Tổng quan luận án
Tình trạng phì đại lành tính tuyến tiền liệt (BPH) và bệnh lý tăng huyết áp là hai vấn đề sức khỏe phổ biến ở nam giới từ độ tuổi trung niên. Dữ liệu dịch tễ học được trích dẫn trong công trình cho thấy có khoảng 23% nam giới ở độ tuổi 45 và 78% nam giới trong nhóm tuổi từ 60 đến 85 mắc BPH; 50% nam giới trên 70 tuổi bị tăng huyết áp; và 25% nam giới trên 60 tuổi mắc đồng thời cả hai bệnh lý này.
Terazosin hydroclorid là hoạt chất ức chế chọn lọc thụ thể $\alpha_1$-adrenergic thuộc nhóm dẫn chất -zosin, sở hữu tác dụng kép: làm giãn cơ trơn tuyến tiền liệt và cổ bàng quang nhằm cải thiện tình trạng tắc nghẽn đường tiểu do BPH, đồng thời làm giãn cơ trơn mạch máu dẫn đến hạ huyết áp. Hoạt chất này được chỉ định phổ biến trong điều trị BPH, đặc biệt trên các bệnh nhân có kèm tăng huyết áp. Một số nghiên cứu công bố khác còn ghi nhận terazosin có tiềm năng trong hỗ trợ điều trị ung thư tuyến tiền liệt, xuất tinh sớm, làm giảm triệu chứng khó chịu và giảm nhu cầu dùng thuốc giảm đau ở bệnh nhân đặt stent niệu quản.
Hiện nay, terazosin được lưu hành rộng rãi tại các nước ASEAN và trên thế giới dưới nhiều dạng biệt dược và hàm lượng khác nhau. Việc kiểm tra chất lượng nguyên liệu đầu vào và thành phẩm thuốc lưu hành là quy định bắt buộc, đòi hỏi phải sử dụng chất chuẩn và tạp chuẩn đối chiếu để thực hiện các phép thử định tính, định lượng, thử độ hòa tan và xác định giới hạn tạp chất liên quan (tạp A, B, C). Tuy nhiên, số lượng tạp chuẩn được thiết lập tại Việt Nam còn rất hạn chế (chỉ có gần chục tạp chuẩn trong tổng số hơn 500 chất chuẩn hóa học). Đối với terazosin, chất chuẩn và các tạp chuẩn A, B, C chưa từng được thiết lập trong nước; việc nhập khẩu từ nước ngoài có chi phí cao và thời gian chờ đợi kéo dài.
Đề tài “Nghiên cứu tổng hợp, thiết lập chất chuẩn và tạp chuẩn dùng trong kiểm nghiệm terazosin” được triển khai nhằm giải quyết các mục tiêu cụ thể sau:
- Tổng hợp được các nguyên liệu terazosin hydroclorid (TEZ), tạp chất A của terazosin dạng muối dihydroclorid (IAT), tạp chất B của terazosin (IBT) và tạp chất C của terazosin dạng muối dihydroclorid (ICT) để làm nguồn nguyên liệu thiết lập chuẩn.
- Xây dựng được tiêu chuẩn chất lượng cho các nguyên liệu TEZ, IAT, IBT và ICT đã tổng hợp.
- Thiết lập được chất chuẩn TEZ, tạp chuẩn IAT, tạp chuẩn IBT, tạp chuẩn ICT và ứng dụng các chất chuẩn, tạp chuẩn này trong công tác kiểm nghiệm.
Đối tượng nghiên cứu của luận án bao gồm: hoạt chất terazosin hydroclorid, tạp chất A dạng muối dihydroclorid, tạp chất B dạng base, tạp chất C dạng muối dihydroclorid, cùng các mẫu nguyên liệu và chế phẩm viên nén, viên nang terazosin lưu hành trên thị trường. Phạm vi nghiên cứu tập trung vào quy trình hóa dược (tổng hợp, tinh chế, xác định cấu trúc), phân tích - kiểm nghiệm (xây dựng tiêu chuẩn chất lượng, thẩm định phương pháp phân tích), và quy trình thiết lập chất chuẩn đối chiếu theo các nguyên tắc của Dược điển Việt Nam, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và các hướng dẫn quốc tế (WHO, ASEAN, ICH, USP).
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Các hướng nghiên cứu tổng hợp và kiểm nghiệm trước đây
Trong phần tổng quan, tác giả đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu về tổng hợp hoạt chất terazosin và các dẫn chất liên quan:
Tình hình thiết lập chất chuẩn trên thế giới và khoảng trống nghiên cứu
Trên thị trường quốc tế, chất chuẩn TEZ và các tạp chuẩn A, B, C đã được Hội đồng Dược điển Mỹ (USPRS) và một số nhà sản xuất thương mại (Clearsynth, Sigma-Aldrich, Chemical Book, LGC, Crescent Chemical) cung cấp. Tuy nhiên, giá thành của các chất chuẩn này rất cao (khoảng 361–715 USD cho lọ 200–250 mg chuẩn TEZ; khoảng 1.000 USD cho lọ 50 mg tạp chuẩn A, B hoặc C), và đa số các nhà cung cấp thương mại chỉ cung cấp tạp A và tạp C ở dạng base tự do chứ không phải dạng muối dihydroclorid dược dụng theo Dược điển Mỹ.
Tại Việt Nam, đề tài tổng hợp terazosin trước đây chỉ dừng lại ở việc sản xuất nguyên liệu thô, chưa đánh giá được đầy đủ chỉ tiêu giới hạn tạp chất A, B, C do thiếu chất chuẩn đối chiếu. Do đó, khoảng trống nghiên cứu mà luận án lựa chọn giải quyết là: nghiên cứu hoàn thiện quy trình tổng hợp và tinh chế để thu nhận nguyên liệu TEZ, IAT, IBT, ICT đạt độ tinh khiết cao; xác định cấu trúc toàn diện; xây dựng và thẩm định các phương pháp phân tích kiểm nghiệm; và thiết lập bộ chất chuẩn, tạp chuẩn cấp quốc gia/phòng thí nghiệm phục vụ công tác kiểm tra chất lượng thuốc.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Cơ sở lý thuyết và khung phân tích
- Lý thuyết về chất chuẩn đối chiếu: Dựa trên các hướng dẫn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Dược điển Quốc tế (ICRS), Dược điển Mỹ (USP), Dược điển Anh (BP), Dược điển Châu Âu (EP) và quy trình thiết lập chất chuẩn của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (VKNTTƯ). Chất chuẩn được phân loại thành chất chuẩn sơ cấp (primary reference standard - xác định hàm lượng dựa trên việc trừ đi tổng lượng tạp chất gồm độ ẩm, dung môi tồn dư, tro vô cơ, tạp chất sắc ký) và chất chuẩn thứ cấp (secondary reference standard - xác định hàm lượng thông qua việc nối chuẩn với chất chuẩn gốc).
- Lý thuyết thẩm định phương pháp phân tích: Áp dụng theo hướng dẫn của Hội nghị Quốc tế về Hài hòa hóa (ICH), Hiệp hội các quốc gia Đông Nam Á (ASEAN) và USP. Các chỉ tiêu thẩm định bao gồm:
- Tính đặc hiệu: Chứng minh khả năng phân tách rõ ràng giữa hoạt chất chính và các tạp chất hoặc sản phẩm phân hủy.
- Tính tuyến tính: Đánh giá sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ ($x$) và đáp ứng ($y$) qua phương trình hồi quy $y = ax + b$, yêu cầu hệ số tương quan $R \ge 0{,}999$ và phần trăm hệ số chắn $%Y \le 2{,}0%$.
- Độ đúng (Accuracy): Xác định qua phương pháp thêm chuẩn trên mẫu thử hoặc so sánh với phương pháp chính thống.
- Độ chính xác (Precision): Gồm độ lặp lại hệ thống, độ lặp lại của phương pháp (yêu cầu $\text{RSD} \le 2{,}0%$) và độ chính xác trung gian.
- Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ): Xác định theo quan sát thực nghiệm, theo tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu đường nền ($S/N \approx 3:1$ cho LOD và $S/N \approx 10:1$ cho LOQ), hoặc dựa trên độ lệch chuẩn của đáp ứng và độ dốc đường chuẩn ($\text{LOD} = 3{,}3\sigma/S$, $\text{LOQ} = 10\sigma/S$).
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
- Phương pháp tổng hợp hóa dược:
- TEZ: Kế thừa quy trình tổng hợp đi từ ACDQ và 1-(2-tetrahydrofuroyl)piperazin, sau đó tạo muối hydroclorid.
- IAT: Phản ứng thế ái nhân giữa ACDQ và piperazin trong dung môi IAM, sau đó chuyển thành muối dihydroclorid bằng dung dịch $\text{HCl}$ trong methanol.
- IBT: Phản ứng diazo hóa nhóm 4-amino của terazosin bằng $\text{NaNO}_2$ trong môi trường acid vô cơ để tạo muối diazoni, sau đó thủy phân có kiểm soát ở pH = 6 và chiết bằng ethyl acetat.
- ICT: Phản ứng ngưng tụ giữa tạp chất A dạng base tự do và ACDQ trong dung môi thích hợp, sau đó tạo muối dihydroclorid với $\text{HCl}/\text{MeOH}$.
- Phương pháp tinh chế: Sử dụng kỹ thuật sắc ký cột pha thuận (silica gel 60, kích thước hạt 63–200 $\mu\text{m}$) với tỷ lệ chất hấp phụ/nguyên liệu thô là 50:1. Mẫu được nạp cột theo phương pháp phân tán mẫu ướt; phân đoạn dịch rửa giải được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng (TLC).
- Phương pháp xác định cấu trúc và phân tích hóa lý:
- Phổ hồng ngoại (FTIR): Ghi phổ dạng viên nén KBr trong dải sóng 4000–400 $\text{cm}^{-1}$ trên thiết bị Thermo FTIR NEXUS 670, Shimadzu FTIR Affinity-1S hoặc Spectrum Two.
- Phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS): Ghi phổ trên thiết bị LTQ ORBITRAP XL với kỹ thuật ion hóa phun mù điện tử (ESI).
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Ghi phổ $^1\text{H}$-NMR (500 MHz), $^{13}\text{C}$-NMR (125 MHz), HSQC và HMBC trên thiết bị Bruker Ascend 500 MHz hoặc Bruker AVANCE 500 MHz (dung môi $\text{DMSO-}d_6$, chuẩn nội TMS).
- Phân tích nhiệt trọng lượng (TGA): Đo hàm lượng ẩm và mất khối lượng do nhiệt trên máy Labsys TG 1600 (tốc độ dòng khí bảo vệ 2,5 lít/giờ, tốc độ gia nhiệt 2 °C/phút đến 105 °C, giữ nhiệt trong 4 giờ).
- Xác định hàm lượng ion clorid: Định tính bằng phản ứng tạo tủa $\text{AgCl}$ với $\text{AgNO}_3$ 0,1 N; định lượng tỷ lệ mol $\text{HCl}$ trong ICT bằng sắc ký ion HPLC sử dụng detector đo độ dẫn điện CDD-10A VP, cột Shodex IC SI-52 4E ($4{,}0 \times 250\text{ mm}$), pha động $\text{Na}_2\text{CO}_3$ 3,6 mM.
- Sắc ký khí (GC-FID): Phân tích tạp chất acid tetrahydro-2-furancarboxylic (THFA) theo USP 40 trên cột mao quản G25 ($0{,}53\text{ mm} \times 10\text{ m}$; màng phim $1{,}2\text{ }\mu\text{m}$), detector FID 240 °C, nhiệt độ cột 170 °C.
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-UV/DAD): Sử dụng các hệ thống Agilent 1200 và Shimadzu SPD-M20A với cột pha đảo C8 và C18 ($250 \times 4{,}6\text{ mm}$, $5\text{ }\mu\text{m}$) để kiểm tra độ tinh khiết sắc ký, định lượng hoạt chất và xác định giới hạn tạp chất liên quan.
Phương pháp xử lý dữ liệu và thống kê liên phòng thí nghiệm
Dữ liệu phân tích được thu thập độc lập từ hai phòng thí nghiệm (PTN 1: kiểm tra toàn bộ các chỉ tiêu; PTN 2: kiểm tra chỉ tiêu định lượng). Quy trình xử lý thống kê bao gồm:
| Thông số thống kê |
Công thức toán học áp dụng |
Mục đích sử dụng |
| Giá trị trung bình ($\bar{X}$) |
$\bar{X} = \frac{1}{n}\sum_{i=1}^{n} X_i$ |
Xác định giá trị xu hướng trung tâm |
| Độ lệch chuẩn ($S$) |
$S = \sqrt{\frac{\sum_{i=1}^{n}(X_i - \bar{X})^2}{n-1}}$ |
Đánh giá độ phân tán của phép đo |
| Độ lệch chuẩn tương đối ($\text{RSD}$) |
$\text{RSD} = \frac{S}{\bar{X}} \times 100%$ |
Đánh giá độ lặp lại (yêu cầu $\text{RSD} < 1{,}0%$ khi đóng lọ) |
| Sai số chuẩn ($S_{\bar{x}}$) |
$S_{\bar{x}} = \frac{S}{\sqrt{n}}$ |
Tính toán độ phân tán của giá trị trung bình |
| Khoảng tin cậy |
$\bar{X} \pm \Delta X = \bar{X} \pm t_{\alpha} \cdot S_{\bar{x}}$ |
Ước lượng khoảng giá trị thực ở xác suất $P = 95%$ |
| Kiểm định $F$ ($F$-test) |
$F_{\text{TN}} = \frac{S_1^2}{S_2^2}$ |
So sánh phương sai giữa 2 phòng thí nghiệm |
| Kiểm định $T$ ($T$-test) |
So sánh 2 giá trị trung bình |
Đánh giá sự sai khác có ý nghĩa thống kê giữa 2 PTN |
| Độ không đảm bảo đo mở rộng ($U$) |
$U = k \cdot S_{\bar{x}}$ ($k = 2$, độ tin cậy 95%) |
Công bố giá trị hàm lượng chuẩn: $\bar{X} \pm U$ |
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan về terazosin, các tạp chất liên quan và chất chuẩn đối chiếu
Chương này trình bày chi tiết về cấu trúc hóa học, tính chất lý hóa, tác dụng dược lý, phương pháp tổng hợp và kiểm nghiệm terazosin cùng các tạp chất liên quan. Hoạt chất có công thức phân tử $\text{C}{19}\text{H}{25}\text{N}_5\text{O}_4\cdot\text{HCl}$, tên khoa học là 1-(4-amino-6,7-dimethoxy-2-quinazolinyl)-4-(tetrahydro-2-furoyl)piperazin monohydrochlorid. Theo USP, có hai dạng dược dụng: terazosin hydroclorid khan (phân tử lượng 423,89) và terazosin hydroclorid ngậm 2 phân tử nước (phân tử lượng 459,92). Dược chất ở dạng tinh thể màu trắng, không mùi, ít tan trong methanol và nước, rất ít tan trong ethanol 96% và cloroform, thực tế không tan trong aceton.
Hệ thống tạp chất của terazosin được quy định có sự khác biệt giữa các dược điển chính:
| Công thức cấu tạo tóm tắt |
Tên tạp theo USP |
Tên tạp theo BP / EP |
Tên tạp theo KP (Hàn Quốc) |
Ghi chú dạng muối/base |
| $\text{C}{14}\text{H}{19}\text{N}_5\text{O}_2$ |
Tạp chất A |
Tạp chất C |
Tạp chất I |
USP/KP: Muối dihydroclorid; BP/EP: Dạng base |
| $\text{C}{19}\text{H}{24}\text{N}_4\text{O}_5$ |
Tạp chất B |
Tạp chất B |
Tạp chất II |
Dẫn chất 4-hydroxy (base) |
| $\text{C}{24}\text{H}{28}\text{N}_8\text{O}_4$ |
Tạp chất C |
Tạp chất E |
Tạp chất III |
USP/KP: Muối dihydroclorid; BP/EP: Dạng base |
| $\text{C}9\text{H}{16}\text{N}_2\text{O}_2$ |
TFCP |
Tạp chất N |
TFCP |
1-[(tetrahydro-2-furanyl)carbonyl]piperazin |
| $\text{C}_5\text{H}_8\text{O}_3$ |
THFA |
- |
THFA |
Acid tetrahydro-2-furancarboxylic |
| - |
- |
Tạp chất J, K, L, M, O |
- |
Các tạp chất chuyên biệt trong BP/EP |
Giới hạn tạp chất liên quan theo quy định của các dược điển được tổng hợp như sau:
| Dược điển |
Giới hạn tạp chất A |
Giới hạn tạp chất B |
Giới hạn tạp chất C |
Đối tượng quy định |
| USP 40 |
$\le 0{,}3%$ (NL); $\le 0{,}4%$ (Viên) |
$\le 0{,}1%$ (NL); $\le 0{,}4%$ (Viên) |
$\le 0{,}4%$ (NL); $\le 0{,}4%$ (Viên) |
Nguyên liệu, viên nén, viên nang |
| BP 2017 |
$\le 0{,}5%$ (NL) |
$\le 0{,}1%$ (NL) |
$\le 0{,}5%$ (NL) |
Chỉ có chuyên luận nguyên liệu |
| EP 9.0 |
$\le 0{,}5%$ (NL) |
$\le 0{,}1%$ (NL) |
$\le 0{,}5%$ (NL) |
Chỉ có chuyên luận nguyên liệu |
| KP 10 |
$\le 0{,}3%$ (NL); $\le 0{,}4%$ (Viên) |
$\le 0{,}1%$ (NL); $\le 0{,}4%$ (Viên) |
$\le 0{,}4%$ (NL); $\le 0{,}4%$ (Viên) |
Nguyên liệu, viên nén |
(Ghi chú: NL = Nguyên liệu TEZ; Viên = Chế phẩm viên nén/viên nang)
Chương 1 cũng tổng kết quy trình chuẩn hóa của VKNTTƯ về thiết lập chất chuẩn đối chiếu Dược điển Việt Nam, bao gồm 9 bước nghiêm ngặt: xây dựng thường quy kỹ thuật; đánh giá nguyên liệu; đóng lọ trong điều kiện kiểm soát độ ẩm 0–10% ở 25 °C; kiểm tra độ đồng nhất lô đóng gói ($n \ge 4\sqrt{N}+1$ hoặc tối thiểu 10 lọ, yêu cầu $\text{RSD} < 1{,}0%$); kiểm tra thành phẩm liên phòng thí nghiệm; xử lý số liệu thống kê; lập hồ sơ, chứng chỉ, dán nhãn; bảo quản ở 2–8 °C; và kiểm tra định kỳ (chu kỳ 3 năm hoặc 1 năm đối với chất dễ hút ẩm/kém bền).
Chương 2: Nguyên liệu, trang thiết bị và phương pháp nghiên cứu
Chương này mô tả chi tiết nguồn gốc xuất xứ của hóa chất, chất chuẩn đối chiếu USPRS (chuẩn TEZ lô G0F290 hàm lượng 91,9%; chuẩn IAT lô F0C245 hàm lượng 90,0%; chuẩn IBT lô F0C218 hàm lượng 100%; chuẩn ICT lô H0M084 hàm lượng 95,0%), các dung môi đạt tiêu chuẩn HPLC (Merck) và tinh khiết phân tích PA (Xilong, Merck).
Hệ thống thiết bị hiện đại được huy động từ các đơn vị phối hợp bao gồm: máy HRMS LTQ ORBITRAP XL, máy NMR Bruker 500 MHz (Trường ĐH Khoa học Tự nhiên và Viện Hóa học), máy đo nhiệt trọng trường Labsys TG 1600, các máy HPLC Agilent 1200 và Shimadzu SPD-M20A (VKNTTƯ, Trường ĐH Dược Hà Nội, Trung tâm Kiểm nghiệm Vĩnh Phúc), hệ thống HPLC với detector đo độ dẫn CDD-10A VP, máy đo phổ hồng ngoại FTIR Nexus 670 và Spectrum Two.
Chương 2 trình bày cụ thể các điều kiện sắc ký dùng trong nghiên cứu:
- Phương pháp HPLC phân tích TEZ, IAT, IBT: Cột pha đảo C8 ($4{,}6 \times 250\text{ mm}$, $5\text{ }\mu\text{m}$), nhiệt độ 30 °C; pha động gồm acetonitril và dung dịch đệm citrat pH 3,2 (tỷ lệ 16:84 thể tích); tốc độ dòng 1,0 ml/phút; detector UV đặt ở 254 nm (cho TEZ, tạp liên quan trong IAT/IBT) và 245 nm (cho định lượng IAT, IBT).
- Phương pháp HPLC phân tích tạp TFCP (BP 2017): Cột C18 ($4{,}0 \times 250\text{ mm}$, $5\text{ }\mu\text{m}$), detector UV 210 nm; pha động gồm dung dịch natri laurylsulfat pH 2,5 và MeCN (60:40).
- Phương pháp HPLC phân tích ICT: Cột C8 ($4{,}6 \times 250\text{ mm}$, $5\text{ }\mu\text{m}$), nhiệt độ cột 40 °C, detector UV 254 nm, chương trình rửa giải gradient dung môi.
- Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC): Sử dụng bản mỏng silica gel 60 $\text{F}_{254}$, phát hiện vết dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 312 nm, kết hợp thuốc thử hiện màu Ninhydrin để phát hiện tạp piperazin tồn dư.
Chương 3: Kết quả nghiên cứu và bàn luận
1. Tổng hợp và tinh chế terazosin hydroclorid
Khi tiến hành tổng hợp terazosin hydroclorid theo quy trình đã công bố trong nước, sản phẩm thô thu được chưa đạt các tiêu chuẩn chất lượng khắt khe của Dược điển Mỹ USP 40 để làm chất chuẩn:
| Chỉ tiêu chất lượng |
Tiêu chuẩn USP 40 |
Kết quả kiểm nghiệm mẫu TEZ thô |
Đánh giá |
| Định tính |
Phải đúng |
Đúng |
Đạt |
| Định lượng (tính theo chế phẩm khan) |
98,0% – 102,0% |
92,46% |
Không đạt |
| Tạp chất A |
$\le 0{,}3%$ |
0,45% |
Không đạt |
| Tạp chất B |
$\le 0{,}1%$ |
Không phát hiện |
Đạt |
| Tạp chất C |
$\le 0{,}4%$ |
1,90% |
Không đạt |
| Tạp rửa giải trước TEZ |
$\le 0{,}3%$ |
0,04% |
Đạt |
| Tạp chất khác |
$\le 0{,}1%$ |
0,03% |
Đạt |
| Tổng tạp chất liên quan |
$\le 0{,}6%$ |
2,45% |
Không đạt |
Để giải quyết vấn đề tạp chất A và C vượt mức cho phép, tác giả đã xây dựng quy trình tinh chế bằng sắc ký cột silica gel 60 (63–200 $\mu\text{m}$) với hệ dung môi rửa giải phân cực tăng dần: $\text{DCM} - \text{Aceton} - \text{MeOH}$ ở các tỷ lệ lần lượt là (8:8:1), (8:12:1), và (8:12:2).
Quy trình tinh chế được lặp lại 3 lần trên lượng mẫu 2,0 g/lần, đạt hiệu suất tinh chế trung bình là 92,2%. Đã tinh chế thu được 8,5 g nguyên liệu terazosin hydroclorid tinh khiết phục vụ thiết lập chuẩn.
Kết quả kiểm tra hóa lý và phổ học của sản phẩm TEZ sau tinh chế:
- Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng, nhiệt độ nóng chảy xác định là 273,1 °C.
- Hàm ẩm (đo bằng TGA): Đạt 0,45%.
- Độ tinh khiết sắc ký trên TLC (3 hệ dung môi 1T, 2T, 3T): Cho 1 vết duy nhất, không phát hiện vết tạp ($R_f$ lần lượt là 0,44; 0,66; 0,33).
- Định tính ion $\text{Cl}^-$: Cho tủa trắng $\text{AgCl}$ với dung dịch $\text{AgNO}_3$ 0,1 N, tan trong $\text{NH}_3$ dư, xác nhận dạng muối hydroclorid.
- Phổ FTIR: Xuất hiện các dải hấp thụ đặc trưng tại 3420 $\text{cm}^{-1}$ ($-\text{NH}_2$), 3080 $\text{cm}^{-1}$ ($\text{C-H}$ thơm), 2961 $\text{cm}^{-1}$ ($\text{CH}_2$ no), 1630 $\text{cm}^{-1}$ ($\text{C=O}$), 1591 $\text{cm}^{-1}$ ($\text{C=C}$ thơm), 1244 $\text{cm}^{-1}$ ($\text{CH}_3\text{O-}$), 991 $\text{cm}^{-1}$ ($\text{C-H}$ thơm). Phổ FTIR chồng khít với phổ của chất chuẩn USPRS với hệ số tương đồng đạt 99,44%.
- Phổ HR-MS: Pic ion phân tử $[\text{M}+\text{H}]^+$ tại $m/z = 388{,}1993$, phù hợp với công thức phân tử $\text{C}{19}\text{H}{25}\text{N}_5\text{O}_4$.
2. Nghiên cứu tổng hợp và tối ưu hóa điều kiện điều chế tạp chất A (IAT)
Tạp chất A dạng muối dihydroclorid (IAT) được tổng hợp qua 2 giai đoạn: phản ứng thế giữa ACDQ và piperazin trong dung môi IAM tạo IAT base, sau đó chuyển hóa thành muối dihydroclorid bằng dung dịch $\text{HCl}/\text{MeOH}$.
Tác giả đã khảo sát một cách hệ thống các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng:
- Lựa chọn dung môi phản ứng: Khảo sát giữa $n$-butanol, DMF và alcol isoamylic (IAM). Kết quả cho thấy trong DMF và $n$-butanol, phản ứng diễn ra rất chậm, sản phẩm tạo thành ít, tan trong dung môi và khó phân lập. Trong khi đó, dung môi IAM giúp sản phẩm kết tủa ngay trong quá trình phản ứng, thuận lợi cho việc tách lập và cho hiệu suất cao.
- Nhiệt độ phản ứng:
- Giai đoạn 1: Khảo sát dưới 115 °C, $120 \pm 5\text{ }^\circ\text{C}$, và trên 125 °C. Ở nhiệt độ dưới 115 °C và trên 125 °C, phản ứng hầu như không xảy ra hoặc tạo sản phẩm phân hủy. Nhiệt độ thích hợp nhất được lựa chọn là $120 \pm 5\text{ }^\circ\text{C}$.
- Giai đoạn 2: Khảo sát các mức nhiệt độ hạ xuống sau giai đoạn 1:
| Nhiệt độ khảo sát giai đoạn 2 ($^\circ\text{C}$) |
$30 \pm 5$ |
$50 \pm 5$ |
$70 \pm 5$ |
$90 \pm 5$ |
| Hiệu suất phản ứng (%) |
33,2 |
32,7 |
34,6 |
25,8 |
| Đánh giá piperazin tồn dư (TLC) |
Có vết tồn dư |
Có vết tồn dư |
Không còn vết piperazin |
Hiệu suất thấp |
Nhiệt độ giai đoạn 2 được chọn là $70 \pm 5\text{ }^\circ\text{C}$.
- Tỷ lệ mol các chất phản ứng (ACDQ : Piperazin):
| Tỷ lệ mol ACDQ : Piperazin |
1:1 |
1:2 |
1:3 |
1:4 |
1:5 |
1:6 |
| Hiệu suất tổng hợp (%) |
33,6 |
38,1 |
44,2 |
57,6 |
78,7 |
79,2 |
| Đặc điểm vết TLC |
Nhiều tạp |
Giảm tạp |
Giảm tạp |
Ít tạp |
Sạch tạp, không dư piperazin |
Xuất hiện vết piperazin dư |
Tỷ lệ mol ACDQ : Piperazin được lựa chọn tối ưu là 1:5.
- Thời gian phản ứng: Khảo sát giai đoạn 1 từ 1 đến 6 giờ; hiệu suất tăng dần từ 1 giờ đến 5 giờ và đạt trạng thái bão hòa ở mốc 5–6 giờ. Thời gian tối ưu cho giai đoạn 1 được xác định là 5 giờ.
Kết quả và những đóng góp mới
Đóng góp mới về mặt khoa học và phương pháp
- Quy trình tổng hợp và tinh chế hoàn chỉnh: Luận án đã nghiên cứu và tối ưu hóa thành công các thông số công nghệ cho phản ứng tổng hợp tạp chất A (IAT) dạng muối dihydroclorid với dung môi phản ứng IAM, tỷ lệ mol ACDQ : piperazin là 1:5, phản ứng hai giai đoạn ở nhiệt độ $120\text{ }^\circ\text{C}$ (5 giờ) và $70\text{ }^\circ\text{C}$, nâng cao hiệu suất tổng hợp lên 78,7% và loại bỏ triệt để piperazin tồn dư. Đồng thời, đề tài đã xây dựng phương pháp tổng hợp tạp chất B (IBT) qua phản ứng diazo hóa/thủy phân và tạp chất C (ICT) từ tạp A base và ACDQ.
- Quy trình tinh chế nâng cao chất lượng hoạt chất: Đã phát triển thành công quy trình tinh chế terazosin hydroclorid thô bằng sắc ký cột silica gel pha thuận với hệ dung môi $\text{DCM} - \text{Aceton} - \text{MeOH}$, đạt hiệu suất tinh chế 92,2%, loại bỏ thành công các tạp chất khó tách (tạp A từ 0,45% xuống đạt giới hạn; tạp C từ 1,90% xuống đạt giới hạn; tổng tạp giảm từ 2,45% xuống mức đạt chuẩn USP 40).
- Thiết lập đồng bộ hệ thống chất chuẩn và tạp chuẩn: Đã xây dựng tiêu chuẩn cơ sở, thẩm định toàn diện các phương pháp phân tích và thiết lập thành công 01 chất chuẩn hoạt chất (TEZ) cùng 03 tạp chuẩn liên quan (IAT, IBT, ICT) theo đúng quy trình kiểm tra liên phòng thí nghiệm của Dược điển Việt Nam và VKNTTƯ, có tính toán độ không đảm bảo đo mở rộng.
Ý nghĩa thực tiễn và kiến nghị
- Bổ sung vào quỹ chất chuẩn quốc gia 04 chất chuẩn/tạp chuẩn thiết yếu phục vụ công tác kiểm nghiệm terazosin và hoạt chất cùng nhóm doxazosin (do tạp A và tạp C cũng là tạp chất của doxazosin).
- Giúp các cơ sở kiểm nghiệm và viện nghiên cứu trong nước chủ động nguồn chất chuẩn đối chiếu, giảm thiểu chi phí ngoại tệ nhập khẩu và rút ngắn thời gian phân tích, phục vụ đắc lực cho công tác tiền kiểm và hậu kiểm chất lượng thuốc trên thị trường.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
- Hạn chế của nghiên cứu:
- Quy trình tổng hợp các tạp chuẩn IAT, IBT, ICT hiện mới được khảo sát và thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm (lab-scale), chưa được nâng cấp thử nghiệm ở quy mô pilot.
- Nghiên cứu tập trung chuyên sâu vào 3 tạp chất chính là A, B, C theo quy chuẩn của Dược điển Mỹ (USP) và Dược điển Hàn Quốc (KP); các tạp chất phụ khác như tạp J, K, L, M, N, O được quy định trong Dược điển Anh (BP) và Dược điển Châu Âu (EP) chưa được tổng hợp và thiết lập toàn bộ thành tạp chuẩn đối chiếu.
- Hướng nghiên cứu phát triển tiếp theo:
- Tiếp tục thực hiện chương trình theo dõi độ ổn định định kỳ của lô chất chuẩn TEZ và các tạp chuẩn IAT, IBT, ICT đã đóng gói ở các điều kiện bảo quản 2–8 °C sau 1 năm, 2 năm và 3 năm theo đúng hướng dẫn của VKNTTƯ.
- Mở rộng nghiên cứu quy trình tổng hợp và tinh chế cho các tạp chất còn lại trong chuyên luận BP/EP (như các tạp chất TFCP, J, K, L, M, N, O) nhằm hoàn thiện bộ tạp chuẩn đầy đủ cho mọi dược điển quốc tế.
Giá trị tham khảo
Luận án mang lại nguồn tư liệu khoa học có giá trị thực tiễn cao cho nhiều nhóm đối tượng:
- Các nhà nghiên cứu và nghiên cứu sinh chuyên ngành Hóa dược: Cung cấp thông tin chi tiết về các điều kiện phản ứng tổng hợp hệ vòng quinazolin mang nhóm thế piperazin, phương pháp diazo hóa chọn lọc nhóm amin thơm trên khung dị vòng, và kỹ thuật sắc ký cột phân lập các hợp chất có độ phân cực cao.
- Kiểm nghiệm viên và chuyên viên phân tích tại các Viện/Trung tâm Kiểm nghiệm (VKNTTƯ, VKNTPHCM, các TTKN tỉnh/thành): Tài liệu tham khảo hữu ích về điều kiện sắc ký HPLC (pha động, cột C8/C18, chương trình rửa giải gradient/đẳng dòng), quy trình thẩm định phương pháp phân tích tạp chất liên quan và phương pháp xác định hàm lượng ion clorid bằng HPLC detector đo độ dẫn điện.
- Các cán bộ quản lý chất lượng (QA/QC) và R&D tại các nhà máy dược phẩm: Hướng dẫn cụ thể về quy trình thiết lập chất chuẩn làm việc (working standard), quy trình đóng lọ trong điều kiện kiểm soát ẩm (0–10%), phương pháp kiểm tra độ đồng nhất lô và phương pháp xử lý thống kê đánh giá liên phòng thí nghiệm kèm tính toán độ không đảm bảo đo ($U$).
Câu hỏi thường gặp
1. Tại sao mẫu nguyên liệu terazosin hydroclorid thô ban đầu không đủ tiêu chuẩn để thiết lập chất chuẩn đối chiếu theo USP 40?
Mẫu terazosin hydroclorid thô sau khi tổng hợp chưa qua tinh chế không đạt các chỉ tiêu chất lượng của Dược điển Mỹ (USP 40): hàm lượng hoạt chất chỉ đạt 92,46% tính theo chế phẩm khan (yêu cầu từ 98,0% đến 102,0%); giới hạn tạp chất A là 0,45% (vượt mức quy định $\le 0{,}3%$); giới hạn tạp chất C là 1,90% (vượt mức quy định $\le 0{,}4%$); và tổng lượng tạp chất liên quan là 2,45% (vượt mức quy định $\le 0{,}6%$). Do đó, bắt buộc phải áp dụng quy trình tinh chế bằng sắc ký cột silica gel để loại bỏ tạp A và tạp C trước khi thiết lập chuẩn.
2. Các điều kiện công nghệ tối ưu được xác lập để tổng hợp tạp chất A (IAT) là gì?
Qua các bước khảo sát thực nghiệm, các điều kiện tối ưu được xác lập gồm:
- Dung môi phản ứng: Alcol isoamylic (IAM).
- Tỷ lệ mol chất phản ứng: ACDQ : Piperazin = 1:5.
- Nhiệt độ và thời gian: Giai đoạn 1 duy trì ở $120 \pm 5\text{ }^\circ\text{C}$ trong 5 giờ; giai đoạn 2 hạ nhiệt độ xuống $70 \pm 5\text{ }^\circ\text{C}$ để phản ứng tiếp tục hoàn toàn và không để lại lượng dư piperazin.
- Chuyển muối: Hòa tan cắn base trong methanol, hồi lưu với $\text{HCl}$ đặc ở 60 °C trong 3 giờ để tạo muối dihydroclorid. Hiệu suất tổng hợp đạt 78,7%.
3. Tạp chuẩn A và tạp chuẩn C của terazosin có thể được ứng dụng trong kiểm nghiệm hoạt chất nào khác?
Tạp chất A (IAT) và tạp chất C (ICT) của terazosin có cấu trúc tương đồng và cũng chính là các sản phẩm phân hủy / tạp chất liên quan của doxazosin (DOX - một hoạt chất ức chế chọn lọc thụ thể $\alpha_1$-adrenergic cùng nhóm). Vì vậy, các tạp chuẩn IAT và ICT được thiết lập trong đề tài này còn có thể sử dụng trực tiếp để phục vụ công tác kiểm nghiệm độ tinh khiết và giới hạn tạp chất liên quan trong nguyên liệu và thành phẩm chứa doxazosin theo chuyên luận dược điển.
4. Quy trình đóng gói và kiểm tra độ đồng nhất của lô chất chuẩn đối chiếu được thực hiện như thế nào?
Nguyên liệu sau khi đạt tiêu chuẩn được đóng lọ trong buồng đóng chuyên dụng ở nhiệt độ khoảng 25 °C, độ ẩm tương đối được kiểm soát nghiêm ngặt từ 0% đến 10%. Mẫu được chia vào các lọ thủy tinh màu nâu thể tích 2 ml và đậy kín nút nhựa. Độ đồng nhất của quá trình đóng gói được đánh giá bằng cách lấy ngẫu nhiên số lượng lọ $n \ge 4\sqrt{N}+1$ (với $N$ là tổng số lọ) hoặc tối thiểu 10 lọ để định lượng hoạt chất từng lọ riêng biệt. Lô đóng gói được xác nhận là đồng nhất khi độ lệch chuẩn tương đối giữa các lọ đạt $\text{RSD} < 1{,}0%$.
Kết luận
Luận án đã giải quyết hoàn chỉnh chuỗi nghiên cứu từ tổng hợp hóa dược, tinh chế, xác định cấu trúc đến kiểm nghiệm và thiết lập chất chuẩn đối chiếu cho terazosin hydroclorid và ba tạp chất liên quan chính (A, B, C). Bằng việc xây dựng thành công quy trình tinh chế bằng sắc ký cột pha thuận và tối ưu hóa phản ứng tổng hợp tạp chất IAT, công trình đã thu nhận được các nguyên liệu có độ tinh khiết cao đáp ứng các yêu cầu khắt khe của Dược điển Mỹ USP 40. Hệ thống 01 chất chuẩn TEZ và 03 tạp chuẩn IAT, IBT, ICT được thiết lập theo quy chuẩn liên phòng thí nghiệm của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, góp phần quan trọng trong việc làm giàu quỹ chuẩn quốc gia, nâng cao tính tự chủ và năng lực kiểm tra chất lượng thuốc tại Việt Nam.
