Tổng quan luận án

Rối loạn phổ tự kỷ (Autism Spectrum Disorders - ASD) là một nhóm rối loạn phát triển thần kinh phức tạp, không đồng nhất về mặt lâm sàng và di truyền, khởi phát sớm trong ba năm đầu đời. Đặc trưng cốt lõi của bệnh nhân tự kỷ bao gồm sự khiếm khuyết trong tương tác xã hội, khó khăn về giao tiếp ngôn ngữ và phi ngôn ngữ, cùng các hành vi, sở thích mang tính hạn hẹp, định hình và lặp đi lặp lại. Bệnh thường đi kèm với các rối loạn khác như khuyết tật trí tuệ (khoảng 31%), co giật (20-25%), rối loạn lo âu, rối loạn giấc ngủ, rối loạn tiêu hóa và phản ứng bất thường với kích thích cảm giác. Tỷ lệ mắc ASD trên thế giới ghi nhận khoảng 1/59 đến 1/68 ở trẻ dưới 8 tuổi, với tỷ lệ nam mắc bệnh nhiều hơn nữ (khoảng 4:1 đến 4-6:1). Cơ sở di truyền của tự kỷ có mức độ đóng góp cao (40-80%, thậm chí lên đến 90%), thể hiện qua sự đồng nhất kiểu hình ở các cặp song sinh cùng trứng (70-90%) so với song sinh khác trứng (0-30%) và nguy cơ mắc bệnh ở anh chị em trong gia đình lên tới 25%.

Tại Việt Nam, số lượng trẻ được chẩn đoán mắc chứng tự kỷ tại các cơ sở y tế công lập và tư nhân có xu hướng gia tăng nhanh chóng (số ca ghi nhận tại Bệnh viện Nhi Trung ương tăng từ 450 ca năm 2008 lên 1.968 ca năm 2011; thống kê năm 2015 ghi nhận khoảng 200.000 trường hợp). Tuy nhiên, nhận thức của cộng đồng còn hạn chế, tỷ lệ trẻ đến khám muộn vẫn ở mức cao (43,86% trên 36 tháng tuổi), và các nghiên cứu di truyền phân tử về bệnh tự kỷ tại Việt Nam còn rất hạn chế. Việc ứng dụng công nghệ giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa (Whole Exome Sequencing - WES) là hướng tiếp cận có ý nghĩa thực tiễn nhằm phát hiện các biến thể di truyền trên toàn bộ hệ gen mã hóa protein, phục vụ làm sáng tỏ nguyên nhân gây bệnh.

Luận án "Nghiên cứu phát hiện các biến thể ở một số bệnh nhân tự kỷ Việt Nam bằng phương pháp giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa (exome)" được tác giả Nguyễn Thu Hiền thực hiện năm 2019 dưới sự hướng dẫn của PGS. Nguyễn Huy Hoàng và GS.TS Phan Văn Chi tại Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, phối hợp với Khoa Tâm bệnh thuộc Bệnh viện Nhi Trung ương, trong khuôn khổ đề tài KHCN ưu tiên cấp Viện Hàn lâm KHCNVN mã số VAST02.

Mục tiêu của đề tài

  1. Giải trình tự và phân tích toàn bộ vùng mã hóa (exome) ở một số bệnh nhân tự kỷ Việt Nam.
  2. Xác định các biến thể di truyền trên các gen liên quan đến bệnh tự kỷ ở một số bệnh nhân tự kỷ Việt Nam.

Nội dung nghiên cứu

  1. Sàng lọc bệnh nhân tự kỷ.
  2. Thu thập mẫu máu và tách DNA tổng số từ mẫu máu bệnh nhân và gia đình.
  3. Giải trình tự toàn bộ exome của một số bệnh nhân tự kỷ Việt Nam.
  4. Phân tích số liệu tìm các biến thể di truyền liên quan đến bệnh tự kỷ ở một số người Việt Nam.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Mẫu máu ngoại vi của 07 bệnh nhân tự kỷ nam (ký hiệu từ T01, T02, T03, T06, T07, T08, T09) và các thành viên gia đình (bố, mẹ). Bệnh nhân được chẩn đoán xác định rối loạn phổ tự kỷ theo các thang đánh giá chuẩn hóa DBC-P (điểm số từ 25-29, ngưỡng chẩn đoán >17) và CARS (điểm số từ 40,5-44, ngưỡng tự kỷ nặng từ 37-60) bởi bác sĩ chuyên khoa Khoa Tâm bệnh, Bệnh viện Nhi Trung ương.
  • Phạm vi không gian: Phòng Hệ gen học chức năng - Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Công nghệ sinh học và Bệnh viện Nhi Trung ương, Hà Nội.
  • Phạm vi thời gian và pháp lý: Luận án thực hiện và bảo vệ năm 2019, tuân thủ các quy định y đức theo Quyết định số 02/QĐ-NCHG của Hội đồng Y đức Viện Nghiên cứu hệ gen và Tuyên bố Helsinki của Hội đồng Y khoa thế giới.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa lịch sử nghiên cứu dịch tễ học, lâm sàng và di truyền học của bệnh tự kỷ trên thế giới và tại Việt Nam từ năm 1943 đến 2018:

Lịch sử khái niệm, phân loại và dịch tễ học

  • Khái niệm và phân loại: Thuật ngữ "tự kỷ" do bác sĩ tâm thần học Leo Kanner đưa ra năm 1943 khi mô tả nhóm 11 trẻ có khiếm khuyết tương tác xã hội và hành vi rập khuôn. Rối loạn phát triển lan tỏa (PDD) bao gồm 5 hội chứng: Hội chứng Asperger (Hans Asperger, 1944; Hamilton, 2000; Baskin et al., 2006; McPartland, 2006; Collaborators, 2016), Hội chứng Rett (Andreas Rett, 1966; Bengt Hagberg, 1983; Huda Zoghbi, 1999; Percy, 2014), Rối loạn tan rã thời thơ ấu (Theodor Heller, 1908; Rogers, 2004), Rối loạn phát triển lan tỏa không xác định (PDD-NOS - Smith et al., 2015), và tự kỷ điển hình.
  • Dịch tễ học quốc tế: Tỷ lệ mắc ASD được ghi nhận bởi Williams et al. (2006: 20/10.000), Elsabbagh et al. (2012: 62/10.000, tương đương 1/160 trẻ), Baxter et al. (2015: 7,6/1.000, tương đương 1/132 người), số liệu CDC Hoa Kỳ (2008, 2014, 2015: tỷ lệ 1/68 trẻ, tăng 119,4% giai đoạn 2000-2010), Anh (Brugha et al., 2011: xấp xỉ 1%), châu Á và Trung Quốc (Sun & Allison, 2010; Sun et al., 2013: 14,8/10.000).
  • Thực trạng tại Việt Nam: Các công bố của Quách Thúy Minh (2011), Khoa Tâm thần (2012), Vu SH et al. (2014, 2017), Đậu Tuấn Nam & Vũ Hải Vân (2015) ghi nhận số lượng trẻ khám và điều trị tự kỷ tăng theo từng năm tại Bệnh viện Nhi Trung ương và Bệnh viện Nhi đồng 1; tỷ lệ theo thống kê quốc tế là 75,1/100.000 người.
  • Công cụ sàng lọc và chẩn đoán: Điểm lại các công cụ CHAT (Baron-Cohen et al., 1992), M-CHAT 23 (Robins et al., 2001), CARS, DBC-P (Stewart Einfeld & Bruce Tonge, 1992), ADI-R, ADOS / PL-ADOS, GARS (James E. Gilliam, 1995) và quy trình chẩn đoán qua mạng của Dennis Wall (Wall et al., 2012).

Cơ sở di truyền học và các công trình nghiên cứu trước

  • Hội chứng liên quan: Hội chứng Fragile X (gen FMR1 lặp đoạn CGG >200 lần tại Xq27.3 - Bagni & Greenough, 2005; Rousseau et al., 1995; Hagerman et al., 2010) và bệnh xơ cứng não củ (đột biến TSC1 tại 9q34 hoặc TSC2 tại 16p13 - Gutierrez et al., 1998; Crino et al., 2006; Napolioni & Curatolo, 2008).
  • Biến thể số lượng bản sao (CNVs): Các nghiên cứu của Redon et al. (2006), Sebat et al. (2007), Christian et al. (2008), Marshall et al. (2008), Rajcan-Separovic et al. (2007), Kumar et al. (2008), Liang et al. (2009), Fernandez et al. (2010).
  • Các nhóm gen chức năng:
    • Gen khớp thần kinh (Synapse): Nhóm neuroligin (NLGN1-5, đột biến R704C trên NLGN3 - Lintas & Persico, 2009; Etherton et al., 2011), nhóm SHANK (SHANK1-3, đặc biệt SHANK3 tại vùng 22q13 liên quan hội chứng Phelan-McDermid - Naisbitt et al., 1999; Boeckers et al., 2002; Phelan & McDermid, 2011), nhóm neurexin (NRXN1-3 - Ichtchenko et al., 1995; Missler et al., 2003; Zhang et al., 2005; Vaags et al., 2012).
    • Gen cấu trúc chromatin và phát triển hình thái: MECP2 (Chahrour & Zoghbi, 2007; Lam et al., 2000; Young et al., 2008), HOXA1 (Ingram et al., 2000; Conciatori et al., 2004; Muscarella et al., 2010; Raznahan et al., 2012; Tischfield et al., 2005; Bosley et al., 2007), PTEN (Blumenthal & Dennis, 2008; Ma & Blenis, 2009; Goffin et al., 2001; Lintas & Persico, 2009), EIF4E (Neves-Pereira et al., 2009).
    • Gen cân bằng kênh ion Ca2+: CACNA1C, CACNA1F, KCNMA1, SCN2A, RYR2, RYR3 (Splawski et al., 2004; Krey & Dolmetsch, 2007; Hakamata et al., 1992; Lai et al., 1992; Lanner et al., 2010; Matsuo et al., 2009; Heyes et al., 2015).
    • Gen ty thể, MUC16 và HTR4: Giulivi et al. (2010), Palmieri & Persico (2010), Mizejewski et al. (2013), Hu et al. (2011).
  • Ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS, WES, WGS): Điểm lại các công trình WES lớn của O'Roak et al. (2011: phát hiện đột biến trên FOXP1, GRIN2B, SCN1A, LAMC3; 2012: xác định đột biến đứt gãy trên CHD8, DYRK1A, GRIN2B, PTEN, TBL1XR1, TBR1), Iossifov et al. (2012), Sanders et al. (2012: gen SCN2A, KATNAL2, CHD8), Neale et al. (2012: gen BRCA2, FAT1, KCNMA1), Chahrour & Zoghbi (2007: gen UBE3B, CLTCL1, NCKAP5L, ZNF18), Bi et al. (2012: gen ANK3 biến thể S2569A, T3720M, T4255P), Novarino et al. (2012: gen BCKDK), Puffenberger et al. (2012: gen HERC2), Yu et al. (2013: gen AMT, PEX7, VPS13B/COH1, SYNE1), Egawa et al. (2015: gen CLN8 R24H), Inoue et al. (2015: gen RPS24, CD300LF), Nava et al. (2012) và Stein et al. (2013) nghiên cứu đột biến liên kết NST X (PHF8, HUWE1, TMLHE), Butler et al. (2014, 2015), và nghiên cứu WGS của Yuen et al. (2015).

Khoảng trống nghiên cứu luận án giải quyết

Phần lớn các nghiên cứu WES quy mô lớn được tiến hành trên các quần thể người da trắng hoặc các quốc gia phát triển. Tại Việt Nam, chưa có dữ liệu giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa exome trên các ca bệnh tự kỷ được chẩn đoán lâm sàng chặt chẽ. Luận án giải quyết khoảng trống này bằng cách thiết lập quy trình WES kết hợp kiểm chứng Sanger, cung cấp danh mục các biến thể di truyền và đột biến mới ở bệnh nhân tự kỷ Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và mô hình tiếp cận

Nghiên cứu dựa trên mô hình di truyền đa gen/ít gen (oligogenic/polygenic model) của ASD, theo đó kiểu hình tự kỷ phát sinh do tác động phối hợp của nhiều biến thể di truyền hiếm hoặc mới (de novo) trên các hệ thống gen chức năng: điều hòa độ dẻo khớp thần kinh (synaptic plasticity), tái cấu trúc chất nhiễm sắc, kênh dẫn truyền tín hiệu ion canxi nội bào và các con đường dẫn truyền thần kinh trung ương.

Phương pháp thực nghiệm phòng thí nghiệm

  1. Thu thập mẫu và tách chiết DNA:
    • Thu 2 ml máu tĩnh mạch của bệnh nhân và bố mẹ, chống đông bằng EDTA 1,5 mg/ml.
    • Tách chiết DNA tổng số bằng bộ kit QIAamp Blood Mini Kit (QIAGEN) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
    • Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA bằng phương pháp đo quang phổ và điện di trên gel agarose 0,8%.
  2. Tạo thư viện DNA giải trình tự exome:
    • Sử dụng hệ thống SureSelect Target Enrichment System for Illumina paired-end multiplexed sequencing với bộ kit SureSelect XT Library Prep và SureSelect V5+UTR-post (kích thước đoạn chèn 220 bp – 350 bp).
    • Quy trình gồm 5 bước: (1) Cắt DNA tổng số thành đoạn ngắn; (2) Gắn các đoạn adaptor và chỉ số phân loại mẫu (indexes); (3) Lai các đoạn DNA với mẫu dò exon được gắn biotin và hạt từ phủ streptavidin; (4) Rửa loại bỏ các phân tử không bắt cặp và thu hồi các đoạn exon; (5) Khuếch đại các đoạn exon bằng PCR.
    • Định lượng và kiểm định chất lượng thư viện bằng máy phân tích Agilent Bioanalyzer (sử dụng bộ kit TruSeq DNA Nano 350 và 550) và kiểm tra bằng phương pháp PCR-free (bộ kit TruSeq DNA PCR-free).
  3. Giải trình tự gen thế hệ mới (NGS):
    • Thực hiện trên hệ thống máy Illumina NextSeq 500 theo nguyên lý giải trình tự bằng tổng hợp (Sequencing by Synthesis - SBS) sử dụng 4 loại nucleotide đánh dấu huỳnh quang chu kỳ kép trên flow cell, xuất dữ liệu thô ở định dạng FASTQ.
  4. Kiểm chứng biến thể bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự Sanger:
    • Sử dụng các hóa chất PCR: dNTPs, Taq DNA polymerase (Fermentas, Sigma).
    • Sử dụng các cặp mồi oligonucleotide đặc hiệu để nhân đoạn gen quan tâm trên máy PCR Eppendorf AG (Đức):
      • Gen RYR3: cặp mồi R4-F/R4-R và R65-F/R65-R (kích thước sản phẩm 1,5 kb).
      • Gen RYR2: cặp mồi R2-F/R2-R (kích thước sản phẩm 0,6 kb).
      • Gen MUC16: các cặp mồi từ M16_1F/R đến M16_6F/R (kích thước sản phẩm 0,4 kb).
      • Gen HTR4: cặp mồi H4_F/H4_R (kích thước sản phẩm 0,4 kb).
    • Giải trình tự tự động hai chiều bằng máy Sequencer ABI 3500 Genetic Analyzer sử dụng kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing.

Bảng thông tin đoạn mồi oligonucleotide dùng trong nghiên cứu (trích từ Bảng 2.2 của luận án)

Tên gen đích Tên cặp mồi Chiều mồi Trình tự nucleotide (5' -> 3') Kích thước sản phẩm (kb)
RYR3 R4-F Xuôi TTATTGTGTTGCTTGGCTCCCGGAG 1,5
R4-R Ngược GGTCATATGTAGGAAATGCCAAGAGG
R65-F Xuôi GCCTAGTGCCTAGGGATGTCCATGG 1,5
R65-R Ngược GCTCCTCTCCTCTCAGCACATGAAAT
RYR2 R2-F Xuôi CACATTATGATGGTACGTAGGGG 0,6
R2-R Ngược GCCTGGACAACAGAGCACGACTCC
MUC16 M16_1F / 1R Xuôi / Ngược GGCACAGCCTCTTCAGCAGGGAC / GTCACCACAGAATTGCTAGAGGTAGG 0,4
M16_2F / 2R Xuôi / Ngược ATCCGTCCAAACTAAAGCACCCACC / TTGGATGAGGTGGGCGTGGCTGGCA 0,4
M16_3F / 3R Xuôi / Ngược TTCCACCCCAGCTCCAAAGACAGGC / TTCCTTGCTGTATCCCTTGGGTCTGG 0,4
M16_4F / 4R Xuôi / Ngược ATGCACCAAGACCTATGCTCAGCC / GGCTGTAGTTGGTGGAGCTGACAT 0,4
M16_5F / 5R Xuôi / Ngược AAGCAGTCCAGTACACTCAGGG / AACCTGCATAGAGAGGGAGGGAGG 0,4
M16_6F / 6R Xuôi / Ngược AGTACCTTCTTCCCTGATCTGAGG / ATCCAAGCCTCTCATGGCAGAAAGG 0,4
HTR4 H4_F / 4R Xuôi / Ngược CCCTCCGACTCTTCTCCTCAA / TCACCCAGACCACTATCAGA 0,4

Quy trình phân tích tin sinh học

  • Gióng hàng trình tự (Alignment): Sử dụng phần mềm BWA (Burrows-Wheeler Aligner) với các thuật toán BWA-backtrack, BWA-SW và BWA-MEM để so sánh dữ liệu đọc thô với hệ gen người tham chiếu.
  • Xử lý tệp tin và định dạng: Dùng Samtools và Picard để sắp xếp, đánh chỉ mục (index) và xử lý các tệp SAM/BAM.
  • Xác định biến thể (Variant Calling): Dùng bộ công cụ GATK (Genome Analysis Toolkit) của Broad Institute để lọc dữ liệu, phát hiện đột biến điểm (SNPs) và vi mất/thêm đoạn (Indels).
  • Trực quan hóa và chú giải: Sử dụng phần mềm IGV (Integrated Genomics Viewer) để kiểm tra trực quan các biến thể lắp ráp; đối chiếu với cơ sở dữ liệu dbSNP, OMIM, danh mục 101 gen của bộ TruSight Autism (Illumina) và mô hình hóa cấu trúc không gian 3D protein.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 1 tổng thuật các kiến thức nền tảng về ASD:

  • Khái niệm bệnh tự kỷ, tiêu chuẩn phân loại trong nhóm rối loạn phát triển lan tỏa (PDD) và phân biệt với các hội chứng Asperger, Rett, Rối loạn tan rã thời thơ ấu và PDD-NOS.
  • Phân tích số liệu dịch tễ học thế giới (tỷ lệ 1/160 đến 1/68) và thực trạng gia tăng số ca bệnh tại Việt Nam ghi nhận tại Bệnh viện Nhi Trung ương và Bệnh viện Nhi đồng 1. Đánh giá các công cụ chẩn đoán tâm lý - lâm sàng (CHAT, M-CHAT, CARS, DBC-P, ADI-R, ADOS, GARS).
  • Tổng quan các cơ sở di truyền: các hội chứng đơn gen (Fragile X, Xơ cứng não củ), biến thể số lượng bản sao (CNVs), các họ gen xinap (NLGN, SHANK, NRXN), gen biến đổi chất nhiễm sắc (MECP2), gen phát triển hình thái (HOXA1, PTEN, EIF4E), gen kênh ion canxi (CACNA1C, CACNA1F, KCNMA1, RYR2, RYR3, SCN2A), biến dị DNA ty thể và các gen chỉ thị mới (MUC16, HTR4).
  • Lịch sử nghiên cứu di truyền ASD giai đoạn 1975–2015 và các tiến bộ của công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (NGS, WES, WGS) trong phát hiện đột biến de novo và biến thể di truyền hiếm.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm và phân tích tin sinh học:

  • Thông tin lâm sàng của 07 bệnh nhân nam (T01, T02, T03, T06, T07, T08, T09). Toàn bộ bệnh nhân có điểm chẩn đoán DBC-P từ 25 đến 29 điểm và điểm CARS từ 40,5 đến 44 điểm (thuộc nhóm tự kỷ mức độ nặng, kèm các biểu hiện lâm sàng như hiếu động, không ngồi yên, mắt nhìn nghiêng, không giao tiếp mắt, hạn chế giao tiếp).
  • Hóa chất, vật tư, sinh phẩm của các hãng Sigma, Merck, Fermentas, QIAGEN, Illumina và hệ thống trang thiết bị (Illumina NextSeq 500, ABI 3500 Genetic Analyzer, Agilent Bioanalyzer, GelDoc, máy PCR Eppendorf).
  • Quy trình 5 bước tạo thư viện SureSelect V5+UTR-post, quy chuẩn kiểm định chất lượng thư viện (Bioanalyzer, PCR-free) và vận hành giải trình tự trên máy Illumina NextSeq 500.
  • Đường dẫn phân tích tin sinh học (FASTQ -> BWA -> Samtools/Picard -> GATK -> IGV) và danh mục các cặp mồi oligonucleotide kiểm chứng giải trình tự Sanger.

Bảng thông tin lâm sàng của các bệnh nhân nghiên cứu (trích từ Bảng 2.1 của luận án)

STT Ký hiệu bệnh nhân Giới tính Mẫu gia đình thu thập Điểm DBC-P Điểm CARS Đánh giá mức độ
1 T01 Nam Bố + Mẹ >17 >40 Tự kỷ nặng
2 T02 Nam Bố + Mẹ >17 >40 Tự kỷ nặng
3 T03 Nam Bố + Mẹ 29 41,5 Tự kỷ nặng
4 T06 Nam Bố + Mẹ 29 40,5 Tự kỷ nặng
5 T07 Nam Bố + Mẹ 25 42,5 Tự kỷ nặng
6 T08 Nam Bố + Mẹ 29 40,5 Tự kỷ nặng
7 T09 Nam - 29 44,0 Tự kỷ nặng

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm và số liệu phân tích di truyền:

  • Tách chiết DNA và kiểm định thư viện: DNA tổng số đạt tiêu chuẩn về nồng độ và độ tinh sạch. Thư viện DNA SureSelect V5+UTR-post phân bố kích thước chuẩn từ 220–350 bp. Dữ liệu đọc thô trên hệ thống Illumina NextSeq 500 đạt chất lượng đọc cao (FastQ quality score), tỷ lệ gióng hàng với hệ gen người tham chiếu đạt độ bao phủ sâu.
  • Xác định và chú giải biến thể: Qua các bước lọc tin sinh học, xác định được các biến thể di truyền trên các gen liên quan đến ASD ở 07 bệnh nhân:
    • Bệnh nhân T01: Xác định các biến thể liên quan và đa hình rs7725785 trên gen HTR4.
    • Bệnh nhân T02: Phát hiện và kiểm chứng bằng Sanger biến thể p.Ala2224Ser trên gen MUC16 và biến thể p.Trp13569Cys.
    • Bệnh nhân T03: Phát hiện và kiểm chứng bằng Sanger biến thể p.Val2430Ala trên gen MUC16.
    • Bệnh nhân T06: Phát hiện và kiểm chứng bằng Sanger các biến thể p.Leu13171Phe và p.Glu12869Lys trên gen MUC16; đặc biệt phát hiện 02 biến thể mới p.Leu111Pro và p.Arg3048Cys (p.R3048C) trên gen kênh canxi RYR3. Đã mô phỏng cấu trúc protein không gian 3D và đánh giá mức độ bảo tồn acid amin của RYR3 qua các loài.
    • Bệnh nhân T07: Phát hiện và xác thực bằng Sanger biến thể p.Val13167Met trên gen MUC16; 02 biến thể mới p.Arg801Cys và p.Tyr819Cys (p.W819C) trên gen kênh canxi RYR2. Kết quả phân tích mô hình 3D cho thấy các đột biến nằm ở vùng bảo tồn cao của phân tử protein RYR2 giữa các loài.
    • Bệnh nhân T08: Phát hiện và xác thực bằng Sanger biến thể p.Trp13569Cys trên gen RYR2.
    • Bệnh nhân T09: Phát hiện và xác thực bằng Sanger biến thể p.Ala2224Ser trên gen MUC16.
  • Phân tích các gen kênh ion và đa hình HTR4:
    • Tổng hợp các biến thể trên các gen nhạy cảm với ASD thuộc họ kênh ion (RYR2, RYR3).
    • Xác định sự xuất hiện của đa hình đơn nucleotide rs7725785 (c.507+53G>T) trên gen thụ thể serotonin HTR4 ở 04 bệnh nhân (T01, T07, T08, T09).

Chương 4: Bàn luận kết quả

Chương 4 tập trung phân tích, lý giải ý nghĩa sinh học của các phát hiện:

  • Đánh giá độ chính xác của quy trình giải trình tự WES trên máy Illumina NextSeq 500 kết hợp phần mềm BWA-GATK và phương pháp kiểm chứng Sanger trên ABI 3500.
  • Ý nghĩa của gen MUC16: Bàn luận vai trò của gen MUC16 (mã hóa mucin 16, protein màng kích thước lớn). Cùng với IL-8 và TIMP-1, MUC16 được xếp vào nhóm chỉ thị sinh học nhóm 3 trong sàng lọc tự kỷ ở trẻ sơ sinh (Mizejewski et al., 2013). Các biến thể mới phát hiện trên MUC16 có thể làm thay đổi tính chất bề mặt tế bào và tương tác tiếp hợp.
  • Ý nghĩa của các gen kênh ion RYR2 và RYR3:
    • Phân tích vai trò của thụ thể Ryanodine (RYRs) - kênh giải phóng ion Ca2+ lớn nhất từ lưới nội chất vào bào tương, có cấu trúc homotetramer dạng nấm xuyên màng.
    • RYR2 đóng vai trò điều hòa nồng độ canxi nội bào trong tế bào kích thích. Các đột biến p.Arg801Cys và p.Tyr819Cys (p.W819C) làm thay đổi acid amin ở các vị trí bảo tồn tiến hóa cao, có khả năng ảnh hưởng đến động học mở kênh Ca2+.
    • RYR3 biểu hiện ở vùng hồi hải mã, đồi thị và tế bào Purkinje của tiểu não (Hakamata et al., 1992; Lanner et al., 2010). Các nghiên cứu trên mô hình chuột bị loại bỏ gen RYR3 (knock-out) cho thấy sự suy giảm hành vi vận động và biểu hiện tăng động (Matsuo et al., 2009). Biến thể p.Arg3048Cys và p.Leu111Pro trên bệnh nhân T06 cung cấp thêm bằng chứng di truyền về sự liên quan giữa rối loạn cân bằng nội môi Ca2+ và kiểu hình tự kỷ.
  • Đa hình rs7725785 trên gen HTR4: Phân tích vai trò của gen thụ thể serotonin 5-HT4 (HTR4) trong con đường dẫn truyền thần kinh trung ương liên quan đến trí nhớ, học tập và các bệnh lý thần kinh (Hu et al., 2011). Sự xuất hiện của alen biến thể rs7725785 c.507+53G>T ở 4/7 bệnh nhân gợi ý đây là một đa hình tiềm năng liên quan đến tính nhạy cảm với ASD ở quần thể người Việt Nam.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

  1. Đưa ra số liệu về các biến thể di truyền ở 07 bệnh nhân tự kỷ Việt Nam thông qua phương pháp giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa (exome).
  2. Xác định 02 biến thể mới (trong đó có p.Arg3048Cys / p.R3048C và p.Leu111Pro) trên gen RYR3 ở 01 bệnh nhân tự kỷ (T06).
  3. Xác định 02 biến thể mới (trong đó có p.Tyr819Cys / p.W819C và p.Arg801Cys) trên gen RYR2 ở 01 bệnh nhân tự kỷ (T07).
  4. Xác định 06 biến thể mới trên gen MUC16 (bao gồm p.Ala2224Ser, p.Val2430Ala, p.Glu12869Lys, p.Val13167Met, p.Leu13171Phe, p.Trp13569Cys) ở các bệnh nhân.
  5. Xác định sự hiện diện của đa hình rs7725785 c.507+53G>T trên gen HTR4 ở 04 bệnh nhân tự kỷ (T01, T07, T08, T09).

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

  • Cần mở rộng quy mô nghiên cứu trên số lượng bệnh nhân và các thành viên gia đình lớn hơn trong quần thể người Việt Nam để củng cố giá trị thống kê dịch tễ học di truyền.
  • Tiếp tục thực hiện các nghiên cứu chức năng (in vitro và in vivo) đối với các biến thể mới được phát hiện trên các gen RYR2, RYR3, MUC16 và đa hình HTR4 để làm rõ cơ chế phân tử gây bệnh.
  • Ứng dụng công nghệ giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa exome (WES) và quy trình phân tích tin sinh học đã thiết lập vào hỗ trợ chẩn đoán sớm, tư vấn di truyền tiền sản và định hướng can thiệp y học cá thể hóa cho trẻ tự kỷ tại Việt Nam.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Cỡ mẫu nghiên cứu còn giới hạn (07 bệnh nhân và gia đình), do tính phức tạp trong việc tiếp cận và thu thập mẫu máu đạt chuẩn chẩn đoán lâm sàng tâm bệnh.
  • Phương pháp giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa (WES) chỉ tập trung vào các vùng exon mã hóa protein (~1-2% hệ gen), không phát hiện được các biến thể nằm sâu trong vùng intron không mã hóa, vùng khởi động (promoter) hoặc các biến thể cấu trúc lớn/CNVs nhỏ nằm ngoài vùng exon mà phương pháp giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) có thể bao quát.
  • Các biến thể mới phát hiện chủ yếu được kiểm chứng bằng giải trình tự Sanger và mô phỏng cấu trúc protein in silico, chưa tiến hành các thử nghiệm chức năng sinh hóa tế bào để đánh giá trực tiếp hoạt tính dòng ion canxi qua kênh.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Tăng cường thu thập mẫu bệnh nhân tự kỷ theo cấu trúc gia đình có nhiều thế hệ hoặc nhiều anh chị em mắc bệnh (multiplex families) kết hợp nhóm chứng người Việt Nam bình thường.
  • Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) để khảo sát toàn diện cả vùng mã hóa và không mã hóa.
  • Thiết lập các mô hình tế bào biểu hiện protein đột biến để kiểm tra chức năng sinh lý của kênh ion RYR2, RYR3 và thụ thể HTR4 mang biến thể.

Giá trị tham khảo

  • Đối tượng tham khảo:
    • Nghiên cứu sinh, học viên cao học, giảng viên ngành Di truyền học, Sinh học phân tử, Công nghệ sinh học và Tin sinh học: Tham khảo quy trình chuẩn về thiết lập thư viện exome SureSelect V5+UTR, thông số vận hành máy giải trình tự Illumina NextSeq 500, đường dẫn xử lý dữ liệu (BWA, GATK, Picard, IGV) và thiết kế mồi kiểm chứng Sanger.
    • Bác sĩ chuyên khoa Nhi, Tâm thần học, Thần kinh học và chuyên viên tư vấn di truyền: Sử dụng dữ liệu biến thể gen RYR2, RYR3, MUC16, HTR4 làm cơ sở tham khảo trong tư vấn nguy cơ di truyền và chẩn đoán phân tử cho các gia đình có trẻ mắc ASD.
    • Các nhà nghiên cứu chính sách y tế và dịch tễ học: Tham khảo các số liệu tổng quan dịch tễ học ASD tại Việt Nam và các công cụ sàng lọc lâm sàng (CARS, DBC-P).
  • Nội dung có giá trị tham khảo cao: Bảng thiết kế mồi PCR giải trình tự Sanger (Bảng 2.2), sơ đồ quy trình phân tích tin sinh học phát hiện biến thể từ dữ liệu FASTQ, và các kết quả phân tích cấu trúc 3D của đột biến kênh canxi ryanodine receptor.

Câu hỏi thường gặp

1. Bệnh nhân tham gia nghiên cứu được lựa chọn dựa trên những tiêu chuẩn chẩn đoán lâm sàng nào?

Bệnh nhân được bác sĩ chuyên khoa tại Khoa Tâm bệnh, Bệnh viện Nhi Trung ương chẩn đoán xác định tự kỷ dựa trên hai bộ công cụ chuẩn hóa: thang DBC-P (Developmental Behavior Checklist for Parent) với điểm số đánh giá từ 25 đến 29 (ngưỡng chẩn đoán tự kỷ là >17 điểm) và thang CARS (Childhood Autism Rating Scale) với điểm số từ 40,5 đến 44 (ngưỡng tự kỷ nặng từ 37 đến 60 điểm). Tất cả 07 bệnh nhân đều là nam giới, có các biểu hiện hành vi đặc trưng như hiếu động, không nhìn thẳng vào mắt, mắt nhìn nghiêng và khó khăn trong giao tiếp.

2. Quy trình kỹ thuật giải trình tự và công cụ tin sinh học nào được sử dụng trong luận án?

Luận án sử dụng bộ kit SureSelect XT Library Prep (SureSelect V5+UTR-post) để bắt giữ và làm giàu vùng exome, giải trình tự chu kỳ kép trên hệ thống máy Illumina NextSeq 500 theo nguyên lý giải trình tự bằng tổng hợp (SBS). Dữ liệu thô (FASTQ) được gióng hàng với hệ gen người tham chiếu bằng phần mềm BWA (thuật toán BWA-backtrack, BWA-SW, BWA-MEM), xử lý tệp SAM/BAM bằng Samtools và Picard, xác định biến thể bằng phần mềm GATK (Genome Analysis Toolkit), và trực quan hóa kết quả bằng phần mềm IGV (Integrated Genomics Viewer).

3. Luận án đã phát hiện những biến thể mới nào trên các gen kênh ion canxi (RYR2, RYR3)?

Trên gen RYR3, luận án phát hiện 02 biến thể mới là p.Leu111Pro và p.Arg3048Cys (p.R3048C) ở bệnh nhân T06. Trên gen RYR2, luận án phát hiện 02 biến thể mới là p.Arg801Cys và p.Tyr819Cys (p.W819C) ở bệnh nhân T07, cùng biến thể p.Trp13569Cys ở bệnh nhân T08. Tất cả các biến thể này đều được kiểm chứng chính xác bằng phương pháp giải trình tự Sanger trên máy ABI 3500.

4. Đa hình rs7725785 trên gen HTR4 có đặc điểm gì và xuất hiện ở những bệnh nhân nào?

Đa hình rs7725785 là biến thể thay thế đơn nucleotide (c.507+53G>T) nằm trên gen mã hóa thụ thể serotonin 5-HT4 (HTR4) - một thụ thể quan trọng trong con đường dẫn truyền thần kinh trung ương liên quan đến nhận thức và trí nhớ. Đa hình này được xác định xuất hiện ở 04 trên tổng số 07 bệnh nhân tự kỷ nghiên cứu (gồm các bệnh nhân T01, T07, T08 và T09).

5. Vì sao tác giả lựa chọn giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa (WES) thay vì giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) hay xét nghiệm mảng vi lai (Microarray)?

Mặc dù vùng mã hóa (exome) chỉ chiếm khoảng 1-2% toàn bộ hệ gen người, nhưng lại chứa tới khoảng 85% các đột biến đã biết gây ra các bệnh lý di truyền và thiểu năng trí tuệ theo di truyền Mendel. Phương pháp WES cho phép đọc dữ liệu với độ bao phủ sâu, phát hiện chính xác các biến thể nucleotide hiếm và đột biến mới (de novo) với chi phí và thời gian xử lý dữ liệu tối ưu hơn so với WGS, đồng thời khắc phục được hạn chế về độ phân giải thấp của các kỹ thuật di truyền truyền thống như FISH hay aCGH/microarray.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thu Hiền đã ứng dụng thành công công nghệ giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa (WES) trên hệ thống Illumina NextSeq 500 kết hợp phân tích tin sinh học (BWA, GATK, IGV) và kiểm chứng giải trình tự Sanger trên 07 bệnh nhân tự kỷ Việt Nam mức độ nặng. Nghiên cứu đã xác định được danh mục các biến thể di truyền quan trọng, bao gồm 02 biến thể mới trên gen kênh canxi RYR3, 02 biến thể mới trên gen RYR2, 06 biến thể mới trên gen MUC16 và đa hình rs7725785 trên gen thụ thể serotonin HTR4. Các kết quả này đóng góp dữ liệu thực nghiệm có giá trị về hệ gen học bệnh tự kỷ ở người Việt Nam, củng cố giả thuyết về vai trò của rối loạn cân bằng kênh ion Ca2+ và thụ thể thần kinh trong cơ chế bệnh sinh ASD, đồng thời cung cấp tài liệu tham khảo khoa học phục vụ công tác chẩn đoán phân tử và tư vấn di truyền.