ĐẶT VẤN ĐỀ Cây kế sữa (Silybum marianum (L.) Gaertn), thuộc họ Cúc (Asteraceae) với thành phần hóa học chính là các flavonoid đã được chứng minh có một số hoạt tính sinh học quan trọng như chống oxi hóa mạnh, ức chế sự hủy hoại tế bào gan do các tác nhân như rượu, thuốc,. đồng thời kích thích tái tạo tế bào gan; cải thiện đáng kể chức năng gan mật và ít tác dụng không mong muốn [1], [2], [3]. Trong số các hoạt chất thuộc nhóm flavonoid trong cây Kế sữa thì silybin là một chất chiếm tỉ lệ lớn (từ 50-70%) và là hoạt chất chính tạo nên tác dụng sinh học của nhóm này [1], [4]. Tuy nhiên, silybin có độ tan và tính thấm kém nên sinh khả dụng theo đường uống thấp [4], [5], [6].
Do đó, một số nghiên cứu đã được thực hiện nhằm cải thiện độ tan, tính thấm và sinh khả dụng của silybin như: tạo phức với β-cyclodextrin, tạo dẫn xuất glycosid, bào chế liposome và phytosome [5], [2], [7], [8]. Trong số các biện pháp trên, bào chế hoạt chất dưới dạng phytosome được xem là hướng nghiên cứu mới, có hiệu quả trong việc nâng cao sinh khả dụng đường uống của silybin [8], [9]. Trong phytosome các hoạt chất (cao chiết hoặc chất tinh khiết) thường là các flavonoid, polyphenol tự nhiên sẽ liên kết với phospholipid thông thường là phosphatidyl cholin (PC) tạo thành tiểu phân có cấu trúc tương tự màng tế bào, qua đó vừa cải thiện độ tan của hoạt chất trong dịch ruột, vừa tăng vận chuyển hoạt chất qua lớp màng lipid kép. Mặt khác, phytosome được hấp thu theo cơ chế chủ động nhờ tế bào M ở ruột non vào tuần hoàn chung qua hệ lympho, qua đó giảm chuyển hóa bước 1 qua gan và tăng sinh khả dụng của silybin [10].
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu cũng như các chế phẩm phytosome của nhiều hoạt chất như phytosome quercetin, phytosome curcumin, phytosome trà xanh, phytosome ginkgo biloba. Tuy nhiên, ở Việt 2 Nam đến nay chưa có nghiên cứu về bào chế phytosome silybin. Bên cạnh đó, nguồn nguyên liệu phytosome nói chung và phytosome silybin nói riêng chủ yếu là nhập khẩu từ nước ngoài với giá thành cao cũng sẽ ảnh hưởng phần nào đến việc ứng dụng rộng rãi dạng phytosome vào các sản phẩm chăm sóc và bảo vệ sức khỏe. Do đó, việc tiến hành nghiên cứu bào chế phytosome silybin là cần thiết.
Vì vậy, đề tài: “Nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin” được thực hiện với hai mục tiêu sau: 1. Bào chế được phytosome silybin qui mô phòng thí nghiệm. Đánh giá được sinh khả dụng, độc tính cấp, bán trường diễn và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin trên thực nghiệm. TỔNG QUAN VỀ SILYBIN 1.
Nguồn gốc Silybin thường được chiết xuất và tinh chế từ quả hoặc hạt của cây Kế sữa Silybum marianum (L. Silybin tự nhiên là hỗn hợp của hai đồng phân là silybin A và silybin B với tỷ lệ xấp xỉ bằng nhau [2], [4], [16]. Công thức hóa học Hình 1. Công thức cấu tạo silybin A và silybin B *Nguồn: theo Biedermann D.
và cs (2014) [16] - Tên khoa học (danh pháp IUPAC) [4], [16]: Silybin-A: (2R,3R)-2-[(2R,3R)-2,3-dihydro-3-(4-hydroxy-3- methoxyphenyl)-2-(hydroxymethyl)-1,4-benzodioxin-6-yl]-2,3-dihydro-3,5,7- trihydroxy-4H-1-benzopyran-4-one. Silybin-B: (2R,3R)-2-[(2S,3S)-2,3-dihydro-3-(4-hydroxy-3- methoxyphenyl)-2-(hydroxymethyl)-1,4-benzodioxin-6-yl]-2,3-dihydro-3,5,7- trihydroxy-4H-1-benzopyran-4-one. - Công thức phân tử: C25H22O10 - Tên khác: silibinin - Khối lượng phân tử: 482,44. 4 - Về mặt hóa học thì silybin thuộc phân nhóm flavonolignan, phần đầu có cấu trúc giống như một taxifolin (một nhóm flavononol trong flavonoid).
Phần thứ hai là một đơn vị phenylpropanoid (conyferil alcohol). Hai phần này được liên kết với nhau thành một cấu trúc bằng một vòng oxeran [4], [16]. Tính chất lý hóa * Tính chất vật lý Bột đồng nhất, màu vàng nhạt, vị hơi đắng, có mùi thơm nhẹ. Tỷ trọng: 1,6 ± 0,1 g/cm3; nhiệt độ nóng chảy là 162-1630C, dung dịch trong aceton có [20]D = +11,38.
Dung dịch silybin trong methanol ở dải sóng từ 200 nm đến 800 nm có các cực đại hấp thụ tại 217, 230, 288 nm [16]. Trong bảng phân loại sinh dược học bào chế (BCS), silybin thuộc nhóm IV vì hoạt chất có hệ số thấm Papp < 2 x 10-6 cm/s và ít tan trong nước (độ tan < 0,04 mg/ml) [6], [17]. Silybin rất khó tan trong nước, tan kém trong EtOH; không tan trong chloroform, ether dầu hỏa; tan tốt một số dung môi aprotic phân cực (Aceton, DMF, THF) [16], [4]. Một số nghiên cứu cho thấy, trong các dung dịch nước trung tính, silybin hoạt động như một acid yếu với pKa là 7,7 - 7,95 đối với nhóm 7-OH và 6,63 đối với nhóm 5-OH và 11,0 đối với nhóm 20-OH.
Ngoài ra các nghiên cứu cũng chỉ ra độ hòa tan của silybin trong nước tăng nhanh theo độ pH và tăng tuyến tính với nhiệt độ [16]. * Tính chất hóa học Silybin là một flavonoid nên nó có một số tính chất hóa học cũng như phản ứng đặc trưng của nhóm flavonoid như: Phản ứng với hơi amoniac và dung dịch kiềm loãng (dung dịch NaOH, KOH, Na2CO3); Phản ứng cyanidin (phản ứng Shinoda); Phản ứng với dung dịch FeCl3 Trong môi trường kiềm mạnh hoặc gia nhiệt kéo dài trên 100°C gây ra sự phá vỡ bộ khung của silybin [16], [4]. 5 Năm nhóm hydroxy (-OH) của silybin có thể được chia thành ba loại: ba nhóm phenol, một nhóm ancol bậc hai và một nhóm ancol bậc một. Trong số các nhóm hydroxy phenolic, nhóm hydroxy ở vị trí C-5 liên kết hydro mạnh với nhóm oxo liền kề.
Nhóm oxo ở dạng liên hợp với vòng thơm và hoạt động như một chất cho cặp electron tự do cho liên kết hydro với nhóm 5- OH. Hai nhóm hydroxy phenol khác có tính chất tương tự, với nhóm C-7 OH phản ứng mạnh hơn nhóm 20-OH do cản trở steric thấp hơn và sự hiện diện của liên kết hydro. Nhóm ancol ở C-23 OH có thể được este hóa dễ dàng và bị oxy hóa thành acid cacboxylic. Nhóm ancol bậc hai ở C-3 OH có thể dễ dàng bị oxy hóa (ngay cả với oxy trong không khí) thành keton tạo ra 2,3- dehydrosilybin [16], [4].
Dược động học - Hấp thu: Sau khi uống, silybin được hấp thu nhanh chóng trong đường tiêu hóa (với Tmax khoảng 2-4 giờ). Tuy nhiên, silybin chỉ hấp thu 20- 50% ở đường ruột do thấm kém qua tế bào biểu mô ruột [4], [18]. Theo nghiên cứu của Wu J. và cs, sinh khả dụng đường uống trên chuột cống chỉ đạt 0,73% [19].
- Phân bố: Silybin đến các mô nhanh, nồng độ dạng tự do và nồng độ dạng liên hợp đạt tối đa chỉ sau 1 giờ sau khi dùng liều 50 mg/kg trên chuột. Nồng độ silybin ở mật gấp 100 lần so với trong máu [4]. Mô hình đơn lớp tế bào Caco-2 đã chỉ ra MK571 (một chất ức chế đặc hiệu protein liên quan đến đa kháng thuốc (MRP2)) làm giảm đáng kể tỷ lệ silybin phân bố vào hệ tuần hoàn (Hình 1. - Chuyển hóa: Silybin trải qua cả giai đoạn I và giai đoạn II của quá trình chuyển hóa trong tế bào gan [18].
Dưới tác dụng của các enzym chuyển hóa trong cơ thể, silybin bị chuyển hóa thành silybin monoglucuronic, silybin diglucuronic, silybin monosulfat và silybin diglucuronic sulfat. Silybin ở dạng tự do, sulfat hóa và glucuronic hóa trong huyết tương khoảng 17,28 và 55% 6 [3], [4]. Các nghiên cứu được thực hiện cho thấy ở giai đoạn I silybin tương tác với cytochromes (CYP) và chuyển hóa thành O-demethylatedsilybin (chính) và cả hai chất chuyển hóa mono và dihydroxy-silybin (phụ) [21], [22], [23]. Silybin monoglucuronid và diglucuronid, cũng như silybin monosulfat và silybin diglucuronid sulfat, tất cả đều được hình thành trong giai đoạn II của quá trình chuyển hóa của silybin [18].
Các glucuronid silybin được hình thành trong giai đoạn II sau đó được vận chuyển theo dịch mật đến ruột, nơi các enzym vi khuẩn phân cắt các chất đường và giải phóng silybin aglycon, có thể được hấp thu trở lại, do đó thúc đẩy tuần hoàn ruột [24]. Hình minh họa quá trình phân bố và thải trừ silybin *Nguồn: theo Xie Y. và cs (2019) [25] - Thải trừ: Tỷ lệ phần trăm của silybin thải trừ trong nước tiểu ở dạng tự do và liên hợp là rất thấp, dao động từ 1 đến 2% so với liều uống ban đầu trong 24 giờ và chất MRP2 (hình 1.2) là chất vận chuyển chính cho việc bài tiết silybin qua mật [26], [25]. Silybin chủ yếu được thải trừ qua đường mật (khoảng 80%) dưới dạng liên hợp glucuronic và sulfat thông qua cơ chế vận chuyển chủ động [3], [4], [27].
Người ta đã chứng minh được rằng 3-8% silybin dùng đường uống được bài tiết nguyên vẹn trong nước tiểu. Thời gian 7 bán thải của silybin ngắn (từ 1-3 giờ đối với dạng tự do và 3-8 giờ đối với dạng liên hợp) [28], [18], [4]. * Từ những đặc điểm về dược động học trên cho thấy những nguyên nhân chính dẫn đến SKD kém của Silybin là: độ tan trong nước thấp, tính thấm kém qua tế bào biểu mô ruột, bị chuyển hóa pha II mạnh và thải trừ nhanh. Vì vậy, việc tìm ra một dạng mới để tăng SKD của silybin là cần thiết.
Tác dụng chống oxy hóa Tác dụng chống oxy hóa của silybin đã được mô tả trong các nghiên cứu trên tế bào. Silybin ức chế sự hình thành gốc tự do gây cản trở sự peroxid lipid của màng (từ đó làm thay đổi tính thấm của màng) và làm tăng hàm lượng chất dọn dẹp nội bào [29]. Trên thực nghiệm, silybin ức chế sự hình thành các gốc tự do superoxid anion và nitric oxid (NO), làm tăng hàm lượng ATP thông qua sự phosphoryl hóa ADP, giảm hàm lượng malondialdeyd (MDA). Đặc biệt, silybin cũng gián tiếp chống oxy hóa thông qua loại bỏ hoàn toàn các nguyên nhân gây giảm glutathion do các enzym: glutathion peroxidase và glutathion reductase.
Glutathion là một chất chống oxy hóa, có khả năng ngăn ngừa các tác động của gốc tự do, peroxid, kim loại nặng gây hại đến các thành phần quan trọng của tế bào [30], [31]. Tác dụng chống viêm Silybin có khả năng tương tác vào yếu tố NF-κB (Nuclear Factor-kappa B). NF-κB là một protein liên kết DNA cảm ứng hoạt động như một yếu tố phiên mã cho các gen liên quan đến viêm nhiễm. Các hoạt tính chống viêm của silybin cũng liên quan đến sự tác động của silybin với nhiều cytokin, các đường dẫn tín hiệu cảm ứng.
Từ đó, làm giảm sự kích thích nitric-oxid synthase; ức chế cyclooxygenase (COX) và sự hình thành leukotrien trong tiểu cầu, bạch cầu và các tế bào nội bào [3], [1], [32]. Tác dụng chống xơ gan Trên mô hình xơ gan ở người trên in vitro, silybin thể hiện tác dụng chống xơ cả trực tiếp và gián tiếp. Silybin làm giảm yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu - gây ra sự tổng hợp DNA và tăng sinh tế bào ở liều 25 μmol/L [33].