MỞ ĐẦU Ngày nay, với sự tiến bộ và phát triển vượt bậc của công nghệ sinh học và sự ra đời của công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) đã giúp ích rất nhiều trong nghiên cứu các bệnh di truyền, bao gồm cả các bệnh di truyền hiếm gặp. Giải trình tự toàn bộ hệ gen mã hóa (WES) là một trong những công nghệ NGS cho phép giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa của hệ gen người, vùng chỉ chiếm 1% kích thước bộ gen nhưng có chứa đến 85% số lượng các biến thể gây bệnh. Do vậy, WES được xem là một kỹ thuật đầy hứa hẹn trong nghiên cứu các rối loạn di truyền hiếm gặp với chi phí phù hợp, lượng dữ liệu đầu ra lớn cũng như hiệu quả phân tích không chênh lệch nhiều khi so với giải trình tự toàn bộ hệ gen. Theo đạo luật thuốc hiếm (Orphan Drug Act), định nghĩa bệnh hiếm là các bệnh được tìm thấy với tỉ lệ mắc bệnh ít hơn 1/200.000 người ở Hoa Kỳ; trong khi tỉ lệ này theo Liên minh Châu Âu là 1/2000 người và hiện có khoảng 6000-7000 bệnh hiếm trên toàn thế giới đã được báo cáo (https://www.
Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tại Việt Nam ước tính trong 15 người thì có 1 người mắc bệnh hiếm, tương đương với khoảng 6 triệu người đang sống chung với những căn bệnh này. Do tính chất hiếm gặp của những nhóm bệnh hiếm mà việc chẩn đoán chính xác và kịp thời được xem là một thách thức lớn đối với các hệ thống chăm sóc sức khỏe. Sự chậm trễ trong chẩn đoán có thể dẫn đến chậm trễ trong công tác điều trị cũng như xử lý bệnh không đúng, gây suy kiệt về thể chất cũng như tinh thần của người bệnh và gia đình. Tại Việt Nam, cho đến nay, thông tin di truyền của ba bệnh hiếm gồm ly thượng bì bóng nước (tỷ lệ 11,1/1 triệu dân), bạch tạng (tỷ lệ 1/17.000 người) và thiểu sản vành tai (0,83-17,4/10.000 ca sinh) đều rất hạn chế/chưa được báo cáo.
Phổ lâm sàng của mỗi bệnh rộng, đôi khi chồng chéo giữa các phân nhóm khiến cho việc chẩn đoán chính xác trở nên khó khăn hơn, thậm chí là không phân loại được trong một số trường hợp phức tạp. Do đó các xét nghiệm di truyền là cần thiết, giúp phân loại chính xác các nhóm/phân nhóm những bệnh này. Bên cạnh đó, các nghiên cứu trên cộng đồng người phương Tây và số ít cộng đồng người châu Á đã công bố các biến thể gây bệnh nằm trên 21 gen gây nên ly thượng bì bóng nước trên 20 gen là nguyên nhân dẫn đến bạch tạng. Đối với thiểu sản vành tai, mặc dù nguyên nhân dẫn 2 đến bệnh vẫn chưa được làm rõ nhưng các yếu tố di truyền cũng đã được chỉ ra trong rất nhiều nghiên cứu với số lượng gen có thể liên quan đến bệnh ngày càng được mở rộng.
Vì vậy, để có thể khảo sát tất cả các gen gây bệnh/liên quan này thì các phân tích dựa trên NGS được xem là phương pháp hiệu quả cao, giúp nhanh chóng xác định các thông tin di truyền bệnh một cách chính xác, tiết kiệm thời gian và giảm thiểu chi phí. Với những ưu điểm của WES đã được báo cáo trong rất nhiều các nghiên cứu bệnh hiếm, công nghệ này được lựa chọn là công cụ để thực hiện đề tài “Nghiên cứu biến thể di truyền liên quan đến các bệnh Ly thượng bì bóng nước, Bạch tạng và Thiểu sản vành tai bằng giải trình tự hệ gen mã hóa”. Các kết quả thu được trong nghiên cứu này bước đầu giúp xây dựng bộ dữ liệu về các biến thể di truyền ở nhóm người bệnh mắc ba bệnh hiếm này ở Việt Nam. Đồng thời, đây cũng là cơ sở khoa học hỗ trợ các bác sĩ/nhà di truyền học trong công tác tư vấn di truyền cũng như phát triển các nghiên cứu lâm sàng xa hơn hướng tới mục tiêu chữa trị các căn bệnh nói trên hay tiên lượng bệnh trong tương lai.
Mục tiêu nghiên cứu của luận án: - Giải trình tự và phân tích trình tự hệ gen mã hóa trên các đối tượng người bệnh Việt Nam mắc ly thượng bì bóng nước, bạch tạng và thiểu sản vành tai. - Xác định các biến thể nguyên nhân/nguy cơ, các gen tiềm năng có thể liên quan đến các cơ chế tiềm ẩn dẫn đến ly thượng bì bóng nước, bạch tạng và thiểu sản vành tai. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án: 1. Khai thác thông tin lâm sàng, thu thập mẫu máu và tách chiết DNA tổng số của người bệnh mắc ly thượng bì bóng nước, bạch tạng, thiểu sản vành tai cùng các thành viên trong gia đình (nếu có).
Giải trình tự toàn bộ hệ gen mã hóa các mẫu người bệnh. Phân tích dữ liệu thu được và so sánh với các cơ sở dữ liệu đã công bố để xác định các biến thể gen liên quan/gây bệnh tiềm năng. 3 Những đóng góp mới của luận án: Đã xác định được các biến thể gen là nguyên nhân di truyền ở người bệnh mắc ly thượng bì bóng nước, trong đó có ba biến thể mới nằm trên gen COL7A1 (c. Đã xác định được nguyên nhân di truyền ở người bệnh bạch tạng, trong đó, biến thể TYR c.W39R) là nguyên nhân dẫn đến phân nhóm bạch tạng da và mắt loại 1 lần đầu tiên được tìm thấy ở trạng thái đồng hợp tử.
Đã xác định được 27 biến thể mới nằm trên các gen ứng viên có thể liên quan đến thiểu sản vành tai. TỔNG QUAN Trước đây, sử dụng công nghệ giải trình tự Sanger chỉ xác định được trình tự của một số đoạn gen trong một khoảng thời gian nhất định. Trong nghiên cứu bệnh di truyền nói chung và bệnh hiếm nói riêng, để xác định được các biến thể di truyền gây bệnh cần sàng lọc trên tất cả các gen liên quan, do đó tốn rất nhiều thời gian và kinh phí. Với số lượng bệnh hiếm không nhỏ (~ 11.000) đã được báo cáo, gây ra bởi các biến thể gây bệnh nằm rải rác trên các gen khác nhau, nếu chỉ dựa trên giải trình tự Sanger thì lượng biến thể di truyền liên quan đến bệnh được tìm thấy bị hạn chế, dẫn đến nhiều bệnh di truyền chưa xác định được nguyên nhân trong một thời gian dài.
Với lượng dữ liệu lớn được trích xuất từ công nghệ NGS trong khoảng hơn một thập kỷ qua, đã giải quyết các vấn đề tồn đọng này một cách hiệu quả cũng như giảm thiểu thời gian chờ một cách đáng kể, đặc biệt rất có ý nghĩa trong nghiên cứu các bệnh hiếm gặp/các bệnh chưa rõ nguyên nhân. Trong nghiên cứu này, thông qua WES chúng tôi tiến hành xác định các biến thể di truyền liên quan đến ba bệnh hiếm gặp chưa được nghiên cứu nhiều ở Việt Nam, bao gồm: bệnh ly thượng bì bóng nước, bạch tạng và thiểu sản vành tai.1 Bệnh ly thượng bì bóng nước 1. Giới thiệu chung về ly thượng bì bóng nước Ly thượng bì bóng nước (Epidermolysis Bullosa - EB) là một nhóm rối loạn di truyền về da hiếm gặp được xác định bởi độ tổn thương trên da ở mức vừa phải cho đến tổn thương nghiêm trọng trên các biểu mô và hình thành các vết phồng rộp. Biểu hiện lâm sàng ở người bệnh mắc EB có thể từ nhẹ đến nặng, rất nặng hoặc có thể dẫn đến tử vong.
Trong các trường hợp bệnh nặng, biểu mô ở bất kỳ cơ quan nào của cơ thể cũng có thể bị ảnh hưởng, với nguy cơ tiến triển ác tính và tăng nguy cơ tử vong. Cho đến nay, chưa có cách chữa trị đặc hiệu cho bệnh này, các phương pháp điều trị chỉ tập trung vào điều trị triệu chứng, chủ yếu là chăm sóc vết thương, kiểm soát nhiễm trùng, hỗ trợ dinh dưỡng, phòng ngừa và điều trị các biến chứng [1]. Trong ba thập kỷ qua, một nhóm đồng thuận quốc tế đã tiến hành tổng cộng 5 cuộc họp, hội bàn để sửa đổi và cập nhật các phân nhóm của EB dựa trên đặc điểm 5 kiểu hình đặc trưng và các thông tin di truyền liên quan. Bốn phân nhóm chính của EB bao gồm: ly thượng bì bóng nước đơn giản - Epidermolysis bullosa simplex (EBS), ly thượng bì bóng nước liên kết - Junctional epidermolysis bullosa (JBS), ly thượng bì bóng nước loạn dưỡng - Dystrophic bullermolysis bullosa (DEB) và hội chứng Kindler.
Các phân nhóm này được phân biệt bởi trạng thái hình thành các nốt phồng rộp ở các lớp nhất định của da [1]. Phân nhóm EBS là phổ biến nhất, chiếm ~70% các trường hợp EB, thường biểu hiện với các tổn thương ở bàn tay và bàn chân với sự hình thành vết phồng rộp đầu tiên xuất hiện trong tế bào sừng ở lớp đáy (basal keratinocytes). Mô hình di truyền phổ biến trong EBS là di truyền trội nhiễm sắc thể thường, tuy nhiên một số rất nhỏ các trường hợp di truyền lặn cũng đã được báo cáo. Phân nhóm JEB có dạng di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, được đặc trưng bởi các vết phồng rộp xuất hiện ở vùng lá sáng (lamina lucida) của màng đáy.
Phân nhóm DEB là dạng di truyền lặn hoặc trội tùy thuộc vào các ảnh hưởng của từng phân nhóm thuộc DEB và vị trí của các tổn thương là tại vùng lá đặc (lamina densa) thuộc màng đáy. Phân nhóm cuối cùng của EB là hội chứng Kindler (EB Kindler), là một hội chứng di truyền lặn đặc trưng bởi các tổn thương xuất hiện ở màng đáy. Các biểu hiện lâm sàng ở các trường hợp EB Kindler thông thường với các vết phồng rộp xuất hiện ở ngoài cùng (acral), da nhạy cảm với ánh sáng, có biểu hiện teo da và chứng da loang lổ/da đốm (poikiloderma) tiến triển. Các mức độ ảnh hưởng lâm sàng được đặc trưng trong và giữa các phân nhóm EB phản ánh mức độ nghiêm trọng của bệnh, các biến chứng đi kèm cũng như nguy cơ tử vong sớm ở một số phân nhóm.
Ví dụ, các trường hợp JEB thể nặng có liên quan đến tỷ lệ tử vong sớm sau khi sinh ở trẻ, trong khi các trường hợp EBS thể khu trú thì các biểu hiện tương đối nhẹ và không ảnh hưởng đến tuổi thọ [1, 2]. Mặc dù EB được biết là một rối loạn di truyền gây ra bởi các biến thể gen, làm thay đổi hay phá vỡ tính cơ học của các protein cấu trúc, ảnh hưởng đến tính toàn vẹn và kết dính bên trong các mô; tuy nhiên cơ chế phân tử gây bệnh vẫn chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn.