Chương 1.1 Khái niệm Histon deacetylasse (HDAC) là một nhóm các enzym xúc tác cho quá trình loại bỏ nhóm ε-N-acetyl của lysin ở đầu N tận cùng của protein histon. Các HDAC tồn tại cả ở dạng protein đơn lẻ và phức hợp với các protein như mSin3, N-CoR và SMRT để tạo thành các phức hợp đồng kìm hãm phiên mã [132]. Những phức hợp này sau đó được vận chuyển đến những vùng genom xác định nhờ tương tác với các yếu tố có vị trí gắn đặc hiệu trên ADN bao gồm các yếu tố phiên mã, các thụ thể trong nhân, các gen điều chỉnh di truyền biểu sinh, cụ thể như protein gắn methyl (MDB), enzym ADN methyl transferase (DNMT) và enzym histon methyl transferase (HMT). Biến đổi cấu trúc của nhiễm sắc thể bởi hoạt động của enzym histon deacetylase là một trong những cơ chế của di truyền biểu sinh [161].
Quá trình acetyl hoá lys in của protein histon được khám phá ra bởi Allfrey V. và cộng sự từ khoảng năm thập kỷ trước [3]. Nhiều nghiên cứu sau đó cũng đã chỉ ra tầm quan trọng của sự acyl hoá nhóm ε-amino của phân tử lys in ở đầu N tận cùng của histon trong quá trình biểu hiện gen. Trên cơ sở đó, các nhà khoa học nhận định rằng sự cân bằng trong hoạt động của enzym HAT và HDAC là yếu tố ảnh hưởng đến sự hoạt hoá hay bất hoạt quá trình phiên mã [48].
Cơ chế deacetyl hoá lys in xúc tác bởi HDAC được minh hoạ trong hình dưới đây (Hình 1. Nhóm chức N-ε-acetyl trên lys in được gắn với ion kẽm ở trung tâm hoạt động của enzym. Enzym được hoạt hoá, nhóm chức acetyl bị tấn bởi một phân tử nước tạo ra sản phẩm là lysin ở dạng amoni không gắn nhóm acetyl và sản phẩm phụ là acid acetic ở dạng acetat.1: Hình biểu diễn cơ chế deacetyl hoá lysin của HDAC 2 luan an HDAC được đặt tên theo protein histon do các nhà nghiên cứu khám phá ra chức năng của nhóm enzym này đầu tiên là loại bỏ nhóm acetyl của histon [46]. Tuy nhiên, sau này các nghiên cứu sâu hơn về hoạt động của nhóm enzym này cho thấy các enzym HDAC còn có khả năng deacetyl hoá rất nhiều protein không phải histon khác bao gồm các yếu tố phiên mã như RUNX3 [62], p53 [59], E2F [97], c- Myc [112], yếu tố kappa B của nhân (NF-ĸB) [21], yếu tố cảm ứng sự giảm oxi máu 1-alpha (HIF-1α) [70], thụ thể estrogen alpha (ERα) [41], thụ thể androgen (AR) [131], chaperon (HSP90) [7], nhân tố điều chỉnh tín hiệu Stat3 [166] và Smad7 [134], protein chỉnh sửa (Ku70) [26] và một yếu tố phiên mã quan trọng cho sự phát triển xương cũng được xác định là cơ chất của HDAC [60].
Phân loại Cho đến nay, 18 loại enzym HDAC đã được xác định và phân chia thành 4 nhóm căn cứ vào sự tương đồng của chúng với HDAC ở nấm men. Trong 4 nhóm này các enzym nhóm I, II và IV là những enzym phụ thuộc kim loại (metallo- enzym), trong quá trình hoạt động cần có sự phối hợp của ion kẽm nằm ở trung tâm xúc tác của các enzym [106]. Ngược lại, các enzym HDAC nhóm III (các sirtuin) được xác định là các enzym có hoạt động phụ thuộc NAD+. Và khái niệm các chất ức chế HDAC thường được đề cập đến là các chất có khả năng ức chế các HDAC nhóm I, II và IV.
Các HDAC có độ dài chuỗi amino acid không giống nhau, thay đổi từ 347 amino acid (HDAC11) đến 1215 amino acid (HDAC6). Tất cả các HDAC đều có vùng deacetyl được bảo tồn cao. Sự khác biệt lớn nhất giữa các enzym được tìm thấy ở vùng cửa vào của trung tâm hoạt động. Ngoài ra, các HDAC nhóm I cho thấy có thêm một khoang phụ nằm bên trong trung tâm hoạt động, được dự đoán là vị trí có vai trò đưa phân tử nước vào và loại bỏ sản phẩm phụ là acid acetic.
Khoang phụ này dường như không có mặt ở các HDAC nhóm II. Với các HDAC nhóm III, không có ion kẽm ở trung tâm hoạt động, các phân tử lys in mang nhóm acetyl được gắn với ADP-ribose. Vị trí phân bố trong tế bào của các HDAC không giống nhau, các HDAC nhóm I và IV có ở nhân tế bào, các HDAC nhóm IIb có ở bào tương, còn các HDAC nhóm IIa được tìm thấy ở cả nhân và bào tương. Chức năng và cơ chất của từng enzym trong nhóm cũng không hoàn toàn giống nhau.
Trong đó, đặc biệt nhất là nhóm I, tất cả các enzym nhóm này đều có chức năng sinh học liên quan đến quá trình sinh sản của tế bào [96]. Cấu trúc các enzym histon deacetylase nhóm I, II và IV 1. HDAC nhóm I HDAC1, HDAC2, HDAC3 và HDAC8 là các enzym thuộc nhóm I. HDAC1, HDAC2 và HDAC3 là hợp phần trong các phức hợp protein có liên quan đến quá trình ức chế phiên mã.
Mô hình cấu trúc được xây dựng dựa trên sự tương đồng của các biến thể HDAC1 khác nhau, vốn được dùng để giải thích những đột biến trên HDAC, cũng rất hữu ích cho việc phát triển các chất ức chế HDAC và xây dựng cấu trúc mang hoạt tính (pharmacophore) cho các chất này. Quá trình phân tách cấu trúc tinh thể bằng tia X của HDAC1 cho thấy cấu trúc của trung tâm hoạt động được tạo bởi một kênh kỵ nước kích thước 11Å với một ion kẽm có vai trò xúc tác và một khoang phụ thân nước có kích thước 14Å nằm ở đáy của kênh enzym. Khi không có phối tử, khoang phụ này tham gia vào quá trình xúc tác phản ứng deacetylase hoá, giúp cho sản phẩm phụ acetat được loại ra khỏi phản ứng thông qua những tương tác ưu tiên [37, 153]. Cấu trúc của các HDAC2 bao gồm 8 phiến gấp nếp β (β sheet) và 13 cấu trúc xoắn α (α helice) trong một domain α/β, với các phiến β kẹp giữa các xoắn α (Hình 1.
Kênh enzym kết nối bề mặt enzym với ion kẽm cũng có bản chất thân dầu, kích thước xấp xỉ 11Å, được bao phủ bởi các amino acid là Gly154, Phe155, Phe210 và His183 có khả năng tạo phức với ion kẽm. Từ vị trí liên kết với kẽm, khoang phụ có kích thước 14Å và bản chất thân nước có vị trí hướng về phần trung tâm của enzym. Các amino acid gồm Met35, Phe114 và Leu144 là những amino acid chính tạo nên khoang phụ [79, 152].2: Mô hình cấu trúc trung tâm hoạt động của HDAC2 Khoang phụ của HDAC8 được bộc lộ ra bên ngoài cho thấy sự linh động của kênh enzym trên bề mặt protein (Hình 1. Khoang phụ này chứa một số amino acid Arg được bảo tồn cao và phần cấu trúc quan trọng nhất là arginin trung tâm của 4 luan an chuỗi bên R37.
Acid amin này được cho là giúp cải thiện cả hoạt tính xúc tác cùng với ái lực acetat của HDAC8, và có vai trò bảo vệ kênh enzym khi tham gia vào quá trình vận chuyển nước và acid acetic ra khỏi trung tâm hoạt động của enzym. Sự chuyển động của phân tử nước hoặc acid acetic bị ức chế bởi liên kết bền vững giữa G139 và G303. Do đó cần có sự sắp xếp lại cấu trúc của chuỗi bên R37 và vòng xoắn (loop) để mở rộng vị trí hoạt động để các phân tử này có thể di chuyển ra ngoài thông qua kênh enzym [50, 154, 155].3: Cấu trúc trung tâm hoạt động của HDAC8 Cho đến nay, theo dữ liệu cấu trúc trên Ngân hàng dữ liệu protein (PDB) có 7 enzym gồm HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC6, HDAC7 và HDAC8 ở người hoặc nấm men đã được công bố cấu trúc tinh thể kết tinh (có hoặc không kèm với chất ức chế có liên quan). So sánh cấu trúc của các HDAC nhóm I cho thấy cả 4 loại enzym đều có cấu trúc chuỗi polipeptid xương sống (backbone) gần như giống hệt nhau.
Cấu trúc ống của kênh enzym trong nhóm I được đặc trưng bởi hai phenylalanin tạo ra một dạng xếp chồng π (π-stacking), và vị trí phối hợp với ion kẽm được bảo tồn cao ở tất cả các enzym trong nhóm I. Bề mặt ngoài của HDAC8 có sự khác biệt lớn so với HDAC1, HDAC2 và HDAC3, với các amino acid khác biệt quan trọng là Lys33, Ile34, Tyr100, Pro205, Pro273, Met274 và Ser276. Cụ thể, Tyr204/209 ở HDAC1/HDAC2 được thay thế bằng Phe199/207 ở HDAC3/HDAC8. Việc mất đi nhóm hydroxyl ở vị trí này có thể tạo nên sự chọn lọc giữa các đồng phân nhưng đặc điểm này cũng có thể bị che khuất bởi các amino acid khác.
Sự hiện diện thêm của Gly206 và tiếp theo đó là Pro205 ở vị trí của Asn203/208 ở HDAC1/HDAC2 và Asp197 ở HDAC3. Một sự khác biệt quan trọng nữa là Lys 33 ở HDAC8 thay thế His33 ở HDAC1, HDAC2, HDAC3 và 5 luan an Tyr100 thay thế cho Glu98/104 của HDAC1/HDAC2 và Asp93 của HDAC3. Ở vị trí đầu vào của kênh enzym, sự thay đổi của HDAC8 là Ile34 và Pro273 và Met274 thay thế cho lần lượt là Pro, Arg và Leu ở HDAC1, HDAC2, HDAC3. Phân tử Tyr100 ở HDAC8 tạo nên một đường viền nhỏ hơn so với các enzym còn lại.
Hình biểu trung tâm hoạt động (Hình 1.4) giúp làm nổi bật hơn sự khác biệt về hình học giữa các enzym, yếu tố có thể tạo nên tính chọn lọc [125].4: Hình ảnh bề mặt của các HDAC1, 2, 3 và 8 Nghiên cứu về khoang phụ của các HDAC nhóm I bằng các đột biến gây ra trên HDAC1 hướng về vùng cấu trúc khoang phụ nhằm tìm hiểu rõ hơn về cách thức di chuyển của phân tử acid acetic [153]. Danh sách các amino acid tạo nên khoang phụ của các enzym nhóm I được công bố trước, sau đó các amino acid tương ứng của các enzym nhóm II và IV cũng được trình bày (mặc dù ở hai nhóm enzym này không có khoang phụ). Thay thế những amino acid quan trọng của vùng này có thể dẫn đến sự giảm đáng kể hoạt tính xúc tác. Những amino acid có vai trò then chốt có thể kể đến Tyr23, Tyr24, Arg34, Cys 151 và đặc biệt là Tyr303 ở HDAC1.
Thêm vào đó, Val19, Met30, Ile35, Phe109 và Leu139 là những amino acid quyết định hình dạng của khoang phụ chứa ion acetat. Những đột biến của alanin làm giảm hoạt tính xúc tác mặc dù các alanin không tham gia trực tiếp vào quá trình gắn ion acetat. Nhìn chung, những nghiên cứu về khoang phụ cũng gợi ý rằng những chất ức chế có nhóm chức tương đương acetat có thể gắn vào khoang phụ sẽ có khả năng tăng tính chọn lọc. HDAC nhóm II HDAC nhóm II là các enzym có nhiều ở mô và có liên quan đến quá trình biệt hoá cũng như phát triển của mô như mô xương, tim, cơ trơn, hệ miễn dịch, hệ mạch, 6 luan an não thông qua tác dụng ức chế phiên mã [106].