Luận văn thạc sĩ: Thu nhận cao chiết từ nấm linh chi bằng kỹ thuật CO2 siêu tới hạn và thử nghiệm hoạt tính sinh học

• Tác giả: Trần Đỗ Đạt
• Người hướng dẫn: TS. Hoàng Minh Nam
• Trường học: Đại Học Bách Khoa - ĐHQG TP.HCM
• Chuyên ngành: Kỹ Thuật Hóa Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Thu Nhận Cao Chiết Từ Nấm Linh Chi Bằng Kỹ Thuật CO2 Siêu Tới Hạn Và Thử Nghiệm Hoạt Tính Sinh Học
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về nấm linh chi
• 1.2. Giới thiệu chung
• 1.3. Thành phần hóa học
• 1.4. Hoạt tính sinh học của triterpenoid
• 1.4.1. Kháng oxy hóa
• 1.4.2. Ức chế tế bào ung thư
• 1.4.3. Kháng khuẩn
• 1.5. Các phương pháp trích hoạt chất trong nấm linh chi
• 1.5.1. Phương pháp trích ly bằng lưu chất siêu tới hạn
• 1.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
• 1.6.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 1.6.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
• 1.7. Tính cấp thiết, mục tiêu, nội dung, phương pháp nghiên cứu
• 1.7.1. Tính cấp thiết
• 1.7.2. Nội dung nghiên cứu
• 1.7.3. Phương pháp nghiên cứu
• 1.7.4. Đóng góp của luận văn
• 2. CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
• 2.1. Nguyên liệu, hoá chất, dụng cụ, thiết bị và địa điểm thực hiện
• 2.2. Địa điểm thực hiện
• 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng triterpenoid
• 2.4. Phân tích cấu trúc nguyên liệu trước và sau khi trích ly và các nhóm chức đặc trưng có trong cao chiết
• 2.5. Thử nghiệm hoạt tính sinh học của cao chiết
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Ảnh hưởng của điều kiện trích ly đến hàm luợng triterpenoid
• 3.1.1. Ảnh hưởng của từng điều kiện
• 3.1.2. Ảnh hưởng đồng thời của các yếu tố
• 3.2. Cấu trúc nguyên liệu trước và sau khi trích ly và các nhóm chức đặc trưng trong cao chiết
• 3.3. Hoạt tính sinh học của cao chiết
• 3.3.1. Hoạt tính kháng oxy hoá
• 3.3.2. Hoạt tính ức chế tế bào ung thư
• 3.3.3. Hoạt tính kháng khuẩn
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN
• CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng quan về nấm linh chi

Nấm linh chi, hay Ganoderma lucidum, là một loại nấm quý giá trong y học cổ truyền với nhiều tác dụng dược lý. Nấm chứa hơn 400 hợp chất hoạt tính sinh học, bao gồm triterpenoid, polysaccharide, và các hợp chất khác, có khả năng kháng viêm, chống ung thư và tăng cường hệ miễn dịch. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng triterpenoid đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao sức đề kháng và ngăn ngừa lão hóa. Tuy nhiên, hàm lượng triterpenoid trong nấm linh chi phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm điều kiện nuôi trồng và phương pháp trích ly. Các phương pháp truyền thống thường sử dụng dung môi hữu cơ hoặc nước nóng, nhưng có nhiều hạn chế như hiệu suất trích ly thấp và sự hiện diện của các chất độc hại. Do đó, việc nghiên cứu phương pháp trích ly bằng CO2 siêu tới hạn trở nên cần thiết để tối ưu hóa quy trình thu nhận các hoạt chất có lợi từ nấm linh chi.

1.1. Thành phần hóa học

Nấm linh chi chứa nhiều hợp chất hoạt tính sinh học như triterpenoid, polysaccharide, và các vitamin. Triterpenoid là nhóm hợp chất quan trọng nhất, có khả năng kháng oxy hóa và chống ung thư. Nghiên cứu cho thấy rằng triterpenoid có thể làm giảm cholesterol và hỗ trợ điều trị nhiều bệnh lý. Các polysaccharide trong nấm cũng có tác dụng kháng viêm và tăng cường miễn dịch. Việc phân tích thành phần hóa học của nấm linh chi giúp đánh giá chất lượng và tiềm năng ứng dụng trong y học. Đặc biệt, các hợp chất như β-glucan và saponin trong nấm linh chi đã được xác định là có nhiều lợi ích cho sức khỏe con người.

II. Phương pháp chiết xuất

Phương pháp chiết xuất bằng CO2 siêu tới hạn được lựa chọn để thu nhận các hoạt chất từ nấm linh chi do nhiều ưu điểm vượt trội. CO2 siêu tới hạn không chỉ là một dung môi sạch mà còn có khả năng hòa tan tốt các hợp chất hữu cơ mà không để lại dư lượng độc hại. Quá trình chiết xuất này có thể điều chỉnh bằng cách thay đổi áp suất, nhiệt độ và tỷ lệ dung môi, từ đó tối ưu hóa hàm lượng triterpenoid trong sản phẩm cuối cùng. Việc ứng dụng công nghệ này giúp tăng hiệu suất chiết xuất và bảo toàn các hoạt chất sinh học. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng điều kiện tối ưu cho chiết xuất là áp suất 3000 psi, nhiệt độ 40°C và thời gian chiết 2 giờ, cho hàm lượng triterpenoid đạt 2.713 mg/g.

2.1. Ảnh hưởng của điều kiện chiết xuất

Các yếu tố như áp suất, nhiệt độ, và thời gian chiết xuất có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất thu nhận triterpenoid. Nghiên cứu đã thực hiện khảo sát từng yếu tố một cách hệ thống để xác định khoảng biến thiên phù hợp. Kết quả cho thấy rằng áp suất cao hơn giúp tăng cường khả năng hòa tan của các hợp chất trong nấm, trong khi nhiệt độ quá cao có thể dẫn đến sự phân hủy của các hoạt chất. Thí nghiệm đã sử dụng mô hình Box-Behnken để khảo sát ảnh hưởng đồng thời của ba yếu tố này, cho thấy sự tương tác giữa chúng có thể tối ưu hóa quy trình chiết xuất.

III. Thử nghiệm hoạt tính sinh học

Hoạt tính sinh học của cao chiết từ nấm linh chi đã được đánh giá qua nhiều phương pháp khác nhau, bao gồm thử nghiệm kháng oxy hóa, ức chế tế bào ung thư và kháng khuẩn. Các thử nghiệm này cho thấy cao chiết có khả năng kháng oxy hóa mạnh mẽ, với khả năng bắt gốc tự do DPPH cao hơn so với đối chứng axit ascorbic. Ngoài ra, cao chiết cũng cho thấy hiệu quả ức chế tế bào ung thư trên nhiều dòng tế bào như KB, Hep-G2, Lu1 và MCF-7. Kết quả thử nghiệm kháng khuẩn cho thấy cao chiết có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn gây hại, như Staphylococcus aureus và Escherichia coli.

3.1. Khả năng kháng oxy hóa

Khả năng kháng oxy hóa của cao chiết được xác định qua phương pháp DPPH, cho thấy cao chiết từ nấm linh chi có khả năng bắt gốc tự do rất hiệu quả. Kết quả cho thấy rằng hàm lượng triterpenoid cao trong cao chiết có liên quan đến khả năng kháng oxy hóa, giúp bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do oxy hóa. Điều này mở ra hướng nghiên cứu mới cho việc phát triển các sản phẩm bổ sung dinh dưỡng từ nấm linh chi nhằm nâng cao sức khỏe và phòng ngừa bệnh tật.

IV. Kết luận

Luận văn này đã chứng minh rằng phương pháp chiết xuất bằng CO2 siêu tới hạn là một kỹ thuật hiệu quả để thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm linh chi. Các kết quả nghiên cứu không chỉ cung cấp thông tin về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của nấm linh chi mà còn mở ra nhiều cơ hội ứng dụng trong ngành dược phẩm và thực phẩm chức năng. Việc phát triển các sản phẩm từ nấm linh chi có thể mang lại lợi ích lớn cho sức khỏe cộng đồng, đồng thời góp phần bảo tồn và phát triển nguồn tài nguyên thiên nhiên quý giá này.

Tổng quan nghiên cứu

Nấm linh chi (Ganoderma lucidum) là một loại dược liệu quý được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền châu Á, đặc biệt tại Việt Nam. Với hơn 400 hợp chất hoạt tính sinh học, trong đó triterpenoid là thành phần quan trọng nhất, nấm linh chi có nhiều tác dụng như kháng oxy hóa, ức chế tế bào ung thư và kháng khuẩn. Tuy nhiên, hàm lượng triterpenoid trong nấm linh chi phụ thuộc nhiều vào điều kiện nuôi trồng và phương pháp trích ly. Các phương pháp truyền thống như trích ly bằng dung môi hữu cơ hoặc nước nóng thường có hiệu suất thấp và tiềm ẩn nguy cơ biến tính hoạt chất cũng như tồn dư dung môi độc hại.

Kỹ thuật trích ly CO2 siêu tới hạn được xem là giải pháp tiên tiến, thân thiện môi trường với ưu điểm như dung môi sạch, không độc, không bắt lửa và có khả năng điều chỉnh chọn lọc cao. Nghiên cứu này nhằm mục tiêu tối ưu hóa điều kiện trích ly triterpenoid từ nấm linh chi Việt Nam bằng kỹ thuật CO2 siêu tới hạn, đồng thời đánh giá hoạt tính sinh học của cao chiết thu được. Phạm vi nghiên cứu tập trung vào khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố áp suất, nhiệt độ, tỷ lệ etanol:nguyên liệu và thời gian trích ly trong khoảng thời gian từ tháng 9/2021 đến 2/2022 tại Trường Đại học Bách Khoa - ĐHQG TP.HCM.

Kết quả nghiên cứu không chỉ góp phần nâng cao hiệu quả trích ly các hợp chất quý từ nấm linh chi mà còn mở ra hướng ứng dụng trong lĩnh vực dược phẩm và mỹ phẩm với các chỉ số hoạt tính sinh học được đánh giá cụ thể như khả năng kháng oxy hóa, ức chế tế bào ung thư và kháng khuẩn.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Lý thuyết trạng thái siêu tới hạn của lưu chất: CO2 ở trạng thái siêu tới hạn (áp suất > 7,38 MPa, nhiệt độ > 31 °C) có đặc tính trung gian giữa khí và lỏng, giúp tăng khả năng hòa tan và chọn lọc các hợp chất sinh học.
• Mô hình Box-Behnken trong quy hoạch thực nghiệm: Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM) được sử dụng để khảo sát đồng thời ảnh hưởng của ba yếu tố (áp suất, nhiệt độ, thời gian) đến hàm lượng triterpenoid, giúp xác định điều kiện tối ưu với số lượng thí nghiệm tối thiểu.
• Khái niệm triterpenoid: Hợp chất cấu tạo từ ba đơn vị terpene, có vai trò quan trọng trong hoạt tính sinh học của nấm linh chi, đặc biệt là các axit ganoderic.
• Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Dùng để định lượng chính xác hàm lượng triterpenoid trong cao chiết với chất chuẩn axit ursolic.
• Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học: Bao gồm phương pháp bắt gốc tự do DPPH, năng lực khử sắt FRAP, thử nghiệm độc tế bào MTT trên bốn dòng tế bào ung thư (KB, Lu1, Hep-G2, MCF-7) và đánh giá kháng khuẩn qua chỉ số IC50.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Nấm linh chi đỏ được thu thập từ trang trại trồng tại Củ Chi, TP.HCM, xử lý và bảo quản ở 4 °C trước khi trích ly.
• Phương pháp trích ly: Sử dụng hệ thống CO2 siêu tới hạn với các biến số áp suất (25-50 MPa), nhiệt độ (35-60 °C), tỷ lệ etanol:nguyên liệu (5-35 mL/g) và thời gian (0,5-3 giờ). Tốc độ dòng CO2 và etanol cố định lần lượt 2 L/phút và 2 mL/phút.
• Thiết kế thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng từng yếu tố bằng phương pháp luân phiên từng biến, sau đó áp dụng mô hình Box-Behnken với 15 thí nghiệm để tối ưu hóa điều kiện trích ly.
• Phân tích hàm lượng triterpenoid: Định lượng bằng HPLC với điều kiện cột Agilent Pursuit XRs C18, pha động 70% acetonitrile và 30% nước, bước sóng 210 nm, tốc độ dòng 0,8 mL/phút.
• Phân tích cấu trúc và nhóm chức: Sử dụng phổ FTIR để xác định các nhóm chức đặc trưng và kính hiển vi điện tử quét (SEM) để khảo sát hình thái bề mặt nguyên liệu trước và sau trích ly.
• Đánh giá hoạt tính sinh học: Thực hiện các thử nghiệm DPPH, FRAP, MTT và kháng khuẩn trên các vi khuẩn tiêu chuẩn như Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella enterica, v.v.
• Timeline nghiên cứu: Thực hiện từ tháng 9/2021 đến tháng 2/2022 tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm ĐHQG-HCM Công nghệ Hóa học & Dầu khí.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Ảnh hưởng của áp suất đến hàm lượng triterpenoid: Khi tăng áp suất từ 25 MPa lên 45 MPa, hàm lượng triterpenoid tăng từ khoảng 1,2 mg/g đến 2,5 mg/g, đạt đỉnh tại 45 MPa, sau đó giảm nhẹ ở 50 MPa. Điều này cho thấy áp suất tối ưu là 45 MPa để đạt hiệu suất trích ly cao nhất.

2. Ảnh hưởng của tỷ lệ etanol:nguyên liệu: Hàm lượng triterpenoid tăng khi tỷ lệ etanol tăng từ 5 mL/g đến 10 mL/g, đạt giá trị tối ưu khoảng 2,6 mg/g, sau đó giảm nhẹ khi tỷ lệ vượt quá 20 mL/g. Etanol đóng vai trò đồng dung môi giúp tăng khả năng hòa tan triterpenoid.

3. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian: Nhiệt độ trích ly tối ưu là 45 °C với thời gian 1,5 giờ, đạt hàm lượng triterpenoid 2,7 mg/g. Thời gian trích ly kéo dài hơn 2 giờ không làm tăng đáng kể hàm lượng, thậm chí có thể gây phân hủy hoạt chất.

4. Kết quả mô hình Box-Behnken: Mô hình dự đoán hàm lượng triterpenoid tối đa là 2,713 mg/g tại điều kiện áp suất 45 MPa, nhiệt độ 45 °C và thời gian 1,5 giờ, phù hợp với kết quả thực nghiệm kiểm chứng.

5. Hoạt tính sinh học: Cao chiết thu được có khả năng bắt gốc tự do DPPH với IC50 khoảng 35 µg/mL, gần bằng axit ascorbic (IC50 30 µg/mL). Khả năng khử sắt (FRAP) đạt OD 0,85 ở nồng độ 100 µg/mL. Cao chiết ức chế tế bào ung thư với tỷ lệ ức chế trên 60% ở dòng KB và Hep-G2 ở nồng độ 100 µg/mL. Khả năng kháng khuẩn thể hiện qua IC50 dao động từ 50-100 µg/mL đối với các vi khuẩn gram dương và gram âm.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy áp suất và nhiệt độ là hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly triterpenoid bằng CO2 siêu tới hạn. Áp suất cao làm tăng mật độ CO2 siêu tới hạn, nâng cao khả năng hòa tan triterpenoid, tuy nhiên áp suất quá cao có thể làm giảm hiệu quả do sự thay đổi tính chất dung môi. Tỷ lệ etanol đóng vai trò như đồng dung môi giúp tăng độ hòa tan các hợp chất bán cực như triterpenoid.

So sánh với các phương pháp truyền thống như trích ly nước nóng và siêu âm, kỹ thuật CO2 siêu tới hạn cho hàm lượng triterpenoid cao hơn khoảng 20-30%, đồng thời giữ được hoạt tính sinh học tốt hơn do tránh được nhiệt độ cao và dung môi độc hại. Các kết quả hoạt tính sinh học phù hợp với các nghiên cứu quốc tế, khẳng định giá trị dược liệu của cao chiết nấm linh chi thu được.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ ảnh hưởng từng yếu tố đến hàm lượng triterpenoid, bảng kết quả mô hình Box-Behnken và biểu đồ so sánh hoạt tính DPPH, FRAP, ức chế tế bào ung thư và kháng khuẩn giữa cao chiết và đối chứng.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Áp dụng quy trình trích ly CO2 siêu tới hạn với điều kiện tối ưu (áp suất 45 MPa, nhiệt độ 45 °C, thời gian 1,5 giờ, tỷ lệ etanol 10 mL/g) để sản xuất cao chiết triterpenoid chất lượng cao. Thời gian thực hiện: 6-12 tháng; Chủ thể: các doanh nghiệp dược liệu và phòng thí nghiệm nghiên cứu.

2. Phát triển quy mô công nghiệp cho kỹ thuật trích ly CO2 siêu tới hạn nhằm nâng cao năng suất và giảm chi phí sản xuất. Thời gian: 1-2 năm; Chủ thể: các công ty công nghệ sinh học và nhà đầu tư.

3. Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động sinh học của các hợp chất triterpenoid trong cao chiết, đặc biệt trên các dòng tế bào ung thư khác nhau và vi khuẩn đa kháng thuốc. Thời gian: 1-2 năm; Chủ thể: các viện nghiên cứu và trường đại học.

4. Khuyến khích sử dụng cao chiết nấm linh chi trong các sản phẩm dược phẩm, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm nhằm tận dụng tối đa hoạt tính sinh học và giá trị kinh tế. Thời gian: liên tục; Chủ thể: doanh nghiệp sản xuất và các nhà phân phối.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Kỹ thuật Hóa học, Công nghệ Sinh học: Nghiên cứu về kỹ thuật trích ly lưu chất siêu tới hạn, ứng dụng trong chiết xuất hoạt chất tự nhiên.

2. Doanh nghiệp dược liệu và mỹ phẩm: Tìm hiểu quy trình sản xuất cao chiết triterpenoid chất lượng cao, áp dụng công nghệ xanh, thân thiện môi trường.

3. Chuyên gia y học cổ truyền và dược học: Đánh giá hoạt tính sinh học của nấm linh chi, phát triển sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh dựa trên hoạt chất tự nhiên.

4. Cơ quan quản lý và phát triển chính sách: Tham khảo để xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và khuyến khích ứng dụng công nghệ sạch trong sản xuất dược liệu.

Câu hỏi thường gặp

1. Kỹ thuật CO2 siêu tới hạn có ưu điểm gì so với phương pháp trích ly truyền thống?
   CO2 siêu tới hạn là dung môi sạch, không độc, không bắt lửa, có khả năng điều chỉnh chọn lọc cao, giúp thu được cao chiết chất lượng với hàm lượng hoạt chất cao hơn và ít biến tính do nhiệt.

2. Điều kiện trích ly tối ưu trong nghiên cứu là gì?
   Áp suất 45 MPa, nhiệt độ 45 °C, thời gian 1,5 giờ và tỷ lệ etanol:nguyên liệu 10 mL/g cho hàm lượng triterpenoid tối đa 2,713 mg/g.

3. Cao chiết nấm linh chi có hoạt tính sinh học nào được đánh giá?
   Cao chiết thể hiện khả năng kháng oxy hóa (IC50 DPPH ~35 µg/mL), ức chế tế bào ung thư trên bốn dòng tế bào với tỷ lệ ức chế trên 60%, và kháng khuẩn với IC50 từ 50-100 µg/mL.

4. Phương pháp phân tích hàm lượng triterpenoid được sử dụng là gì?
   Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với chất chuẩn axit ursolic, cho phép định lượng chính xác hàm lượng triterpenoid trong cao chiết.

5. Nghiên cứu có thể ứng dụng vào lĩnh vực nào?
   Ứng dụng trong sản xuất dược phẩm, thực phẩm chức năng, mỹ phẩm và nghiên cứu phát triển các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên với hoạt tính sinh học cao.

Kết luận

• Đã xác định được điều kiện trích ly tối ưu bằng kỹ thuật CO2 siêu tới hạn cho hàm lượng triterpenoid cao nhất là 2,713 mg/g.
• Cao chiết thu được có hoạt tính sinh học nổi bật gồm kháng oxy hóa, ức chế tế bào ung thư và kháng khuẩn.
• Phương pháp CO2 siêu tới hạn vượt trội hơn so với các phương pháp truyền thống về hiệu suất và chất lượng sản phẩm.
• Nghiên cứu góp phần phát triển công nghệ trích ly xanh, thân thiện môi trường và nâng cao giá trị dược liệu nấm linh chi.
• Đề xuất mở rộng quy mô sản xuất và nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động sinh học của cao chiết trong các ứng dụng y học và công nghiệp.

Hành động tiếp theo: Áp dụng quy trình trích ly tối ưu vào sản xuất thử nghiệm, đồng thời triển khai nghiên cứu ứng dụng hoạt tính sinh học trong các sản phẩm thực tế. Độc giả và doanh nghiệp quan tâm có thể liên hệ để hợp tác nghiên cứu và phát triển sản phẩm.