Đặt vấn đề Chất ức chế enzyme α-glucosidase (AGIs) là một trong những nhóm phổ biến được ứng dụng giúp ổn định đường huyết cho người tiểu đường, thừa cân và béo phì. Chất AGIs có chức năng ngăn sự tạo thành monosaccharide từ disaccharide, làm cho quá trình tổng hợp insulin diễn ra dễ dàng và hạn chế hấp thụ monosaccharide. Chất AGIs có thể được tổng hợp bằng con đường hóa học hoặc tự nhiên từ thực vật, động vật và vi sinh vật. Chất AGIs tổng hợp theo con đường hóa học hiện thường gây một số tác dụng phụ như rối loạn chức năng gan và chứng đau dạ dày.
Tuy nhiên chất AGIs từ đậu đỗ lên men bởi Aspergillus oryzae (A.oryzae) có độ an toàn cao, không có tác dụng phụ đối với cơ thể sống. Hiện nay đã có nhiều công trình nghiên cứu tạo ra các sản phẩm thực phẩm thương mại có hiệu quả chức năng hỗ trợ ổn định đường huyết, phòng chống tiểu đường, thừa cân và béo phì. Tác Giả Nguyễn Đức Tiến Trưởng bộ môn Nghiên cứu phụ phẩm và môi trường Nông nghiệp - Viện Cơ Điện Nông Nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch đã nghiên cứu ‘‘Tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase và thử nghiệm sản xuất thực phẩm chức năng’’. Đã nghiên cứu trích ly hoạt chất ức chế AGIs từ đậu đen lên men thu được hàm lượng AGIs là 86,8%, IC50 là 5,4mg/ml.
Nếu chỉ dừng lại ở trích ly thì hoạt chất thu được lẫn rất nhiều tạp chất khác. Việc tinh chế hoạt chất AGIs là rất cần thiết. Từ những lý do trên tôi tiên hành đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu tinh chế hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ đậu đen lên men bằng chủng Aspergillus oryzae”. Mục đích Nghiên cứu tinh chế hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ đậu đen lên men bằng chủng Aspergillus oryzae.
Yêu cầu - Nghiên cứu ảnh hưởng quá trình kết tủa bằng ethanol đến hiệu quả tinh chế hoạt chất AGIs. n 2 - Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình cô đặc đến thu nhận hoạt chất AGIs. - Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình sắc ký lọc gel đến hiệu quả tinh chế hoạt chất AGIs. - Nghiên cứu ảnh hưởng của bao bì bảo quản đến chất lượng sản phẩm.
- Đánh giá chất lượng sản phẩm và đưa ra quy trinh tinh chế hoạt chất AGIs. n 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Đậu đen lên men 2. Đậu đen Đậu đen có tên khoa học là Vigna cylindrical Skeels hay Vigna unguiculata walp.
Có hai loại đậu đen: Loại vỏ đen ruột trắng và loại vỏ đen ruột xanh thường gọi là đậu đen xanh lòng (loại này thường được sử dụng làm thuốc hơn). Hàm lượng protein trong đậu đen có thể sánh với protein trong các thực phẩm thịt hay bơ sữa. Chất đạm thực vật có trong đậu đen là loại protein quý và đặc biệt đậu đen có đủ 10 loại axit amin cần thiết như: Lysine, methionine, tryptophane, phenylalanine, threonine, valine, leucine, isoleucine, arginine và histidine. Thành phần chất dinh dưỡng trong đậu đen STT Thành phần Tỷ lệ trong 100g hạt đậu đen 1 Nước 14,0g 2 Lipit 1,7g 3 Gluxit 53,3g 4 Protein 24,2g 5 Celluloze 4,0g 6 Canxi (Ca) 56,0mg 7 Photpho (P) 354,0mg 8 Sắt (Fe) 6,1mg 9 Caroten 0,06mg 10 Vitamin B1 0,50mg 11 Vitamin B2 0,21mg 12 Vitamin PP 1,8mg 13 Vitamin C 3,0mg 14 Các thành phần khác… - n 4 Đậu đen cũng được xác nhận là có tác dụng lợi tiểu và tiêu độc cơ thể.
Ngoài lợi ích cho hệ tiêu hóa, tim mạch, chất xơ hòa tan có trong đậu đen có tác dụng ổn định lượng đường trong máu. Trường hợp cơ thể kháng insulin mắc bệnh tiểu đường thì nên tăng cường ăn đậu đen, nó sẽ giúp cơ thể tiêu thụ năng lượng một cách chậm hơn và cuối cùng ổn định lượng đường huyết. Tại Hoa Kỳ, người ta đã thực hiện một nghiên cứu đối chứng những người mắc bệnh tiểu đường tuýp 2 được chia làm 2 nhóm, nhóm ăn theo tiêu chuẩn quy định đối với người mắc bệnh tiểu đường, khẩu phần ăn có 24g chất xơ đậu đen/ngày và một nhóm khác dùng tới 50g chất xơ đậu đen/ngày. Kết quả hai nhóm đều giảm lượng đường huyết và insulin nhưng ở nhóm sau lượng cholesterol toàn phần giảm được gần 7%, triglycerid giảm 10,2% và hàm lượng cholesterol xấu giảm 12,5%.
Gần đây, các nhà khoa học còn phát hiện đậu đen lên men còn giàu chất AGIs [3]. Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae (A.oryzae) Aspergillus oryzae (A.oryzae) thuộc chi Aspergillus. Họ Trichocomaceae, bộ Eurotiales, lớp Eurotiomycetes, ngành Ascomycota và thuộc giới nấm (Kitamoto, 2002). Mốc màu hoa cau mà nhân dân ta thường dùng để làm tương.
Đây cũng chính là loài mà người Nhật dùng để đường hóa gạo khi làm rượu Sake. Người nghiên cứu sớm nhất về loài nấm này là một nhà khoa học Nhật Bản tên là Jokichi Takamine (1854 - 1922).oryzae đã được chọn lọc để có các chủng có hoạt tính rất cao, được sử dụng để sản xuất nhiều sản phẩm khác nhau ở nhiều nước khác nhau ngay từ những thập niên 60 và ngày càng được ứng dụng rộng rãi, phổ biến, nâng cao và chuyên sâu. Nấm này còn được dùng để sản xuất tương Nhật từ đậu tương, dạng đặc gọi là miso (soybean paste), dạng loãng gọi là shoyu (soy sauce). Và nấm này có thể dùng trong công nghiệp để sản xuất nhiều loại enzyme khác nhau (amylase, protease, lipase, hemicellulase, cellulase, oxidoreductase, phytase, pectinesterase…) [2;25].
Aspergillus oryzae (Hệ sợi) Hình 2. Aspergillus oryzae (Cơ quan sinh sản vô tính) Hiện nay trên thế giới đã tìm thấy một loại chất chiết từ các chủng Aspergillus.sp lên men đậu tương có khả năng ức chế enzym α-glucosidase. Nhóm tác giả Klich chứng minh đậu tương lên men bằng A.oryzae cho hợp chất ức chế enzym α-glucosidase cao hơn so với lên men bằng Asp. Elegans và Asp.Reurhizus vì vậy chủng nấm mốc A.oryzae là nguyên liệu phù hợp nhất cho sản xuất hoạt chất AGIs.
Một số ứng dụng của hoạt chất AGIs từ đậu lên men trên thế giới Trên thế giới có nhiều công trình đã và đang nghiên cứu công nghệ sản xuất các sản phẩm lên men đậu chế biến, quá trình nghiên cứu không chỉ dừng lại việc n 6 cung cấp thực phẩm, mà còn hướng đến các tác dụng lớn hơn trong việc phòng một số bệnh như: béo phì, tiểu đường. Theo nghiên cứu của Hiroyuki Fujita và cộng sự, chiết xuất Touchi từ đậu lên men là thực phẩm truyền thống của Trung Quốc, có chứa họat chất AGIs với hàm lượng IC50 0,05 - 0,55mg/g [9]. Hiện nay chất chiết từ đậu lên men Tuochi chứa hoạt chất AGIs được sử dụng trong dược phẩm, thực phấm sản xuất, thực phẩm chức năng, thực phẩm y tế chăm sóc đặc biệt nó không chỉ tạo ra sự đa dạng về sản phẩm mà còn mang đến một số tác dụng trong phòng bệnh như: bệnh tiểu đường, béo phì… Ứng dụng trong dược phẩm dưới nhiều hình thức như: Viên nén, viên nang, hay dạng viên rắn như: Nutritionalsupplement bao gồm khoảng 100mg Touchi chiết xuất và khoảng 166,67mg phaseolamin. Hay thuốc providesabout gồm có 300mg Touchi và khoảng 500mg phaseolamin.
Khả năng ức chế của nó thể ngăn cản sự hình thành của 100gram carbohydrates. Mang đến lợi ích cho người sử dụng vì tính thuận tiện về vận chuyển. Ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng: Như bổ sung sản xuất trà, các sản phẩm đồ uống, súp xiro đây cũng là hướng mới trong quá trình sản xuất và thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu trên thế giới. Theo nghiên cứu của ToyoRoshi, Kawasaki, Nhật Bản bột Tuochi được nghiền mịn và bổ sung vào trà với hàm lượng 0,3g và giá trị IC50 là 1,03g/l, sau đó đóng gói vào túi nhôm, các bệnh nhận được một gói trà, hòa tan với 100ml nước uống trước bữa ăn.
Để so sánh tác dụng của loại trà này người ta cũng tiến hành thử nghiệm với loại trà không bổ sung bột Tuochi [23]. Kết quả cho thấy ở các bệnh nhân sử dụng loại trà có hàm lượng Touchi, nồng độ đường trong máu ổn định và nồng độ chất béo trung tính giảm so với các bệnh nhân không sử dụng trà có bổ sung Touchi. Một số sản phẩm chứa hoạt chất AGIs trên thể giới n 7 2. Hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase (AGIs) 2.
Giới thiệu về enzyme α-glucosidase Enzyme α-glucosidase là một enzyme có hoạt tính exohydrolysis từ đầu khử đến đầu không khử của oligosaccharides chứa các α-D-glucose nối với nhau bằng liên kết 1-4glycosides. Enzyme α-glucosidase có thể có nhiều nguồn gốc khác nhau: Từ vi khuẩn, nấm mốc, đường tiêu hóa động vật. việc khác nhau về nguồn gốc α-glucosidase có thể dẫn đến sự khác biệt về pH hoạt động, khoảng nhiệt độ hoạt động, hoạt độ của enzyme.những thông số cơ này chỉ có thể thu nhận được qua thực nghiệm trên một enzyme α-glucosidase cụ thể. Cấu tạo của enzyme α - glucosidase Enzyme α-glucosidase được phân chia theo cấu trúc chính gồm có gen mã hóa lysosomal alpha-glucosidase dài khoảng 20kb.
Cấu trúc không gian của enzyme α-glucosidase n 8 2. Giới thiệu về hoạt chất AGIs 2. Nguồn sản xuất hoạt chất AGIs Hoạt chất AGIs có thể tạo ra bằng nhiều con đường khác nhau như: Trích ly từ thực vật, động vật, tổng hợp bằng con đường hóa học hoặc bằng con đường vi sinh vật: a. AGIs từ thực vật Chất AGIs có thể được tạo ra bằng nhiều con phần khác nhau của thực vật.
Đây là nguồn thu nhận AGIs phong phú và đa dạng nhất. Năm 2006, Atsuo và cộng sự [5] đã công bố dịch chiết bằng methanol từ lá cây hoa sữa phơi khô có khả năng AGIs ruột non của chuột. Năm 2002, Ye và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết một loại thảo mộc Trung Quốc tên là Ramulus mori (Sangzhi) trên chuột [7]. Gần đây Phuwapraisirisan và cộng sự (2009) đã nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của lá rau Corchorus olitorius ( Thái Lan) [21].
Ngoài ra, trên thực tế còn rất nhiều loài thực vật chứa chất AGIs (1- deoxynojirimicin hay DNJ từ lá dâu [1]) đã được các nhà khoa học nghiên cứu và công nhận. Tuy nhiên, sản xuất các chất AGIs từ thực vật trên quy mô lớn rất tốn kém và phức tạp. Chất AGIs từ động vật Năm 2009, các nhà khoa học Việt Nam và Hàn Quốc đã khám phá ra khả năng AGIs của các hợp chất chiết xuất từ Stichopus japonicas (Hải Sâm) [19]. Nghiên cứu cho thấy nếu chiết hải sâm bằng hexan ở nồng độ 0,5mg/ml thì khả năng AGIs từ nấm men là 68%.
Từ dịch chiết Hải Sâm, các nhà khoa học đã thu được ba loại AGIs. Chất AGIs từ vi sinh vật Việc sản xuất chất AGIs bằng vi sinh vật đang thu hút sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học cũng như các nhà sản xuất vì chúng sử dụng an toàn, không có các tác dụng phụ đối với cơ thể sống.