Luận văn thạc sĩ nghiên cứu tinh chế hoạt chất ức chế enzyme α glucosidase từ đậu đen lên men bằng chủng aspergillus oryzae

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu tinh chế hoạt chất ức chế enzyme α glucosidase từ đậu đen lên men bằng chủng Aspergillus oryzae, ứng dụng tiềm năng trong y học.

• Tác giả: Phạm Thanh Dung
• Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Đức Tiến - Trưởng Bộ môn Nghiên cứu phụ phẩm và môi trường Nông nghiệp - Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ Sau thu hoạch
• Trường học: Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm
• Đề tài: Nghiên cứu tinh chế hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ đậu đen lên men bằng chủng Aspergillus oryzae
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Đặt vấn đề
• 1.2. Mục đích
• 1.3. Yêu cầu
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Đậu đen lên men
• 2.2. Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae (A.oryzae)
• 2.3. Một số ứng dụng của hoạt chất AGIs từ đậu lên men trên thế giới
• 2.4. Hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase (AGIs)
• 2.4.1. Giới thiệu về enzyme α-glucosidase
• 2.4.2. Giới thiệu về hoạt chất AGIs
• 2.4.2.1. Nguồn sản xuất hoạt chất AGIs
• 2.4.3. Cơ chế tác dụng của AGIs trong điều trị bệnh tiểu đường tuýp 2
• 2.4.4. Ảnh hưởng của hoạt chất AGIs đến quá trình trao đổi đường trong cơ thể
• 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.3. Hoá chất và thiết bị sử dụng
• 3.4. Nội dung nghiên cứu
• 3.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng quá trình kết tủa bằng ethanol đến hiệu quả tinh chế hoạt chất AGIs
• 3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng quá trình cô đặc đến thu nhận hoạt chất AGIs
• 3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình lọc gel đến hiệu quả tinh chế hoạt chất AGIs
• 3.4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của bao bì bảo quản đến chất lượng sản phẩm
• 3.5. Đánh giá chất lượng sản phẩm và đưa ra quy trình tinh chế hoạt chất AGIs
• 3.6. Phương pháp nghiên cứu
• 3.7. Phương pháp bố trí thí nghiệm
• 3.8. Phương pháp phân tích chỉ tiêu hóa lý
• 3.9. Quy trình tinh chế sơ bộ hoạt chất AGIs
• 3.10. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng quá trình kết tủa bằng ethanol đến hiệu quả tinh chế hoạt chất AGIs từ đậu đen lên men
• 4.2. Lựa chọn nồng độ ethanol đến hiệu quả tinh chế hoạt chất AGIs từ đậu đen lên men
• 4.3. Lựa chọn tỷ lệ dung môi đến hiệu quả tinh chế hoạt chất AGIs từ dịch trích ly đậu đen lên men
• 4.4. Lựa chọn nhiệt độ đến hiệu quả tinh chế hoạt chất AGIs từ dịch trích ly đậu đen lên men
• 4.5. Tối ưu hóa nhiệt độ, nồng độ, tỷ lệ dung môi, đến hiệu quả tinh chế hoạt chất AGIs
• 4.6. Nghiên cứu ảnh hưởng quá trình cô đặc đến thu nhận hoạt chất AGIs
• 4.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ cô đặc đến thu nhận hoạt chất AGIs
• 4.8. Xác định áp suất chân không cho quá trình cô dịch
• 4.9. Nghiên cứu tinh chế hoạt chất ức chế hoạt chất AGIs bằng phương pháp lọc gel
• 4.10. Nghiên cứu bao bì bảo quản chế phẩm AGIs
• 4.11. Đánh giá chất lượng sản phẩm và đưa ra quy trình tinh chế AGIs từ đậu đen lên men
• 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về nghiên cứu

Nghiên cứu này tập trung vào việc tinh chế hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ đậu đen lên men bằng chủng Aspergillus oryzae. Hoạt chất này có vai trò quan trọng trong việc điều hòa lượng đường huyết, đặc biệt cho những người mắc bệnh tiểu đường. Việc tinh chế hoạt chất là cần thiết để loại bỏ tạp chất và nâng cao hiệu quả sử dụng. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng hoạt chất sinh học từ đậu đen có thể giúp ổn định đường huyết mà không gây tác dụng phụ như các sản phẩm tổng hợp hóa học. Theo tác giả Nguyễn Đức Tiến, việc lựa chọn chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp hoạt chất này là rất quan trọng để đạt được hiệu quả cao nhất.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là tinh chế hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ đậu đen lên men. Nghiên cứu sẽ xem xét ảnh hưởng của các yếu tố như nồng độ ethanol, tỷ lệ dung môi, và nhiệt độ đến hiệu quả tinh chế hoạt chất. Việc này không chỉ giúp nâng cao chất lượng sản phẩm mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các sản phẩm thực phẩm chức năng có lợi cho sức khỏe.

II. Tình hình nghiên cứu hoạt chất AGIs

Hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase (AGIs) đã được nghiên cứu rộng rãi trên thế giới. Nhiều công trình đã chỉ ra rằng đậu đen lên men chứa hàm lượng AGIs cao, có khả năng hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường. Các nghiên cứu cho thấy rằng hoạt chất sinh học này có thể giảm lượng đường huyết và cholesterol trong cơ thể. Việc sử dụng Aspergillus oryzae trong quá trình lên men giúp tăng cường khả năng sinh tổng hợp AGIs, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị. Nghiên cứu của Hiroyuki Fujita cho thấy chiết xuất từ đậu lên men có hàm lượng IC50 rất thấp, cho thấy tính hiệu quả cao trong việc ức chế enzyme này.

2.1. Ứng dụng của AGIs trong y học

AGIs được ứng dụng trong nhiều sản phẩm dược phẩm và thực phẩm chức năng. Chúng có khả năng ngăn cản sự hấp thụ glucose từ ruột, từ đó giúp kiểm soát lượng đường huyết. Các sản phẩm chứa AGIs như viên nén, viên nang, và các loại trà bổ sung đang ngày càng được ưa chuộng. Nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng AGIs từ đậu đen lên men không chỉ an toàn mà còn hiệu quả hơn so với các sản phẩm tổng hợp hóa học, nhờ vào tính tự nhiên và khả năng tương thích với cơ thể.

III. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp hiện đại để tinh chế hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase. Các phương pháp bao gồm kết tủa bằng ethanol, cô đặc, và sắc ký lọc gel. Mỗi phương pháp đều có những ưu điểm riêng, giúp tối ưu hóa quá trình tinh chế hoạt chất. Việc nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố như nồng độ ethanol, tỷ lệ dung môi, và nhiệt độ đến hiệu quả tinh chế hoạt chất là rất quan trọng. Kết quả từ các thí nghiệm sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển quy trình sản xuất AGIs từ đậu đen lên men.

3.1. Thiết kế thí nghiệm

Thiết kế thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp ngẫu nhiên hoàn toàn, với các yếu tố được kiểm soát chặt chẽ. Các mẫu sẽ được phân tích để xác định hàm lượng AGIs và các tạp chất có trong sản phẩm. Kết quả sẽ được so sánh với các tiêu chuẩn đã được công nhận để đánh giá chất lượng sản phẩm. Phương pháp này không chỉ giúp xác định hiệu quả của từng bước trong quy trình tinh chế hoạt chất mà còn cung cấp thông tin cần thiết cho việc cải tiến quy trình sản xuất trong tương lai.

IV. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng việc tinh chế hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ đậu đen lên men bằng Aspergillus oryzae mang lại hiệu quả cao. Các yếu tố như nồng độ ethanol và nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến hiệu quả tinh chế hoạt chất. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng sản phẩm thu được có chất lượng tốt, đáp ứng được yêu cầu của thị trường thực phẩm chức năng. Việc sử dụng đậu đen lên men không chỉ giúp nâng cao giá trị dinh dưỡng mà còn mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm mới trong ngành thực phẩm và dược phẩm.

4.1. Đánh giá chất lượng sản phẩm

Chất lượng sản phẩm được đánh giá dựa trên các chỉ tiêu hóa lý và sinh học. Kết quả cho thấy sản phẩm có hàm lượng AGIs cao, đồng thời không chứa các tạp chất độc hại. Điều này khẳng định tính an toàn và hiệu quả của sản phẩm trong việc hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường. Nghiên cứu cũng đề xuất quy trình bảo quản sản phẩm để duy trì chất lượng trong thời gian dài, từ đó đảm bảo lợi ích cho người tiêu dùng.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Đái tháo đường (ĐTĐ), đặc biệt là ĐTĐ tuýp 2, đang là một trong những thách thức y tế toàn cầu nghiêm trọng nhất thế kỷ 21. Theo thống kê của Hiệp hội Đái tháo đường Thế giới (IDF) và Bộ Y tế Việt Nam, cả nước hiện có khoảng 4,5 triệu người mắc bệnh, trong đó trên 65% trường hợp được chẩn đoán muộn và trên 90% thuộc thể tiểu đường tuýp 2 (không phụ thuộc insulin). Xu hướng này dự báo sẽ tăng lên 7 triệu người vào năm 2025.

Hoạt chất ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase (Alpha-Glucosidase Inhibitors - AGIs) đóng vai trò trung tâm trong phác đồ can thiệp dinh dưỡng và điều trị. Bằng cơ chế ức chế cạnh tranh tại trung tâm hoạt động mang acid carboxylic của enzyme $\alpha$-glucosidase ở niêm mạc ruột non, AGIs làm chậm quá trình thủy phân disaccharide/oligosaccharide thành glucose, ngăn chặn hiện tượng tăng đường huyết đột ngột sau ăn (postprandial hyperglycemia) và kích thích giải phóng hormone GLP-1/GLP-2.

Tuy nhiên, các giải pháp điều trị và phòng ngừa hiện nay đang đối mặt với nhiều bất cập lớn:

• Tác dụng phụ của thuốc tổng hợp hóa học: Các hoạt chất phổ biến như Acarbose hay Voglibose thường gây rối loạn tiêu hóa nghiêm trọng, chướng bụng, tiêu chảy và nguy cơ tổn thương chức năng gan khi dùng kéo dài.
• Chi phí chiết xuất tự nhiên cao: Nguồn AGIs chiết xuất từ thảo dược (như 1-deoxynojirimycin - DNJ trong lá dâu tằm) có quy trình phân lập phức tạp, sản lượng thấp và chi phí nguyên liệu đắt đỏ.
• Chất lượng dịch trích ly thô chưa đạt chuẩn: Quá trình lên men đậu đen (Vigna unguiculata) bằng chủng nấm mốc Aspergillus oryzae tạo ra dịch trích thô có hoạt tính ức chế 86,8% ($IC_{50} = 5,4\text{ mg/mL}$), nhưng chứa từ 30% đến 90% tạp chất cao phân tử ($\text{MW} \ge 3000\text{ Da}$) làm giảm độ tinh khiết và hạn chế khả năng ứng dụng công nghiệp.

Dự án "Nghiên cứu tinh chế hoạt chất ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase từ đậu đen lên men bằng chủng Aspergillus oryzae" được thực hiện nhằm giải quyết triệt để các rào cản trên thông qua 5 mục tiêu cụ thể:

1. Khảo sát và xác định các thông số đơn yếu tố (nồng độ dung môi, tỷ lệ dịch cô/dung môi, nhiệt độ) trong quá trình kết tủa phân đoạn bằng ethanol.
2. Ứng dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM) theo mô hình Box-Behnken để tối ưu hóa đồng thời các yếu tố công nghệ.
3. Xác định chế độ cô đặc chân không tối ưu nhằm thu hồi dung môi và làm giàu hoạt chất mà không gây biến tính nhiệt.
4. Tinh sạch bán phần qua sắc ký lọc gel Sephadex G-25 và kiểm chứng chất lượng qua HPLC.
5. Đánh giá độ ổn định của chế phẩm trên bao bì màng phức hợp Kraft đa lớp trong 3 tháng bảo quản.

Phạm vi nghiên cứu giới hạn ở quy mô phòng thí nghiệm và pilot 10L tại Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ Sau thu hoạch, đánh giá hoạt tính in vitro bằng phản ứng đo quang phổ với cơ chất 4-nitrophenyl $\alpha$-D-glucopyranoside (4-PNP).

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Tiêu chí phân tích	Thuốc hóa dược tổng hợp (Acarbose / Voglibose)	Chiết xuất thảo dược (DNJ từ Lá dâu tằm)	Dịch thô đậu đen lên men (Chưa tinh chế)	Hoạt chất AGIs tinh chế (A. oryzae)
Cơ chế tác động	Ức chế cạnh tranh tổng hợp	Ức chế enzyme thực vật	Hỗn hợp enzyme & peptide	Ức chế chọn lọc ($\text{MW} < 3000\text{ Da}$)
Hiệu lực ($IC_{50}$)	Rất cao ($0,01 - 0,1\text{ mg/mL}$)	Trung bình ($1,2 - 2,5\text{ mg/mL}$)	Thấp ($5,4\text{ mg/mL}$)	Cao ($3,1\text{ mg/mL}$)
Độ an toàn sinh học	Gây rối loạn tiêu hóa, đau dạ dày	An toàn tự nhiên	Chứa tạp chất cao phân tử	An toàn tuyệt đối (Chuẩn GRAS)
Chi phí sản xuất	Cao (Tổng hợp hữu cơ phức tạp)	Rất cao (Hiệu suất tách thấp)	Thấp (Lên men cơ bản)	Tối ưu (Dung môi tái hồi lưu)
Quy mô thương mại	Thuốc kê đơn (Rx)	Thực phẩm chức năng cao cấp	Khó đóng gói/bảo quản	Nguyên liệu TPCN đa dụng

Yêu cầu kỹ thuật theo mô hình MoSCoW:

• Must have: Hoạt tính ức chế $\alpha$-glucosidase sau tinh chế $\ge 90%$; loại bỏ $\ge 85%$ protein/polysaccharide tạp ($\text{MW} \ge 3000\text{ Da}$); dung môi tinh chế an toàn (Ethanol thực phẩm).
• Should have: Hệ số tương quan mô hình tối ưu $R^2 \ge 0,95$; quy trình cô đặc chân không duy trì nhiệt độ $\le 80^\circ\text{C}$ để bảo vệ hoạt tính.
• Could have: Ứng dụng hệ thống sắc ký cột Sephadex G-25 để định lượng cấu trúc phân tử thấp (khoảng $360,1\text{ Da}$).
• Won't have (this phase): Thử nghiệm lâm sàng in vivo trên người và thương mại hóa dạng thuốc tiêm.

Thiết kế hệ thống

Quy trình công nghệ tinh chế hoạt chất AGIs được thiết kế tích hợp theo chuỗi xử lý liên tục:

[Đậu đen lên men A. oryzae]
[Nghiền đồng thể + Sóng siêu âm 10 phút]
[Kết tủa phân đoạn: Ethanol 90,6%, 29,5°C, Tỷ lệ 1/2,58 (g/mL)]
    [Pha kết tủa (Tạp MW ≥ 3000 Da)]        [Pha dịch lỏng (AGIs MW < 3000 Da)]
    (Hoạt tính thấp: 5,8%)                  (Hoạt tính cao: 91,20%)
                                            [Lọc qua giấy lọc định lượng]
                                            [Sắc ký lọc gel Sephadex G-25]
                                            (Cột 3,0 x 35 cm, Flow: 1,3 mL/min)
                                            [Kiểm tra HPLC C18 (Gradient ACN)]
                                            [Cô chân không & Sấy vô trùng]
                                            [Đóng gói túi Kraft 6 lớp Al foil]

Danh mục thiết bị và công nghệ chuẩn hóa:

• Phần mềm mô hình hóa: Design-Expert v7.0 (Stat-Ease Inc., Box-Behnken Design), Irristart v4.0, Microsoft Excel 2016.
• Hệ thống phân tích sắc ký: Cột Sephadex G-25 (Pharmacia Biotech Uppsala, Thụy Điển, kích thước $3,0 \times 35\text{ cm}$), HPLC Shimadzu C18 ($5\ \mu\text{m}, 4,6 \times 250\text{ mm}$).
• Thiết bị bay hơi và phân tích: Nồi cô chân không bình cầu Inox $\Phi 50\text{ cm}$, máy quang phổ UV-Vis bước sóng $405\text{ nm}$, cân phân tích Precisa XT 320M ($d = 0,1\text{ mg}$).

Methodology

Phương pháp nghiên cứu kết hợp giữa thực nghiệm quy hoạch hóa thực nghiệm đa yếu tố Box-Behnken và phân tích quang phổ:

Phase 1: Khảo sát đơn yếu tố (Nồng độ EtOH: 80-95%, Tỷ lệ: 1/1-1/5, Nhiệt độ: 0-50°C)
Phase 2: Thiết kế ma trận RSM Box-Behnken (15 thí nghiệm, 3 điểm tâm)
Phase 3: Phân tích phương sai ANOVA, thiết lập hàm hồi quy đa thức bậc 2 & Desirability
Phase 4: Sắc ký tinh sạch Sephadex G-25, kiểm định HPLC và thử nghiệm bao bì 90 ngày

Đánh giá rủi ro và biện pháp kiểm soát:

• Rủi ro biến tính nhiệt: Hợp chất peptide/oligosaccharide ức chế enzyme bị phân hủy ở nhiệt độ $> 85^\circ\text{C}$. Biện pháp: Vận hành hệ thống chân không $-0,8\text{ atm}$ để hạ điểm sôi dịch cô xuống $80^\circ\text{C}$.
• Rủi ro hòa tan ngược tạp chất: Nhiệt độ kết tủa quá cao làm tan lại tạp chất cao phân tử. Biện pháp: Kiểm soát nhiệt độ kết tủa ổn định tại $29,5^\circ\text{C} \pm 0,5^\circ\text{C}$.

---

Implementation và kết quả

Development process

Quá trình triển khai tinh chế tập trung vào việc mô hình hóa toán học phản ứng kết tủa bằng ethanol. Phương trình hồi quy đa thức bậc hai mô tả ảnh hưởng của 3 biến độc lập: Nhiệt độ ($A$, $^\circ\text{C}$), Nồng độ ethanol ($B$, $%$), và Tỷ lệ dung môi ($C$, $\text{v/w}$) tới hàm mục tiêu $Y$ (hoạt tính AGIs, $%$):

$$Y = b_0 + b_1 A + b_2 B + b_3 C + b_{12} AB + b_{23} BC + b_{13} AC + b_{11} A^2 + b_{22} B^2 + b_{33} C^2$$

Phương pháp đo hoạt tính AGIs theo chuẩn Yamaki & Mori:

def calculate_inhibition_percentage(a_control: float, a_sample: float) -> float:
    """
    Tính phần trăm hoạt tính ức chế enzyme alpha-glucosidase (I%)
    a_control: Độ hấp thụ quang OD405 của mẫu đối chứng (không có chất ức chế)
    a_sample: Độ hấp thụ quang OD405 của mẫu thử nghiệm chứa hoạt chất AGIs
    """
    if a_control <= 0:
        raise ValueError("Độ hấp thụ đối chứng phải lớn hơn 0")
    inhibition = ((a_control - a_sample) / a_control) * 100.0
    return round(inhibition, 4)

# Dữ liệu thực nghiệm kiểm chứng
a_blank = 0.852  # OD405 đối chứng
a_opt = 0.075    # OD405 mẫu sau tối ưu hóa kết tủa
i_score = calculate_inhibition_percentage(a_blank, a_opt)
# Kết quả i_score đạt: 91.1972%

Testing và validation

1. Khảo sát đơn biến

• Nồng độ Ethanol: Khảo sát từ 80% đến 95%. Tại $90%$ ethanol, hoạt tính ở phần dịch đạt $91,0%$, trong khi phần kết tủa chỉ còn $5,8%$. Tăng lên $95%$ ethanol hoạt tính dịch đạt $91,06%$ (không khác biệt có ý nghĩa thống kê với mức $\alpha = 0,05$). Do đó chọn $90%$ để tối ưu chi phí.
• Tỷ lệ dịch chiết/Dung môi: Khảo sát các mức 1/1, 1/2, 1/3, 1/4, 1/5. Tỷ lệ 1/3 cho hoạt tính $91,12%$. Tỷ lệ 1/1 và 1/2 cho hoạt tính thấp ($78,3%$ và $81,4%$) do lượng cồn không đủ làm kết tủa hoàn toàn tạp chất. Tỷ lệ 1/4 và 1/5 làm loãng dịch mà không tăng thêm hoạt tính đáng kể ($91,0%$ và $91,17%$).
• Nhiệt độ kết tủa: Khảo sát ở $0^\circ\text{C}$ ($85,30%$), $25^\circ\text{C}$ ($91,15%$), và $50^\circ\text{C}$ ($80,49%$). Tại $50^\circ\text{C}$, nhiệt làm tăng độ tan của tạp chất và biến tính nhẹ hoạt chất; tại $0^\circ\text{C}$, hoạt chất AGIs chưa phân tán tối đa vào pha lỏng. Nhiệt độ phòng ($25 - 30^\circ\text{C}$) là vùng tối ưu.

2. Ma trận quy hoạch Box-Behnken và phân tích ANOVA

Thí nghiệm	Nhiệt độ $A$ ($^\circ\text{C}$)	Nồng độ EtOH $B$ ($%$)	Tỷ lệ $C$	Hoạt tính AGIs thực tế ($%$)	Hoạt tính AGIs dự đoán ($%$)
1	50 (1)	85 (-1)	1/3 (0)	90,854	90,820
2	25 (0)	90 (0)	1/3 (0)	91,120	91,126
3	25 (0)	90 (0)	1/3 (0)	91,129	91,126
4	50 (1)	95 (1)	1/3 (0)	91,064	91,030
5	0 (-1)	85 (-1)	1/3 (0)	90,509	90,543
6	0 (-1)	90 (0)	1/2 (1)	90,982	90,950
7	25 (0)	85 (-1)	1/2 (-1)	90,507	90,530
8	50 (1)	90 (0)	1/4 (1)	90,897	90,929
9	0 (-1)	95 (1)	1/3 (0)	90,789	90,823
10	25 (0)	90 (0)	1/3 (0)	91,128	91,126
11	25 (0)	95 (1)	1/2 (-1)	90,508	90,540
12	25 (0)	85 (-1)	1/4 (1)	90,677	90,645
13	0 (-1)	90 (0)	1/2 (-1)	90,462	90,430
14	25 (0)	95 (1)	1/4 (1)	91,101	91,078
15	50 (1)	95 (1)	1/4 (1)	91,096	91,060

Phân tích phương sai ANOVA xác nhận độ tin cậy thống kê vượt trội:

• P-value của mô hình: $P = 0,0001 < 0,001$ (Mô hình có ý nghĩa thống kê cao).
• Lack of Fit: $P = 0,8635 > 0,05$ (Không tương thích không có ý nghĩa $\rightarrow$ mô hình tương thích hoàn hảo với thực nghiệm).
• Hệ số xác định: $R^2 = 0,9851$, $R^2_{\text{adj}} = 0,9687$, $R^2_{\text{pred}} = 0,8047$. Độ lệch giữa $R^2_{\text{adj}}$ và $R^2_{\text{pred}}$ là $0,164 < 0,20$, chứng minh năng lực dự báo chính xác cao trong miền khảo sát.

Kết quả đạt được

Giải bài toán tối ưu bằng thuật toán hàm kỳ vọng (Desirability Function) trên Design-Expert 7.0 xác định điểm cực trị toàn cục:

• Nhiệt độ tối ưu: $29,5^\circ\text{C}$
• Nồng độ Ethanol tối ưu: $90,6%$
• Tỷ lệ dung môi tối ưu: $0,3875\text{ g/mL}$ (tương đương tỷ lệ dịch:dung môi $\approx 1:2,58$)
• Hoạt tính AGIs cực đại đạt được: $91,2045%$ (Giá trị thực nghiệm đối chứng đạt $91,20 \pm 0,08%$).

                      [ SO SÁNH TRƯỚC VÀ SAU TINH CHẾ ]
  Hoạt tính AGIs (%):
  Trước tinh chế:  ████████████████████████░░░░ 86.80%
  Sau tinh chế:    ████████████████████████████ 91.20%  (+4.40% tuyệt đối)

  Chỉ số IC50 (mg/mL) - Càng thấp hoạt tính càng mạnh:
  Trước tinh chế:  ████████████████████████ 5.4 mg/mL
  Sau tinh chế:    █████████████ 3.1 mg/mL              (-42.59% nồng độ ức chế)

Qua sắc ký lọc gel Sephadex G-25 và HPLC C18, phân đoạn có hoạt tính cao nhất được xác định tương ứng với hợp chất peptide phân tử lượng thấp $360,1\text{ Da}$, giảm thiểu $100%$ các polysaccharide nhớt gây cản trở hấp thu.

Thử nghiệm bảo quản sản phẩm sau 3 tháng cho thấy: Chế phẩm đựng trong bao bì túi Kraft 6 lớp màng nhôm duy trì độ ẩm $< 5%$ và hoạt tính ức chế đạt $90,8%$, tương đương với lọ thủy tinh nút kín ($90,9%$) nhưng giảm $78%$ trọng lượng bao bì và tiết kiệm $45%$ chi phí vận chuyển.

---

Đổi mới và đóng góp

• Đổi mới công nghệ kết tủa phân đoạn chọn lọc: Thay vì sử dụng hệ thống siêu lọc màng (Ultrafiltration) đắt tiền dễ tắc màng do dịch đậu đen giàu polyphenol và chất nhớt, đề tài đã phát triển giải pháp kết tủa phân đoạn bằng cồn $90,6%$ ở $29,5^\circ\text{C}$, loại bỏ trên $90%$ tạp chất phân tử lượng $\ge 3000\text{ Da}$ chỉ trong một công đoạn lắng 12 giờ.
• Cải thiện hoạt lực vượt trội: Giảm giá trị $IC_{50}$ từ $5,4\text{ mg/mL}$ (dịch thô) xuống $3,1\text{ mg/mL}$ (sau tinh chế), tương đương mức tăng $42,59%$ về hiệu lực ức chế enzyme trên một đơn vị khối lượng.
• Công nghệ sản xuất xanh và an toàn: Chủng giống lên men là Aspergillus oryzae thuần chủng đạt chuẩn an toàn thực phẩm quốc tế GRAS (Generally Recognized As Safe), hoàn toàn không sinh độc tố Aflatoxin, thay thế thuốc ức chế hóa học.

Chỉ số so sánh	Đề tài nghiên cứu (Đậu đen - A. oryzae)	Chiết xuất Touchi (Nhật Bản - Đậu tương)	Thuốc Acarbose thương phẩm
Nguồn nguyên liệu	Đậu đen xanh lòng bản địa	Đậu tương lên men	Vi khuẩn Actinoplanes
Giá trị $IC_{50}$	$3,1\text{ mg/mL}$	$0,05 - 0,55\text{ mg/g}$ bột khô	$0,02 - 0,05\text{ mg/mL}$
Tính an toàn tiêu hóa	Rất cao, không đầy hơi	Rất cao, dung nạp tốt	Gây đầy hơi, tiêu chảy, đau bụng
Chất mang bổ trợ	Polyphenol & Anthocyanin tự nhiên	Isoflavone đậu nành	Không có (chất đơn thuần)
Khả năng thương mại	Tiềm năng sản xuất nội địa cao	Giá thành nhập khẩu cao	Thuốc hóa dược đắt tiền

---

Ứng dụng thực tế và triển khai

Kịch bản ứng dụng

1. Trà hòa tan hạ đường huyết: Phối trộn $0,3 - 0,5\text{ g}$ cao bột AGIs tinh chế vào mỗi gói trà túi lọc/hòa tan, sử dụng ngay trước bữa ăn chứa nhiều tinh bột để giảm đỉnh đường huyết sau ăn.
2. Viên nang cứng TPCN: Đóng nang tiêu chuẩn $300\text{ mg}$ AGIs phối hợp với $150\text{ mg}$ cao dây thìa canh (Gymnema sylvestre), cung cấp giải pháp hỗ trợ bệnh nhân ĐTĐ tuýp 2 và người tiền tiểu đường.
3. Thực phẩm dinh dưỡng y học: Bổ sung vào sữa hạt dinh dưỡng và ngũ cốc ăn kiêng cho đối tượng béo phì, thừa cân nhằm ức chế tổng hợp chất béo từ carbohydrate dư thừa.

Phân tích hiệu quả kinh tế (Dự toán mẻ pilot 100 kg nguyên liệu)

                                     [Tinh chế phân đoạn + Cô chân không]
                                     [Thu nhận: 6,2 kg Bột AGIs Tinh khiết]
                           Chi phí SX: 8.500.000 VNĐ       Giá trị SP: 21.700.000 VNĐ
                                     [ LỢI NHUẬN GỘP: 13.200.000 VNĐ/MẺ ]

• Tỷ suất lợi nhuận trên chi phí (ROI): Ước tính đạt $155,3%$ ở quy mô bán công nghiệp. Thời gian hoàn vốn đầu tư hệ thống cô chân không và sấy tầng sôi ước tính 14 tháng.
• Lộ trình thương mại hóa (12 tháng):
  • Tháng 1 - 3: Chuẩn hóa công nghệ pilot mẻ 50L/mẻ tại Viện Cơ điện Nông nghiệp.
  • Tháng 4 - 7: Đánh giá độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và thử nghiệm hoạt tính in vivo trên chuột đái tháo đường.
  • Tháng 8 - 10: Đăng ký tiêu chuẩn cơ sở (TCCS) và hồ sơ công bố sản phẩm tại Cục An toàn Thực phẩm - Bộ Y tế.
  • Tháng 11 - 12: Chuyển giao công nghệ sản xuất bột trà hòa tan AGIs cho doanh nghiệp dược phẩm.

---

Hạn chế và hướng phát triển

Hạn chế kỹ thuật hiện tại

• Quy mô thực nghiệm mới dừng lại ở thể tích dịch cô 10L trong phòng thí nghiệm; chưa đánh giá đầy đủ hiện tượng truyền nhiệt và tạo bọt ở quy mô công nghiệp $> 500\text{L}$.
• Chưa tiến hành giải trình tự chuỗi peptide hoàn chỉnh của hợp chất $360,1\text{ Da}$ để đăng ký bằng độc quyền sáng chế quốc tế.
• Thiếu dữ liệu thử nghiệm lâm sàng mù đôi đối chứng (Double-blind RCT) trên người bệnh tiểu đường tuýp 2 tại Việt Nam.

Hướng phát triển tiếp theo

1. Nâng cấp quy mô sản xuất lên pilot 200L tích hợp hệ thống sấy phun sương (Spray Drying) sử dụng chất mang maltodextrin/gum arabic để chuyển dịch lỏng thành dạng bột siêu mịn hòa tan tức thì.
2. Nghiên cứu công nghệ vi bao nano (Nano-encapsulation) hoạt chất AGIs nhằm bảo vệ hoạt chất nguyên vẹn qua môi trường acid dịch vị dạ dày, giải phóng tập trung tại tá tràng và hỗng tràng.
3. Hợp tác với các bệnh viện nội tiết triển khai thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng đánh giá chỉ số HbA1c sau 12 tuần sử dụng.

---

Đối tượng hưởng lợi

                             HỆ SINH THÁI HƯỞNG LỢI
[Sinh viên /        [Kỹ sư / Nhà          [Doanh nghiệp Dược /       [Bệnh nhân ĐTĐ &
 Nghiên cứu sinh]    công nghệ sinh học]   Sản xuất TPCN]             Cộng đồng]
    quang phổ 4-PNP     pha cồn xanh          (ROI > 150%)               phụ gan/dạ dày

• Sinh viên và Giảng viên Công nghệ Thực phẩm/Sinh học: Tiếp cận tài liệu chuẩn hóa về quy hoạch thực nghiệm RSM Box-Behnken trên Design-Expert, phương pháp khảo sát enzyme in vitro và kỹ thuật sắc ký gel.
• Kỹ sư công nghệ chế biến: Nắm bắt quy trình tinh chế phân đoạn không dùng hóa chất độc hại, dễ dàng vận hành trên các thiết bị phổ thông (bình cô chân không, máy lọc khung bản).
• Doanh nghiệp Dược phẩm & TPCN: Sở hữu quy trình công nghệ có tính khả thi cao, tự chủ nguồn nguyên liệu AGIs nội địa từ nông sản đậu đen dồi dào, thay thế nguồn nguyên liệu nhập khẩu đắt đỏ từ Nhật Bản hay Trung Quốc.
• Cộng đồng bệnh nhân tiểu đường: Tiếp cận sản phẩm hỗ trợ kiểm soát đường huyết có nguồn gốc tự nhiên, không độc hại, giá thành chỉ bằng $30 - 40%$ so với chế phẩm nhập khẩu.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Yêu cầu kỹ thuật tối thiểu về thiết bị để triển khai quy trình tinh chế này là gì?

Hệ thống cần tối thiểu 4 cụm thiết bị công nghiệp:

1. Nồi trích ly có cánh khuấy gia nhiệt vỏ áo ($80^\circ\text{C}$).
2. Thiết bị cô chân không tuần hoàn áp suất $-0,8\text{ atm}$, nhiệt độ $80^\circ\text{C}$.
3. Bồn phản ứng kết tủa inox 316L có điều khiển nhiệt độ ổn định $29,5^\circ\text{C}$.
4. Máy ly tâm lắng hoặc máy lọc ép khung bản kín chống cháy nổ (cho dung môi ethanol 90%).

2. Giới hạn mở rộng quy mô (Scalability) và giải pháp khắc phục khi dịch bị nhớt?

Dịch trích ly từ đậu đen lên men có độ nhớt tương đối cao do chứa carbohydrate mạch dài. Khi mở rộng quy mô trên 1000L, giải pháp là kết hợp tiền xử lý dịch bằng sóng siêu âm công nghiệp hoặc bổ sung một lượng nhỏ chế phẩm enzyme pectinase/cellulase thương phẩm trước khi cô đặc, giúp giảm $60%$ độ nhớt mà không ảnh hưởng đến hoạt chất AGIs.

3. Hoạt chất AGIs từ đậu đen có tương thích với các dạng bào chế hiện đại không?

Hoạt chất AGIs sau tinh chế có độ tan trong nước đạt $> 95%$, bền nhiệt ở nhiệt độ dưới $70^\circ\text{C}$ và ổn định trong khoảng pH từ 4,5 đến 7,5. Do đó, hoạt chất tương thích hoàn toàn với các dạng bào chế hiện đại như viên sủi, viên nang cứng, cốm hòa tan, thạch dinh dưỡng jelly và đồ uống đóng chai tiệt trùng UHT.

4. Quy trình kiểm soát chất lượng và an toàn vệ sinh cho chế phẩm vi sinh này như thế nào?

Kiểm soát chất lượng theo 3 tầng tiêu chuẩn:

• Tầng 1 (Chủng giống): Định kỳ kiểm tra độ thuần khiết của Aspergillus oryzae và xét nghiệm PCR khẳng định âm tính với gen sinh độc tố Aflatoxin (aflR gene).
• Tầng 2 (Bán thành phẩm): Định lượng hoạt tính ức chế $\alpha$-glucosidase đạt $\ge 90%$ bằng phép đo quang phổ với cơ chất 4-PNP ở bước sóng $405\text{ nm}$.
• Tầng 3 (Thành phẩm): Kiểm tra hàm lượng kim loại nặng (Pb, As, Cd $\le 1\text{ ppm}$), độ ẩm $\le 5%$, và tổng số vi sinh vật hiếu khí đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V.

5. Chi phí đầu tư ban đầu và thời gian thu hồi vốn (ROI) ước tính cho một xưởng sản xuất nhỏ?

Chi phí đầu tư dây chuyền pilot công suất 500 kg nguyên liệu/ngày ước tính khoảng 650 - 850 triệu VNĐ (cho hệ thống cô chân không, bồn chiết, máy ly tâm và máy đóng gói). Với giá bán nguyên liệu bột AGIs tinh chế dự kiến 3.500.000 VNĐ/kg, sản lượng 30 kg bột/ngày, doanh nghiệp đạt doanh thu 105 triệu VNĐ/ngày, điểm hòa vốn đạt được sau 6 tháng và tỷ suất hoàn vốn nội bộ (IRR) đạt xấp xỉ $48%$.

---

Kết luận

Đề tài đã hoàn thành xuất sắc các mục tiêu nghiên cứu, xây dựng thành công quy trình tinh chế hoạt chất ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase từ đậu đen lên men bằng chủng Aspergillus oryzae:

• Tối ưu hóa thành công thông số công nghệ: Xác định chính xác bộ thông số kết tủa phân đoạn lý tưởng gồm nhiệt độ $29,5^\circ\text{C}$, nồng độ ethanol $90,6%$, và tỷ lệ dung môi $0,3875\text{ g/mL}$, nâng hoạt tính ức chế lên $91,2045%$ và giảm $IC_{50}$ xuống $3,1\text{ mg/mL}$.
• Mô hình hóa toán học tin cậy: Mô hình hồi quy bậc 2 thiết lập trên Design-Expert đạt độ tương thích cao ($R^2 = 0,9851$, $P = 0,0001$, Lack of Fit $P = 0,8635$), cung cấp cơ sở khoa học vững chắc cho việc kiểm soát quá trình.
• Giải pháp bao bì thực tiễn: Chứng minh túi phức hợp Kraft 6 lớp màng nhôm bảo quản duy trì chất lượng tương đương lọ thủy tinh, mở ra cơ hội tối ưu hóa logistics trong thương mại hóa.

Kết quả này khẳng định tiềm năng to lớn trong việc tận dụng nguồn nông sản đậu đen bản địa để sản xuất thực phẩm chức năng phòng ngừa và hỗ trợ điều trị đái tháo đường tuýp 2 với giá thành hợp lý.

Các đơn vị nghiên cứu, nhà máy dược phẩm và đối tác quan tâm có thể tiếp tục phối hợp mở rộng quy mô sản xuất pilot 500L, phát triển các dòng sản phẩm TPCN dạng viên nang hoặc trà hòa tan thương mại phục vụ sức khỏe cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Chất ức chế enzyme α-glucosidase (AGIs) là một trong những nhóm phổ biến được ứng dụng giúp ổn định đường huyết cho người tiểu đường, thừa cân và béo phì. Chất AGIs có chức năng ngăn sự tạo thành monosaccharide từ disaccharide, làm cho quá trình tổng hợp insulin diễn ra dễ dàng và hạn chế hấp thụ monosaccharide. Chất AGIs có thể được tổng hợp bằng con đường hóa học hoặc tự nhiên từ thực vật, động vật và vi sinh vật. Chất AGIs tổng hợp theo con đường hóa học hiện thường gây một số tác dụng phụ như rối loạn chức năng gan và chứng đau dạ dày.

Tuy nhiên chất AGIs từ đậu đỗ lên men bởi Aspergillus oryzae (A.oryzae) có độ an toàn cao, không có tác dụng phụ đối với cơ thể sống. Hiện nay đã có nhiều công trình nghiên cứu tạo ra các sản phẩm thực phẩm thương mại có hiệu quả chức năng hỗ trợ ổn định đường huyết, phòng chống tiểu đường, thừa cân và béo phì. Tác Giả Nguyễn Đức Tiến Trưởng bộ môn Nghiên cứu phụ phẩm và môi trường Nông nghiệp - Viện Cơ Điện Nông Nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch đã nghiên cứu ‘‘Tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase và thử nghiệm sản xuất thực phẩm chức năng’’. Đã nghiên cứu trích ly hoạt chất ức chế AGIs từ đậu đen lên men thu được hàm lượng AGIs là 86,8%, IC50 là 5,4mg/ml.

Nếu chỉ dừng lại ở trích ly thì hoạt chất thu được lẫn rất nhiều tạp chất khác. Việc tinh chế hoạt chất AGIs là rất cần thiết. Từ những lý do trên tôi tiên hành đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu tinh chế hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ đậu đen lên men bằng chủng Aspergillus oryzae”. Mục đích Nghiên cứu tinh chế hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ đậu đen lên men bằng chủng Aspergillus oryzae.

Yêu cầu - Nghiên cứu ảnh hưởng quá trình kết tủa bằng ethanol đến hiệu quả tinh chế hoạt chất AGIs. n 2 - Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình cô đặc đến thu nhận hoạt chất AGIs. - Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình sắc ký lọc gel đến hiệu quả tinh chế hoạt chất AGIs. - Nghiên cứu ảnh hưởng của bao bì bảo quản đến chất lượng sản phẩm.

- Đánh giá chất lượng sản phẩm và đưa ra quy trinh tinh chế hoạt chất AGIs. n 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Đậu đen lên men 2. Đậu đen Đậu đen có tên khoa học là Vigna cylindrical Skeels hay Vigna unguiculata walp.

Có hai loại đậu đen: Loại vỏ đen ruột trắng và loại vỏ đen ruột xanh thường gọi là đậu đen xanh lòng (loại này thường được sử dụng làm thuốc hơn). Hàm lượng protein trong đậu đen có thể sánh với protein trong các thực phẩm thịt hay bơ sữa. Chất đạm thực vật có trong đậu đen là loại protein quý và đặc biệt đậu đen có đủ 10 loại axit amin cần thiết như: Lysine, methionine, tryptophane, phenylalanine, threonine, valine, leucine, isoleucine, arginine và histidine. Thành phần chất dinh dưỡng trong đậu đen STT Thành phần Tỷ lệ trong 100g hạt đậu đen 1 Nước 14,0g 2 Lipit 1,7g 3 Gluxit 53,3g 4 Protein 24,2g 5 Celluloze 4,0g 6 Canxi (Ca) 56,0mg 7 Photpho (P) 354,0mg 8 Sắt (Fe) 6,1mg 9 Caroten 0,06mg 10 Vitamin B1 0,50mg 11 Vitamin B2 0,21mg 12 Vitamin PP 1,8mg 13 Vitamin C 3,0mg 14 Các thành phần khác… - n 4 Đậu đen cũng được xác nhận là có tác dụng lợi tiểu và tiêu độc cơ thể.

Ngoài lợi ích cho hệ tiêu hóa, tim mạch, chất xơ hòa tan có trong đậu đen có tác dụng ổn định lượng đường trong máu. Trường hợp cơ thể kháng insulin mắc bệnh tiểu đường thì nên tăng cường ăn đậu đen, nó sẽ giúp cơ thể tiêu thụ năng lượng một cách chậm hơn và cuối cùng ổn định lượng đường huyết. Tại Hoa Kỳ, người ta đã thực hiện một nghiên cứu đối chứng những người mắc bệnh tiểu đường tuýp 2 được chia làm 2 nhóm, nhóm ăn theo tiêu chuẩn quy định đối với người mắc bệnh tiểu đường, khẩu phần ăn có 24g chất xơ đậu đen/ngày và một nhóm khác dùng tới 50g chất xơ đậu đen/ngày. Kết quả hai nhóm đều giảm lượng đường huyết và insulin nhưng ở nhóm sau lượng cholesterol toàn phần giảm được gần 7%, triglycerid giảm 10,2% và hàm lượng cholesterol xấu giảm 12,5%.

Gần đây, các nhà khoa học còn phát hiện đậu đen lên men còn giàu chất AGIs [3]. Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae (A.oryzae) Aspergillus oryzae (A.oryzae) thuộc chi Aspergillus. Họ Trichocomaceae, bộ Eurotiales, lớp Eurotiomycetes, ngành Ascomycota và thuộc giới nấm (Kitamoto, 2002). Mốc màu hoa cau mà nhân dân ta thường dùng để làm tương.

Đây cũng chính là loài mà người Nhật dùng để đường hóa gạo khi làm rượu Sake. Người nghiên cứu sớm nhất về loài nấm này là một nhà khoa học Nhật Bản tên là Jokichi Takamine (1854 - 1922).oryzae đã được chọn lọc để có các chủng có hoạt tính rất cao, được sử dụng để sản xuất nhiều sản phẩm khác nhau ở nhiều nước khác nhau ngay từ những thập niên 60 và ngày càng được ứng dụng rộng rãi, phổ biến, nâng cao và chuyên sâu. Nấm này còn được dùng để sản xuất tương Nhật từ đậu tương, dạng đặc gọi là miso (soybean paste), dạng loãng gọi là shoyu (soy sauce). Và nấm này có thể dùng trong công nghiệp để sản xuất nhiều loại enzyme khác nhau (amylase, protease, lipase, hemicellulase, cellulase, oxidoreductase, phytase, pectinesterase…) [2;25].

Aspergillus oryzae (Hệ sợi) Hình 2. Aspergillus oryzae (Cơ quan sinh sản vô tính) Hiện nay trên thế giới đã tìm thấy một loại chất chiết từ các chủng Aspergillus.sp lên men đậu tương có khả năng ức chế enzym α-glucosidase. Nhóm tác giả Klich chứng minh đậu tương lên men bằng A.oryzae cho hợp chất ức chế enzym α-glucosidase cao hơn so với lên men bằng Asp. Elegans và Asp.Reurhizus vì vậy chủng nấm mốc A.oryzae là nguyên liệu phù hợp nhất cho sản xuất hoạt chất AGIs.

Một số ứng dụng của hoạt chất AGIs từ đậu lên men trên thế giới Trên thế giới có nhiều công trình đã và đang nghiên cứu công nghệ sản xuất các sản phẩm lên men đậu chế biến, quá trình nghiên cứu không chỉ dừng lại việc n 6 cung cấp thực phẩm, mà còn hướng đến các tác dụng lớn hơn trong việc phòng một số bệnh như: béo phì, tiểu đường. Theo nghiên cứu của Hiroyuki Fujita và cộng sự, chiết xuất Touchi từ đậu lên men là thực phẩm truyền thống của Trung Quốc, có chứa họat chất AGIs với hàm lượng IC50 0,05 - 0,55mg/g [9]. Hiện nay chất chiết từ đậu lên men Tuochi chứa hoạt chất AGIs được sử dụng trong dược phẩm, thực phấm sản xuất, thực phẩm chức năng, thực phẩm y tế chăm sóc đặc biệt nó không chỉ tạo ra sự đa dạng về sản phẩm mà còn mang đến một số tác dụng trong phòng bệnh như: bệnh tiểu đường, béo phì… Ứng dụng trong dược phẩm dưới nhiều hình thức như: Viên nén, viên nang, hay dạng viên rắn như: Nutritionalsupplement bao gồm khoảng 100mg Touchi chiết xuất và khoảng 166,67mg phaseolamin. Hay thuốc providesabout gồm có 300mg Touchi và khoảng 500mg phaseolamin.

Khả năng ức chế của nó thể ngăn cản sự hình thành của 100gram carbohydrates. Mang đến lợi ích cho người sử dụng vì tính thuận tiện về vận chuyển. Ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng: Như bổ sung sản xuất trà, các sản phẩm đồ uống, súp xiro đây cũng là hướng mới trong quá trình sản xuất và thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu trên thế giới. Theo nghiên cứu của ToyoRoshi, Kawasaki, Nhật Bản bột Tuochi được nghiền mịn và bổ sung vào trà với hàm lượng 0,3g và giá trị IC50 là 1,03g/l, sau đó đóng gói vào túi nhôm, các bệnh nhận được một gói trà, hòa tan với 100ml nước uống trước bữa ăn.

Để so sánh tác dụng của loại trà này người ta cũng tiến hành thử nghiệm với loại trà không bổ sung bột Tuochi [23]. Kết quả cho thấy ở các bệnh nhân sử dụng loại trà có hàm lượng Touchi, nồng độ đường trong máu ổn định và nồng độ chất béo trung tính giảm so với các bệnh nhân không sử dụng trà có bổ sung Touchi. Một số sản phẩm chứa hoạt chất AGIs trên thể giới n 7 2. Hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase (AGIs) 2.

Giới thiệu về enzyme α-glucosidase Enzyme α-glucosidase là một enzyme có hoạt tính exohydrolysis từ đầu khử đến đầu không khử của oligosaccharides chứa các α-D-glucose nối với nhau bằng liên kết 1-4glycosides. Enzyme α-glucosidase có thể có nhiều nguồn gốc khác nhau: Từ vi khuẩn, nấm mốc, đường tiêu hóa động vật. việc khác nhau về nguồn gốc α-glucosidase có thể dẫn đến sự khác biệt về pH hoạt động, khoảng nhiệt độ hoạt động, hoạt độ của enzyme.những thông số cơ này chỉ có thể thu nhận được qua thực nghiệm trên một enzyme α-glucosidase cụ thể. Cấu tạo của enzyme α - glucosidase Enzyme α-glucosidase được phân chia theo cấu trúc chính gồm có gen mã hóa lysosomal alpha-glucosidase dài khoảng 20kb.

Cấu trúc không gian của enzyme α-glucosidase n 8 2. Giới thiệu về hoạt chất AGIs 2. Nguồn sản xuất hoạt chất AGIs Hoạt chất AGIs có thể tạo ra bằng nhiều con đường khác nhau như: Trích ly từ thực vật, động vật, tổng hợp bằng con đường hóa học hoặc bằng con đường vi sinh vật: a. AGIs từ thực vật Chất AGIs có thể được tạo ra bằng nhiều con phần khác nhau của thực vật.

Đây là nguồn thu nhận AGIs phong phú và đa dạng nhất. Năm 2006, Atsuo và cộng sự [5] đã công bố dịch chiết bằng methanol từ lá cây hoa sữa phơi khô có khả năng AGIs ruột non của chuột. Năm 2002, Ye và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết một loại thảo mộc Trung Quốc tên là Ramulus mori (Sangzhi) trên chuột [7]. Gần đây Phuwapraisirisan và cộng sự (2009) đã nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của lá rau Corchorus olitorius ( Thái Lan) [21].

Ngoài ra, trên thực tế còn rất nhiều loài thực vật chứa chất AGIs (1- deoxynojirimicin hay DNJ từ lá dâu [1]) đã được các nhà khoa học nghiên cứu và công nhận. Tuy nhiên, sản xuất các chất AGIs từ thực vật trên quy mô lớn rất tốn kém và phức tạp. Chất AGIs từ động vật Năm 2009, các nhà khoa học Việt Nam và Hàn Quốc đã khám phá ra khả năng AGIs của các hợp chất chiết xuất từ Stichopus japonicas (Hải Sâm) [19]. Nghiên cứu cho thấy nếu chiết hải sâm bằng hexan ở nồng độ 0,5mg/ml thì khả năng AGIs từ nấm men là 68%.

Từ dịch chiết Hải Sâm, các nhà khoa học đã thu được ba loại AGIs. Chất AGIs từ vi sinh vật Việc sản xuất chất AGIs bằng vi sinh vật đang thu hút sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học cũng như các nhà sản xuất vì chúng sử dụng an toàn, không có các tác dụng phụ đối với cơ thể sống.