Luận án phát hiện đột biến gen CYP21A2 và chẩn đoán trước sinh tại Bệnh viện Nhi Trung ương

Tóm tắt luận án tiến sĩ y học về phát hiện người lành mang gen đột biến cyp21a2 và chẩn đoán trước sinh bệnh tăng sản thượng bì thể thiếu enzym 21hydroxylase.

• Trường học: Đại học Y Hà Nội
• Chuyên ngành: Y học
• Đề tài: Phát Hiện Gen Đột Biến CYP21A2 Và Chẩn Đoán Trước Sinh Bệnh Tăng Sản Thượng Thận
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• Tính cấp thiết của đề tài
• Mục tiêu nghiên cứu
• Ý nghĩa thực tiễn và những đóng góp mới của đề tài
• Cấu trúc của luận án
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Đặc điểm bệnh TSTTBS thể thiếu 21-OH
• 1.1.1. Định nghĩa
• 1.1.2. Cơ chế bệnh sinh
• 1.1.3. Vị trí, cấu trúc, chức năng gen CYP21A2
• 1.1.4. Các dạng đột biến trên gen CYP21A2
• 1.1.5. Đặc điểm lâm sàng và chẩn đoán
• 1.2. Phát hiện người lành mang gen bệnh
• 1.2.1. Đặc điểm di truyền của bệnh
• 1.2.2. Các phương pháp phát hiện người lành mang gen bệnh
• 1.2.3. Quản lý và tư vấn di truyền cho người lành mang gen
• 1.3. Chẩn đoán trước sinh bệnh TSTTBS
• 1.3.1. Chỉ định
• 1.3.2. Các phương pháp chẩn đoán trước sinh bệnh TSTTBS
• 1.4. Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS ở Việt Nam
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Thiết kế nghiên cứu
• 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu lâm sàng và kỹ thuật di truyền phân tử
• 2.3.3. Phương pháp nghiên cứu lâm sàng, chọc ối và kỹ thuật di truyền phân tử
• 2.3.4. Xử lý số liệu
• 2.4. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đặc điểm nhóm nghiên cứu
• 3.1.1. Phân bố theo giới và tuổi của 56 bệnh nhân TSTTBS thể thiếu 21-OH
• 3.1.2. Phân bố thể bệnh của 56 bệnh nhân TSTTBS thể thiếu 21-OH
• 3.1.3. Phân bố kiểu gen của 56 bệnh nhân TSTTBS thể thiếu 21-OH
• 3.1.4. Phân bố các thành viên gia đình của bệnh nhân
• 3.1.5. Phân bố tuổi của bố, mẹ khi làm xét nghiệm
• 3.1.6. Đặc điểm thai phụ được chẩn đoán trước sinh
• 3.1.7. Đặc điểm tuổi của mẹ và thai nhi khi chẩn đoán trước sinh
• 3.2. Kết quả nghiên cứu của mục tiêu 1
• 3.2.1. Kết quả phân tích gen cho bố, mẹ bệnh nhân
• 3.2.2. Kết quả phân tích gen của anh chị em bệnh nhân
• 3.2.3. Minh họa kiểu gen đột biến của thành viên gia đình bệnh nhân
• 3.2.3.1. Minh họa phả hệ và kiểu gen đột biến điểm bằng kỹ thuật giải trình tự gen của gia đình bệnh nhân TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH
• 3.2.3.2. Minh họa kiểu gen đột biến xóa đoạn bằng kỹ thuật MLPA của gia đình bệnh nhân TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• KẾT LUẬN
• KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh

Bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) là một rối loạn nội tiết di truyền, chủ yếu do đột biến gen CYP21A2. Đột biến này dẫn đến thiếu hụt enzym 21-hydroxylase (21-OH), gây ra sự thiếu hụt trong việc tổng hợp các hormone steroid như aldosterone và cortisol. Hệ quả là sự gia tăng sản xuất testosteron, dẫn đến các triệu chứng lâm sàng như nam hóa ở trẻ gái và dậy thì sớm giả ở trẻ trai. Tỷ lệ mắc bệnh trong quần thể là 1/14.000, nhưng tỷ lệ người mang gen lại cao hơn nhiều, từ 1/60 đến 1/83. Điều này cho thấy sự cần thiết phải phát hiện sớm và chẩn đoán trước sinh để quản lý bệnh hiệu quả.

II. Đặc điểm di truyền và phát hiện người lành mang gen bệnh

Bệnh TSTTBS tuân theo quy luật di truyền đơn gen lặn. Trong phả hệ của bệnh nhân, có thể tìm thấy những người mang gen dị hợp tử mà không có biểu hiện lâm sàng. Việc phát hiện người lành mang gen bệnh là rất quan trọng để ngăn ngừa sự lây truyền gen bệnh cho thế hệ sau. Các phương pháp phát hiện bao gồm phân tích sơ đồ phả hệ, xét nghiệm sinh hóa và xét nghiệm sinh học phân tử để tìm gen đột biến CYP21A2. Việc này không chỉ giúp xác định những người có nguy cơ mà còn tạo điều kiện cho việc tư vấn di truyền cho các gia đình có nguy cơ cao.

III. Chẩn đoán trước sinh bệnh TSTTBS

Chẩn đoán trước sinh cho bệnh TSTTBS là một bước quan trọng trong việc phát hiện sớm bệnh cho thai nhi. Các chỉ định chẩn đoán bao gồm các cặp vợ chồng đã xác định là dị hợp tử mang gen CYP21A2 hoặc đã có con bị bệnh. Phương pháp chẩn đoán trước sinh chủ yếu là chọc ối và sinh thiết gai rau, kết hợp với kỹ thuật sinh học phân tử như giải trình tự gen và MLPA. Kết quả chẩn đoán cho thấy có thể phát hiện sớm các thai nhi bị bệnh, từ đó có kế hoạch điều trị kịp thời, giúp giảm thiểu các biến chứng nghiêm trọng.

IV. Ý nghĩa thực tiễn và đóng góp của nghiên cứu

Nghiên cứu về phát hiện gen đột biến CYP21A2 và chẩn đoán trước sinh bệnh TSTTBS có ý nghĩa thực tiễn lớn. Việc phát hiện người lành mang gen bệnh giúp quản lý và tư vấn di truyền cho các thai phụ có nguy cơ cao. Nghiên cứu đã phát hiện thêm nhiều đột biến mới, góp phần làm phong phú thêm kiến thức về bệnh lý này. Chẩn đoán trước sinh không chỉ giúp phát hiện bệnh sớm mà còn tạo điều kiện cho việc điều trị kịp thời, giảm thiểu nguy cơ tử vong và các biến chứng cho trẻ sơ sinh.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) là nhóm bệnh lý nội tiết di truyền, trong đó thể thiếu hụt enzym 21-hydroxylase (21-OH) chiếm tỷ lệ phổ biến nhất từ 90% đến 95%. Bệnh biểu hiện chủ yếu qua hai thể lâm sàng kinh điển là thể mất muối và thể nam hóa đơn thuần, đòi hỏi người bệnh phải sử dụng liệu pháp hormon thay thế suốt đời. Bệnh di truyền theo quy luật đơn gen lặn trên nhiễm sắc thể thường của Mendel, liên quan trực tiếp đến các đột biến tại gen CYP21A2. Trong quần thể, tỷ lệ trẻ sơ sinh mắc bệnh dao động trong khoảng 1/10.000 đến 1/14.000, nhưng tần suất người lành mang gen dị hợp tử lại ở mức cao, từ 1/55 đến 1/83 (hoặc 1/60 đến 1/83 tùy chủng tộc). Nếu hai cá thể mang gen dị hợp tử kết hôn, nguy cơ sinh con bị bệnh là 25% và khả năng sinh con mang gen dị hợp tử là 50%.

Khoảng trống nghiên cứu được tác giả luận án chỉ ra là: phần lớn các công trình trước đây tại Việt Nam chỉ tập trung vào mô tả triệu chứng lâm sàng, xét nghiệm sinh hóa, điều trị nội khoa hoặc khảo sát đột biến gen ở bệnh nhân đã biểu hiện bệnh. Việc phát hiện người lành mang gen dị hợp tử trong phả hệ gia đình và tiến hành chẩn đoán trước sinh cho các thai phụ có nguy cơ cao vẫn còn rất hạn chế, quy mô mẫu ở các nghiên cứu trước đó còn nhỏ và chưa có đề tài chẩn đoán trước sinh bệnh TSTTBS nào được công bố đầy đủ.

Luận án của nghiên cứu sinh Ngô Thị Thu Hương, chuyên ngành Nhi khoa (mã số: 62720135) tại Trường Đại học Y Hà Nội (năm 2015), dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Trần Vân Khánh và PGS.TS. Nguyễn Phú Đạt, đã xác định hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Phát hiện người lành mang gen bệnh cho các thành viên gia đình bệnh nhân bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu enzym 21-hydroxylase.
2. Chẩn đoán trước sinh cho một số thai phụ mang gen đột biến gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu enzym 21-hydroxylase và tư vấn di truyền cho gia đình bệnh nhân.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu bao gồm:

• Đối tượng mục tiêu 1: 130 thành viên trong gia đình (gồm 55 người bố, 56 người mẹ và 19 anh/chị/em ruột) thuộc 56 gia đình của 56 bệnh nhân TSTTBS đã xác định có đột biến gen CYP21A2.
• Đối tượng mục tiêu 2: 12 thai phụ mang gen dị hợp tử đã từng sinh con bị TSTTBS và có nguyện vọng chẩn đoán trước sinh ở lần mang thai tiếp theo (thực hiện xét nghiệm trên 13 thai nhi do có 1 thai phụ thực hiện 2 lần).
• Phạm vi không gian: Nghiên cứu thực hiện tại Khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di truyền (Bệnh viện Nhi Trung ương), Trung tâm Nghiên cứu Gen và Protein (Trường Đại học Y Hà Nội) và Trung tâm Chẩn đoán trước sinh (Bệnh viện Phụ sản Trung ương).
• Phạm vi thời gian: Thực hiện trong 3 năm, từ tháng 9 năm 2011 đến tháng 9 năm 2014.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án đã hệ thống hóa các nghiên cứu về bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH tại Việt Nam và trên thế giới:

• Tại Việt Nam:
  • Võ Kim Huệ (2000): Luận án Tiến sĩ Y học nghiên cứu về chẩn đoán, điều trị và lần đầu tiên công bố đột biến mất đoạn tại exon 6 trên gen CYP21A2.
  • Thái Thiên Nam (2001): Luận văn Thạc sĩ tiếp tục khảo sát đột biến gen và bước đầu nghiên cứu phát hiện người lành mang gen ở thân nhân gia đình người bệnh bằng kỹ thuật PCR với số lượng dưới 5 gia đình.
  • Trần Kiêm Hảo (2007): Luận án Tiến sĩ Y học phát hiện thêm 3 đột biến điểm và đột biến mất đoạn 8bp trên bệnh nhân và thân nhân trong 5 gia đình, ghi nhận các trường hợp bố mẹ mang dị hợp tử kép.
• Trên thế giới:
  • Nghiên cứu tại Nhật Bản (2002): Ghi nhận tỷ lệ đột biến điểm tại intron 2 (I2g) chiếm 39,8%.
  • Krone N. và cộng sự tại Đức (2000): Khảo sát 155 bệnh nhân TSTTBS, ghi nhận tỷ lệ đột biến p.I172N chiếm 19,7%, cho thấy mối liên quan với cả hai kiểu hình mất muối và nam hóa đơn thuần.
  • Nghiên cứu tại bang California, Hoa Kỳ (2010): Phân tích 213 bệnh nhân và 232 thành viên gia đình bằng kỹ thuật giải trình tự gen, ghi nhận đột biến đồng hợp tử tại intron 2 chiếm 23,4%.
  • Violeta A. tại Macedonia (2010): Khảo sát 51 bệnh nhân và 70 thành viên gia đình, ghi nhận tỷ lệ bố mẹ mang đột biến gen là 45,6%, trong đó tỷ lệ mang đột biến I2g là 12,9% và P30L là 20%.
  • Nghiên cứu tại Trung Quốc (2011): Phân tích phả hệ và đột biến gen ở các gia đình có con mắc bệnh, ghi nhận cơ chế đột biến mới (de novo) liên quan đến sự chuyển đoạn của gen CYP21A2.

Vị trí của luận án: Kế thừa các phát hiện ban đầu về đột biến gen tại Việt Nam, luận án mở rộng quy mô nghiên cứu lên 56 gia đình (130 thân nhân), áp dụng kết hợp hai kỹ thuật di truyền phân tử là giải trình tự gen trực tiếp và MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), đồng thời là công trình đầu tiên tại Việt Nam triển khai thành công chẩn đoán trước sinh bệnh TSTTBS qua phân tích DNA tế bào ối.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

• Bệnh sinh học phân tử: Gen CYP21A2 nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 6 (6p21.3) thuộc vùng phức hợp hòa hợp tổ chức mô chính lớp III (MHC class III). Gen này cùng gen giả CYP21A1P đều gồm 10 exon, trải dài khoảng 30kb, có độ tương đồng trình tự nucleotide đến 98% ở các exon và khoảng 96% ở các intron. Sự tương đồng cao dẫn đến hiện tượng tái tổ hợp chéo lệch lạc hoặc chuyển đoạn gen trong giảm phân, làm xuất hiện các đột biến mất đoạn, lặp đoạn, chuyển đoạn hoặc đột biến điểm.
• Cơ chế sinh hóa: Enzym 21-OH xúc tác chuyển hóa progesterone thành 11-deoxycorticosterone và chuyển 17-hydroxyprogesterone (17-OHP) thành 11-deoxycortisol. Khi thiếu hụt enzym 21-OH, quá trình tổng hợp cortisol và aldosterone bị suy giảm, tuyến yên tăng tiết ACTH do cơ chế điều hòa ngược âm tính bị gián đoạn, kích thích vỏ thượng thận tăng sản và chuyển hướng sản sinh quá mức androgen (testosterone), dẫn đến nam hóa cơ quan sinh dục ở thai nhi gái và dậy thì sớm giả ở trẻ trai.
• Quy luật di truyền: Di truyền đơn gen lặn trên nhiễm sắc thể thường theo quy luật Mendel.

Phương pháp nghiên cứu

• Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu tiến cứu, mô tả cắt ngang.
• Phương pháp chọn mẫu: Chọn mẫu tiện ích, lấy toàn bộ các thành viên gồm bố, mẹ, anh/chị/em ruột của 56 bệnh nhân TSTTBS đã xác định đột biến gen CYP21A2 đang theo dõi tại Bệnh viện Nhi Trung ương và các thai phụ mang gen dị hợp tử có thai tiếp theo trong giai đoạn 2011 - 2014.
• Kỹ thuật thu thập và phân tích dữ liệu:
  • Khám lâm sàng, khai thác tiền sử, lập sơ đồ phả hệ ít nhất 3 thế hệ cho từng gia đình.
  • Lấy máu ngoại vi của các thành viên gia đình để tách chiết DNA.
  • Thực hiện thủ thuật chọc hút 10 - 15 ml dịch ối dưới hướng dẫn của siêu âm ở tuổi thai 15 - 18 tuần (trung bình 16,3 ± 1,5 tuần), nuôi cấy tế bào ối, tách chiết DNA và kiểm tra độ tinh sạch bằng máy NanoDrop.
  • Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger: Xác định các đột biến điểm trên 10 exon và các vùng intron liên kết của gen CYP21A2.
  • Kỹ thuật MLPA: Phát hiện các dạng đột biến mất đoạn lớn, lặp đoạn và sắp xếp lại cấu trúc gen.
• Xử lý số liệu: Số liệu nghiên cứu được nhập và phân tích bằng phần mềm thống kê y học EPIDATA (phiên bản 3.x).

Nội dung chính theo từng chương

Luận án có tổng dung lượng 119 trang (với 12 bảng số liệu, 3 biểu đồ, 46 hình ảnh minh họa phả hệ và kết quả gen, 90 tài liệu tham khảo gồm 9 tài liệu tiếng Việt và 81 tài liệu tiếng Anh), được cấu trúc thành 4 chương chính.

Chương 1: Tổng quan

Chương này gồm 32 trang, trình bày toàn diện về:

• Định nghĩa, lịch sử nghiên cứu và cơ chế bệnh sinh của TSTTBS thể thiếu 21-OH.
• Cấu trúc di truyền học của vùng 6p21.3, gen CYP21A2 và gen giả CYP21A1P. Hơn 100 dạng đột biến đã được ghi nhận trên thế giới, bao gồm 10 đột biến điểm phổ biến và các đột biến mất đoạn lớn.
• Đặc điểm lâm sàng hai thể bệnh kinh điển: thể mất muối (nôn trớ, mất nước, sụt cân, hạ natri máu, tăng kali máu, nguy cơ trụy mạch tử vong) và thể nam hóa đơn thuần (phì đại âm vật ở trẻ gái, dậy thì sớm giả ở trẻ trai, phát triển cơ bắp và tăng tốc tuổi xương).
• Cơ sở di truyền học của người lành mang gen dị hợp tử, các phương pháp phát hiện (phân tích phả hệ, định lượng 17-OHP sau nghiệm pháp kích thích ACTH, xét nghiệm sinh học phân tử).
• Chỉ định và phương pháp chẩn đoán trước sinh: sinh thiết gai rau (tuần 9-12, nguy cơ sảy thai 2-3%), chọc hút dịch ối (tuần 15-18, nguy cơ sảy thai < 1%), ứng dụng giải trình tự gen và MLPA.
• Tổng kết tình hình nghiên cứu TSTTBS tại Việt Nam từ năm 2000 đến trước thời điểm thực hiện đề tài.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương này gồm 13 trang, mô tả chi tiết:

• Tiêu chuẩn lựa chọn 130 thành viên thuộc 56 gia đình bệnh nhân TSTTBS và 12 thai phụ có nguy cơ cao.
• Quy trình phối hợp liên viện giữa Bệnh viện Nhi Trung ương, Đại học Y Hà Nội và Bệnh viện Phụ sản Trung ương.
• Quy trình kỹ thuật thu thập mẫu bệnh phẩm dịch ối, nuôi cấy tế bào ối, tách chiết DNA bằng kit thương mại, đo nồng độ và độ tinh sạch trên máy NanoDrop.
• Quy trình phản ứng PCR nhân đoạn gen đặc hiệu, giải trình tự gen trực tiếp theo chu trình nhiệt và quy trình lai khuếch đại đa đầu dò (MLPA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
• Đạo đức trong nghiên cứu: cam kết bảo mật thông tin phả hệ, sự đồng thuận tự nguyện tham gia và tư vấn di truyền trước - sau xét nghiệm.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương này gồm 32 trang, trình bày các kết quả thực nghiệm:

1. Đặc điểm nhóm bệnh nhân và gia đình

• Nhóm 56 bệnh nhân: 30 nam (53,6%) và 26 nữ (46,4%), sự khác biệt giới tính không có ý nghĩa thống kê ($p > 0,05$). Trẻ dưới 1 tuổi chiếm 55,4% (31 trẻ), từ 1 - 5 tuổi chiếm 32,1% (18 trẻ), trên 5 tuổi chiếm 12,5% (7 trẻ); nhóm dưới 5 tuổi chiếm tổng số 87,5%.
• Phân bố thể bệnh: Thể mất muối chiếm 83,9% (47 bệnh nhân), thể nam hóa đơn thuần chiếm 16,1% (9 bệnh nhân), không có bệnh nhân thể không cổ điển.
• Kiểu gen của bệnh nhân: 41 bệnh nhân mang đột biến đồng hợp tử, 15 bệnh nhân mang đột biến dị hợp tử kép. Đột biến điểm tại intron 2 (I2g) chiếm tỷ lệ cao nhất (31,9%), tiếp theo là xóa đoạn (26,4%), p.R356W (18,0%) và p.I172N (11,1%).
• Cơ cấu 130 thành viên gia đình: 55 bố (42,3%), 56 mẹ (43,2%), 5 anh trai (3,8%), 6 chị gái (4,6%), 5 em trai (3,8%), 3 em gái (2,3%). Tuổi trung bình của bố là $32,6 \pm 5,3$ tuổi (22 - 38 tuổi); tuổi trung bình của mẹ là $29,8 \pm 6,7$ tuổi (21 - 37 tuổi, nhóm dưới 30 tuổi chiếm 78,6%).

2. Kết quả phát hiện người lành mang gen ở thân nhân

Nghiên cứu phát hiện 9 dạng đột biến trên gen CYP21A2, trong đó đột biến điểm chiếm 69,6% và đột biến xóa đoạn chiếm 30,4%. Tỷ lệ mang gen ở các nhóm thân nhân được tổng hợp trong các bảng sau:

Đối tượng thân nhân	Tổng số phân tích (n)	Số người mang dị hợp tử (n)	Tỷ lệ mang gen (%)	Dạng đột biến chủ yếu
Mẹ bệnh nhân	56	56	100,0%	I2g (33,8%), Xóa đoạn (30,4%), p.1763insT (1,8%)
Bố bệnh nhân	55	54	98,2%	I2g (35,7%), Xóa đoạn (25,0%), alen kép p.Q318X & R356W (2 người)
Anh/chị/em ruột	19	14	73,7%	I2g (8 người), Xóa đoạn (2 người), p.I172N (2 người), khác (2 người)

Ghi chú: Có 1 bố chưa tìm thấy đột biến; trong 19 anh/chị/em có 4 người hoàn toàn bình thường (26,3%) và 1 người chưa phân tích gen.

Nhóm anh/chị/em	Tổng số mang gen dị hợp tử (n)	I2g (n)	Xóa đoạn (n)	p.I172N (n)
Anh trai	3	2	1	0
Chị gái	5	2	1	1
Em trai	4	2	0	1
Em gái	2	2	0	0
Tổng số	14	8	2	2

3. Kết quả chẩn đoán trước sinh

Thực hiện chẩn đoán trước sinh cho 12 thai phụ (tuổi trung bình $32,9 \pm 3,4$ tuổi) trên 13 thai nhi ở tuổi thai trung bình $16,3 \pm 1,5$ tuần:

• 3 thai nhi hoàn toàn bình thường (không mang alen đột biến).
• 2 thai nhi mắc bệnh TSTTBS thể thiếu 21-OH mang đột biến đồng hợp tử p.R356W (cùng thuộc một cặp bố mẹ ở gia đình số 06, gồm 1 thai trai năm 2012 và 1 thai gái năm 2014; gia đình đều xin đình chỉ thai nghén ở tuần thứ 18).
• 8 thai nhi mang gen dị hợp tử (người lành mang gen): 6 thai mang đột biến xóa đoạn, 1 thai mang đột biến p.I172N và 1 thai mang dị hợp tử kép p.Q318X & R356W.

Chương 4: Bàn luận

Chương này gồm 17 trang, tập trung thảo luận:

• Cơ cấu tuổi bệnh nhân chủ yếu dưới 5 tuổi (87,5%) phản ánh sự cải thiện trong việc phát hiện và điều trị bệnh ở giai đoạn sớm.
• Tần suất các loại đột biến gen CYP21A2: Đột biến I2g (31,9%) và xóa đoạn (26,4%) là hai dạng phổ biến nhất ở bệnh nhân và thân nhân, tương đồng với các nghiên cứu tại Nhật Bản, Đức, Hoa Kỳ. Đột biến p.R356W liên quan chặt chẽ đến thể mất muối nặng do thay thế arginine thành tryptophan tại vị trí 356 làm mất hoạt tính enzym. Đột biến p.I172N bảo tồn 0-2% hoạt tính enzym, dẫn đến biểu hiện lâm sàng đa dạng giữa thể nam hóa đơn thuần và mất muối nhẹ.
• Phân tích các trường hợp phả hệ đặc biệt: Giải thích trường hợp con mang đột biến đồng hợp tử I2g nhưng bố không phát hiện đột biến qua cơ chế đột biến mới (de novo) trong giảm phân hoặc đột biến hiếm nằm ngoài vùng đầu dò/mồi khảo sát.
• Hiệu quả của mô hình câu lạc bộ bệnh nhân TSTTBS tại Bệnh viện Nhi Trung ương (hoạt động trên 16 năm) trong việc nâng cao nhận thức, hỗ trợ tuân thủ điều trị và vận động các gia đình tham gia tư vấn di truyền cũng như chẩn đoán trước sinh.
• Thực trạng can thiệp điều trị trước sinh: Do cả hai trường hợp thai nhi bị bệnh gia đình đều lựa chọn đình chỉ thai nghén, nghiên cứu chưa có cơ hội áp dụng phác đồ điều trị dexamethasone trước sinh nhằm hạn chế nam hóa ở thai nhi gái.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn

• Luận án đã phát hiện thêm 7 đột biến điểm mới ở các thành viên gia đình bệnh nhân so với các nghiên cứu trước đây được thực hiện tại Bệnh viện Nhi Trung ương.
• Đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam thực hiện chẩn đoán trước sinh bệnh TSTTBS thể thiếu 21-OH bằng cách kết hợp thủ thuật chọc ối với hai kỹ thuật di truyền phân tử chuyên sâu là giải trình tự gen Sanger và kỹ thuật MLPA.
• Xác lập cơ sở khoa học và quy trình thực hành tư vấn di truyền cho các dòng họ có người mắc bệnh, giúp xác định người lành mang gen dị hợp tử để phòng ngừa việc kết hôn giữa hai cá thể cùng mang gen hoặc kết hôn cận huyết thống.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Cần triển khai phát hiện sớm người lành mang gen trong các gia đình có tiền sử bệnh nhân TSTTBS để lập hồ sơ quản lý, theo dõi và tư vấn di truyền chủ động.
• Tăng cường truyền thông, giáo dục cộng đồng về nguy cơ sinh con mắc bệnh khi kết hôn cận huyết thống hoặc trong các quần thể biệt lập.
• Hướng dẫn các gia đình phối hợp mở rộng xét nghiệm phát hiện người mang gen cho cả hai bên nội, ngoại qua nhiều thế hệ; chủ động tiến hành chẩn đoán trước sinh ở các tuần thai sớm cho các cặp vợ chồng dị hợp tử để chuẩn bị phương án điều trị kịp thời sau sinh hoặc điều trị trước sinh.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế được ghi nhận

• Số lượng thai phụ được chẩn đoán trước sinh còn hạn chế (12 thai phụ với 13 thai nhi) do số lượng người mẹ mang thai lần tiếp theo trong thời gian nghiên cứu chưa nhiều và các chị/em gái của bệnh nhân còn nhỏ tuổi.
• Nghiên cứu chưa thực hiện được can thiệp điều trị bằng dexamethasone trước sinh cho thai nhi gái mắc bệnh do các gia đình phát hiện thai bệnh đều xin đình chỉ thai kỳ ở tuần thứ 18.
• Kỹ thuật lấy mẫu trước sinh mới dừng lại ở phương pháp chọc ối ở tuần thai 15 - 18, chưa áp dụng rộng rãi kỹ thuật sinh thiết gai rau ở tuần thai sớm hơn (tuần 9 - 12).
• Vẫn còn 1 trường hợp người bố chưa xác định được đột biến bằng các kỹ thuật hiện tại của đề tài.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Mở rộng quy mô chẩn đoán trước sinh trên cỡ mẫu lớn hơn tại nhiều trung tâm sản - nhi.
• Ứng dụng kỹ thuật sinh thiết gai rau để đưa thời điểm chẩn đoán về tuần thai thứ 9 - 12, tạo điều kiện triển khai phác đồ điều trị dexamethasone trước sinh cho thai nhi gái bị bệnh nhằm ngăn ngừa bất thường cơ quan sinh dục ngoài.
• Ứng dụng các kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới (NGS) hoặc mở rộng vùng phân tích để phát hiện các đột biến hiếm, đột biến sâu trong intron mà kỹ thuật thông thường chưa khảo sát hết.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị chuyên môn cao cho nhiều nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và bác sĩ chuyên khoa Nhi, Nội tiết, Di truyền y học: Tham khảo khung lý thuyết bệnh sinh, mối tương quan giữa kiểu gen CYP21A2 và kiểu hình lâm sàng (thể mất muối và thể nam hóa đơn thuần), cùng quy trình giải trình tự gen và kỹ thuật MLPA.
• Bác sĩ Sản khoa và chuyên viên Chẩn đoán trước sinh: Tham khảo quy trình phối hợp chọc ối, xử lý tế bào ối và phân tích DNA thai nhi phục vụ tư vấn tiền sản.
• Cán bộ y tế dự phòng và tư vấn di truyền: Sử dụng các số liệu về tần suất người lành mang gen (95,4% ở thân nhân trực hệ trong nghiên cứu) và các sơ đồ phả hệ mẫu để xây dựng tài liệu tư vấn tiền hôn nhân, phòng ngừa kết hôn cận huyết.

Câu hỏi thường gặp

1. Tần suất người lành mang gen TSTTBS trong quần thể và trong các gia đình có bệnh nhân là bao nhiêu?

Trong quần thể chung, tỷ lệ người lành mang gen dị hợp tử dao động từ 1/55 đến 1/83 (trong khi tỷ lệ mắc bệnh là 1/10.000 đến 1/14.000). Trong nghiên cứu này, khi khảo sát 130 thành viên thuộc 56 gia đình bệnh nhân, tỷ lệ người mang gen dị hợp tử lên tới 95,4% (100% ở mẹ, 98,2% ở bố và 73,7% ở anh/chị/em ruột).

2. Các dạng đột biến gen CYP21A2 nào xuất hiện phổ biến nhất ở bệnh nhân và thân nhân trong nghiên cứu?

Nghiên cứu ghi nhận 9 dạng đột biến, trong đó dạng đột biến điểm tại intron 2 (I2g/IVS2-13A/C>G) chiếm tỷ lệ cao nhất (31,9% ở bệnh nhân, 35,7% ở bố, 33,8% ở mẹ), tiếp theo là đột biến xóa đoạn (26,4% ở bệnh nhân, 25,0% ở bố, 30,4% ở mẹ), đột biến p.R356W (18,0% ở bệnh nhân) và đột biến p.I172N (11,1% ở bệnh nhân).

3. Quy trình kỹ thuật nào đã được sử dụng để thực hiện chẩn đoán trước sinh trong luận án?

Quy trình gồm: thực hiện chọc hút 10 - 15 ml dịch ối dưới hướng dẫn của siêu âm ở tuổi thai 15 - 18 tuần (trung bình 16,3 tuần), nuôi cấy tế bào ối, tách chiết DNA thai nhi, kiểm tra độ tinh sạch bằng máy NanoDrop, sau đó tiến hành phân tích gen bằng kỹ thuật giải trình tự Sanger và kỹ thuật MLPA để xác định đột biến điểm hoặc đột biến mất đoạn.

4. Kết quả chẩn đoán trước sinh trên 13 thai nhi đã ghi nhận những kiểu gen nào?

Trong 13 thai nhi được phân tích: có 3 thai nhi hoàn toàn bình thường (không mang gen bệnh), 8 thai nhi là người lành mang gen dị hợp tử (6 thai mang đột biến xóa đoạn, 1 thai mang p.I172N, 1 thai mang dị hợp tử kép p.Q318X & R356W) và 2 thai nhi mắc bệnh mang đột biến đồng hợp tử p.R356W.

5. Vì sao việc phát hiện sớm thai nhi gái mắc bệnh TSTTBS trước sinh lại có ý nghĩa lâm sàng đặc biệt?

Nếu phát hiện sớm thai nhi gái mắc bệnh từ những tuần đầu thai kỳ, người mẹ có thể được điều trị bằng thuốc dexamethasone nhằm ức chế tuyến thượng thận thai nhi tăng tiết androgen, qua đó làm giảm hoặc ngăn chặn tình trạng nam hóa bộ phận sinh dục ngoài, giúp trẻ tránh được các phẫu thuật tạo hình phức tạp sau khi sinh.

Kết luận

Luận án của tác giả Ngô Thị Thu Hương đã phân tích thành công đột biến gen CYP21A2 trên 130 thân nhân của 56 gia đình bệnh nhân TSTTBS, xác định tỷ lệ người lành mang gen dị hợp tử ở bố là 98,2%, ở mẹ là 100% và ở anh/chị/em ruột là 73,7%. Công trình đã ứng dụng hiệu quả hai kỹ thuật giải trình tự gen và MLPA để phát hiện 9 dạng đột biến, trong đó đột biến I2g và đột biến xóa đoạn chiếm ưu thế. Luận án đã thực hiện chẩn đoán trước sinh thành công cho 12 thai phụ (13 thai nhi) qua kỹ thuật chọc ối, phát hiện chính xác 2 thai nhi mắc bệnh, 8 thai nhi mang gen dị hợp tử và 3 thai nhi bình thường. Đây là cơ sở khoa học quan trọng cho công tác tư vấn di truyền, quản lý người mang gen và can thiệp dự phòng sớm bệnh TSTTBS thể thiếu 21-OH tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN 1. Đặc điểm bệnh TSTTBS thể thiếu 21-OH 1.1 Định nghĩa: TSTTBS thể thiếu 21-OH là bệnh gây nên do đột biến gen CYP21A2 trên cánh ngắn của NTS số 6(6p21) là gen mã hóa để tổng hợp enzym 21-OH. Khi gen CYP21A2 bị đột biến gây giảm hoặc không tổng hợp được enzym 21-OH tham gia vào quá trình tổng hợp hormon vỏ thượng thận, dẫn đến không tổng hợp được aldosteron và cortisol làm tăng tổng hợp testosteron. Biểu hiện lâm sàng của bệnh gồm các triệu chứng của suy thượng thận cấp, rối loạn điện giải: giảm Na+, tăng K+, nam hóa ở trẻ gái, giả dậy thì sớm ở trẻ trai.

Cơ chế bệnh sinh Quá trình chuyển hóa từ cholesteron tạo thành aldosteron, cortisol và testosteron, trong đó enzym 21- OH xúc tác cho sự chuyển hóa progesteron thành deoxycorticosteron và 17-hydroxyprogesteron thành 11desoxycortisol và cuối cùng là tổng hợp cortisol và aldosteron. Khi đột biến gen CYP21A2 gây thiếu hụt enzym 21-OH sẽ dẫn đến giảm nồng độ của hai hormon này trong cơ thể. Đồng thời làm tăng tiền chất progesteron và 17-OHP dẫn đến tăng tổng hợp androgen. Ở trẻ gái do tăng testosteron ức chế sự phát triển của buồng trứng và gây nam hóa cơ quan sinh dục như: phì đại âm vật biểu hiện ngay sau khi sinh.

Ở trẻ trai gây dậy thì sớm giả. Bệnh gây tăng phát triển cơ thể ở cả hai giới.3 Vị trí, cấu trúc, chức năng gen CYP21A2 Gen CYP21A2 nằm trên cánh ngắn của NST số 6 (6p21.3), nằm trong phức hợp MHC (major histocompatibility complex) của hệ thống HLA. Mỗi gen CYP21A2 và CYP21A1P bao gồm 10 exon và có kích thước khoảng 30kb. Trình tự nucleotide của hai gen này tương đồng 98% trong các exon và khoảng gần 96% trong các intron, do vậy trong quá trình phân bào giảm nhiễm, do sự thay đổi của trình tự nucleotid hoặc do sự đột biến mất đoạn giữa hai alen hoặc nhân đoạn, chuyển đoạn một cách hoàn toàn dẫn đến thay đổi cấu trúc của gen, gen CYP21A2 bị thay thế bằng một đoạn của gen CYP21A1P.

Chức năng của gen CYP21A2 là mã hóa để tổng hợp enzym 21- OH, khi bị đột biến làm thay đổi cấu trúc của gen CYP21A2, nên không tổng hợp được enzym 21-OH, hoặc enzym 21-OH được tổng hợp không có hoạt tính dẫn đến các thể bệnh trên lâm sàng.4 Các dạng đột biến trên gen CYP21A2 Cho đến nay, trên thế giới đã ghi nhận có hơn 100 các đột biến khác nhau gây bệnh TSTTBS do thiếu hụt 21-OH, các đột biến này bao gồm các đột biến điểm, mất đoạn nhỏ, thêm đoạn nhỏ và sắp xếp lại một cách phức tạp của gen. Trong đó 10 đột biến phổ biến nhất được phát hiện gây nên những thể lâm sàng khác nhau. Đặc điểm lâm sàng và chẩn đoán Thể nam hóa đơn thuần: Trẻ trai có dậy thì sớm giả, dương vật to nhanh, có lông mu, trứng ca, giọng trầm,. tuổi xương tăng nhanh, chiều cao thấp khi ở tuổi trưởng thành.

Ở trẻ gái, âm vật to giống như dương vật, môi lớn dính vào nhau, lỗ niệu đạo ở ngay dưới âm vật, và có các dấu hiệu nam hóa rõ hơn sau này: cao nhanh, lông mu, lông nách, trứng cá, cơ bắp phát triển.ngoại hình nam, không phát triển tuyến vú và buồng trứng gây rối loạn kinh nguyệt hoặc vô kinh. Thể mất muối: trẻ mất nước mạn tính, không tăng cân, nôn nhiều, biếng ăn và bỏ bú kèm rối loạn điện giải nặng có thể dẫn đến trụy mạch và tử vong. Xét nghiệm 17-OHP và testosteron tăng. Rối loạn điện giải hạ natri máu, tăng kali máu.

Tìm thấy đột biến gen CYP21A2.2 Phát hiện người lành mang gen bệnh 1. Đặc điểm di truyền của bệnh Bệnh tuân theo quy luật di truyền đơn gen lặn, NST thường của Menden. Trong sơ đồ phả hệ có người lành mang gen bệnh.