Luận văn thạc sĩ: Tác động Capsaicin lên thụ thể NK1R và tế bào lympho

Luận văn thạc sĩ phân tích tác động của capsaicin lên thụ thể NK1R trên tế bào lympho và tế bào tái tổ hợp, cung cấp kết quả dược lực học chi tiết.

• Tác giả: Lê Văn Cao
• Người hướng dẫn: Ts. Trịnh Tất Cường
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên cứu sự tác động của Capsaicin lên thụ thể Neurokinin-1 trên tế bào Lympho và tế bào mang vectơ tái tổ hợp NK-1
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sỹ Khoa học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Thụ Thể NK1R và Capsaicin

Thụ thể NK1R (Neurokinin-1 Receptor) là một thụ thể kết cặp G-protein (GPCR) quan trọng trong hệ thần kinh và miễn dịch của con người. Thụ thể này có cấu trúc 7 miền xuyên màng và tham gia vào nhiều quá trình sinh lý như điều hòa đau, viêm, và đáp ứng miễn dịch. Capsaicin, hoạt chất chính từ ớt cay (Hồ tiêu), là một chất kích thích tự nhiên có khả năng tương tác với các thụ thể khác nhau trên bề mặt tế bào. Nghiên cứu tác động của capsaicin lên thụ thể NK1R mở ra các cơ hội mới trong phát triển thuốc từ nguồn gốc tự nhiên, đặc biệt trong lĩnh vực điều trị đau mãn tính và viêm.

1.1. Thụ Thể Neurokinin 1 Là Gì

Thụ thể NK1R là một GPCR có 7 miền xuyên màng thuộc họ thụ thể Tachykinin. Nó biểu hiện mạnh mẽ trên các tế bào lympho và các tế bào thần kinh. Thụ thể này có phối tử tự nhiên là chất P (Substance P), một neurotransmitter quan trọng trong truyền tín hiệu đau và viêm. Chức năng chính của NK1R bao gồm điều hòa phản ứng viêm, quá trình cảm thụ đau, và đáp ứng miễn dịch.

1.2. Capsaicin Hoạt Chất Tự Nhiên Từ Ớt

Capsaicin là alkaloid tự nhiên chiết tách từ các loại ớt cay, đặc biệt là từ Hồ tiêu. Hợp chất này có khả năng tương tác với nhiều thụ thể khác nhau trên màng tế bào. Nghiên cứu cho thấy capsaicin có tác dụng chống viêm, giảm đau, và điều chỉnh đáp ứng miễn dịch. Tính chất đặc biệt này làm cho capsaicin trở thành một ứng viên tiềm năng cho phát triển các loại thuốc thế hệ mới.

II. Phương Pháp Nghiên Cứu Tác Động Của Capsaicin Lên NK1R

Để nghiên cứu tương tác giữa capsaicin và thụ thể NK1R, các nhà khoa học sử dụng các công nghệ tiên tiến và phương pháp sinh học tế bào. Trong nghiên cứu của Lê Văn Cao tại Đại học Quốc gia Hà Nội, capsaicin được chiết tách từ Hồ tiêu sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Các nhà nghiên cứu sử dụng tế bào CHO biểu hiện NK1R tái tổ hợp cũng như tế bào lympho từ máu chuột để đánh giá dược lực học của capsaicin. Kỹ thuật đo biểu hiện NK1R bằng kit Fura 2AM cho phép đo nồng độ Ca2+ bên trong tế bào, phản ánh hoạt động của thụ thể.

2.1. Chiết Tách và Xác Định Capsaicin

Capsaicin được chiết tách từ Hồ tiêu bằng các dung môi hữu cơ và được tinh chế bằng HPLC. Phương pháp này cho phép xác định độ tinh khiết cao của capsaicin (>95%). Sau đó, các nhà nghiên cứu xây dựng đường chuẩn capsaicin để định lượng chính xác trong các thí nghiệm tiếp theo. Nồng độ và tính chất của capsaicin được kiểm tra bằng phương pháp phổ.

2.2. Mô Hình Tế Bào và Kỹ Thuật Đo Lường

Nghiên cứu sử dụng hai mô hình tế bào chính: tế bào CHO mang vectơ tái tổ hợp NK1R và tế bào lympho tách từ máu chuột. Tế bào CHO-NK1R cho phép nghiên cứu tương tác đặc hiệu với thụ thể, trong khi tế bào lympho tự nhiên cung cấp bối cảnh sinh lý thực tế. Kỹ thuật đo Ca2+ bằng Fura 2AM là phương pháp tiêu chuẩn để đo hoạt động thụ thể thông qua tăng nồng độ calci bên trong tế bào.

III. Kết Quả Chính Của Nghiên Cứu Tác Động Capsaicin Trên NK1R

Các kết quả từ nghiên cứu tác động của capsaicin lên thụ thể NK1R cho thấy tương tác có ý nghĩa giữa capsaicin và NK1R. Trên tế bào CHO biểu hiện NK1R tái tổ hợp, capsaicin thể hiện hoạt động kích thích với nồng độ hiệu lực 50% (EC50) ở mức niciêu. Tế bào lympho cũng cho thấy phản ứng tương tự khi tiếp xúc với capsaicin, cho thấy hoạt động tự nhiên của NK1R trên những tế bào này. So sánh giữa đường cong kích thích tăng Ca2+ trên hai loại tế bào cho thấy capsaicin là một chất kích thích NK1R tiềm năng với tiềm năng ứng dụng dược học cao.

3.1. Hoạt Động Kích Thích Của Capsaicin Trên NK1R Tái Tổ Hợp

Capsaicin thể hiện hoạt động kích thích trên tế bào CHO-NK1R, gây ra tăng nồng độ Ca2+ bên trong tế bào theo cách phụ thuộc vào nồng độ. Thông số dược lực học cho thấy capsaicin có sức bám dính và hiệu lực so sánh với phối tử đặc hiệu chất P. Đồ thị liều-đáp ứng của capsaicin cho thấy ngưỡng hoạt động ở nồng độ thấp, chỉ ra hiệu lực cao của hợp chất này.

3.2. Tương Tác Capsaicin Với NK1R Trên Tế Bào Lympho

Tế bào lympho tự nhiên biểu hiện thụ thể NK1R endogenous, cho phép đánh giá hoạt động thực sinh lý của capsaicin. Phản ứng của tế bào lympho với capsaicin tương tự như trên tế bào CHO-NK1R, nhưng với biên độ phản ứng có thể khác nhau do số lượng thụ thể khác nhau. Kết quả này xác nhận rằng capsaicin có tương tác thực sự với NK1R trong hệ thống sinh học tự nhiên.

IV. Ứng Dụng Và Triển Vọng Của Nghiên Cứu NK1R Capsaicin

Nghiên cứu tác động của capsaicin lên thụ thể NK1R có ý nghĩa lâm sàng quan trọng trong phát triển thuốc mới chống đau và viêm. Aprepitant (AP), một chất đối vận NK1R hiện được sử dụng lâm sàng để ngăn chặn buồn nôn do hóa trị, cho thấy tiềm năng của các tác nhân hoạt động NK1R trong y học hiện đại. Capsaicin, như một chất kích thích tự nhiên, có thể cung cấp sự lựa chọn khác với hiệu ứng phụ ít hơn. Công nghệ GPCR tái tổ hợp được sử dụng trong nghiên cứu này có thể tăng tốc độ sàng lọc dược phẩm mới từ các nguồn gốc tự nhiên, mở ra cơ hội phát triển các loại thuốc mới từ các loại thực vật có hoạt chất y tế.

4.1. Ứng Dụng Trong Phát Triển Thuốc Chống Đau

Thụ thể NK1R tham gia trực tiếp vào quá trình cảm thụ và truyền tín hiệu đau. Capsaicin có khả năng kích thích NK1R có thể được phát triển thành thuốc điều trị đau mãn tính, đau neuropathy, và đau viêm. Ưu điểm của capsaicin là nó có nguồn gốc tự nhiên, độ độc tính thấp, và đã được sử dụng an toàn trong y học truyền thống trong nhiều thế kỷ. Các công thức topical chứa capsaicin đã được chứng minh hiệu quả trong giảm đau cơ xương khớp.

4.2. Triển Vọng Sàng Lọc Dược Phẩm Từ Tự Nhiên

Mô hình tế bào NK1R tái tổ hợp phát triển từ nghiên cứu này có thể sử dụng để sàng lọc các hoạt chất tự nhiên khác từ các loại thực vật. Công nghệ GPCR tái tổ hợp cho phép tăng năng suất của quy trình phát triển thuốc, giảm chi phí, và tăng tốc độ khám phá các hoạt chất mới. Điều này có thể dẫn đến phát triển các loại thuốc mới từ các nguồn tài nguyên sinh vật bền vững, hỗ trợ y học chính xác và y học cá nhân hóa.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Việt Nam là một trong những quốc gia có tính đa dạng sinh học cao trên thế giới và được xếp là nước có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng. Với xu thế ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại để góp phần làm thay đổi diện mạo về công nông nghiệp cũng như y dược học hiện đại, trong những năm gần đây lĩnh vực y dược phẩm đã và đang rất quan tâm về khai thác các tài nguyên có nguồn gốc từ thiên nhiên. Con người đã và đang tập trung nghiên cứu, khai thác sâu rộng hơn về tài nguyên phong phú này với nhiều kỹ thuật và công nghệ đa dạng, hiện đại [2]. Đến nay, việc tiêu chuẩn hóa dược phẩm có nguồn gốc tự nhiên đang là một đòi hỏi cấp bách.

Muốn vậy, các nghiên cứu nhằm xác định các cơ chế tác dụng ở cấp phân tử, phát hiện các mục tiêu dược lý phân tử và các chức năng sinh học của chúng, đồng thời dùng chúng để sàng lọc và xác định các thành phần có hoạt tính sinh học và cả độc tính của dược liệu cần được triển khai toàn diện và hệ thống [5]. Với thụ thể là những đại phân tử protein, có các vị trí phân bố phổ biến trên màng tế bào. Chúng có khả năng nhận biết và gắn đặc hiệu với một số phân tử khác được gọi là chất gắn hay phối tử (ligand). Và các phối tử thường rất nhỏ so với thụ thể, chúng có thể là hormone, chất dẫn truyền thần kinh, alcaloid như morphin, chất hữu cơ có phân tử nhỏ, thuốc hay một số loại ion.

Mỗi loại thụ thể chỉ có thể gắn kết với một hoặc một số phối tử mang cấu trúc nhất định và có tính đặc hiệu cao [8]. Hồ Tiêu (Piper nigrum L) có nhiều ứng dụng thực tế. Nó không chỉ được dùng trong lĩnh vực thực phẩm mà còn được dùng làm thuốc trong y học cổ truyền. Có thể nói, Hồ Tiêu là những nguyên liệu có chứa các thành phần có hoạt tính sinh học rất có ý nghĩa trong đời sống [2, 5].

Trong các chất đó, Capsaicin được xem như là một chất có giá trị dược phẩm đáng quan tâm. Capsaicin có tác dụng giảm đau, là do làm giảm chất P (Substance P) là một neuropeptid chủ yếu tham gia dẫn truyền các xung động thần kinh từ ngoại vi 2 tới hệ thống thần kinh trung ương. Nếu chất P được giải phóng vào các tổ chức ở mô khớp, tại đó nó hoạt hoá các chất trung gian của phản ứng viêm liên quan đến cơ chế hóa sinh của bệnh viêm khớp dạng thấp thì capsaicin làm cho da và khớp mất cảm giác đau bằng cách làm giảm và ngăn ngừa sự tái tích luỹ lượng chất P tại các tế bào thần kinh cảm giác ngoại vi [4, 7]. Vì những luận điểm trên việc nghiên cứu Capsaicin từ Hồ tiêu có ý nghĩa quan trọng trong Y dược và nhằm làm sáng tỏ liệu thụ thể Neurokinin-1 có phải là mục tiêu dược lý phân tử của Capsaicin được chiết tách từ Hồ tiêu hay không, chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu sự tác động của Capsaicin lên thụ thể Neurokinin-1 trên tế bào Lympho và tế bào mang vectơ tái tổ hợp NK-1” Để đánh giá được hoạt tính dược học của Capsaicin là chất đối vận hoặc chủ vận của thụ thể neurokinin-1 bằng đánh giá sự thay đổi nồng độ Ca2+ trong tế bào, chúng tôi tiến hành các nội dung nghiên cứu sau: - Thiết lập quy trình tách chiết Capsaicin từ Hồ tiêu - Thiết lập quy trình đánh giá hoạt tính Capsaicin là đối vận hay chủ vận của NK1R bằng sự thay đổi Ca2+ trên dòng tế bào Lympho từ chuột và trên dòng tế bào mang vectơ chứa NK1R tái tổ hợp.

- Xác định các thông số động lực học phân tử (EC 50, IC50, Ki) của Capsaicin trên mô hình NK1R tự nhiên (tế bào lympho chuột) và tái tổ hợp (Tế bào CHO biểu hiện NK1R người). 3 CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN 1. Thụ thể kết cặp G-Protein (GPCR) 1. Thụ thể GPCR là gì? Các thụ thể kết cặp G-protein (G-protein coupled receptor, viết tắt là GPCR) là nhóm thụ thể xuyên màng sinh chất, hoạt động nhờ kết cặp với G- protein.

Đây là một trong các họ protein lớn và đa dạng nhất ở người [19, 21, 37]. Các GPCR ở người - hGPCR (trong báo cáo này được gọi tắt là GPCR) phân bố rộng, từ hệ thần kinh trung ương (CNS) cho đến hầu hết các mô, cơ quan của cơ thể, và đa dạng về trình tự axit amin cũng như chức năng, bao gồm từ các vai trò trong quá trình phát triển phôi đến hoạt động của các giác quan. Chẳng hạn ở người, cả thị giác và khứu giác đều phụ thuộc vào các GPCR. Các GPCR liên quan đến nhiều bệnh lý ở người, gồm cả các bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn (tiêu chảy, ho gà, …) hoặc vi khuẩn khác gây bệnh bằng cách tiết độc tố can thiệp vào hoạt động của các GPCR (ngộ độc thực phẩm) [7].

4 Ngoại bào Nội bào Hình 1. Cấu trúc chung của thụ thể liên kết 7 vùng xuyên màng Mặc dù rất đa dạng về trình tự axit amin và chức năng sinh lý, song các GPCR có cấu trúc rất giống nhau. Phần lớn các GPCR đều được cấu tạo từ một chuỗi polypeptit với cấu hình không gian gồm 7 chuỗi xoắn xuyên màng sinh chất, gọi tắt là miền TM (transmembrance, xem Hình 1. Sự giống nhau về cấu trúc của các GPCR cũng như các G-protein giữa các loài sinh vật khác nhau (từ nấm men đến người) cho thấy các thụ thể GPCR và các G-protein có vai trò sinh lý tế bào cực kỳ quan trọng và có lẽ chúng có nguồn gốc tiến hóa chung từ rất sớm [5, 6].

Chức năng GPCR biểu hiện như thế nào? Bước đầu tiên trong con đường truyền tin (signal transduction) của tế bào là sự đính kết (binding) của một phân tử tín hiệu (signal molecule) thường có tính đặc thù cao, gọi là phối tử đặc hiệu (specific ligand) vào thụ thể (receptor). Các dược chất và các phân tử nội sinh (như các hoocmôn, các chất dẫn truyền thần kinh) tác động qua các thụ thể trong phần lớn các trường hợp là chất chủ vận (agonist; là các chất sau khi đính kết với thụ thể gây nên đáp ứng tế bào) hoặc đôi khi là các chất đối kháng (antagonist, còn gọi là đối vận; 5 là các chất đính kết thụ thể song không gây đáp ứng tế bào). Các chất chủ vận sau khi đính kết thụ thể thường làm thay đổi cấu hình thụ thể theo cơ chế dị lập thể (allosteric) và theo một cách phổ biến chúng phá vỡ các liên kết ion giữa các chuỗi xoắn thứ 5 và thứ 6 của GPCR [7, 8], điều này dẫn đến hoạt hóa các G-protein. Tùy thuộc vào loại G-protein kết cặp với GPCR là Gs, Gi hay Gq, phức hệ “phối tử - thụ thể” sẽ hoạt hóa một hoặc một số con đường truyền tin hóa học tiếp theo trong tế bào (truyền tin nội bào) [9, 10].

Đối với nhiều loại GPCR, sự tiếp nhận tín hiệu sau đó bị ngắt quãng bởi hiện tượng nội nhập bào của GPCR do sự thúc đẩy của arrestin [11]. Có thể nói, quá trình truyền tin của GPCR có thể tóm lược qua ba giai đoạn chính: i) Tiếp nhận tín hiệu, bởi sự đính kết của phối tử vào thụ thể (hình thành phức hệ “phối tử-thụ thể”), ii) Truyền hóa nội bào, bởi sự nội nhập bào của GPCR, và iii) Phục hồi trạng thái ban đầu, được điều hòa bởi sự tương tác giữa các miền cấu trúc của GPCR với các protein nội bào [13, 18]. Thụ thể gắn cặp thay đổi hình dạng và bên Phối tử gắn trong tế bào G-Protein đƣợc kích thích cặp với GPCR dƣới tƣơng tác của thụ thể và G-protein GPCR G-Protein Các G-protein đã đƣợc kích hoạt tách rời GPCR và khởi động chuỗi phản ứng trao đổi chất bên trong tế bào. Các G-protein mới gắn cặp, và GPCR có thể kích thích hàng trăm G-protein G-Protein mới Hình 1.

Sự hoạt hóa G-Protein bởi GPCR 6 Tùy thuộc vào loại G-protein (Gs, Gi hay Gq) mà thụ thể GPCR bắt cặp, tín hiệu được truyền qua tế bào theo một trong hai con đường chính: 1) thông qua điều hòa lượng cAMP, hoặc 2) tăng nồng độ Ca 2+ nội bào bởi inositol- (1,4,5)-triphosphate (IP3) [8]. Phối tử (ligand)/ Nếu GPCR kết cặp với các G- Phân tử thuốc protein thuộc loại Gs hoặc Gi, (vd: NK1R) đáp ứng tế bào thường do sự thay đổi lượng cAMP nội bào; nếu G-protein thuộc loại Gq, đáp ứng tế bào thường do sự IP Ca2+ cAMP tăng tạm thời nồng độ của Ca2+. 3 Tiểu đơn vị α và γ có liên kết Hình 1. Con đường truyền tin qua GPCR, cộng hóa trị, do vậy bám dính cho phép đo biểu hiện chức năng thụ thể qua các chất truyền tin thứ hai (IP3, cAMP, Ca2+) và cố định G-protein vào mặt trong màng tế bào.

Sau khi tách ra khỏi G-Protein, tiểu đơn vị α sẽ hoạt hóa enzym Adenylate cyclase (AC). Theo nguyên lý đó, để đánh giá sự hoạt hóa và biểu hiện chức năng của các GPCR, người ta thường dùng các phép thử chức năng (functional bioassay) cho phép đo sự thay đổi hoặc về nồng độ cAMP (đối với các GPCR kết cặp với các Gi/Gs-protein) hoăc về nồng độ IP3/Ca 2+ (đối với các GPCR kết cặp Gq-protein) (xem Hình 1. Adenylate cyclase (AC) là một protein xuyên màng, vùng hướng về phía bào tương được gọi là vùng thủy phân. Enzym AC sẽ giúp chuyển ATP thành cAMP [7].

Lớp bao bọc tế bào được gọi là lớp màng tế bào. Đó là một lớp phospholipid kép. Lớp màng này cho phép tế bào duy trì một hỗn hợp nhất định các chất có vai trò hóa sinh, đồng thời ngăn ngừa các hóa chất không mong muốn ở bên ngoài môi trường có thể xâm nhập tế bào. Để có thể thực hiện đầy đủ chức năng của mình, các bộ máy sinh hóa bên trong tế bào cần 1 7 cơ chế cho phép nó có thể nhận được các thông điệp về môi trường bên ngoài tế bào [22].

Thụ thể liên kết G-Protein Thụ thể liên kết G-Protein (GPCRs) đóng vai trò quan trọng trong hệ thống truyền tin tế bào. Đó là các protein nằm trên màng tế bào, tên gọi thụ thể liên kết G-Protein là để nói đến cơ chế truyền tín hiệu phổ biến nhất thông qua thụ thể đó là các protein có thể liên kết với GTP ở bên trong tế bào [34, 38]. Phối tử Ngoại bào Màng tế bào Tế bào chất Hình 1. Cấu trúc thụ thể và sự bắt cặp với G-Protein Tín hiệu (signal) truyền từ thụ thể GPCR đến một protein nội bào được gọi là G-protein, do vậy nhóm thụ thể này còn được gọi là G- Protein Coupled Receptors (GPCR).