ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, xu hướng trên thế giới dùng thuốc từ dược liệu ngày càng tăng lên, việc nghiên cứu và phát triển thuốc từ dược liệu tạo thuận lợi để ngành công nghiệp Dược nước ta phát triển theo hướng hiện đại hóa các thuốc y học cổ truyền, thuốc có nguồn gốc dược liệu và tận dụng nguồn tài nguyên dược liệu. Nước ta có điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu, nguồn nước, địa hình đa dạng… dẫn đến nguồn tài nguyên thực vật được xếp vào loại phong phú, nhiều tiềm năng, trong đó, nhiều loài đã và đang được sử dụng làm thuốc. Luật Dược 2016 ra đời như một bước đột phá, bắt kịp xu thế phát triển của thế giới, đưa dược liệu thành lĩnh vực mũi nhọn cho sự phát triển của ngành dược hiện đại Việt Nam. Lan Kim tuyến (Anoectochilus sp.), hay còn gọi là Lan gấm, được biết đến như một loài dược liệu quý.
Bên cạnh kiểu dáng đẹp, một số nghiên cứu trên thế giới cũng cho thấy các loài Lan Kim tuyến có một số tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh trên động vật thí nghiệm như hoạt tính chống viêm [39], chống oxy hóa và bảo vệ gan [61], [67], [68], tác dụng chống khối u [55], tác dụng kích thích hệ miễn dịch [65] với hai hoạt chất chính là kinsenosid và polysaccharid. Do có nhiều tác dụng có lợi cho sức khỏe, những năm gần đây, Lan Kim tuyến mọc tự nhiên đã bị khai thác quá mức làm suy giảm nghiêm trọng phạm vi phân bố của loài. Đến năm 2008, Sách đỏ Việt Nam 2007 được xuất bản và xếp Lan Kim tuyến vào nhóm IA thực vật rừng đang nguy cấp (Theo Điều 9, nghị định 32/2006/NĐ-CP, loài thực vật này chỉ được phép chế biến, kinh doanh vì mục đích thương mại khi có nguồn gốc trồng cấy nhân tạo; không được khai thác vì mục đích thương mại nếu mẫu vật mọc hoang dại trong tự nhiên). Để góp phần bảo tồn và phát triển loài này, cũng như tạo nguồn nguyên liệu nuôi trồng cho việc làm thuốc (không sử dụng cây mọc trong tự nhiên), nhiều dự án nuôi trồng Lan Kim tuyến đã được đầu tư từ ngân sách Nhà Nước.
Điển hình là: Dự án “Nghiên cứu khai thác và phát triển nguồn gen dược liệu Lan Gấm (Anoectochilus formosanus Hayata) tại Thanh Hóa và một số tỉnh Bắc Trung Bộ” được phê duyệt thực hiện với kinh phí 5,5 tỷ đồng theo Quyết định số 4317/QĐ-. Đề tài nghiên cứu cấp thành phố (do Sở KHCN TPHCM cấp kinh phí) “Xây dựng quy trình sản xuất sinh khối cây lan gấm (Anoectochilus formosanus) sử dụng hợp chất hữu cơ bằng kỹ thuật bioreactor” (Thời gian thực hiện từ tháng 1/2017). Đề tài nghiên cứu khoa học cấp tỉnh Đắk Nông “Ứng dụng công nghệ sinh học nhân giống và sản xuất cây Lan Gấm (Anoectochilus roxburghii) tại tỉnh Đắk Nông” (nghiệm thu tháng 3/2017) Đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu nhân giống và trồng thử nghiệm cây Kim Tuyến (Anoectochilus sp.)” do Sở KHCN tỉnh Kon Tum cấp kinh phí (thực hiện trong năm 2017) Có thể thấy rằng việc phát triển công nghệ nuôi trồng sinh khối loài Lan Kim tuyến để đưa vào khai thác phục vụ nhu cầu điều trị, hỗ trợ điều trị, bảo vệ và tăng cường sức khỏe cho người dân đang là nhiệm vụ khoa học được ưu tiên. Dù đã có các tài liệu nghiên cứu công bố thành phần hóa học chính và tác dụng dược lý trên động vật thử nghiệm của các loại cao chiết từ Lan Kim tuyến, nhưng cho đến nay chưa có nghiên cứu nào ở Việt Nam được thực hiện để xây dựng quy trình chiết xuất và hướng đến sản xuất chế phẩm từ cao chiết Lan Kim tuyến.
Do đó, đề tài “Nghiên cứu xây dựng và tối ưu hóa quy trình chiết xuất dược liệu Lan kim tuyến (Anoectochilus formosanus Hayata).” được thực hiện với những nội dung cụ thể như sau: Xây dựng quy trình định lượng hợp chất chính trong Lan kim tuyến. Xây dựng và tối ưu hóa quy trình chiết xuất cao chuẩn hóa từ toàn cây Lan kim tuyến. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dành cho cao chuẩn hóa. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.
TỔNG QUAN VỀ DƯỢC LIỆU LAN KIM TUYẾN 1. Tổng quan thực vật học 1. Vị trí phân loại loài Anoectochilus formosanus Lan kim tuyến có tên khoa học là Anoectochilus formosanus Theo hệ thống phân loại thực vật Takhtajan (2009) và dữ liệu thực vật của Bộ Nông nghiệp Hoa Kì (USDA), vị trí phân loại của cây Lan kim tuyến (Anoectochilus sp.) như sau [52], [56]: Giới: Plantae (Thực vật) Bộ: Asparagales (Bộ Măng tây) Họ: Orchidaceae (Họ Lan) Chi: Anoectochilus Loài: Anoectochilus formosanus 1. Đặc điểm chi Anoectochilus Theo thống kê của The Plant List chi Anoectochilus có 43 loài được chấp nhận [54], trong đó có 2 loài đang ở mức sắp nguy cấp và nguy cấp (The IUCN Red List of Threatened Species) [41].
Các loài thuộc chi Anoectochilus STT Tên loài Loài không thuộc danh sách IUCN 1 Anoectochilus albolineatus E. 2 Anoectochilus albomarginatus Loudon 3 Anoectochilus annamensis Aver.Lang) Ormerod 5 Anoectochilus brevilabris Lindl. 6 Anoectochilus burmannicus Rolfe 7 Anoectochilus calcareus Aver. 8 Anoectochilus chapaensis Gagnep.
9 Anoectochilus dewildeorum Ormerod .4 STT Tên loài Loài không thuộc danh sách IUCN 10 Anoectochilus elatus Lindl.Lang 12 Anoectochilus falconis Ormerod 13 Anoectochilus flavescens Blume 14 Anoectochilus formosanus Hayata 15 Anoectochilus geniculatus Ridl. 16 Anoectochilus grandiflorus Lindl.Li 18 Anoectochilus imitans Schltr. 19 Anoectochilus insignis Schltr. 20 Anoectochilus integrilabris Carr 21 Anoectochilus kinabaluensis (Rolfe) J.Wood & Ormerod 22 Anoectochilus klabatensis (Schltr.
& de Vogel 23 Anoectochilus koshunensis Hayata 24 Anoectochilus longicalcaratus J. 25 Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie 26 Anoectochilus malipoensis W.Shui 27 Anoectochilus monicae J.Wood 28 Anoectochilus narasimhanii Sumathi & al. 30 Anoectochilus papillosus Aver. 31 Anoectochilus papuanus (Schltr.
32 Anoectochilus pectinatus (Hook.Lang 34 Anoectochilus reinwardtii Blume 35 Anoectochilus rhombilabius Ormerod 36 Anoectochilus roxburghii (Wall. 37 Anoectochilus setaceus Blume 38 Anoectochilus subregularis (Rchb.5 STT Tên loài Loài không thuộc danh sách IUCN 39 Anoectochilus sumatranus (J.Comber 40 Anoectochilus xingrenensis Z.Jin 41 Anoectochilus yatesiae F.Bailey Loài sắp nguy cấp 42 Anoectochilus sandvicensis Lindl Loài nguy cấp 43 Anoectochilus zhejiangensis Z.Chang Đã có nhiều nghiên cứu nuôi cấy mô các loài có giá trị kinh tế cao của chi Anoectochilus, trong đó hai loài thường được nuôi cấy là Anoectochilus formosanus và Anoectochilus roxburghii, tuy nhiên hai loài này có đặc điểm hình thái rất giống nhau [3], [4], [5]. Nghiên cứu này sử dụng loài Anoectochilus formosanus được nuôi cấy ở Viện Sinh học nhiệt đới làm nguồn nguyên liệu. Huỳnh Hữu Đức và cộng sự (2019) đã sử dụng vùng gen ITS1 và ITS2 trong DNA ribosome để phân biệt các loài thuộc chi Anoectochilus tại Việt Nam.
Khi dựa trên trình tự DNA vùng gen ITS1 để phân tích cho thấy giữa các loài thuộc chi Anoectochilus chỉ có hai vị trí khác biệt điều này cho thấy việc xác định các loài khác nhau thuộc chi này gặp nhiều khó khăn khi chỉ dựa trên trình tự này. Tuy nhiên, khi phân tích các loài thuộc chi Anoectochilus dựa trên trình tự DNA vùng gen ITS2 cho thấy vị trí biến đổi cao hơn là 20 vị trí. Và đối với hai loài thuộc chi Lusidia có 5 vị trí khác biệt. Điều này cũng cho thấy đặc điểm hình thái có thể tương tự nhau nhưng khi xét về di truyền phân tử thì có sự khác nhau.
Kết quả này chứng tỏ có thể sử dụng vùng gen ITS1 và ITS2 để đánh giá mối quan hệ di truyền và xác định hai loài trong chi Anoectochilus là Anoectochilus roxburhii và Anoectochilus formosanus [2]. Phân bố và sinh thái Mùa hoa tháng 2 - 4. Tái sinh bằng chồi từ thân rễ và hạt, ít và sinh trưởng rất chậm. Mọc dưới tán rừng nguyên sinh, hầu hết là rừng nhiệt đới ẩm lá rộng .6 thường xanh trên sườn núi đá granit, riôlit, phiến sét, ở độ cao 500 - 1600 m, rải rác thành từng nhóm vài ba cây trên đất ẩm, rất giàu mùn và lá cây rụng.
Phân bố trong nước: Lào Cai (Sapa: Phăng Xi Păng, Văn Bàn: Liêm Phú), Hà Tĩnh (Hương Sơn: Rào Àn), Quảng Trị, Kontum (Đắk Glei: núi Ngọc Linh, Sa Thầy: núi Chư Mom Ray), Đắk Lắk (Krông Bông: núi Chư Yang Sinh), Lâm Đồng (Lạc Dương: núi Bì Đúp). Phân bố trên thế giới: Ấn Độ, Nepal, Bhutan, Trung Quốc, Myanmar, Thái Lan, Lào, Campuchia, Malaysia, Indonesia [6]. Mẫu dược liệu Lan kim tuyến Cây thảo, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài; thân trên đất mọng nước và có nhiều lông mềm, mang 2 - 4 lá mọc xòe sát đất. Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, chóp hơi nhọn và có mũi ngắn, cỡ 3 - 4 x 2 - 3 cm, có màu khác nhau với mạng gân thường nhạt hơn (màu lục sẫm với mạng gân màu lục nhạt hay màu nâu - đỏ với mạng gân màu vàng - lục hay hồng); cuống lá dài 2 - 3 cm.
Cụm hoa dài 10 - 15 cm, mang 4 - 10 hoa mọc thưa. Lá bắc hình trứng, chóp thót nhọn đột ngột, dài 8 - .7 10 mm, màu hồng. Hoa thường màu trắng, dài 2,5 - 3 cm; các mảnh bao hoa dài khoảng 6 mm; môi dài đến 1,5 cm, ở mỗi bên gốc mang 6 - 8 dải hẹp, chóp phiến rộng, chẻ hai sâu, hốc chứa mật dài 7 mm, bầu dài 1,3 cm, màu lục, có nhiều lông mềm [6]. Tổng quan thành phần hóa học 1.
Flavonoid và flavonoid glycosid Flavonoid là chất chuyển hóa thứ cấp phổ biến trong thực vật với công dụng chủ yếu là dọn dẹp gốc tự do và chống oxy hóa. Các flavonoid có hàm lượng lớn trong Lan kim tuyến và có thể được dùng để kiểm định chất lượng Lan kim tuyến là quercetin, kaemferol và isorhamnetin [30], [34]. Trong phân đoạn etyl acetat và n-butanol của dịch chiết cồn toàn cây Lan kim tuyến, các nhà khoa học đã phân lập được 8 flavonoid glycosid bao gồm quercetin‐7‐O‐β‐D‐[6”‐O‐ (trans‐feruloyl)]‐ glucopyranosid, 8‐C‐p‐Hydroxy- benzylquercetin, isorhamnetin‐7‐ O‐β‐D‐ glucopyranosid, isorhamnetin‐3‐O‐β‐D‐ glucopyranosid, kaempferol‐3‐O‐β‐D‐gluco-pyranosid, kaempferol‐7 ‐ O ‐ β ‐ D‐ glucopyranosid, 5 ‐ hydroxy ‐3′, 4′, 7‐ trimethoxyflavonol ‐3‐O‐β‐D‐rutinosid và isorhamnetin‐3‐O‐β‐D‐rutinosid [13]. Các glycosid khác Glycosid là các hợp chất có tác dụng sinh học chính trong Lan kim tuyến.
Kinsenosid, một hợp chất glycosid được phân lập từ Anoectochilus sp., có tác dụng bảo vệ mạch máu trong điều kiện glucose huyết cao. Ngoài ra, kinsenosid có thể hạ glucose và cholesterol hiệu quả và đã được thử nghiệm khả năng chống oxy hóa, hạ glucose và cholesterol ở chuột bị tiểu đường gây ra bởi streptozotocin [44]. Hơn nữa, kinsenosid còn có tác dụng hạ lipid máu [17], chống độc gan và gan thuộc tính bảo vệ tế bào [62]. Các glycosid đã được phân lập ở Lan kim tuyến bao gồm kinsenosid, kinsendiosid A, kinsendiosid B, daucosterol, 3-O-β-D-glucosid-(S)-3- hydroxyl-γ-butyrolactone, este metyl 4-β-D-glucopyranosyloxy-butyric và 4 - (β - D-glucopyranosyloxy) benzyl (gastrodin) [48], [49].
Polysaccharid Polysaccharid cũng là một nhóm có hoạt tính của Lan kim tuyến. Các nhà khoa học đã ghi nhận polysaccharid toàn phần trong dịch chiết nước với hàm lượng 3,5% so với trọng lượng khô của toàn cây Lan kim tuyến Anoectochilus roxburghi.