MỞ ĐẦU Bệnh bạch cầu cấp là một nhóm bệnh của cơ quan tạo máu chiếm tỷ lệ khoảng 38,5% các bệnh về máu [1]. Cũng nhƣ các bệnh ung thƣ khác, bệnh có xu hƣớng ngày càng tăng do môi trƣờng ô nhiễm, sử dụng các hóa chất bảo vệ thực vật không có kiểm soát và hậu quả của các chất da cam dioxin do chiến tranh để lại [2]. Đặc trƣng của bệnh là sự tăng sinh quá mức của các tế bào non ác tính lấn át các tế bào tủy và máu ngoại vi bình thƣờng. Đặc điểm của các tế bào này là có sự rối loạn về protein và cấu trúc tế bào.
Bệnh gồm nhiều thể loại khác nhau, theo tiêu chuẩn FAB thì đƣợc ký hiệu từ M0 đến M7 và L1 đến L3 [16]. Việc xếp loại đúng, nhanh chóng và chính xác thể bệnh có vai trò quyết định giúp cho bác sỹ lâm sàng áp dụng các phác đồ điều trị có hiệu quả cho ngƣời bệnh. Đặc biệt trong thể M3 có nguy cơ chảy máu cao thì việc chẩn đoán nhanh chóng, chính xác còn có ý nghĩa quyết định đến sinh mạng bệnh nhân [6]. Tiêu chuẩn FAB dựa trên kết quả xét nghiệm của ba phƣơng pháp là miễn dịch, di truyền và nhuộm hóa học tế bào.
Phƣơng pháp miễn dịch và di truyền sử dụng các kỹ thuật đòi hỏi máy móc hiện đại đắt tiền và nguồn lao động có trình độ cao. Phƣơng pháp nhuộm hóa học tế bào đồng bộ gồm các kỹ thuật nhuộm PAS, peroxidaza, nhuộm sudan B, photphataza axit, photphataza kiềm, esteraza đặc hiệu và không đặc hiệu ức chế với NaF và không ức chế. Esteraza đặc hiệu chỉ có mặt trên các tế bào dòng tủy còn các dòng khác âm tính hoặc dƣơng tính với cƣờng độ rất thấp. Esteraza không đặc hiệu có mặt ở nhiều dòng tế bào khác nhau nhƣng ở dòng monoxit thì bị ức chế bằng NaF.
Ngoài hai kỹ thuật nhuộm PAS và nhuộm Sudan dùng để phát hiện glucozit và lipit thì sáu kỹ thuật còn lại là nhuộm phát hiện enzym. Do độ đặc hiệu còn thấp, việc phân loại dòng tế bào theo tiêu chuẩn FAB dựa trên phƣơng pháp nhuộm hóa học vẫn cần phải có sự điều chỉnh tới 29,7% nhờ vào kỹ thuật miễn dịch và di truyền. Phƣơng pháp xác định tế bào thuộc dòng tủy dựa chủ yếu vào kết quả nhuộm peroxidaza và esteraza đặc hiệu. Kỹ thuật nhuộm peroxidaza thƣờng không ổn định do dễ bị phân hủy bởi ánh sáng vì thế cần bổ sung thêm kỹ thuật nhuộm esteraza có độ ổn định hơn.
Hiện nay, cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu là naphtol AS-D cloaxetat đƣợc đƣợc hãng Sigma bán trên thị trƣờng với giá thành rất cao (13 triệu/1 gam). Qua nghiên cứu tài liệu có thể thấy, cơ chất naphtol AS-D cloaxetat đƣợc tổng hợp theo phƣơng pháp truyền thống là ngƣng tụ axit 3-hiđroxi-2-naphtoic với o-toluiđin, sau đó este hóa bằng cloaxetyl clorua. Phản ứng ngƣng tụ cần thời gian dài, hiệu suất thấp; quá trình chuyển hóa naphtol AS-D thành dẫn xuất cloaxetat hiệu suất cũng không ổn định. 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Do việc nghiên cứu thiếu hệ thống nên chƣa xác định đƣợc mối tƣơng quan giữa cấu trúc và hoạt tính, chƣa tìm đƣợc cơ chất có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất.
Quá trình nhuộm chƣa đƣợc tối ƣu hóa gây khó khăn cho cán bộ thực hiện và tốn kém cho bệnh nhân. Nƣớc ta chƣa sản xuất đƣợc cơ chất, phải nhập ngoại. Cơ chất dễ bị phân huỷ ở nhiệt độ > -200C, là một trong những khó khăn lớn cho việc vận chuyển và bảo quản. Những thách thức đó đã làm cho phƣơng pháp xét nghiệm này chƣa đƣợc triển khai rộng rãi ở Việt Nam.
Vì vậy, đề tài nghiên cứu tổng hợp cơ chất, chế tạo kít và tối ƣu hóa quy trình nhuộm esteraza đặc hiệu để phân loại tế bào bạch cầu phục vụ việc khám và điều trị bệnh ung thƣ máu có ý nghĩa khoa học, thực tiễn và kinh tế - xã hội sâu sắc. Mục tiêu của đề tài là xây dựng phƣơng pháp mới, hiệu quả cao để tổng hợp cơ chất; khảo sát một cách có hệ thống mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính để tìm kiếm cơ chất mới có độ nhạy và tính đặc hiệu cao; tối ƣu hóa các điều kiện nhuộm và chế tạo kít nhuộm esteraza để phân loại tế bào phục vụ việc khám và điều trị bệnh ung thƣ máu. Nội dung nghiên cứu 1- Nghiên cứu tổng hợp các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit làm nguyên liệu điều chế cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào bạch cầu ngƣời. 2- Nghiên cứu tổng hợp các este 3-(N-thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat làm cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu ngƣời.
3- Xác định cấu trúc của các hợp chất điều chế đƣợc bằng các phƣơng pháp vật lý và hóa lý hiện đại (Phổ IR, 1H-NMR và MS) và nghiên cứu mối tƣơng quan giữa độ nhạy của phản ứng nhuộm esteraza với cấu trúc phân tử cơ chất bằng phƣơng pháp tính hóa lƣợng tử. 4- Nghiên cứu sử dụng este 3-(N-thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat để nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu ngƣời và tìm kiếm cơ chất mới có độ đặc hiệu và độ nhạy cao. 5- Nghiên cứu ảnh hƣởng hiệu ứng electron các nhóm thế X, hiệu ứng không gian của các gốc N-hiđrocacbon nhóm amit thế và các gốc cacboxylat trong phân tử cơ chất đến độ nhạy và độ đặc hiệu đối với phản ứng nhuộm esteraza. 6- Nghiên cứu tối ƣu hóa quy trình nhuộm bằng phƣơng pháp đơn hình và ứng dụng để chế tạo bộ kít nhuộm esteraza dùng phân loại dòng tế bào trong bệnh bạch cầu ngƣời từ cơ chất tổng hợp đƣợc.
11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU HÓA HỌC CÁC HỢP CHẤT 3-HIĐROXI-(N-THẾ)NAPHTALEN-2-CACBOXAMIT 3-Hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit có cấu trúc nhƣ sau: O 8 1 7 9 2 R1 NH 3 6 10 OH 5 4 R1 là các vòng thơm có các nhóm thế thƣờng ở vị trí octo- hoặc para- Các hợp chất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit đƣợc ứng dụng rất rộng rãi trong thực tiễn. Trong công nghiệp chúng đƣợc dùng làm nguyên liệu đầu để sản xuất phẩm màu, đặc biệt là mực in. Do quy trình sản xuất đơn giản, gam màu phong phú, độ bền cao, nên loại hợp chất này đã có lúc chiếm tỷ trọng rất lớn đối với thị trƣờng phẩm màu thế giới.
Vai trò của họ hợp chất này trở nên đặc biệt quan trọng khi ngƣời ta sử dụng chúng làm nguyên liệu sản xuất cơ chất để nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào bạch cầu ngƣời. Do những ứng dụng quan trọng nhƣ vậy, nên loại hợp chất này đã thu hút sự quan tâm to lớn của các nhà khoa học. Số công trình công bố trong lĩnh vực này rất lớn và đa dạng. Trong khuôn khổ tổng quan này chỉ đề cập các phƣơng pháp tổng hợp quan trọng, những tính chất hóa lý cơ bản và một số ứng dụng phổ biến liên quan đến họ hợp chất này.
Tổng hợp các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit Theo tài liệu [45] ngƣời ta tổng hợp 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacbox- amit chủ yếu theo phƣơng pháp trực tiếp một giai đoạn hoặc phƣơng pháp gián tiếp hai giai đoạn. Phƣơng pháp một giai đoạn Phƣơng pháp này lần đầu tiên đƣợc Schopf là nhà hóa học ngƣời Đức dùng để tổng hợp naphtol AS vào năm 1892 [45], dựa trên phản ứng ngƣng tụ giữa axit 3-hiđroxi-2-naphtoic với anilin có mặt PCl3. Phƣơng pháp này còn đƣợc dùng cho tới ngày nay với một số cải tiến, thay vì dùng PCl3 vừa làm tác nhân vừa làm dung môi, ngƣời ta tiến hành phản ứng trong các dung môi để tăng hiệu suất sản phẩm [11]. Đây còn đƣợc gọi là phƣơng pháp tổng hợp trực tiếp.
Quá trình phản ứng đƣợc mô tả trên sơ đồ 1. 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.1 R H2N Cl Clobenzen (Xylen) N R + Cl P 0 P Cl 70-80 C NH R R N COOH CONH P Clobenzen (Xylen) R + NH 0 OH 130-136 C/3h OH R Phản ứng đƣợc thực hiện bằng cách khuấy hỗn hợp của anilin, axit 3-hiđroxi- 2-naphtoic và một lƣợng dƣ PCl3 trong dung môi hữu cơ nhƣ clobenzen hoặc toluen ở nhiệt độ thấp, thƣờng là dƣới 400C, tốt nhất là từ 00C đến 250C. Khi phản ứng xảy ra, nhiệt độ sẽ tự tăng lên trên 400C. Để đuổi HCl ngƣời ta phải đun hỗn hợp ở nhiệt độ 750C đến 1800C trong thời gian vài giờ.
Hiệu suất 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen- 2-cacboxamit đạt từ 60-70%. Theo phƣơng pháp trực tiếp một giai đoạn, ngƣời ta còn có thể tổng hợp 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit bằng cách cho axit 3-hiđroxi-2-naphtoic tác dụng với lƣợng dƣ SOCl2. Sau khi khuấy 10 phút, ngƣời ta bắt đầu cho thêm dẫn xuất anilin thế vào hỗn hợp [14]. Dung môi sử dụng trong phƣơng pháp này là axetonitrin.
Quá trình phản ứng đƣợc mô tả trên sơ đồ 1.2 O NH2 O OH PCl3 /SOCl2 NH + OH OH Tuy nhiên trong quá trình thêm anilin thế vào hỗn hợp, HCl tách ra từ SOCl2 phản ứng rất mãnh liệt tạo kết tủa phenylamoni clorua làm cho hiệu suất 3-hiđroxi- (N-thế)naphtalen-2-cacboxamit thu đƣợc rất thấp. 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Tổng hợp 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit bằng phƣơng pháp hai giai đoạn Ngoài phƣơng pháp một giai đoạn, 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit còn đƣợc tổng hợp bằng phƣơng pháp gián tiếp hai giai đoạn [10, 33, 35]. Trong giai đoạn 1, ngƣời ta tiến hành phản ứng giữa axit 3-hiđroxi- 2-naphtoic với SOCl2 để điều chế sản phẩm trung gian 3-hiđroxi-2-naphtoyl clorua.
Phản ứng đƣợc mô tả trên sơ đồ 1.3 COOH SOCl2 COCl HCl, SO2 OH OH Ở giai đoạn 2, cho naphtoyl clorua tác dụng với anilin thế tạo ra sản phẩm cuối là 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit. Quá trình phản ứng đƣợc mô tả bằng sơ đồ 1.4 COCl anilin CONH HCl OH OH Do naphtoyl clorua dễ phân huỷ trong không khí, nên phản ứng phải đƣợc thực hiện trong điều kiện bảo ôn rất nghiêm ngặt. Hiệu suất phản ứng này cũng không cao, chỉ khoảng 60%. Kock-Yee Law và cs [59] đã thực hiện phản ứng hai giai đoạn theo cách khác.
Ở giai đoạn một, các tác giả đã đun hỗn hợp 2,8-đihiđroxi-3-naphtoic với phenol có mặt xúc tác ngƣng tụ là POCl3 ở 1250C, dƣới áp suất khí nitơ. Để tránh phản ứng phụ đối với nhóm 8-OH, lƣợng dƣ phenol đã đƣợc sử dụng vừa làm tác nhân vừa làm dung môi. Sau 2 giờ hiệu suất phenyl 2,8-đihiđroxi-3-naphtoat đạt 76%. Ở giai đoạn 2, tiến hành đun hồi lƣu hỗn hợp phenyl 2,8-đihiđroxi-3-naphtoat và các dẫn xuất anilin thế tƣơng ứng ở 2500C trong dung môi là N-metyl pyroliđinon (NMP) dƣới áp suất nitơ.
Sau 2 giờ hiệu suất N-thế-2,8-đihiđroxinaphtalen-3-cacboxamit đạt trên 89%. Quá trình phản ứng đƣợc mô tả trên sơ đồ 1. 14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.5 O COOH HO 1) O 0 OH POCl3 , 125 C OH X O O H2N X O NH 2) OH NMP OH X = H, p-F, p-Cl, o-C2H5; NMP = N-metyl pyroliđinon. Tính chất của các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit 1.