Luận Văn Thạc Sĩ: Thiết Kế In Silico Dược Phẩm Ức Chế Màng Sinh Học Ở Staphylococcus Aureus

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu công nghệ sinh học thiết kế in silico dược phẩm có khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học ở, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Lê Anh Vũ
• Người hướng dẫn: PGS. TS Nguyễn Thúy Hương
• Trường học: Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Thiết kế in silico dược phẩm có khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học ở Staphylococcus aureus
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CÁM ƠN
• TÓM LƯỢC
• SUMARY
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Quá trình nghiên cứu và thiết kế dược phẩm
• 1.2. Quá trình nghiên cứu dược phẩm
• 1.3. Những hạn chế của quá trình phát triển dược phẩm truyền thống
• 1.4. Thiết kế dược phẩm
• 1.5. Thiết kế dược phẩm in silico
• 1.6. Vai trò của máy tính trong hỗ trợ phát triển dược phẩm
• 1.7. Tổng quan về quá trình thiết kế dược phẩm in silico
• 1.8. Các chiến lược thiết kế in silico
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Vật liệu, hóa chất, môi trường
• 2.1.1. Nguồn giống vi sinh vật
• 2.1.2. Trang thiết bị, hóa chất
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
• 2.2.2. Thiết kế thí nghiệm
• 2.2.3. Bố trí thí nghiệm
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Thiết kế dược phẩm
• 3.1.1. Tìm kiếm mục tiêu
• 3.1.2. Mô hình hóa cấu trúc protein mục tiêu
• 3.1.3. Tìm kiếm phối tử
• 3.1.4. Sàng lọc ảo pharmacophore
• 3.2. Thử nghiệm cụ thể trên S. aureus
• 3.2.1. Đường cong sinh trưởng của S. aureus
• 3.2.2. Đánh giá khả năng chống sự hình thành màng sinh học của một số phối tử được chọn
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Luận văn thạc sĩ

Luận văn thạc sĩ này tập trung vào việc thiết kế in silico các dược phẩm có khả năng ức chế màng sinh học của Staphylococcus aureus. Nghiên cứu được thực hiện tại Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn của PGS. TS Nguyễn Thúy Hương. Luận văn này đã được bảo vệ thành công vào ngày 08/01/2016, với sự đánh giá của hội đồng chuyên môn. Mục tiêu chính của nghiên cứu là tìm kiếm các hợp chất có khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học, một yếu tố độc lực quan trọng của Staphylococcus aureus.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu nhằm thiết kế in silico các dược phẩm có khả năng ức chế màng sinh học của Staphylococcus aureus. Cụ thể, nghiên cứu tập trung vào việc lựa chọn protein mục tiêu, mô hình hóa cấu trúc protein, và tìm kiếm các phối tử có hoạt tính ức chế. Các phương pháp in silico được sử dụng để rút ngắn thời gian và chi phí nghiên cứu so với các phương pháp truyền thống.

1.2. Phương pháp tiếp cận

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp in silico như mô hình hóa phân tử, sàng lọc ảo, và docking phân tử để tìm kiếm các hợp chất tiềm năng. Protein sarA được chọn làm mục tiêu vì nó kích hoạt operon icaADBC, chịu trách nhiệm cho sự hình thành màng sinh học. Các công cụ như LigandScout và SwissDock được sử dụng để tạo mô hình pharmacophore và thực hiện docking phân tử.

II. Thiết kế in silico dược phẩm

Thiết kế in silico là một phương pháp hiện đại, sử dụng máy tính để mô phỏng và dự đoán các tương tác phân tử, giúp giảm thiểu thời gian và chi phí nghiên cứu. Trong luận văn thạc sĩ này, phương pháp thiết kế in silico được áp dụng để tìm kiếm các hợp chất có khả năng ức chế màng sinh học của Staphylococcus aureus. Các bước chính bao gồm mô hình hóa cấu trúc protein, sàng lọc ảo các phối tử, và đánh giá hiệu quả của các hợp chất tiềm năng.

2.1. Mô hình hóa protein mục tiêu

Protein sarA được chọn làm mục tiêu vì vai trò của nó trong việc kích hoạt sự hình thành màng sinh học. Cấu trúc 3D của protein được mô hình hóa từ cơ sở dữ liệu Protein Data Bank. Các công cụ như LigandScout được sử dụng để tạo mô hình pharmacophore, giúp xác định các đặc điểm cấu trúc cần thiết cho việc ức chế protein mục tiêu.

2.2. Sàng lọc ảo và docking phân tử

Sau khi mô hình hóa protein, nghiên cứu tiến hành sàng lọc ảo để tìm kiếm các phối tử phù hợp. Chương trình ZincPharmer được sử dụng để sàng lọc 151 phân tử dựa trên mô hình pharmacophore. Tiếp theo, 29 phân tử được chọn để thực hiện docking phân tử trên nền tảng SwissDock. Kết quả docking cho thấy các phân tử này có năng lượng liên kết tự do âm, cho thấy tiềm năng ức chế protein sarA.

III. Ứng dụng và kết quả nghiên cứu

Nghiên cứu đã đạt được những kết quả đáng kể trong việc thiết kế in silico các dược phẩm có khả năng ức chế màng sinh học của Staphylococcus aureus. Các hợp chất tiềm năng được thử nghiệm in vitro cho thấy hiệu quả ức chế màng sinh học mà không ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của vi khuẩn. Điều này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các loại thuốc kháng sinh hiệu quả.

3.1. Thử nghiệm in vitro

Năm phân tử được chọn để thử nghiệm in vitro, trong đó ba phân tử (Acetic Acid, Acetaminophen, và Acetylsalicylic Acid) cho kết quả dương tính. Acetic Acid và Acetylsalicylic Acid ức chế 100% sự hình thành màng sinh học ở nồng độ 5000 µg/ml, trong khi Acetaminophen đạt hiệu quả tương tự ở nồng độ 10000 µg/ml. Các phân tử này không ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của vi khuẩn, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong điều trị.

3.2. Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu này chứng minh rằng thiết kế in silico có thể là một công cụ hiệu quả trong việc phát triển các dược phẩm mới. Các hợp chất được phát hiện có thể được sử dụng như chất ức chế màng sinh học, đặc biệt trong điều trị các bệnh nhiễm trùng do Staphylococcus aureus gây ra. Ngoài ra, nhóm thuốc kháng viêm không steroid (NSAID) có thể là một thư viện hữu ích cho việc tìm kiếm các phân tử chống màng sinh học trong tương lai.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Staphylococcus aureus là một vi khuẩn Gram dương có khả năng hình thành màng sinh học, đóng vai trò quan trọng trong cơ chế gây bệnh và kháng thuốc. Ước tính khoảng 20-30% dân số thế giới là vật chủ của S. aureus, trong đó màng sinh học chiếm tới 90% sinh khối vi khuẩn, giúp vi khuẩn chống lại hệ miễn dịch và kháng sinh. Theo báo cáo của Viện Nghiên cứu Sức khỏe Hoa Kỳ (USA NIH), màng sinh học liên quan đến 80% các trường hợp nhiễm trùng trên người, đặc biệt là các nhiễm trùng mãn tính và bệnh viện. Do đó, việc phát triển các dược phẩm có khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của S. aureus là một thách thức lớn và có ý nghĩa thiết thực trong y học hiện đại.

Mục tiêu nghiên cứu là thiết kế in silico các hợp chất dược phẩm có khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học của S. aureus, tập trung vào protein sarA – một yếu tố điều hòa kích hoạt operon icaADBC chịu trách nhiệm cho sự tổng hợp polysaccharide nội bào (PIA), thành phần chính của màng sinh học. Nghiên cứu được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 7 đến tháng 12 năm 2015 tại Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh, với phạm vi tập trung vào dòng vi khuẩn S. aureus ATCC 29213.

Ý nghĩa của nghiên cứu được thể hiện qua việc ứng dụng phương pháp thiết kế dược phẩm dựa trên cấu trúc (Structure-Based Drug Design - SBDD) và sàng lọc ảo phối tử (Ligand-Based Virtual Screening - LBVS) nhằm rút ngắn thời gian và giảm chi phí phát triển dược phẩm, đồng thời nâng cao hiệu quả tìm kiếm các hợp chất chống màng sinh học. Kết quả nghiên cứu góp phần mở rộng thư viện các hợp chất tiềm năng, đặc biệt là nhóm thuốc kháng viêm không steroid (NSAIDs), phục vụ cho các nghiên cứu và ứng dụng trong điều trị các bệnh nhiễm trùng do S. aureus gây ra.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên hai lý thuyết chính trong thiết kế dược phẩm in silico:

1. Thiết kế dược phẩm dựa trên cấu trúc (SBDD): Phương pháp này sử dụng cấu trúc 3 chiều của protein mục tiêu để mô phỏng và đánh giá sự tương tác của các hợp chất với điểm hoạt động của protein. Protein sarA được lựa chọn làm mục tiêu vì vai trò điều hòa operon icaADBC, ảnh hưởng trực tiếp đến sự hình thành màng sinh học. Mô hình cấu trúc 3D của sarA được xây dựng dựa trên dữ liệu từ Protein Data Bank và mô hình hóa tương đồng.

2. Sàng lọc ảo dựa trên phối tử (LBVS): Dựa trên mô hình pharmacophore – mô tả các đặc điểm hóa học và hình học cần thiết cho hoạt tính sinh học của hợp chất. Mô hình pharmacophore được tạo ra bằng phần mềm LigandScout, sau đó sử dụng chương trình ZincPharmer để sàng lọc 151 phân tử tiềm năng từ cơ sở dữ liệu hóa học.

Các khái niệm chính bao gồm:

• Màng sinh học (Biofilm): Cấu trúc phức tạp gồm các tế bào vi khuẩn được bao bọc bởi polymer ngoại bào (EPS), giúp vi khuẩn bám dính và chống lại tác nhân kháng sinh.
• Operon icaADBC: Bộ gen mã hóa các enzyme tổng hợp polysaccharide nội bào (PIA), thành phần chính của màng sinh học.
• Protein sarA: Yếu tố điều hòa phiên mã, kích hoạt operon icaADBC, ảnh hưởng đến sự hình thành màng sinh học.
• Docking phân tử: Phương pháp mô phỏng sự liên kết giữa protein mục tiêu và các hợp chất tiềm năng, đánh giá năng lượng liên kết tự do để dự đoán hiệu quả ức chế.
• Pharmacophore: Mô hình hóa các đặc điểm hóa học cần thiết cho hoạt tính sinh học của hợp chất.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính bao gồm:

• Cấu trúc protein sarA lấy từ Protein Data Bank.
• Cơ sở dữ liệu phân tử hóa học từ ZincPharmer.
• Dòng vi khuẩn S. aureus ATCC 29213 dùng trong thử nghiệm in vitro.

Phương pháp phân tích:

• Mô hình hóa protein: Xây dựng mô hình 3D của protein sarA bằng kỹ thuật mô hình hóa tương đồng.
• Tạo mô hình pharmacophore: Sử dụng LigandScout để xác định các đặc điểm hóa học quan trọng.
• Sàng lọc ảo: Lọc 151 phân tử dựa trên mô hình pharmacophore, chọn ra 29 phân tử có năng lượng liên kết âm khi docking với sarA qua SwissDock.
• Docking phân tử: Đánh giá năng lượng liên kết tự do để xác định các phân tử tiềm năng.
• Thử nghiệm in vitro: Lựa chọn 5 phân tử để đánh giá hoạt tính ức chế màng sinh học trên dòng vi khuẩn S. aureus ATCC 29213.

Timeline nghiên cứu:

• Tháng 7/2015: Lựa chọn protein mục tiêu và mô hình hóa cấu trúc.
• Tháng 8-10/2015: Tạo mô hình pharmacophore và sàng lọc ảo.
• Tháng 11/2015: Docking phân tử và lựa chọn hợp chất thử nghiệm.
• Tháng 12/2015: Thử nghiệm in vitro và phân tích kết quả.

Cỡ mẫu thử nghiệm in vitro gồm 5 phân tử được chọn từ 29 phân tử docking thành công, với các nồng độ thử nghiệm khác nhau để đánh giá khả năng ức chế màng sinh học và ảnh hưởng đến sự phát triển vi khuẩn.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Mô hình hóa và sàng lọc ảo: Từ 151 phân tử được sàng lọc dựa trên mô hình pharmacophore, 29 phân tử có năng lượng liên kết tự do âm khi docking với protein sarA, cho thấy khả năng tương tác thuận lợi. Tỷ lệ thành công của phương pháp sàng lọc ảo đạt khoảng 19%.

2. Thử nghiệm in vitro: Trong 5 phân tử được thử nghiệm, 3 phân tử gồm Acetic Acid, Acetylsalicylic Acid và Acetaminophen cho kết quả ức chế màng sinh học 100% ở nồng độ lần lượt là 5000 µg/ml (Acetic Acid và Acetylsalicylic Acid) và 10000 µg/ml (Acetaminophen). Hai phân tử còn lại không đạt hiệu quả ức chế đáng kể.

3. Ảnh hưởng đến sự phát triển vi khuẩn: Các phân tử trên không ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của S. aureus ở nồng độ sử dụng, cho thấy khả năng ức chế màng sinh học không do tác động diệt khuẩn trực tiếp.

4. Tỷ lệ thành công tổng thể: Chiến lược thiết kế dược phẩm dựa trên cấu trúc và sàng lọc ảo phối tử đạt tỷ lệ thành công khoảng 60% trong việc tìm ra các hợp chất có hoạt tính ức chế màng sinh học.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp thiết kế dược phẩm in silico kết hợp mô hình hóa protein, tạo mô hình pharmacophore và sàng lọc ảo là một công cụ hiệu quả trong việc phát hiện các hợp chất ức chế màng sinh học của S. aureus. Việc lựa chọn protein sarA làm mục tiêu là hợp lý do vai trò điều hòa operon icaADBC, một yếu tố quyết định trong quá trình hình thành màng sinh học.

So sánh với các nghiên cứu trước đây, kết quả ức chế màng sinh học của Acetylsalicylic Acid và Acetaminophen phù hợp với báo cáo về tác dụng của nhóm thuốc kháng viêm không steroid (NSAIDs) trong việc ngăn chặn sự hình thành màng sinh học. Việc các phân tử này không ảnh hưởng đến sự phát triển vi khuẩn cho thấy cơ chế ức chế tập trung vào quá trình tổng hợp polysaccharide nội bào, không gây độc tế bào trực tiếp, điều này có lợi trong việc giảm nguy cơ phát triển kháng thuốc.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ đường cong sinh trưởng vi khuẩn và biểu đồ tỷ lệ ức chế màng sinh học theo nồng độ hợp chất, cũng như bảng so sánh năng lượng liên kết tự do của các phân tử docking thành công.

Phương pháp này giúp giảm đáng kể chi phí và thời gian so với phương pháp sàng lọc nâng cao (HTS) truyền thống, đồng thời mở rộng khả năng tìm kiếm các hợp chất tiềm năng từ thư viện hóa học lớn.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Mở rộng thư viện hợp chất: Tiếp tục sử dụng phương pháp sàng lọc ảo để khảo sát thêm các hợp chất thuộc nhóm thuốc kháng viêm không steroid và các nhóm hóa học khác nhằm tăng tỷ lệ phát hiện hợp chất ức chế màng sinh học hiệu quả.

2. Tối ưu hóa cấu trúc phân tử: Áp dụng các kỹ thuật mô hình hóa và docking linh hoạt để tối ưu hóa các phân tử đã được xác định, nâng cao ái lực liên kết và hiệu quả ức chế, tiến tới thiết kế các dẫn chất có hoạt tính cao hơn.

3. Thử nghiệm in vivo: Triển khai các nghiên cứu thử nghiệm trên mô hình động vật để đánh giá hiệu quả và độ an toàn của các hợp chất tiềm năng, làm cơ sở cho các nghiên cứu lâm sàng tiếp theo.

4. Phát triển công cụ tính toán: Nâng cấp và tích hợp các thuật toán docking và mô hình pharmacophore mới nhằm tăng độ chính xác và khả năng dự đoán, đồng thời giảm thời gian tính toán.

5. Hợp tác đa ngành: Khuyến khích sự phối hợp giữa các nhà nghiên cứu sinh học phân tử, hóa học dược phẩm và y học lâm sàng để phát triển các dược phẩm chống màng sinh học có tính ứng dụng cao.

Các giải pháp trên nên được thực hiện trong vòng 2-3 năm tới, với sự chủ trì của các nhóm nghiên cứu tại các trường đại học và viện nghiên cứu chuyên ngành công nghệ sinh học và dược phẩm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu công nghệ sinh học: Có thể áp dụng phương pháp thiết kế dược phẩm in silico để phát triển các hợp chất mới chống lại các vi khuẩn có khả năng tạo màng sinh học, nâng cao hiệu quả nghiên cứu và giảm chi phí.

2. Chuyên gia dược phẩm: Sử dụng kết quả nghiên cứu để mở rộng thư viện hợp chất tiềm năng, đặc biệt là nhóm NSAIDs, phục vụ cho việc phát triển thuốc mới trong điều trị các bệnh nhiễm trùng mãn tính.

3. Bác sĩ lâm sàng và chuyên gia y tế: Hiểu rõ cơ chế hình thành màng sinh học và tác dụng của các hợp chất ức chế, từ đó có thể đề xuất các liệu trình điều trị kết hợp hiệu quả hơn cho bệnh nhân nhiễm S. aureus.

4. Sinh viên và học viên cao học: Tham khảo phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật mô hình hóa và sàng lọc ảo trong thiết kế dược phẩm, làm nền tảng cho các nghiên cứu khoa học và luận văn chuyên ngành.

Câu hỏi thường gặp

1. Thiết kế dược phẩm in silico là gì?
   Thiết kế dược phẩm in silico là phương pháp sử dụng máy tính để mô phỏng và dự đoán sự tương tác giữa các hợp chất hóa học và protein mục tiêu, giúp rút ngắn thời gian và giảm chi phí phát triển thuốc mới.

2. Tại sao chọn protein sarA làm mục tiêu?
   Protein sarA điều hòa operon icaADBC, chịu trách nhiệm tổng hợp polysaccharide nội bào – thành phần chính của màng sinh học, nên ức chế sarA giúp ngăn chặn sự hình thành màng sinh học của S. aureus.

3. Pharmacophore là gì và vai trò của nó?
   Pharmacophore là mô hình mô tả các đặc điểm hóa học và hình học cần thiết để một hợp chất có hoạt tính sinh học, được dùng để sàng lọc ảo các hợp chất tiềm năng trong cơ sở dữ liệu.

4. Các hợp chất Acetic Acid, Acetylsalicylic Acid và Acetaminophen có tác dụng như thế nào?
   Ba hợp chất này ức chế 100% sự hình thành màng sinh học của S. aureus ở nồng độ 5000-10000 µg/ml mà không ảnh hưởng đến sự phát triển vi khuẩn, cho thấy khả năng ức chế màng sinh học hiệu quả và an toàn.

5. Phương pháp sàng lọc ảo có ưu điểm gì so với sàng lọc nâng cao (HTS)?
   Sàng lọc ảo giúp giảm chi phí và thời gian nghiên cứu, tăng hiệu quả tìm kiếm hợp chất tiềm năng, đồng thời giảm tỷ lệ thất bại trong các giai đoạn thử nghiệm tiếp theo.

Kết luận

• Thiết kế dược phẩm in silico dựa trên protein sarA và mô hình pharmacophore là phương pháp hiệu quả để tìm kiếm các hợp chất ức chế màng sinh học của S. aureus.
• 29 phân tử được xác định có năng lượng liên kết âm với sarA, trong đó 3 phân tử Acetic Acid, Acetylsalicylic Acid và Acetaminophen cho kết quả ức chế màng sinh học 100% trong thử nghiệm in vitro.
• Các hợp chất này không ảnh hưởng đến sự phát triển vi khuẩn, cho thấy cơ chế ức chế tập trung vào màng sinh học, giảm nguy cơ kháng thuốc.
• Phương pháp sàng lọc ảo phối tử kết hợp docking phân tử đạt tỷ lệ thành công khoảng 60%, góp phần giảm chi phí và thời gian phát triển dược phẩm.
• Nghiên cứu mở ra hướng phát triển các dược phẩm chống màng sinh học mới, đặc biệt từ nhóm thuốc kháng viêm không steroid, với kế hoạch mở rộng thử nghiệm và tối ưu hóa trong các giai đoạn tiếp theo.

Để tiếp tục phát triển, các nhà nghiên cứu và chuyên gia trong lĩnh vực công nghệ sinh học và dược phẩm được khuyến khích áp dụng phương pháp này, đồng thời triển khai các nghiên cứu in vivo và lâm sàng nhằm đưa các hợp chất tiềm năng vào ứng dụng thực tiễn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

= ———ễ—ễễ———== ĐẠI HỌC QUOC GIA THÀNH PHO HO CHÍ MINH TRUONG DAI HOC BACH KHOA KHOA KY THUAT HOA HOC BO MON CONG NGHE SINH HOC LE ANH VU THIET KE IN SILICO DUOC PHAM CO KHA NANG UC CHE SU HINH THANH MANG SINH HOC O STAPHYLOCOCCUS AUREUS CHUYEN NGANH CONG NGHE SINH HOC MA SO : 60420201 LUAN VAN THAC SY Thanh phố Hồ Chi Minh, thang 12 năm 2015 z4 ke rz“i net Cy z4 3aa¿nveấtZNg,ướ “Po,tenñ SKz“ta4e/u -#kLÃ/m„G7”⁄: “`frglcyu,, ane eal K„ý ĐẠI2 = Ậ xO bởi `.)Z2 Yee ‘hin, c“fryka-{‘ew?l Pƒetos‘ainogea Teys+ fag 9, ky: tog % K4 ip % ki4 ? iy ene’H i bñ A yo Et #0 71 » we %,ñ*% #24 2,2 282%7# Ae ic wn htarả o.rend,2‘aLenư)ar!‘eya {hay ì * Fre e, oy4ae X era? 1 ƒ fre , #0 0 4 La rey wz2j t° Secti4tn Mibter j:aenJSdoy2 7.eis Ma “(+Pzh1e,r85aổts4 ae Nema? .#⁄ ate la Tan Pace ea end aes‘es Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại hoc Bách Khoa, ĐHQG TP. Hồ Chí Minh, 268 Lý Thường Kiệt, phường 14, Q. Hồ Chí Minh. Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.

TS Nguyễn Thúy Hương Ủy viên phản biện 1: PGS. TS Đỗ Phúc Ủy viên phản biện 2: TS. Võ Đình Lệ Tâm Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, Đại Học Quốc Gia Thanh phố Hồ Chí Minh, ngày 08 tháng 01 năm 2016. Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: 1.

Chủ tịch Hội đồng: PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng 2. Thư ký hội đồng: TS. Huỳnh Ngọc Oanh 3. Ủy viên phản biện 1: PGS.

Ủy viên phản biện 2: TS. Võ Đình Lệ Tâm 5. Ủy viên hội đồng: TS. Phan Ngọc Hòa Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa.

CHỦ TỊCH HỘI DONG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC ĐẠI HOC QUOC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Lê Anh Vũ MSHV: 13313255 Ngày, thang, năm sinh: 31/03/1990 Noi sinh: Kién Giang Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201 I. TÊN DE TÀI: “Thiết kế in silico dược phẩm có khả năng ức chế sự hình thành màng sinh học 6 Staphylococcus aureus” NHIEM VU VA NOI DUNG: - Lựa chọn protein mục tiêu phù hợp cho các thử nghiệm sinh hoc. Mô hình hóa protein mục tiêu đã lựa chọn được. Tìm kiêm in silico các phôi tử phù hợp có hoạt tính ức chê protein mục tiêu.

Ứng dụng và nghiên cứu tác dụng của các phối tử được thiết kế dựa trên mục tiêu lựa chọn được. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 06/07/2015. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VU: 04/12/2015. CÁN BỘ HƯỚNG DÂN: PGS.

NGUYÊN THÚY HƯƠNG. năm 2015 CAN BỘ HƯỚNG DAN CHU NHIEM BO MON DAO TAO TRUONG KHOA KY THUAT HOA HOC LỜI CÁM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin được bảy t lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS.TS Nguyễn Thúy Hương — người Thay đã tận tình hướng dẫn, giúp d và tao mọi điều kiện tốt nhất đ tôi hoàn thành chương trình cao học. Tôi đã học được nhiều điều quý báu ở cô về kiến thức, nhiệt huyết, tình yêu thương và tỉnh thần trách nhiệm. Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học — Trường Đại học Bách Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi đ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp.

Xin trân trọng cảm ơn tất cả quý thầy cô đã tận tình truyền đạt cho tôi kiến thức và kinh nghiệm, giúp tôi có được hành trang hữu ích d phát tri n nghề nghiệp. Xin cảm ơn bạn Hà Thiên Hương — học viên cao học ngành Công nghệ Sinh học khóa 13 đã luôn chia sẻ và nhiệt tình hỗ trợ tôi thực hiện thí nghiệm. Xin cảm ơn các bạn học viên cao học ngành Công nghệ Sinh học khóa 13, khóa l4 và các bạn sinh viên đã giúp d_ và động viên tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Cuối cùng, tôi xin bay t lòng biết ơn sâu sắc đến bạn Phan Thị Cam Quyên và gia đình thân yêu đã luôn khích lệ và ủng hộ tôi về mặt vật chất lẫn tinh thần đ tôi vững tin thực hiện đề tài nghiên cứu này.

TÓM LƯỢC Thiết kế được phẩm in silico được thừa nhận như một công cụ hỗ trợ hiện đại cho việc phát hiện và phát tri n những loại được phẩm mới. Phương pháp thiết kế dược phẩm dựa trên cau trúc mục tiêu được sử dụng trong nghiên cứu này đ tìm chất chống màng sinh học nhăm mục đích ức chế sự sản xuất mang sinh học ở Staphylococcus aureus mà được xem như là yếu tố độc lực chính của loài vi khuẩn này. Protein sarA đã được chon làm mục tiêu cho quá trình thiết kế nay vì nó kích hoạt operon icaADBC chịu trách nhiệm cho sự hình thành màng sinh học. Các phương pháp được sử dụng đ giải quyết mục tiêu và nội dung là mô hình hóa cấu trúc 3-D của protein mà được lay từ cơ sở dữ liệu Protein Data Bank.

Mô hình pharmacophore được tạo ra băng cách sử dụng phần mềm LigandScout. 151 phân tử đã được chọn ra sau khi sàng lọc ảo dựa trên pharmacophore bằng chương trình ZincPharmer. Sau đó, 29 phân tử được tìm thay phù hợp vì có năng lượng liên kết tự do có giá trị âm khi tiễn hành docking băng trang web Swissdock. Trong điều kiện in vifro, 5 phân tử được chọn đ thử nghiệm hoạt tính chống mang sinh học.

Ba phân tử cho kết quả dương tinh theo thứ tự như sau: Acetic Acid va Acetylsalicylic Acid ức chế sự hình thành màng sinh học 100% ở nồng độ 5000 pg/ml trong khi sự ức chế bởi Acetaminophen là 100% ở nông độ 10000 ug/ml. Tất cả những phân tử trên ở nông độ sử dụng đềuth hiện sự ảnh hưởng đến sự hình thành mảng sinh học mà không ảnh hưởng đángk đến sự phát tri n của vi khuẩn. Điều nay cho phép kết luận rằng chiến lược thiết kế dược phẩm dựa trên cấu trúc sử dụng sàng lọc ảo dựa trên phối tử có tỉ lệ thành công ở mức 60% và Acetic Acid, Acetaminophen, Acetylsalicylic Acid cóth được sử dụng như chất chống mang sinh học. Ngoài ra, nhóm thuốc kháng viêm không steroid có th được sử dụng như một thư viện hữu ích cho việc tim kiếm những phân tử chống màng sinh học trong tương lai.

ii SUMARY In silico drug design acts as a new accession for drug discovery and industry. Structure based computer aided drug design was used in this study to find anti-biofilm agents to repress Staphylococcus aureus biofilm production which is conceded the main virulence factor of this bacterium. The sarA protein was chosen as the target for this process as it stimulates icaADBC operon which is responsible for biofilm formation. The methods used to resolve the objectives and content was modeling 3-D structure of the protein which was obtained from Protein Data Bank.

Pharmacophore model generation was performed using LigandScout program. 151 molecules were chosen by pharmacophore based virtual screening using ZincPharmer. Then 29 molecules were found suitable as having negative binding free energies with sarA protein in EADock engine from the SwissDock website. In in vitro conditions, five molecules were selected to detect their anti-biofilm activity.

Three molecules gave positive results and were as follows: Acetic Acid and Acetylsalicylic Acid inhibited biofilm production 100% at 5000 g/ml concentration while Acetaminophen inhibition was 100% at 10000 g/ml. All the molecules at the used concentrations were found to affect biofilm production without significant change in bacterial growth. It was concluded that a structure based drug design strategy using ligand based virtual screening had a success score of about 60% and that Acetic Acid, Acetaminophen and Acetylsalicylic Acid can be used as anti-biofilm molecules. Also Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs family can be a useful library for anti-biofilm future investigations.

iil LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tÔI. Các sô liệu và kêt quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được công bô trong bât kỳ công trình nào khác. Tac giả IV MỤC LỤC LOL CẢM ON. cà St HH 111re ¡908099 2 ii S800 ——.ỐBÄẬẦD hồ.

lil LOL CAM ĐOAN. ác St c2 HH 1111reg iv I/1819300i 0 ——-dẢỔẦÂỔẢỔÕÕẼỀỶẲỀẢẮ.) 2 vii DANH MỤC BANG.G- c1 12 91 919191 H1 1T HH ng HT TH Hưng ng ix DANH MỤC TU VIET TẮT. G1251 91 83 91 91 91 5195 11 1E kg ng sư chọ X MO DAU. TONG QUAN TÀI LIỆU.

Quá trình nghiên cứu và thiết kế được phẩm .1 Quá trình nghiên cứu dược phẩm .2 Những hạn chế của quá trình phát tri n dược phẩm truyền thong .3 Thiết kế dược phẩm .4 Thiết kế dược phẩm in siliCGO.5 Vai trò của máy tính trong hỗ trợ phát tri n dược phẩm .6 Tong quan vé quá trình thiết kế dược phẩm in silico .7 Các chiến lược thiẾt kế im Silico. c6 2cc St treo 10 1. Vi khuẩn Staphylococcus @HY€IS. 5 5S SE SE SEEE E9 13111111 5111111111511 11c 21 1.1 Giới thiệu về StaphyloCOCCUS QUIEUS vececccccscscsssssssessssssesessssssesesesesesesesesesees 21 1.2 Vai trò trong lâm sàng của StaphylOCOCCUS HTY€HS.3 Các yếu tô độc lực.

Màng sinh ho. 1101 TY TH TH nh 26 1.1 Tổng quan về màng sinh hỌC.-- - +: 2< 2 2E 2E SE 2 E31 EEE2ESEEEEcEErrrrre 26 1.2 Gen điều hòa của mang sinh học .3 Cơ chế của sự hình thành màng sinh học. Các nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến hướng của dé tài. VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP .1 Vật liệu, hóa chất, môi trường.1 Nguồn giống vi sinh vật .2 Trang thiết bị, hóa chất .- --- -ck+ s11 E121 S1 cv ng ng ng cet 34 2.2 Phương pháp nghiÊn CỨU.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát.2 Thiết kế thí nghiệm.3 Bồ trí thí nghiệm.------ - -ES< k SE S3 3 1 1 5 511111 11 1011111111101 11101 ke 43 CHUONG 3.

KET QUA VÀ THẢO LUẬN .- + SE SE vn re rrseg 46 3.1 Thiết kế dược phẩm .1 Tìm kiểm mục tiÊU.2 Mô hình hóa cấu trúc protein mục tiêu .3 Tìm kiếm phối tử .4 Sang lọc ảo pharmacophore .2 Thử nghiệm cu th trÊn S.1 Đường cong sinh trưởng CUA S.2 Đánh giá khả năng chống sự hình thành màng sinh học của một số phối tử được i89; ằ. KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ,.-- G119 91 H1 11 11 g1 1n HH TT ng HT ngưng vi 73 4.---- -- 6 5S 11 325 5 51111111 5151111101 11 111110101 11110101 1111010101011 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC V1 DANH MỤC HÌNH Hình 1. Sơ đỗ tong quan về quá trình thiết kế dược phẩm in siÏico. Sơ đồ bi u diễn các quy trình sảng lọc ảo.

Ví dụ về một mô hình pharmacophore. Ví dụ về docking phân tử giữa hop chất hóa học và một profein. Sơ đỗ tong quan về quá trình tổng hop PIA. Sơ đỗ nghiên cứu tong quát .---- ¿+ + S222 S2 E321 EEESESE 1E EeErxrxrrcee 38 Hình 2.

Quy trình tìm kiếm protein mục tiêU.