MỞ ĐẦU Paclitaxel (PTX), hoạt chất chiết từ vỏ cây thông đỏ (Taxus brevifolia) với những nghiên cứu ban đầu những năm 60 cho thấy khả năng gây độc tế bào, tạo sự quan tâm từ các nhà khoa học trong lĩnh vực dược phẩm. Wall và Mansukh C. Wani phân lập từ thông đỏ (Taxus brevifolia) chất PTX. Viện Ung thư Quốc gia Mỹ phát hiện hoạt chất này có tính năng cản trở việc phân hủy bình thường của vi ống, ổn định vi ống, từ đó ức chế phân bào [53].
Công ty Bristol Myers Squibb (BMS) đã dùng hoạt chất trên bào chế ra thuốc TAXOL® [53]. Năm 1992, FDA chính thức phê duyệt dùng Taxol điều trị ung thư buồng trứng, vú, phổi (dạng tế bào không nhỏ) và ung thư cổ tử cung. PTX trong các nghiên cứu khác nhau cho thấy là tác nhân chống ung thư có hiệu quả trong điều trị ung thư phổi, vú, buồng trứng, giảm bạch cầu và ung thư gan. PTX có vai trò trong việc điều trị các loại ung thư khác nhau bằng cách nhắm vào ống tubulin hoặc gây ức chế tế bào.
Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới, với nhu cầu ngày càng tăng cũng như việc sử dụng phổ biến trong phác đồ điều trị của loại thuốc chống ung thư này [53], các chế phẩm chứa PTX vẫn được tiếp tục nghiên cứu cải tiến dạng bào chế. Riêng ở Việt Nam, bước đầu có những nghiên cứu thành công về bào chế dạng chế phẩm tiêm chứa PTX tuy nhiên chưa có công bố nghiên cứu dạng bột đông khô. Ưu điểm của dạng bột đông khô có thể chứa hàm lượng nhỏ trong mỗi đơn vị bào chế nên có thể dùng 1 lần/ 1 đơn vị theo chỉ định mà không cần phải chia nhỏ liều như dạng dung dịch đậm đặc pha tiêm truyền thông thường. Bên cạnh đó, trong quá trình nghiên cứu bào chế, nghiên cứu tiền lâm sàng trên động vật thí nghiệm là hết sức cần thiết.
Việc nghiên cứu đầy đủ cơ chế dược động học của thuốc trên động vật thí nghiệm sẽ tiên đoán một số định hướng về hiệu quả tác động đích và độc tính của thuốc. Cả Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (FDA) và Cục Sức khỏe Canada (Health Canada) đều yêu cầu các thử nghiệm động vật được tiến hành trước khi con người được thử nghiệm một thuốc mới [43]. Hơn nữa, thông tin thử nghiệm tiền lâm sàng sẽ tránh các thử nghiệm không cần thiết trên lâm sàng, do đó cho phép đưa ra nhanh nhất có thể các sản phẩm thuốc chống ung thư vào thử nghiệm lâm sàng mà không ảnh hưởng đến tính an toàn của thuốc [14]. Các mô hình nghiên cứu trên 2 động vật thí nghiệm bước đầu đang được tiến hành tại Việt Nam và thường đi theo xu hướng đánh giá trên động vật thí nghiệm bị gây bệnh [1], [3].
Với những lý do trên, đề tài: “Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và nghiên cứu khả năng phân bố sinh học của paclitaxel từ chế phẩm thuốc tiêm sản xuất tại Việt Nam” được thực hiện nhằm nghiên cứu bào chế dạng bột đông khô chứa PTX, xây dựng quy trình đánh giá chất lượng và nghiên cứu khả năng phân bố sinh học, góp phần phát triển mô hình nghiên cứu tiền lâm sàng của dạng bào chế chứa PTX sản xuất tại Việt Nam. Luận án được tiến hành với các mục tiêu nghiên cứu cụ thể sau: - Xây dựng công thức và quy trình điều chế thuốc tiêm truyền chứa PTX với hai dạng bào chế dung dịch đậm đặc và bột đông khô pha tiêm truyền - Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và nghiên cứu độ ổn định của chế phẩm - Nghiên cứu thông số dược động học và đánh giá phân bố sinh học trong một số mô của chế phẩm chứa PTX so sánh với chế phẩm thương mại. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TỔNG QUAN VỀ PACLITAXEL 1.
Tên, công thức phân tử, công thức cấu tạo và tính chất Tên hóa học: (5β,20-Epoxy-1,2α,4,7 β,13 α -hexahydroxytax-11-en-9-one4,10- diacetate2-benzoate13-ester with (2R,3S)-N-benzoyl-3-phenyllisoserine) [8], [60] Công thức phân tử: C47H51NO14 Phân tử lượng: 853,91 [60] Công thức cấu tạo được trình bày ở Hình 1. Công thức cấu tạo paclitaxel “Nguồn: Dược điển Mỹ, 2014” [60] PTX có khung taxan là khung cấu trúc của các dược chất chống ung thư nên được xếp vào nhóm taxan, cùng cơ chế tác dụng trong phân loại thuốc chống ung thư. [2] Tính chất: PTX không tan trong nước, tan rất kém trong hầu hết các dung môi dùng trong dược phẩm, tan trong methanol. Tan trong ethanol khoảng 46 mM, trong methylen chlorid hoặc acetonitril khoảng 20 mM, trong isopropanol khoảng 14 mM.
Nhiệt độ nóng chảy: 216 - 217 oC. Bảo quản ở điều kiện 2 - 8 oC. Phương pháp định tính, định lượng paclitaxel và tạp liên quan trong thuốc tiêm chứa PTX theo Dược điển hiện hành Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [8] [60]. Định tính: sắc ký đồ mẫu thử phải có thời gian lưu của đỉnh paclitaxel tương ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn.
Định lượng: Hàm lượng PTX (C47H51NO14) không được thấp hơn 90 % và không được vượt quá 110 % hàm lượng trên nhãn. 4 - Dung môi hòa tan mẫu: dung dịch 0,02% acid acetic băng trong methanol. - Pha động: Nước - acetonitril (11 : 9) (tt/tt) được lọc và khử khí. - Mẫu chuẩn: dung dịch chứa paclitaxel RS trong dung môi hòa tan mẫu với nồng độ 0,6 mg/mL.
- Mẫu thử: pha loãng mẫu thử trong dung môi hòa tan mẫu để thu được dung dịch có nồng độ PTX khoảng 0,6 mg/ mL. - Điều kiện sắc ký: Cột sắc ký: cột L43 (PFP) 250 mm x 4 mm, 5µm. Bước sóng phát hiện: 227 nm Thể tích tiêm: 10 µL. Tốc độ dòng: 1,5 mL/phút.
Giới hạn tạp phân hủy: tạp xác định phải đạt yêu cầu như trong Bảng 1. Tạp phân hủy khác không được quá 0,1%; tổng tạp không quá 2,0%. - Dung môi hòa tan mẫu: acetonitril - Pha động: Dung dịch A: Nước - acetonitril (3:2) (tt/tt) Dung dịch B: Acetonitril Chương trình dung môi: Thời gian Dung dịch A (%) Dung dịch B (%) Rửa giải 0 → 26 100 0 Đẳng dòng 26 → 66 100 → 17 0 → 83 Gradient 66 → 67 17 → 100 83 → 0 Gradient 67 → 75 100 0 Đẳng dòng - Mẫu chuẩn: dung dịch chứa Paclitaxel RS và tạp chuẩn (tạp B) trong acetonitril với nồng độ tương ứng 1,2 mg/ mL và 0,006 mg/mL. - Mẫu thử: pha loãng mẫu thử trong dung môi pha loãng để thu dung dịch có nồng độ PTX khoảng 1,2 mg/ mL.
- Điều kiện sắc ký: Cột sắc ký: cột L1 (C18) 250 mm x 4,6 mm x 3µm, nhiệt độ cột 35 oC Bước sóng phát hiện: 227 nm 5 Thể tích tiêm: 10 µL. Tốc độ dòng: 1,2 mL/ phút. Giới hạn tạp chất trong chế phẩm PTX dùng đường tiêm Thời gian lưu tương Giới hạn cho phép Tên tạp chất đối so với paclitaxel (%) Baccatin III 0,19 0,8 Dẫn xuất Ethyl ester 0,21 0,4 10-Deacetylpaclitaxel 0,50 0,8 10-Deacetyl-7-epipaclitaxel 0,95 0,5 7-Epipaclitaxel 1,40 0,6 “Nguồn: Dược điển Mỹ, 2014” [60] 1. Một số chế phẩm thuốc tiêm có chứa PTX trên thị trường - Dung dịch đậm đặc pha tiêm (100mg/16,7ml hoặc 30mg/5ml): Taxol® (Bristol- Myers Squibb), Paclitaxel “Ebewe” (Ebewe Pharma), Paclitaxel Injection (Teva Health Systems), Intaxel® (Fresenius Kabi), Anzatax® (Mayne Pharm), Stragen® (Haupt Pharma Woftratshausen), Paxus (PT Dankos Farma), Canbaxel 30 (Bidiphar), Canbaxel 100 (Bidiphar).
- Bột pha tiêm: Abraxane® (Celgene) 1. ĐỊNH HƯỚNG CẢI TIẾN CÔNG THỨC BÀO CHẾ THUỐC TIÊM CHỨA PACLITAXEL 1. Định hướng cải thiện độ tan PTX trong nghiên cứu công thức bào chế Căn cứ vào độ tan và tính thấm của PTX, xu hướng cải thiện độ tan của PTX trong quá trình bào chế được mô tả ở Hình 1. Paclitaxel có độ tan và tính thấm tương tự dược chất nhóm IV của hệ thống phân loại BCS nên thiết lập công thức bào chế sẽ theo định hướng để cải thiện độ tan và tăng tính thấm của dược chất.
Theo một số nghiên cứu, các phương pháp tiếp cận hiện tại đang được áp dụng trong bào chế thuốc nhóm II, với việc sử dụng tá dược tăng cường hấp thu, có thể được áp dụng để nghiên cứu công thức bào chế dạng thuốc tiêm đối với các dược chất nhóm IV [33] và do vậy có thể áp dụng trong nghiên cứu công thức bào chế PTX. Tổng quát hướng nghiên cứu cải thiện độ tan Paclitaxel 1. Nghiên cứu công thức thuốc tiêm chứa PTX Công thức thuốc tiêm chứa PTX được sử dụng rộng rãi nhất trong lâm sàng là dạng dung dịch đậm đặc pha tiêm truyền (thuốc gốc và thuốc generic), được pha loãng trước khi tiêm tĩnh mạch. Công thức có chứa Cremophor® EL và ethanol khan.
Tuy nhiên, tá dược này có liên quan với các tác dụng phụ như co thắt phế quản, hạ huyết áp và các triệu chứng quá mẫn. Thành phần của tá dược này có thể giải phóng histamin và gây hạ huyết áp và phản ứng quá mẫn sau khi tiêm truyền nhanh hoặc sau tiêm tĩnh mạch. Hướng nghiên cứu công thức bào chế trên thế giới cho đến nay chủ yếu thay đổi thành phần tá dược nhưng vẫn đảm bảo tăng độ tan của PTX. Một số phương pháp cải tiến phổ biến: 1.
Đồng dung môi Tarr và Yalkowsky (1987) đã bào chế hệ đồng dung môi PTX (5 mg/mL) chứa ethanol, tween 80, và pluronic L64 theo tỷ lệ 3: 1: 6 (tt/tt/tt), thay cho công thức của Taxol. Dung dịch này ổn định về mặt hóa học và thể chất trong 3 tháng, nhưng khi pha loãng đến nồng độ 3,45 mM chỉ ổn định trong 3 ngày [42]. Hệ hỗn dịch Tarr và Yalkowsky (1987) đã bào chế PTX dạng dầu/ nước bằng cách dùng triacetin làm trung gian hòa tan. Nghiên cứu cho thấy PTX hòa tan tốt trong triacetin (75 mg/ mL).
Mặc dù vậy thuốc kết tủa khi nhũ tương được pha loãng khoảng chín lần 7 với dextrose 5%. Tarr và đồng sự đã bào chế hỗn dịch dạng tiêm đầu tiên của PTX chứa 10 - 15 mg PTX/ mL trong một công thức bao gồm 50% triacetin, 1,5% lecithin đậu nành, 1,5% pluronic F68, và 2,0% ethyl oleat. Khoảng 10% glycerol được thêm vào để ngăn ngừa tách pha. Hỗn hợp này ổn định trong khoảng thời gian 6 tháng khi được bảo quản ở 4 oC.
Tuy nhiên lượng triacetin cần thiết để bào chế PTX với liều điều trị được phát hiện là độc hại khi tiêm tĩnh mạch cho chuột và không có hoạt tính chống ung thư nào được báo cáo [58]. Lundberg (2005) đã bào chế một hỗn dịch với triolein là pha dầu và dipalmityl-phosphatidylcholin làm chất nhũ hóa chính. Tween 80 và PEG-dipalmitoyl osphatidylethanolamin được sử dụng làm chất ổn định. Đông khô hỗn dịch này với dextrose 5% tạo thành một sản phẩm ổn định, có thể tạo dung dịch hợp thành với nước pha tiêm [39].