Luận văn thạc sĩ kỹ thuật hóa học nghiên cứu thu nhận cao chiết từ nấm linh chi bằng kỹ thuật co2 siêu tới hạn và thử nghiệm hoạt tính sinh học

Nghiên cứu thu nhận cao chiết từ nấm linh chi bằng CO2 siêu tới hạn và thử nghiệm hoạt tính sinh học trong luận văn thạc sĩ kỹ thuật hóa học.

• Tác giả: Trần Đỗ Đạt
• Người hướng dẫn: TS. Hoàng Minh Nam
• Trường học: Đại Học Bách Khoa - ĐHQG TP.HCM
• Chuyên ngành: Kỹ Thuật Hóa Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Thu Nhận Cao Chiết Từ Nấm Linh Chi Bằng Kỹ Thuật CO2 Siêu Tới Hạn Và Thử Nghiệm Hoạt Tính Sinh Học
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về nấm linh chi
• 1.2. Giới thiệu chung
• 1.3. Thành phần hóa học
• 1.4. Hoạt tính sinh học của triterpenoid
• 1.4.1. Kháng oxy hóa
• 1.4.2. Ức chế tế bào ung thư
• 1.4.3. Kháng khuẩn
• 1.5. Các phương pháp trích hoạt chất trong nấm linh chi
• 1.5.1. Phương pháp trích ly bằng lưu chất siêu tới hạn
• 1.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
• 1.6.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 1.6.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
• 1.7. Tính cấp thiết, mục tiêu, nội dung, phương pháp nghiên cứu
• 1.7.1. Tính cấp thiết
• 1.7.2. Nội dung nghiên cứu
• 1.7.3. Phương pháp nghiên cứu
• 1.7.4. Đóng góp của luận văn
• 2. CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
• 2.1. Nguyên liệu, hoá chất, dụng cụ, thiết bị và địa điểm thực hiện
• 2.2. Địa điểm thực hiện
• 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng triterpenoid
• 2.4. Phân tích cấu trúc nguyên liệu trước và sau khi trích ly và các nhóm chức đặc trưng có trong cao chiết
• 2.5. Thử nghiệm hoạt tính sinh học của cao chiết
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Ảnh hưởng của điều kiện trích ly đến hàm luợng triterpenoid
• 3.1.1. Ảnh hưởng của từng điều kiện
• 3.1.2. Ảnh hưởng đồng thời của các yếu tố
• 3.2. Cấu trúc nguyên liệu trước và sau khi trích ly và các nhóm chức đặc trưng trong cao chiết
• 3.3. Hoạt tính sinh học của cao chiết
• 3.3.1. Hoạt tính kháng oxy hoá
• 3.3.2. Hoạt tính ức chế tế bào ung thư
• 3.3.3. Hoạt tính kháng khuẩn
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN
• CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nấm linh chi

Nấm linh chi, hay Ganoderma lucidum, là một loại nấm quý giá trong y học cổ truyền với nhiều tác dụng dược lý. Nấm chứa hơn 400 hợp chất hoạt tính sinh học, bao gồm triterpenoid, polysaccharide, và các hợp chất khác, có khả năng kháng viêm, chống ung thư và tăng cường hệ miễn dịch. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng triterpenoid đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao sức đề kháng và ngăn ngừa lão hóa. Tuy nhiên, hàm lượng triterpenoid trong nấm linh chi phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm điều kiện nuôi trồng và phương pháp trích ly. Các phương pháp truyền thống thường sử dụng dung môi hữu cơ hoặc nước nóng, nhưng có nhiều hạn chế như hiệu suất trích ly thấp và sự hiện diện của các chất độc hại. Do đó, việc nghiên cứu phương pháp trích ly bằng CO2 siêu tới hạn trở nên cần thiết để tối ưu hóa quy trình thu nhận các hoạt chất có lợi từ nấm linh chi.

1.1. Thành phần hóa học

Nấm linh chi chứa nhiều hợp chất hoạt tính sinh học như triterpenoid, polysaccharide, và các vitamin. Triterpenoid là nhóm hợp chất quan trọng nhất, có khả năng kháng oxy hóa và chống ung thư. Nghiên cứu cho thấy rằng triterpenoid có thể làm giảm cholesterol và hỗ trợ điều trị nhiều bệnh lý. Các polysaccharide trong nấm cũng có tác dụng kháng viêm và tăng cường miễn dịch. Việc phân tích thành phần hóa học của nấm linh chi giúp đánh giá chất lượng và tiềm năng ứng dụng trong y học. Đặc biệt, các hợp chất như β-glucan và saponin trong nấm linh chi đã được xác định là có nhiều lợi ích cho sức khỏe con người.

II. Phương pháp chiết xuất

Phương pháp chiết xuất bằng CO2 siêu tới hạn được lựa chọn để thu nhận các hoạt chất từ nấm linh chi do nhiều ưu điểm vượt trội. CO2 siêu tới hạn không chỉ là một dung môi sạch mà còn có khả năng hòa tan tốt các hợp chất hữu cơ mà không để lại dư lượng độc hại. Quá trình chiết xuất này có thể điều chỉnh bằng cách thay đổi áp suất, nhiệt độ và tỷ lệ dung môi, từ đó tối ưu hóa hàm lượng triterpenoid trong sản phẩm cuối cùng. Việc ứng dụng công nghệ này giúp tăng hiệu suất chiết xuất và bảo toàn các hoạt chất sinh học. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng điều kiện tối ưu cho chiết xuất là áp suất 3000 psi, nhiệt độ 40°C và thời gian chiết 2 giờ, cho hàm lượng triterpenoid đạt 2.713 mg/g.

2.1. Ảnh hưởng của điều kiện chiết xuất

Các yếu tố như áp suất, nhiệt độ, và thời gian chiết xuất có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất thu nhận triterpenoid. Nghiên cứu đã thực hiện khảo sát từng yếu tố một cách hệ thống để xác định khoảng biến thiên phù hợp. Kết quả cho thấy rằng áp suất cao hơn giúp tăng cường khả năng hòa tan của các hợp chất trong nấm, trong khi nhiệt độ quá cao có thể dẫn đến sự phân hủy của các hoạt chất. Thí nghiệm đã sử dụng mô hình Box-Behnken để khảo sát ảnh hưởng đồng thời của ba yếu tố này, cho thấy sự tương tác giữa chúng có thể tối ưu hóa quy trình chiết xuất.

III. Thử nghiệm hoạt tính sinh học

Hoạt tính sinh học của cao chiết từ nấm linh chi đã được đánh giá qua nhiều phương pháp khác nhau, bao gồm thử nghiệm kháng oxy hóa, ức chế tế bào ung thư và kháng khuẩn. Các thử nghiệm này cho thấy cao chiết có khả năng kháng oxy hóa mạnh mẽ, với khả năng bắt gốc tự do DPPH cao hơn so với đối chứng axit ascorbic. Ngoài ra, cao chiết cũng cho thấy hiệu quả ức chế tế bào ung thư trên nhiều dòng tế bào như KB, Hep-G2, Lu1 và MCF-7. Kết quả thử nghiệm kháng khuẩn cho thấy cao chiết có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn gây hại, như Staphylococcus aureus và Escherichia coli.

3.1. Khả năng kháng oxy hóa

Khả năng kháng oxy hóa của cao chiết được xác định qua phương pháp DPPH, cho thấy cao chiết từ nấm linh chi có khả năng bắt gốc tự do rất hiệu quả. Kết quả cho thấy rằng hàm lượng triterpenoid cao trong cao chiết có liên quan đến khả năng kháng oxy hóa, giúp bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do oxy hóa. Điều này mở ra hướng nghiên cứu mới cho việc phát triển các sản phẩm bổ sung dinh dưỡng từ nấm linh chi nhằm nâng cao sức khỏe và phòng ngừa bệnh tật.

IV. Kết luận

Luận văn này đã chứng minh rằng phương pháp chiết xuất bằng CO2 siêu tới hạn là một kỹ thuật hiệu quả để thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm linh chi. Các kết quả nghiên cứu không chỉ cung cấp thông tin về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của nấm linh chi mà còn mở ra nhiều cơ hội ứng dụng trong ngành dược phẩm và thực phẩm chức năng. Việc phát triển các sản phẩm từ nấm linh chi có thể mang lại lợi ích lớn cho sức khỏe cộng đồng, đồng thời góp phần bảo tồn và phát triển nguồn tài nguyên thiên nhiên quý giá này.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Nấm linh chi (Ganoderma lucidum) là một loại dược liệu quý được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền châu Á, đặc biệt tại Việt Nam. Với hơn 400 hợp chất hoạt tính sinh học, trong đó triterpenoid là thành phần quan trọng nhất, nấm linh chi có nhiều tác dụng như kháng oxy hóa, ức chế tế bào ung thư và kháng khuẩn. Tuy nhiên, hàm lượng triterpenoid trong nấm linh chi phụ thuộc nhiều vào điều kiện nuôi trồng và phương pháp trích ly. Các phương pháp truyền thống như trích ly bằng dung môi hữu cơ hoặc nước nóng thường có hiệu suất thấp và tiềm ẩn nguy cơ biến tính hoạt chất cũng như tồn dư dung môi độc hại.

Kỹ thuật trích ly CO2 siêu tới hạn được xem là giải pháp tiên tiến, thân thiện môi trường với ưu điểm như dung môi sạch, không độc, không bắt lửa và có khả năng điều chỉnh chọn lọc cao. Nghiên cứu này nhằm mục tiêu tối ưu hóa điều kiện trích ly triterpenoid từ nấm linh chi Việt Nam bằng kỹ thuật CO2 siêu tới hạn, đồng thời đánh giá hoạt tính sinh học của cao chiết thu được. Phạm vi nghiên cứu tập trung vào khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố áp suất, nhiệt độ, tỷ lệ etanol:nguyên liệu và thời gian trích ly trong khoảng thời gian từ tháng 9/2021 đến 2/2022 tại Trường Đại học Bách Khoa - ĐHQG TP.HCM.

Kết quả nghiên cứu không chỉ góp phần nâng cao hiệu quả trích ly các hợp chất quý từ nấm linh chi mà còn mở ra hướng ứng dụng trong lĩnh vực dược phẩm và mỹ phẩm với các chỉ số hoạt tính sinh học được đánh giá cụ thể như khả năng kháng oxy hóa, ức chế tế bào ung thư và kháng khuẩn.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Lý thuyết trạng thái siêu tới hạn của lưu chất: CO2 ở trạng thái siêu tới hạn (áp suất > 7,38 MPa, nhiệt độ > 31 °C) có đặc tính trung gian giữa khí và lỏng, giúp tăng khả năng hòa tan và chọn lọc các hợp chất sinh học.
• Mô hình Box-Behnken trong quy hoạch thực nghiệm: Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM) được sử dụng để khảo sát đồng thời ảnh hưởng của ba yếu tố (áp suất, nhiệt độ, thời gian) đến hàm lượng triterpenoid, giúp xác định điều kiện tối ưu với số lượng thí nghiệm tối thiểu.
• Khái niệm triterpenoid: Hợp chất cấu tạo từ ba đơn vị terpene, có vai trò quan trọng trong hoạt tính sinh học của nấm linh chi, đặc biệt là các axit ganoderic.
• Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Dùng để định lượng chính xác hàm lượng triterpenoid trong cao chiết với chất chuẩn axit ursolic.
• Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học: Bao gồm phương pháp bắt gốc tự do DPPH, năng lực khử sắt FRAP, thử nghiệm độc tế bào MTT trên bốn dòng tế bào ung thư (KB, Lu1, Hep-G2, MCF-7) và đánh giá kháng khuẩn qua chỉ số IC50.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Nấm linh chi đỏ được thu thập từ trang trại trồng tại Củ Chi, TP.HCM, xử lý và bảo quản ở 4 °C trước khi trích ly.
• Phương pháp trích ly: Sử dụng hệ thống CO2 siêu tới hạn với các biến số áp suất (25-50 MPa), nhiệt độ (35-60 °C), tỷ lệ etanol:nguyên liệu (5-35 mL/g) và thời gian (0,5-3 giờ). Tốc độ dòng CO2 và etanol cố định lần lượt 2 L/phút và 2 mL/phút.
• Thiết kế thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng từng yếu tố bằng phương pháp luân phiên từng biến, sau đó áp dụng mô hình Box-Behnken với 15 thí nghiệm để tối ưu hóa điều kiện trích ly.
• Phân tích hàm lượng triterpenoid: Định lượng bằng HPLC với điều kiện cột Agilent Pursuit XRs C18, pha động 70% acetonitrile và 30% nước, bước sóng 210 nm, tốc độ dòng 0,8 mL/phút.
• Phân tích cấu trúc và nhóm chức: Sử dụng phổ FTIR để xác định các nhóm chức đặc trưng và kính hiển vi điện tử quét (SEM) để khảo sát hình thái bề mặt nguyên liệu trước và sau trích ly.
• Đánh giá hoạt tính sinh học: Thực hiện các thử nghiệm DPPH, FRAP, MTT và kháng khuẩn trên các vi khuẩn tiêu chuẩn như Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella enterica, v.v.
• Timeline nghiên cứu: Thực hiện từ tháng 9/2021 đến tháng 2/2022 tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm ĐHQG-HCM Công nghệ Hóa học & Dầu khí.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Ảnh hưởng của áp suất đến hàm lượng triterpenoid: Khi tăng áp suất từ 25 MPa lên 45 MPa, hàm lượng triterpenoid tăng từ khoảng 1,2 mg/g đến 2,5 mg/g, đạt đỉnh tại 45 MPa, sau đó giảm nhẹ ở 50 MPa. Điều này cho thấy áp suất tối ưu là 45 MPa để đạt hiệu suất trích ly cao nhất.

2. Ảnh hưởng của tỷ lệ etanol:nguyên liệu: Hàm lượng triterpenoid tăng khi tỷ lệ etanol tăng từ 5 mL/g đến 10 mL/g, đạt giá trị tối ưu khoảng 2,6 mg/g, sau đó giảm nhẹ khi tỷ lệ vượt quá 20 mL/g. Etanol đóng vai trò đồng dung môi giúp tăng khả năng hòa tan triterpenoid.

3. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian: Nhiệt độ trích ly tối ưu là 45 °C với thời gian 1,5 giờ, đạt hàm lượng triterpenoid 2,7 mg/g. Thời gian trích ly kéo dài hơn 2 giờ không làm tăng đáng kể hàm lượng, thậm chí có thể gây phân hủy hoạt chất.

4. Kết quả mô hình Box-Behnken: Mô hình dự đoán hàm lượng triterpenoid tối đa là 2,713 mg/g tại điều kiện áp suất 45 MPa, nhiệt độ 45 °C và thời gian 1,5 giờ, phù hợp với kết quả thực nghiệm kiểm chứng.

5. Hoạt tính sinh học: Cao chiết thu được có khả năng bắt gốc tự do DPPH với IC50 khoảng 35 µg/mL, gần bằng axit ascorbic (IC50 30 µg/mL). Khả năng khử sắt (FRAP) đạt OD 0,85 ở nồng độ 100 µg/mL. Cao chiết ức chế tế bào ung thư với tỷ lệ ức chế trên 60% ở dòng KB và Hep-G2 ở nồng độ 100 µg/mL. Khả năng kháng khuẩn thể hiện qua IC50 dao động từ 50-100 µg/mL đối với các vi khuẩn gram dương và gram âm.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy áp suất và nhiệt độ là hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly triterpenoid bằng CO2 siêu tới hạn. Áp suất cao làm tăng mật độ CO2 siêu tới hạn, nâng cao khả năng hòa tan triterpenoid, tuy nhiên áp suất quá cao có thể làm giảm hiệu quả do sự thay đổi tính chất dung môi. Tỷ lệ etanol đóng vai trò như đồng dung môi giúp tăng độ hòa tan các hợp chất bán cực như triterpenoid.

So sánh với các phương pháp truyền thống như trích ly nước nóng và siêu âm, kỹ thuật CO2 siêu tới hạn cho hàm lượng triterpenoid cao hơn khoảng 20-30%, đồng thời giữ được hoạt tính sinh học tốt hơn do tránh được nhiệt độ cao và dung môi độc hại. Các kết quả hoạt tính sinh học phù hợp với các nghiên cứu quốc tế, khẳng định giá trị dược liệu của cao chiết nấm linh chi thu được.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ ảnh hưởng từng yếu tố đến hàm lượng triterpenoid, bảng kết quả mô hình Box-Behnken và biểu đồ so sánh hoạt tính DPPH, FRAP, ức chế tế bào ung thư và kháng khuẩn giữa cao chiết và đối chứng.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Áp dụng quy trình trích ly CO2 siêu tới hạn với điều kiện tối ưu (áp suất 45 MPa, nhiệt độ 45 °C, thời gian 1,5 giờ, tỷ lệ etanol 10 mL/g) để sản xuất cao chiết triterpenoid chất lượng cao. Thời gian thực hiện: 6-12 tháng; Chủ thể: các doanh nghiệp dược liệu và phòng thí nghiệm nghiên cứu.

2. Phát triển quy mô công nghiệp cho kỹ thuật trích ly CO2 siêu tới hạn nhằm nâng cao năng suất và giảm chi phí sản xuất. Thời gian: 1-2 năm; Chủ thể: các công ty công nghệ sinh học và nhà đầu tư.

3. Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động sinh học của các hợp chất triterpenoid trong cao chiết, đặc biệt trên các dòng tế bào ung thư khác nhau và vi khuẩn đa kháng thuốc. Thời gian: 1-2 năm; Chủ thể: các viện nghiên cứu và trường đại học.

4. Khuyến khích sử dụng cao chiết nấm linh chi trong các sản phẩm dược phẩm, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm nhằm tận dụng tối đa hoạt tính sinh học và giá trị kinh tế. Thời gian: liên tục; Chủ thể: doanh nghiệp sản xuất và các nhà phân phối.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Kỹ thuật Hóa học, Công nghệ Sinh học: Nghiên cứu về kỹ thuật trích ly lưu chất siêu tới hạn, ứng dụng trong chiết xuất hoạt chất tự nhiên.

2. Doanh nghiệp dược liệu và mỹ phẩm: Tìm hiểu quy trình sản xuất cao chiết triterpenoid chất lượng cao, áp dụng công nghệ xanh, thân thiện môi trường.

3. Chuyên gia y học cổ truyền và dược học: Đánh giá hoạt tính sinh học của nấm linh chi, phát triển sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh dựa trên hoạt chất tự nhiên.

4. Cơ quan quản lý và phát triển chính sách: Tham khảo để xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và khuyến khích ứng dụng công nghệ sạch trong sản xuất dược liệu.

Câu hỏi thường gặp

1. Kỹ thuật CO2 siêu tới hạn có ưu điểm gì so với phương pháp trích ly truyền thống?
   CO2 siêu tới hạn là dung môi sạch, không độc, không bắt lửa, có khả năng điều chỉnh chọn lọc cao, giúp thu được cao chiết chất lượng với hàm lượng hoạt chất cao hơn và ít biến tính do nhiệt.

2. Điều kiện trích ly tối ưu trong nghiên cứu là gì?
   Áp suất 45 MPa, nhiệt độ 45 °C, thời gian 1,5 giờ và tỷ lệ etanol:nguyên liệu 10 mL/g cho hàm lượng triterpenoid tối đa 2,713 mg/g.

3. Cao chiết nấm linh chi có hoạt tính sinh học nào được đánh giá?
   Cao chiết thể hiện khả năng kháng oxy hóa (IC50 DPPH ~35 µg/mL), ức chế tế bào ung thư trên bốn dòng tế bào với tỷ lệ ức chế trên 60%, và kháng khuẩn với IC50 từ 50-100 µg/mL.

4. Phương pháp phân tích hàm lượng triterpenoid được sử dụng là gì?
   Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với chất chuẩn axit ursolic, cho phép định lượng chính xác hàm lượng triterpenoid trong cao chiết.

5. Nghiên cứu có thể ứng dụng vào lĩnh vực nào?
   Ứng dụng trong sản xuất dược phẩm, thực phẩm chức năng, mỹ phẩm và nghiên cứu phát triển các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên với hoạt tính sinh học cao.

Kết luận

• Đã xác định được điều kiện trích ly tối ưu bằng kỹ thuật CO2 siêu tới hạn cho hàm lượng triterpenoid cao nhất là 2,713 mg/g.
• Cao chiết thu được có hoạt tính sinh học nổi bật gồm kháng oxy hóa, ức chế tế bào ung thư và kháng khuẩn.
• Phương pháp CO2 siêu tới hạn vượt trội hơn so với các phương pháp truyền thống về hiệu suất và chất lượng sản phẩm.
• Nghiên cứu góp phần phát triển công nghệ trích ly xanh, thân thiện môi trường và nâng cao giá trị dược liệu nấm linh chi.
• Đề xuất mở rộng quy mô sản xuất và nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động sinh học của cao chiết trong các ứng dụng y học và công nghiệp.

Áp dụng quy trình trích ly tối ưu vào sản xuất thử nghiệm, đồng thời triển khai nghiên cứu ứng dụng hoạt tính sinh học trong các sản phẩm thực tế. Độc giả và doanh nghiệp quan tâm có thể liên hệ để hợp tác nghiên cứu và phát triển sản phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về nấm linh chi 1. Giới thiệu chung Nấm linh chi có tên khoa học là Ganoderma lucidum (G. lucidum), thuộc chi Ganoderma, họ nấm lim (Ganodermataceae).

Linh chi có tên gọi là Lingzhi theo tiếng Trung Quốc, Reishi theo tiếng Nhật. Ở Việt Nam nấm linh chi còn được gọi là nấm Lim, Tiên Thảo và nấm Trường Thọ. Chi Ganoderma trên thế giới có trên 250 loài, nhưng chỉ có sáu loại là linh chi đỏ, đen, xanh, trắng, vàng và tím là được nghiên cứu để phát hiện ra tiềm năng có lợi cho sức khỏe tính chất. Theo màu sắc, nấm linh chi được chia thành 6 loại và mỗi có công dụng khác nhau như trình bày ở bảng 1.1: Phân loại nấm linh chi Tên gọi Màu sắc Đặc tính dược lý Thanh chi Vị chua, tính bình, không độc, (Long chi) sáng mắt, tăng cường trí nhớ Hồng chi Vị đắng, tính bình, không độc, (Xích chi) tăng cường trí nhớ Hoàng chi Vị ngọt, tính bình, không độc, (Kim chi) an thần 2 Vị cay, tính bình, không độc, Bạch chi ích phổi, an thần, chữa ho Vị mặn, tính bình, không độc, Hắc chi ích thận Vị ngọt, tính ôn, không độc, trị Tử chỉ đau nhứt khớp xương, gân cốt Nấm linh chi gồm hai phần cuống nấm và mũ nấm.

Cuống nấm dài hoặc ngắn, thường hình trụ, đường kính 0,5-3 cm. Cuống nấm thường không phân nhánh, đôi khi uốn khúc cong. Lớp vỏ cuống màu đỏ – nâu đỏ – nâu đen, bóng. Mũ nấm dạng thận – gần tròn, đôi khi xòe hình quạt.

Trên mặt mũ có vân gạch đồng tâm màu sắc từ vàng chanh – vàng nghệ – vàng nâu – vàng cam – đỏ nâu – nâu tím, nhẵn bóng. Khi già, sẫm màu lớp vỏ láng, lớp phấn đỏ nâu trên bề mặt ngày càng nhiều, và dày hơn. Kích thước mũ nấm thường 5-12 cm, dày 0,8-3,3 cm. Phần đỉnh cuống thường gồ lên hoặc hơi lõm [1].1 là ảnh chụp của nấm linh chi.1: Nấm linh chi Về công dụng dân gian, nấm linh chi có rất nhiều tác dụng hiệu quả lên các hệ cơ quan của cơ thể, từ hệ miễn dịch, hệ thần kinh, hệ tuần hoàn, hệ tiêu hóa đến việc bài tiết các độc tố trong cơ thể, điều trị bệnh tiểu đường.

Phần lớn các nghiên cứu về dược tính của nấm linh chi chủ yếu xoay quanh khả năng tăng cường hệ miễn dịch, điều hòa tim mạch, hạ huyết áp và bảo vệ gan [2]. Thành phần hóa học Nấm linh chi có nhiều lợi ích đối với sức khỏe và chứa hơn 400 hợp chất hoạt tính sinh học, bao gồm triterpenoid, polysaccharide, nucleotide, sterol, steroid, axit béo và protein [3, 4], có khả năng chống khối u [5], chống vi trùng, chống xơ vữa động mạch, chống viêm [6]. Thành phần chủ yếu của nấm là nước, chiếm đến 90 %. 10 % khối lượng còn lại bao gồm các thành phần dinh dưỡng như protein (10–40 %), chất béo (28 %), carbohydrate (3–28 %), chất xơ (3–32 %), tro (8–10 %) [7].

Ngoài ra trong nấm còn chứa các vitamin, axit béo, các khoáng chất thiết yếu như đồng, kẽm [8] và selen [9].2 trình bày hàm lượng chất khoáng và vitamin có trong nấm.2: Hàm lượng chất khoáng và vitamin có trong nấm linh chi [10] Chất khoáng và vitamin Hàm lượng (mg/100g) Canxi 832 Photpho 4,150 Sắt 82,6 4 Magie 1,030 Natri 375 Kali 3,590 Vitamin B1 3,49 Vitamin B2 17,10 Vitamin B6 0,71 Niacin 61,9 Inositol 307 Choline 1,150 1. Polysaccharide Các polysaccharide của nấm linh chi có tác dụng sinh học như kháng viêm, hạ đường huyết, chống loét, chống lại sự hình thành khối u, và tăng cường khả năng miễn dịch [11, 12]. Có trên 200 loại polysaccharide được phân lập từ nấm linh chi, trong đó chủ yếu gồm 2 loại chính là galactan và glucan. Đặc biệt, glucan có liên kết β (β-glucan) là hoạt chất sinh học có nhiều công dụng quý, có lợi cho con người [13, 14].

β-glucan là một chuỗi các phân tử D-glucose liên kết bởi liên kết (1,3)-β hay (1,6)-β. Các sản phẩm tự nhiên có chứa β-glucan đã được sử dụng rất lâu, nhưng β-glucan chỉ mới được nghiên cứu trong những năm gần đây. β-glucan được sử dụng để điều trị một số bệnh bao gồm ung thư, bệnh truyền nhiễm, bệnh tiểu đường và các bệnh tim mạch [15, 16]. Cấu trúc hóa học của hoạt chất β-glucan được trình bày như ở hình 1.2: Cấu trúc β-glucan phân lập từ nấm linh chi [17] 1.

Saponin Saponin hay saponosid là một nhóm các glycosid có phần genin với cấu trúc triterpen hay steroid và được tìm thấy ở thực vật, ngoài ra cũng được tìm thấy ở động vật thân mềm như hải sâm, sao biển. Tên gọi saponin xuất phát từ sapo theo tiếng Latinh có nghĩa 5 là xà phòng do tính tạo bọt của nhóm hợp chất này. Dựa trên cấu trúc hóa học của phần sapogenin saponin được chia thành 3 nhóm lớn là saponin triterpenoid, saponin steroid và saponin steroid alkaloid. Các triterpenoid trong nấm linh chi thuộc nhóm saponin triterpenoid [18, 19].

Triterpenoid Triterpenoid là một hợp chất được cấu tạo gồm ba đơn vị terpene hoặc 6 đơn vị isoprene có công thức phân tử C30H48. Triterpeneoid được phân thành 6 loại lớn gồm acyclic (nhóm squalene), monocyclic (achilleol A), bicyclic (pouoside A), tricyclic (lansioside A), tetracyclic (lanostane, dammarane và euphane) và pentacyclic triterpenoids (oleanane group, ursane, nhóm lupane và nhóm hopane) được trình bày trong bảng 1.3: Phân loại triterpenoid STT Loại Nhóm Cấu trúc Acyclic 1 Squalene triterpenoid Monocyclic 2 Achilleol A triterpenoid Bicyclic 3 Pouoside A triterpenoid Tricyclic 4 Lansioside A triterpenoid 6 Lanostane Tetracyclic 5 triterpenoid Dammarane Oleane Pentacyclic 6 triterpenoid Ursane 7 Lupane Hopane Các triterpenoid tồn tại dưới dạng tự do (không có phần đường), có cấu trúc vòng, mang một số nhóm chức như: – OH, – O –, C=O. Đặc tính chung là tan tốt trong etanol, metanol, ít tan trong nước ngoại trừ khi kết hợp với đường để tạo thành glycosid. Các triterpenoid có độ nhớt vừa phải, bền với nhiệt độ và tạo vị đắng trong nấm linh chi [11, 12].

Cấu trúc hoá học của các triterpenoid trong nấm linh chi dựa trên lanostan, là một chất chuyển hoá của lanosterol. Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra cao chiết bằng CH2Cl2 và CH3OH bao gồm các triterpenoid thuộc nhóm lanostane (ganoderol A, ganodermadiol, axit applanoxidic A, axit applanoxididic F, ganoderone A, lucidadiol và ganoderal A [20]. Trong phần không phân cực của quả thể nấm linh chi có các triterpenoid tự do với hàm lượng từ 3 – 5 %. Thành phần chính là các axit ganoderic A, B, C, D, F, H, I và J như hình 1.

Chính các triterpenoid này làm cho nấm linh chi có vị đắng, khác với các loại nấm khác. Hàm lượng triterpenoid là khác nhau ở các bộ phận khác nhau và giai đoạn phát triển khác nhau của nấm [21].3: Một số axit ganoderic phổ biến trong nấm linh chi Trong các thành phần hóa học trên, nhóm triterpenoid là một trong số những dược chất quý được phát hiện đầu tiên với nhiều tác dụng. Ở hầu hết các nước phát triển, triterpenoid là chất chính được dùng làm tiêu chuẩn để đánh giá chất lượng của các loài nấm linh chi khác nhau [22]. Triterpenoid chiếm hàm lượng cao trong nấm linh chi và có những tác dụng nổi bật nên trong luận văn này đối tượng được lựa chọn trích ly là triterpenoid và thử nghiệm hoạt tính sinh học của cao chiết.

Hoạt tính sinh học của triterpenoid Triterpenoid phân bố rộng rãi khắp thế giới thực vật và góp phần tạo nên các hoạt tính sinh học của nấm linh chi. Triterpenoid, đặc biệt là các axit ganoderic trong nấm linh chi giúp nấm linh chi có khả năng chống viêm, chống khối u, Human Immuno- deficiency Virus (HIV) [23], ngăn ngừa tiểu đường, kháng khuẩn, kháng oxy hoá và giảm mỡ máu. Kháng oxy hóa Trong cơ thể sống thường xuyên xảy ra các phản ứng oxy hóa – khử, gắn liền với quá trình trao đổi chất, trao đổi năng lượng của tế bào. Chính nhờ phản ứng oxy hóa – khử này mà các dạng oxy hoạt động bao gồm gốc superoxide (O2●), hydro peroxid (H2O2), và gốc hydroxyl (HO●) được hình thành.

Quá trình tích lũy các sản phẩm oxy hóa này ở nồng độ cao là nguyên nhân dẫn đến các tổn thương oxy hóa của cơ thể sinh vật. Ngoài ra, các gốc tự do còn có thể phát sinh bởi nguyên nhân bên ngoài như tia UV, chất kích thích sinh trưởng, chất bảo quản thực phẩm và chất thải công nghiệp. Các ion kim loại chuyển tiếp (Cu2+, Fe2+…) có thể xúc tác cho phản ứng tạo gốc hydroxyl từ superoxide và hydro peroxide. Phản ứng này gọi là phản ứng Fenton (1.

Ức chế tế bào ung thư Khả năng ức chế tế bào ung thư của các hợp chất có thể là do quá trình apoptosis [24]. Apoptosis là quá trình đóng vai trò thiết yếu trong sự phát triển và tồn tại bằng cách loại bỏ tế bào bị hư hỏng hoặc không mong muốn. Một loạt các nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng, hầu hết các chất hóa trị diệt khối u gây ra quá trình apoptosis ở các tế bào và mô đích. Các hợp chất tự nhiên đã được chứng minh là gây ra quá trình apoptosis ở một số dòng tế bào ung thư, đồng thời không ảnh hưởng đến các tế bào bình thường [25].

Tuy cơ chế phân tử mà flavonoid gây ra quá trình apoptosis vẫn chưa được làm rõ, nhưng một số cơ chế có thể liên quan bao gồm ức chế hoạt động của ADN topoisomerase I/II, giảm (Reactive oxygen species ‒ ROS) [26], điều hoà con đường truyền tín hiệu [27], giải phóng cytochrome C với sự kích hoạt tiếp theo của caspase ‒ 9 và caspase ‒ 3, [28] điều hòa giảm biểu hiện Bcl ‒ 2 và Bcl ‒ X, nhưng thúc đẩy biểu hiện Bax và Bak, kích hoạt endonuclease và ức chế Mcl ‒ 1 protein [29]. Kháng khuẩn Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất tự nhiên thường được thể hiện như thể hiện trong hình 1.6 bao gồm các quá trình:  Ức chế sinh tổng hợp vách tế bào vi khuẩn bằng cách ngăn cản sinh tổng hợp lớp peptidoglycan nên không tạo được khung murein;  Gây rối loạn chức năng màng sinh chất: Điện thế màng thể hiện sự khác biệt của điện thế trong và ngoài màng tế bào. Các hợp chất tự nhiên có tính kháng khuẩn sẽ gây ra sự khử cực của màng dẫn đến giảm khả năng chuyển hóa các chất trong tế bào [30];  Ức chế sinh tổng hợp protein: Chủ yếu ức chế ribosome, ngoài ra còn tác động lên các nhân tố tham gia quá trình dịch mã và sau dịch mã. Dẫn tới các protein không được tạo thành hoặc nếu được tạo thành thì không có hoạt tính [31].4: Cơ chế kháng khuẩn của hợp chất có hoạt tính sinh học đối với vi khuẩn Escherichia coli a) và Staphylococcus aureus b) [30] 1.