Luận văn thạc sĩ về đột biến FLT3 trong bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy ở Việt Nam

Luận văn thạc sĩ phân tích hus sàng lọc và phân tích đặc điểm phân tử các đột biến flt3 xuất hiện trên bệnh nhân mắc bệnh ung, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải

• Tác giả: Đỗ Thị Thanh Trung
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Bảo Yên
• Trường học: Đại học quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Sàng lọc và phân tích đặc điểm phân tử các đột biến FLT3 xuất hiện trên bệnh nhân mắc bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy ở Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy (Acute Myeloid Leukemia-AML)
• 1.2. Thực trạng bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy và tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.3. Phân loại các thể bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy
• 1.4. Các phương pháp chẩn đoán bệnh AML. Hướng điều trị đối với người bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy
• 1.5. Gen FLT3 và sự liên quan tới bệnh bạch cầu cấp dòng tủy
• 1.5.1. Cấu trúc và chức năng của gen FLT3
• 1.5.2. Các loại đột biến FLT3
• 1.5.3. Mối liên hệ giữa đột biến trên gen FLT3 và bệnh bạch cầu cấp dòng tủy
• 1.6. Ý nghĩa của việc nghiên cứu gen FLT3 trong chẩn đoán và điều trị AML
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Các hóa chất và bộ kit
• 2.2. Máy móc và thiết bị
• 2.3. Phương pháp
• 2.3.1. Tách DNA tổng số từ mẫu máu. Thiết kế cặp mồi đặc hiệu nhân bản đoạn gen có đột biến
• 2.3.2. Nhân đoạn gen FLT3 chứa đột biến với cặp mồi đặc hiệu bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR)
• 2.3.3. Điện di agarose hoặc acrylamide để phân tích phổ băng đột biến
• 2.3.4. Nhân dòng đoạn gen FLT3 và đọc trình tự gen bằng phương pháp Sanger
• 2.3.5. Một số phần mềm sử dụng trong luận văn
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Thu thập và tách chiết ADN hệ gen từ mẫu máu tổng số
• 3.2. Thiết kế và tối ưu quy trình phát hiện đột biến gen FLT3-ITD. Thiết kế trình tự mồi
• 3.3. Thiết kế và tối ưu quy trình phát hiện đột biến FLT3-ITD
• 3.4. Bước đầu sàng lọc trong quy mô phòng thí nghiệm
• 3.5. Kết quả đưa sản phẩm PCR vào vectơ tái tổ hợp. Phân tích các đặc điểm phân tử của đột biến gen FLT3-ITD
• 3.5.1. Số lượng đột biến gen FLT3-ITD trong một mẫu (số đột biến/mẫu)
• 3.5.2. Kích thước đột biến
• 3.5.3. Trình tự đột biến
• 3.5.4. Mức độ đột biến
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu đột biến FLT3 ở bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp dòng tủy

Nghiên cứu về đột biến FLT3 trong bệnh nhân mắc ung thư bạch cầu cấp dòng tủy (AML) tại Việt Nam đang trở thành một lĩnh vực quan trọng trong y học hiện đại. Bệnh AML là một trong những loại ung thư phổ biến nhất, với tỷ lệ mắc ngày càng gia tăng. Đột biến gen FLT3 được xác định là một trong những yếu tố tiên lượng quan trọng, ảnh hưởng đến kết quả điều trị và khả năng sống sót của bệnh nhân. Việc hiểu rõ về đặc điểm phân tử của các đột biến gen này sẽ giúp cải thiện phương pháp chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân.

1.1. Định nghĩa và vai trò của gen FLT3 trong bệnh ung thư

Gen FLT3 mã hóa cho một loại enzyme tyrosine kinase, có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển và biệt hóa tế bào máu. Đột biến trên gen này, đặc biệt là đột biến FLT3-ITD, đã được chứng minh là có liên quan mật thiết đến sự phát triển của bệnh AML. Nghiên cứu cho thấy khoảng 25% bệnh nhân AML có đột biến này, dẫn đến tình trạng tế bào bạch cầu phát triển không kiểm soát.

1.2. Tình hình nghiên cứu đột biến FLT3 trên thế giới và tại Việt Nam

Trên thế giới, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng đột biến FLT3 là một yếu tố tiên lượng xấu trong điều trị AML. Tại Việt Nam, mặc dù có nhiều nghiên cứu về bệnh ung thư bạch cầu, nhưng việc thống kê và phân tích các đột biến gen vẫn còn hạn chế. Điều này tạo ra một khoảng trống trong việc áp dụng các phương pháp điều trị chính xác cho bệnh nhân.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu đột biến FLT3 ở bệnh nhân AML

Mặc dù có nhiều tiến bộ trong nghiên cứu về đột biến FLT3, nhưng vẫn còn nhiều thách thức cần phải vượt qua. Một trong những vấn đề lớn nhất là thiếu dữ liệu thống kê đầy đủ về tỷ lệ và đặc điểm của các đột biến gen này ở bệnh nhân Việt Nam. Điều này ảnh hưởng đến khả năng chẩn đoán và điều trị hiệu quả cho bệnh nhân. Ngoài ra, việc áp dụng các phương pháp nghiên cứu hiện đại như giải trình tự gen cũng gặp nhiều khó khăn do hạn chế về công nghệ và nguồn lực.

2.1. Thiếu dữ liệu thống kê về đột biến FLT3 tại Việt Nam

Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng tỷ lệ đột biến FLT3 có sự khác biệt lớn giữa các khu vực và dân tộc. Tuy nhiên, tại Việt Nam, chưa có một nghiên cứu nào thống kê đầy đủ về tỷ lệ và đặc điểm của các đột biến gen này. Điều này gây khó khăn trong việc xây dựng phác đồ điều trị phù hợp cho bệnh nhân.

2.2. Khó khăn trong việc áp dụng công nghệ hiện đại

Việc áp dụng các công nghệ hiện đại như giải trình tự gen để phát hiện đột biến FLT3 gặp nhiều khó khăn do thiếu trang thiết bị và nguồn nhân lực. Điều này làm giảm khả năng phát hiện sớm và điều trị kịp thời cho bệnh nhân mắc AML.

III. Phương pháp nghiên cứu đột biến FLT3 ở bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp dòng tủy

Để nghiên cứu đột biến FLT3, các phương pháp hiện đại như PCR (Polymerase Chain Reaction) và điện di gel được sử dụng để phát hiện và phân tích các đột biến gen. Quy trình này bao gồm việc tách chiết DNA từ mẫu máu, thiết kế mồi đặc hiệu và phân tích kết quả. Việc áp dụng các phương pháp này giúp xác định chính xác sự hiện diện của các đột biến gen và từ đó đưa ra các phương pháp điều trị hiệu quả.

3.1. Quy trình tách chiết DNA từ mẫu máu

Quy trình tách chiết DNA từ mẫu máu là bước đầu tiên trong nghiên cứu đột biến FLT3. Việc sử dụng các bộ kit chuyên dụng giúp tăng độ chính xác và hiệu quả trong việc thu nhận DNA, từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho các bước phân tích tiếp theo.

3.2. Phân tích đột biến FLT3 bằng phương pháp PCR

Phương pháp PCR được sử dụng để khuếch đại các đoạn DNA chứa đột biến FLT3. Sau khi khuếch đại, sản phẩm PCR sẽ được phân tích bằng điện di gel để xác định sự hiện diện và kích thước của các đột biến gen. Phương pháp này cho phép phát hiện nhanh chóng và chính xác các đột biến gen trong mẫu bệnh phẩm.

IV. Ứng dụng thực tiễn và kết quả nghiên cứu đột biến FLT3

Kết quả nghiên cứu về đột biến FLT3 có thể được ứng dụng trong việc xây dựng phác đồ điều trị cho bệnh nhân AML. Việc phát hiện sớm các đột biến gen này giúp bác sĩ đưa ra các quyết định điều trị chính xác hơn, từ đó nâng cao tỷ lệ sống sót cho bệnh nhân. Nghiên cứu cũng cho thấy rằng việc điều trị nhắm vào các đột biến gen có thể cải thiện hiệu quả điều trị và giảm thiểu tác dụng phụ.

4.1. Tác động của đột biến FLT3 đến phác đồ điều trị

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng bệnh nhân có đột biến FLT3 thường có tiên lượng xấu hơn. Do đó, việc phát hiện sớm và điều trị nhắm vào các đột biến gen này là rất quan trọng để cải thiện kết quả điều trị.

4.2. Kết quả nghiên cứu và triển vọng tương lai

Kết quả nghiên cứu về đột biến FLT3 không chỉ giúp cải thiện phương pháp điều trị mà còn mở ra hướng đi mới trong nghiên cứu ung thư bạch cầu. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị mới sẽ giúp nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu đột biến FLT3 ở bệnh nhân AML

Nghiên cứu về đột biến FLT3 trong bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp dòng tủy là một lĩnh vực quan trọng và cần thiết. Việc hiểu rõ về các đột biến gen này sẽ giúp cải thiện phương pháp chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều tiến bộ trong việc điều trị và nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân mắc AML.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu đột biến gen trong điều trị ung thư

Nghiên cứu về đột biến gen không chỉ giúp phát hiện sớm bệnh mà còn hỗ trợ trong việc xây dựng phác đồ điều trị cá nhân hóa cho bệnh nhân. Điều này có thể cải thiện đáng kể hiệu quả điều trị và giảm thiểu tác dụng phụ.

5.2. Hướng đi mới trong nghiên cứu và điều trị ung thư bạch cầu

Tương lai của nghiên cứu về đột biến FLT3 sẽ tiếp tục mở ra những hướng đi mới trong điều trị ung thư bạch cầu. Việc phát triển các liệu pháp nhắm vào các đột biến gen sẽ là chìa khóa để nâng cao hiệu quả điều trị và cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ung thư bạch cầu cấp dòng tủy (AML) là một trong những bệnh lý ác tính tiến triển nhanh của hệ thống tạo máu, chiếm khoảng 66,7% tổng số bệnh nhân ung thư máu điều trị hàng năm tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương. Tỷ lệ mắc bệnh trong cộng đồng ước tính khoảng 1 trên 150.000 cá thể trong thời kỳ thanh thiếu niên. Khoảng 45% bệnh nhân AML có kiểu hình nhiễm sắc thể bình thường khi phân tích tế bào di truyền, gây khó khăn lớn cho công tác tiên lượng nếu chỉ sử dụng các kỹ thuật xét nghiệm hình thái học truyền thống.

Mục tiêu trọng tâm của nghiên cứu là thiết lập quy trình phản ứng chuỗi polymerase (PCR) kết hợp điện di tối ưu nhằm phát hiện đột biến lặp đoạn nội phân tử ngẫu nhiên (FLT3-ITD), đồng thời ứng dụng sàng lọc và phân tích chi tiết đặc điểm phân tử của các đột biến này trên bệnh nhân Việt Nam. Đề tài được thực hiện trên 200 mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân AML chưa qua điều trị và 8 mẫu đối chứng người khỏe mạnh tại Hà Nội trong giai đoạn 2013-2014.

Nghiên cứu mang ý nghĩa thực tiễn to lớn trong việc bổ sung dữ liệu dịch tễ học phân tử cho chuyên ngành huyết học nước nhà. Việc phát hiện chính xác đột biến FLT3-ITD đóng vai trò là một chỉ thị sinh học phân tử độc lập để phân tầng nguy cơ tái phát, rút ngắn thời gian chẩn đoán xuống dưới 48 giờ và định hướng phác đồ điều trị nhắm đích bằng các hoạt chất ức chế Tyrosine Kinase chuyên biệt, nâng cao cơ hội sống sót sau 5 năm cho người bệnh.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên cơ sở phân loại bệnh lý ác tính dòng tủy theo tiêu chuẩn Tổ chức Y tế Thế giới (WHO 2008) kết hợp hệ thống phân loại hình thái học Pháp - Mỹ - Anh (FAB với 8 phân nhóm từ M0 đến M7). Cơ chế bệnh sinh phân tử tập trung vào thụ thể Tyrosine Kinase lớp III được mã hóa bởi gen FLT3 định vị tại nhiễm sắc thể 13q12.2. Gen FLT3 có kích thước 96.735 bp, gồm 24 exon, phiên mã tạo phân tử ARN dài 3.700 bp và khung đọc mở dài 2.979 bp, mã hóa cho protein màng có khối lượng phân tử 160 kDa gồm 993 axit amin.

Bình thường, protein FLT3 tồn tại ở dạng monomer bất hoạt trên bề mặt tế bào gốc tạo máu và chỉ kích hoạt khi liên kết với phối tử ligand đặc hiệu. Khi xuất hiện đột biến lặp đoạn nội phân tử ngẫu nhiên (FLT3-ITD) tại exon 14 và exon 15 (mã hóa vùng cận màng JM), thụ thể FLT3 sẽ tự động dime hóa và tự phosphoryl hóa liên tục mà không cần phối tử. Sự kích hoạt bất thường này truyền tín hiệu xuôi dòng qua các con đường sinh tồn tế bào, làm tế bào non tăng sinh mất kiểm soát và ức chế quá trình chết tự nhiên (apoptosis). Đột biến này thường xuất hiện phối hợp trong nhóm bất thường phân tử cùng các gen NPM1, CEBPA, KIT và MLL.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng cỡ mẫu gồm 208 mẫu máu và dịch tủy (200 mẫu từ bệnh nhân AML được chẩn đoán xác định có tỷ lệ tế bào blast trên 20% theo tiêu chuẩn FAB và 8 mẫu đối chứng người bình thường), thu thập theo phương pháp chọn mẫu thuận tiện lâm sàng qua 4 đợt tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương. Lý do lựa chọn thiết kế mẫu này nhằm đảm bảo tính đại diện cho quần thể bệnh nhân AML chưa can thiệp hóa trị liệu tại miền Bắc.

Phương pháp phân tích phân tử được lựa chọn dựa trên tính chính xác, độ nhạy cao và chi phí hợp lý. Toàn bộ DNA hệ gen được tách chiết bằng cột silica sử dụng bộ kit QIAamp DNA Blood Mini Kit nhằm thu được nồng độ DNA tinh sạch đạt từ 40 đến 50 ng/µl. Kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu 11F (23 nucleotide, tỷ lệ GC đạt 43,5%) và 12R (23 nucleotide, tỷ lệ GC đạt 47,8%) để nhân bản đoạn gen mục tiêu có kích thước chuẩn 330 bp với chu trình nhiệt 35 chu kỳ ở nhiệt độ gắn mồi 56°C.

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 2% và gel acrylamide 12% để phân tích phổ băng đột biến. Để khẳng định chính xác trình tự nucleotide, các băng DNA có kích thước lớn hơn 330 bp được tinh sạch từ gel, gắn vào vector pGEM-T Easy, biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α, sàng lọc khuẩn lạc bằng hệ thống chỉ thị màu trắng - xanh và kiểm tra bằng PCR với mồi pUC19 (cho kích thước 600-700 bp đối với dòng tái tổ hợp) trước khi giải trình tự Sanger hai chiều trên hệ thống máy đọc tự động. Dữ liệu trình tự được đối chiếu và xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng như MEGA 5.0, BLAST và ImageJ.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Thứ nhất, quy trình PCR đã được tối ưu hóa thành công với việc giảm nồng độ mồi từ 2,0 pmol xuống 0,4 pmol giúp triệt tiêu hiện tượng mồi dư, đồng thời sử dụng nồng độ khuôn DNA từ 4,8 đến 6,0 ng/µl trong hỗn dịch phản ứng 25 µl giúp các băng điện di hiển thị sắc nét, phân tách rõ ràng các đột biến có chênh lệch kích thước nhỏ.

Thứ hai, sàng lọc trên 200 mẫu bệnh nhân AML phát hiện 15 mẫu mang đột biến lặp đoạn FLT3-ITD, chiếm tỷ lệ 7,5%. Tỷ lệ đột biến biến thiên theo từng đợt thu mẫu lâm sàng: đợt 1 đạt 2,8% (1/36 mẫu), đợt 2 đạt 16,3% (8/49 mẫu), đợt 3 đạt 5,7% (2/35 mẫu) và đợt 4 đạt 5,0% (4/80 mẫu).

Thứ ba, phân tích phổ băng điện di ghi nhận sự đa dạng về số lượng đột biến trên từng cá thể: 10 trên 15 mẫu (chiếm 66,7%) xuất hiện 1 đột biến ITD đơn lẻ, trong khi 5 trên 15 mẫu (chiếm 33,3% gồm các mẫu 53, 60, 88, 112, 127) xuất hiện đồng thời 2 đột biến ITD với 2 băng kích thước lớn hơn băng chuẩn.

Thứ tư, xác định kích thước đoạn lặp qua đường chuẩn semi-log-plot với phương trình hồi quy tuyến tính y = -0,6346 (hệ số xác định R² = 0,9974) cho thấy kích thước đoạn chèn dao động từ 26 bp đến 73 bp. Kết quả giải trình tự Sanger khẳng định kích thước đột biến thực tế nằm trong khoảng từ 32 bp đến 90 bp (điển hình như mẫu 20 lặp 33 bp, mẫu 57 lặp 51 bp và mẫu 71 lặp 32 bp).

Thảo luận kết quả

Tỷ lệ phát hiện đột biến FLT3-ITD 7,5% trong nghiên cứu này thấp hơn so với tỷ lệ 20,4% trên 979 bệnh nhân tại Mỹ của tác giả Christian Thiede (năm 2002) hay tỷ lệ 23,5% trên 234 bệnh nhân tại Đức của tác giả Susanne Schnittger, nhưng tương đương với tỷ lệ 7,0% của nhóm nghiên cứu Yamamoto tại Nhật Bản và 12,0% trong nghiên cứu trên 630 bệnh nhân của tác giả Meshinchi (năm 2008). Sự khác biệt này bắt nguồn từ các yếu tố ngẫu nhiên khi thu thập mẫu như độ tuổi bệnh nhân, tỷ lệ phân bố các thể bệnh theo FAB (M1, M2, M4) và các yếu tố dịch tễ học chủng tộc.

Các dữ liệu nghiên cứu có thể được trực quan hóa hiệu quả thông qua biểu đồ phân bố tần suất đột biến theo các đợt thu mẫu lâm sàng và bảng ma trận so sánh kích thước đoạn lặp đo bằng độ di động điện di (Rf) so với kết quả giải trình tự nucleotide thực tế. Kết quả cho thấy phương pháp đo độ di động điện di cho kích thước ước tính thấp hơn kích thước thực tế khoảng 5 đến 15 bp do ảnh hưởng của cấu trúc không gian DNA.

Về mặt sinh học và điều trị, sự hiện diện của đột biến FLT3-ITD làm thụ thể Tyrosine Kinase luôn ở trạng thái mở, thúc đẩy tế bào non kháng lại các phác đồ hóa trị chuẩn như cytosine arabinoside kết hợp anthracycline. Do đó, bệnh nhân mang đột biến này có thời gian thuyên giảm bệnh ngắn và tỷ lệ tái phát cao, đòi hỏi phải can thiệp sớm bằng các thuốc ức chế Tyrosine Kinase thế hệ mới như Sorafenib, Sunitinib hoặc Midostaurin phối hợp ghép tủy dị thân.

Đề xuất và khuyến nghị

Thứ nhất, chuẩn hóa và chuyển giao quy trình xét nghiệm PCR phát hiện đột biến FLT3-ITD thành quy trình kỹ thuật thường quy tại các bệnh viện chuyên khoa huyết học trên toàn quốc. Mục tiêu hướng tới là 100% bệnh nhân AML mới tiếp nhận được chẩn đoán phân tử trong vòng 24 đến 48 giờ kể từ khi nhập viện, thực hiện bởi các kỹ thuật viên và bác sĩ xét nghiệm thuộc khoa Di truyền Sinh học phân tử trong giai đoạn 2026-2027.

Thứ hai, tích hợp chỉ thị đột biến FLT3-ITD vào hướng dẫn phân tầng nguy cơ điều trị lâm sàng. Bác sĩ điều trị Huyết học cần chỉ định phác đồ phối hợp thuốc ức chế Tyrosine Kinase (như Midostaurin hoặc Sorafenib) với hóa trị chuẩn hoặc phác đồ kết hợp all-trans retinoic acid (ATRA) nhằm cải thiện tỷ lệ lui bệnh hoàn toàn thêm 15% đến 20% cho nhóm bệnh nhân mang đột biến trong vòng 12 tháng tới.

Thứ ba, thiết lập mạng lưới theo dõi dịch tễ học phân tử đa trung tâm đối với bệnh bạch cầu cấp. Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương phối hợp cùng các trường đại học y dược mở rộng quy mô nghiên cứu lên trên 1.000 mẫu bệnh nhân, theo dõi dọc chỉ số sống sót toàn bộ (OS) và thời gian sống không bệnh (DFS) theo lộ trình từ 3 đến 5 năm.

Thứ tư, nâng cấp công nghệ chẩn đoán bằng cách kết hợp kỹ thuật PCR kỹ thuật số (ddPCR) và giải trình tự gen thế hệ mới (NGS). Giải pháp này giúp các đơn vị nghiên cứu y sinh kiểm soát tải lượng đột biến dưới ngưỡng 0,01%, đánh giá chính xác tình trạng bệnh tồn lưu tối thiểu (MRD) để điều chỉnh kịp thời liều lượng thuốc ức chế kinase cho người bệnh.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nhóm bác sĩ lâm sàng chuyên khoa Huyết học và Ung bướu: Sử dụng các số liệu về tỷ lệ đột biến và cơ chế kháng thuốc của FLT3-ITD để xây dựng phác đồ hóa trị tấn công cá thể hóa, chỉ định thời điểm ghép tế bào gốc tạo máu phù hợp nhằm hạn chế nguy cơ tái phát cho bệnh nhân.

Nhóm nghiên cứu sinh, học viên cao học ngành Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học: Khai thác chi tiết các thông số kỹ thuật tối ưu hóa phản ứng PCR (nồng độ mồi 0,4 pmol, nhiệt độ gắn 56°C), kỹ thuật nhân dòng plasmid pGEM-T Easy và phương pháp tinh sạch DNA từ gel phục vụ cho các đề tài nghiên cứu đột biến gen liên quan đến ung thư.

Nhóm kỹ thuật viên xét nghiệm tại các phòng xét nghiệm di truyền y học: Tham khảo quy trình sàng lọc 3 bước nhanh gọn, tiết kiệm chi phí hóa chất bằng DreamTaq và phương pháp tính toán kích thước đoạn lặp bằng phần mềm semi-log-plot để triển khai xét nghiệm chẩn đoán ban đầu.

Nhóm chuyên gia nghiên cứu và phát triển dược phẩm sinh học: Ứng dụng dữ liệu biến thiên cấu trúc vùng cận màng exon 14 và 15 để thiết kế, sàng lọc các hợp chất phân tử nhỏ có hoạt tính ức chế chọn lọc thụ thể Tyrosine Kinase lớp III nhằm phát triển thuốc điều trị trúng đích tại Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

Đột biến FLT3-ITD ảnh hưởng như thế nào đến tiên lượng của bệnh nhân mắc ung thư bạch cầu cấp dòng tủy?

Đột biến FLT3-ITD là yếu tố tiên lượng xấu độc lập trong bệnh lý AML. Khi xảy ra lặp đoạn tại exon 14 và 15, thụ thể Tyrosine Kinase liên tục kích hoạt khiến tế bào ác tính tăng sinh không ngừng. Bệnh nhân mang đột biến này thường có tỷ lệ tái phát sau điều trị hóa chất cao hơn và thời gian sống không bệnh ngắn hơn đáng kể so với nhóm không mang đột biến.

Tại sao tỷ lệ phát hiện đột biến FLT3-ITD trong nghiên cứu này là 7,5%, thấp hơn so với một số nghiên cứu trên thế giới?

Tỷ lệ 7,5% (15/200 mẫu) phản ánh tính đặc thù của cỡ mẫu khảo sát ban đầu tại một trung tâm điều trị. Tỷ lệ đột biến giữa 4 đợt lấy mẫu dao động từ 2,8% đến 16,3%, cho thấy tần suất biến thiên phụ thuộc vào độ tuổi, phân loại thể bệnh theo hệ thống FAB và số lượng bệnh nhân thu thập trong từng giai đoạn nghiên cứu.

Tại sao cần tối ưu hóa nồng độ mồi từ 2,0 pmol xuống 0,4 pmol trong phản ứng PCR?

Nồng độ mồi ban đầu 2,0 pmol quá cao dẫn đến hiện tượng mồi dư, tạo các vệt mờ không đặc hiệu trên bản gel điện di. Việc hạ nồng độ mồi xuống 0,4 pmol giúp phản ứng PCR đạt hiệu suất khuếch đại tối đa, tạo băng DNA 330 bp sắc nét và tiết kiệm chi phí hóa chất cho mỗi mẻ xét nghiệm chẩn đoán.

Mục đích của việc nhân dòng sản phẩm PCR vào vector tái tổ hợp trước khi giải trình tự là gì?

Giải trình tự trực tiếp từ sản phẩm tinh sạch trên gel có thể gặp sai số như mất nucleotide hoặc nhầm lẫn chân tín hiệu do nồng độ thấp. Việc đưa đoạn DNA vào vector pGEM-T Easy và biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α giúp nhân bản chính xác đoạn chèn, đảm bảo đọc được trình tự nucleotide rõ ràng và tin cậy tuyệt đối.

Các chất ức chế Tyrosine Kinase hoạt động như thế nào trong điều trị bệnh nhân có đột biến FLT3?

Các chất ức chế Tyrosine Kinase (như Sunitinib, Sorafenib hoặc Midostaurin) cạnh tranh vị trí gắn phân tử ATP tại vùng xúc tác của enzyme kinase. Sự gắn kết này ngăn chặn quá trình tự phosphoryl hóa của thụ thể FLT3 đột biến, cắt đứt các tín hiệu dẫn truyền sinh ung thư và kích hoạt quá trình chết tự nhiên của tế bào bạch cầu ác tính.

Kết luận

• Thiết lập thành công quy trình kỹ thuật PCR kết hợp điện di gel agarose tối ưu hóa với nồng độ mồi 0,4 pmol và nhiệt độ gắn 56°C để phát hiện chính xác đột biến FLT3-ITD.
• Phát hiện 15 trên 200 bệnh nhân AML mang đột biến FLT3-ITD (tỷ lệ 7,5%), trong đó có 66,7% mẫu mang 1 đột biến và 33,3% mẫu mang đồng thời 2 đột biến lặp đoạn.
• Xác định kích thước đoạn lặp biến thiên rộng từ 32 bp đến 90 bp trên exon 14 và 15, làm thay đổi cấu trúc không gian vùng cận màng của thụ thể Tyrosine Kinase.
• Khẳng định giá trị của phương pháp giải trình tự Sanger thông qua nhân dòng plasmid trong việc cung cấp dữ liệu cấu trúc nucleotide chính xác tuyệt đối phục vụ nghiên cứu phân tử.
• Cung cấp cơ sở khoa học vững chắc để các đơn vị y tế triển khai xét nghiệm chẩn đoán gen thường quy và ứng dụng liệu pháp điều trị nhắm đích trong giai đoạn 2026-2028.

Để nâng cao chất lượng chẩn đoán và điều trị bệnh ung thư máu tại Việt Nam, các cơ sở y tế và viện nghiên cứu cần nhanh chóng áp dụng quy trình xét nghiệm phân tử này vào thực tiễn lâm sàng, đồng thời mở rộng quy mô hợp tác đa trung tâm nhằm tối ưu hóa phác đồ điều trị nhắm đích cho người bệnh.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Hiện nay, di truyền học nghiên cứu về các đặc điểm sinh học ở cấp độ phân tử (gen và hệ gen) ngày càng được xem một tiêu chuẩn quan trọng trong chẩn đoán và tiên lượng các loại bệnh, trong đó có bệnh ung thư bạch cầu. Ung thư bạch cầu được chia làm 4 loại tùy theo tính chất cấp tính hay mạn tính và phân loại tế bào dòng tủy hay dòng lympho. Và theo thống kê trên thế giới, ung thư bạch cầu cấp dòng tủy (AML) là loại có mức độ phổ biến cao và bộc phát nhanh nên được quan tâm nhất. Các bác sĩ thường tiến hành các xét nghiệm di truyền đối với bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp dòng tủy, nhằm quyết định phác đồ điều trị đặc hiệu cho người bệnh để đạt được kết quả tốt nhất.

Hầu hết bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp dòng tủy đạt tỉ lệ lui bệnh 100% sau một đợt điều trị tấn công, 75- 80% lui bệnh hoàn toàn trên 5 năm và phần nhiều trong số đó có thể coi là đã được chữa khỏi. Ung thư bạch cầu cấp dòng tủy có đặc điểm là các tế bào tăng sinh không kiểm soát, chưa biệt hoá, gọi là tế bào non, cùng với các đặc điểm tế bào dòng tuỷ. Tỷ lệ mắc là 1/150.000 trong suốt thời kỳ niên thiếu và dậy thì. Thố ng kê cho thấ y , mỗi năm số bê ̣nh nhân vào Viê ̣n Huyế t h ọc Truyền máu trung ương đều gia tăng , và trong tổ ng số bê ̣nh nhân bi ̣ung thư máu có tới 2/3 bê ̣nh nhân ung thư ba ̣ch cầ u cấ p dòng tủy.

Hầu hết các trường hợp này đều không có nguyên nhân rõ ràng. Tuy nhiên, một số nghiên cứu đã chỉ ra mối liên quan giữa tỷ lệ mắc bệnh và các yếu tố liên quan như nhiễm phóng xạ, tiếp xúc với hóa chất, hoặc kèm theo mắc các bệnh khác như thiếu máu Fanconi hay hội chứng Down. Ngoài ra, ung thư bạch cầu cấp dòng tủy phát sinh do các thay đổi bất thường (đột biến) trong tế bào gốc tạo bạch cầu gây ra trong đời sống của một cá thể, làm rối loạn quá trình sản sinh bạch cầu, tạo ra nhiều tế bào bạch cầu bất thường, dẫn đến mất chức năng bảo vệ cơ thể. Nếu không được chẩn đoán, điều trị kịp thời và hiệu quả, bệnh nhân AML có thể tử vong do bị nhiễm trùng, chảy máu, thiếu máu.

Những bệnh nhân đã phát hiện ra bệnh ung thư bạch cầu cấp thường sẽ được điều trị ngay, nhằm tiêu diệt các tế bào bạch cầu ác tính và để tuỷ xương phục hồi 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung trở lại bình thường. Điều trị hoá chất là phương thức điều trị chính đối với bệnh ung thư bạch cầu cấp. Thông thường, sự kết hợp giữa các thuốc hoá chất (các thuốc steroid) được sử dụng theo một kế hoạch điều trị (thường được gọi là một phác đồ). Điều trị hóa chất được chia làm nhiều giai đoạn: điều trị tấn công, điều trị dự phòng thâm nhiễm hệ thần kinh trung ương, điều trị duy trì.

Ngoài điều trị bằng hóa chất, bệnh nhân AML có thể được điều trị theo một số phương pháp khác: ghép tuỷ xương, tia xạ khối u. Yếu tố tiên lượng là yếu tố quan trọng nhất để xây dựng các phác đồ điều trị trên các bệnh nhân có kết quả di truyền tế bào bình thường. Một số yếu tố tiên lượng tốt là các biến đổi ở mức độ phân tử (gen và ADN) thường xuyên xuất hiện ở các bệnh nhân leukemia cấp dòng tủy, như: đột biến gen NPM1 và gen CEBPA. Tuy nhiên, sự có mặt của đột biến nhân đoạn của gen FLT3 là một yếu tố tiên lượng xấu.

Chẩn đoán chính xác đột biến gây bệnh là công đoạn mang tính chất quyết định trong việc đưa ra tiên lượng và phác đồ điều trị cho bệnh nhân. Đối với bệnh nhân AML, điều này góp phần quan trọng để tăng hiệu quả chữa bệnh cũng như khả năng sống sót. Các đột biến gen thường gặp ở bệnh nhân AML đã được nghiên cứu nhiều trên thế giới, nhưng ở Việt Nam hiện vẫn chưa có một nghiên cứu nàothống kê đầy đủ về loại đột biến cũng như tỉ lệ đột biến, và nghiên cứu các đặc điểm phân tử của các đột biến này. Đây là một thiếu sót lớn trong việc đưa ra phương pháp điều trị chính xác và kịp thời nhất.

Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu tập trung vào đột biến trên gen FLT3 có tên:“Sàng lọc và phân tích đặc điểm phân tử các đột biến FLT3 xuất hiện trên bệnh nhân mắc bệnh ung thƣ bạch cầu cấp dòng tủy ở Việt Nam”với các mục tiêu: 1. Thiết lập quy trình sàng lọc các đột biến FLT3-ITD trên bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp dòng tủy. Bước đầu ứng dụng quy trình đã xây dựng để sàng lọc các đột biến FLT3-ITD trên bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp dòng tủy trong quy mô phòng thí nghiệm. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung 3.

Phân tích các đặc điểm phân tử của các đột biến FLT3-ITD tìm được. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Bệnh ung thƣ bạch cầu cấp dòng tủy (Acute Myeloid Leukemia-AML) Tất cả các tế bào máu do tuỷ xương tạo ra, bao gồm:hồng cầu: mang oxy đi khắp cơ thể; bạch cầu: chống lại các vi sinh vật lạ xâm nhập vào cơ thể, bảo vệ cơ thể khỏi các bệnh nhiễm trùng; tiểu cầu: giúp hình thành cục máu đông trong quá trình đông máu. Có nhiều loại bạch cầu xuất phát từ hai dòng tế bào khác nhau: dòng tế bào lympho (T và B) và dòng tuỷ (bạch cầu đơn nhân, ưa axit, ưa kiềm và trung tính) (Hình 1.1: Sự phát sinh các loại tế bào máu [55] Bạch cầu có nhiệm vụ chống vi khuẩn, protein lạ xâm nhập vào cơ thể, tạo khả năng miễn dịch của cơ thể đối với nhiều bệnh do virus và vi khuẩn gây nên.

Bình thường, các tế bào bạch cầu tự sửa chữa và tái sinh theo con đường được kiểm soát [55]. Tuy nhiên, trong một số trường hợp quá trình này thoát khỏi sự kiểm soát và các tế bào tiếp tục phân chia, nhưng không trưởng thành, chiếm đầy trong tuỷ xương và ngăn cản sự tạo ra các tế bào máu khoẻ mạnh. Nguy hiểm hơn là, các tế bào bạch cầu ác tính không trưởng thành, không thực hiện được chức năng bình 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung thường của chúng, dẫn tới nguy cơ nhiễm khuẩn tăng. Hơn nữa, tuỷ xương không sản xuất đủ hồng cầu và tiểu cầu khoẻ mạnh, hậu quả là xuất hiện các triệu chứng như thiếu máu và ban đỏ.

Bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy là một trong bốn loại ung thư bạch cầu. Đây là một bệnh lý của tủy xương, do sự chuyển dạng bất thường của tế bào nguồn tạo máu, từ đó đưa đến các dòng tế bào không biệt hóa hay biệt hóa bất thường. Mỗi loại bệnh ung thư bạch cầu có đặc trưng và cách điều trị riêng[49]. Vậy thì nguyên nhân của bệnh ung thư bạch cầu là gì? Cho đến nay, nguyên nhân chính xác của các bệnh ung thư bạch cầu vẫn chưa được khẳng định rõ ràng, đầy đủ.

Các nhà nghiên cứu đang cố gắng tìm ra nguyên nhân có khả năng gây ra bệnh này. Một số nghiên cứu về AML tập trung vào việc tìm hiểu về trẻ em mắc các rối loạn di truyền, như hội chứng Down, được cho rằng có nguy cơ phát triển thành bệnh ung thư bạch cầu cao. Nguy cơ này cũng tăng nhẹ đối với anh chị em của những bệnh nhân AML, mặc dù nguy cơ này vẫn còn ít. Trong những năm gần đây, một số công bố cho thấy các trẻ em sống ở gần các nhà máy hạt nhân hơn hoặc ở gần các đường điện cao thế có nguy cơ mắc bệnh AML cao hơn, tuy nhiên, chưa có bằng chứng xác thực nào[34], [44].

Đặc trưng về mặt dịch tễ của bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy là giống như các loại ung thư khác, không lây nhiễm và không thể truyền sang cho người khác được. Khi các tế bào bạch cầu ác tính nhân lên trong tuỷ xương, sự sản xuất các tế bào máu giảm. Do đó bệnh nhân có thể có một số triệu chứng sau: mệt mỏi và khó chịu do thiếu máu, trên cơ thể xuất hiện các vết thâm tím và chảy máu kéo dài do thiếu tiểu cầu trong máu. Đôi khi, bệnh nhân bị nhiễm khuẩn vì số lượng bạch cầu bình thường thấp.

Một số bệnh nhân có các cơn đau ở các chi hoặc có thể sưng hạch lympho. Đầu tiên, các triệu chứng của bệnh giống như các triệu chứng của bệnh cúm, nhưng khi bệnh kéo dài hơn 1 hoặc 2 tuần thì có thể chẩn đoán rõ ràng. Sau khi các xét nghiệm di truyền được thực hiện, bệnh nhân nên được điều trị hoá chất ngay, nhằm tiêu diệt tế bào non trong tuỷ xương để đẩy lui bệnh ngay sau đợt điều trị tấn công đầu tiên này. Tiếp theo, bác sĩ có thể đánh giá lại tiên lượng và 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Đỗ Thị Thanh Trung quyết định thay đổi liều lượng hay số liệu trình điều trị, hoặc chuyển sang phương pháp ghép tuỷ xương [2], [4].

Thực trạng bệnh ung thƣ bạch cầu cấp dòng tủy và tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam 1. Tổng quan tình hình nghiên cứu trên thế giới Hiện nay, tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu cấp, trong đó có bạch cầu cấp dòng tủy ngày càng tăng cao. Hơn nữa, tỷ lệ tử vong do chưa có phương thức chẩn đoán và điều trị kịp thời cũng rất lớn. Vì vậy, nhiều nhà khoa học đã tiến hành các nghiên cứu nhằm tìm ra các phương pháp chẩn đoán, phân biệt các loại bệnh ung thư bạch cầu dựa trên đặc điểm di truyền học nhằm có sự chẩn đoán chính xác, giúp điều trị hướng đích hiệu quả hơn.

Các nhà nghiên cứu đã xác định sự thay đổi trong vật chất di truyền của người bệnh có hai cấp độ là: đột biến nhiễm sắc thể và đột biến gen. Khoảng 55% bệnh nhân AML có đột biến nhiễm sắc thể, được tìm thấy khi quan sát tiêu bản tế bào (karyotyping). Tuy nhiên, 45% bệnh nhân AML còn lại lại có kiểu hình NST bình thường (AML-NK) không thể phát hiện được (Hình 1. Từ đó, nhiều nghiên cứu đã chuyển hướng nhằm phát hiện ra các đột biến gen trên các gen khác nhau ở bệnh nhân AML.