phương pháp điều trị.4 Xử lý số liệu: các số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê y học bằng chương trình EPIDATA 3.5 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu Đề tài nghiên cứu được tuân thủ chặt chẽ theo đạo đức nghiên cứu trong Y học.
