Tổng quan luận án

Đề tài luận án tiến sĩ: “Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và nghiên cứu khả năng phân bố sinh học của paclitaxel từ chế phẩm thuốc tiêm sản xuất tại Việt Nam”.

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Paclitaxel (PTX) là hoạt chất nhóm taxan được phân lập từ vỏ cây thông đỏ (Taxus brevifolia), có tác dụng cản trở sự phân hủy bình thường của vi ống, làm ổn định vi ống và ức chế quá trình phân bào. Năm 1992, Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (FDA) đã phê duyệt sử dụng thuốc tiêm chứa PTX (biệt dược Taxol® của Bristol Myers Squibb) trong điều trị ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư phổi tế bào không nhỏ và ung thư cổ tử cung. Do nhu cầu sử dụng PTX ngày càng tăng trong các phác đồ điều trị ung thư, việc nghiên cứu cải tiến dạng bào chế của dược chất này liên tục được thực hiện trên thế giới.

Tại Việt Nam, bước đầu đã có một số nghiên cứu bào chế thuốc tiêm chứa PTX dưới dạng dung dịch đậm đặc, tuy nhiên chưa có công bố nghiên cứu nào về dạng thuốc bột đông khô pha tiêm truyền chứa PTX. Dạng bột đông khô có ưu điểm chứa hàm lượng phân liều nhỏ trong mỗi đơn vị đóng gói, thuận tiện cho việc sử dụng đơn liều theo chỉ định lâm sàng mà không cần chia nhỏ liều từ dung dịch đậm đặc.

Mặt khác, trong quy trình phát triển sản phẩm thuốc chống ung thư, các cơ quan quản lý dược phẩm như US FDA và Health Canada bắt buộc phải thực hiện các thử nghiệm tiền lâm sàng trên động vật trước khi tiến hành thử nghiệm trên người nhằm dự đoán hiệu quả hướng đích, độc tính và các thông số dược động học (ADME). Tại Việt Nam, các mô hình thử nghiệm tiền lâm sàng cho dạng bào chế chứa PTX chủ yếu mới dừng lại ở đánh giá hiệu lực trên động vật thí nghiệm bị gây bệnh hoặc cấy ghép khối u; hoàn toàn chưa có phòng thí nghiệm nào trong nước xây dựng và ứng dụng quy trình hoàn chỉnh để đánh giá thông số dược động học và sự phân bố sinh học của PTX trên các cơ quan mô động vật. Do đó, việc nghiên cứu bào chế dạng bột đông khô kết hợp xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và đánh giá phân bố sinh học tiền lâm sàng cho chế phẩm sản xuất tại Việt Nam là yêu cầu khoa học cấp thiết.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định 3 mục tiêu cụ thể:

  1. Xây dựng công thức và quy trình điều chế thuốc tiêm truyền chứa PTX với hai dạng bào chế: dung dịch đậm đặc và bột đông khô pha tiêm truyền.
  2. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và nghiên cứu độ ổn định của hai chế phẩm bào chế.
  3. Nghiên cứu thông số dược động học và đánh giá phân bố sinh học trong một số mô của chế phẩm chứa PTX so sánh với chế phẩm thương mại đối chứng.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu:
    • Chế phẩm nghiên cứu: Thuốc tiêm PTX dạng dung dịch đậm đặc nồng độ 30 mg/5 mL (6 mg/mL) và dạng bột đông khô pha tiêm truyền hàm lượng 24 mg PTX/lọ.
    • Chế phẩm thương mại đối chứng: Thuốc tiêm dung dịch đậm đặc Stragen® (Haupt Pharma Woftratshausen, hàm lượng 6 mg/5 mL) và dung dịch tiêm Anzatax® (Hospira Australia Pty., hàm lượng 99,5%).
    • Động vật thí nghiệm: Thỏ trắng cái khỏe mạnh, khối lượng 2,0 – 2,5 kg (cung cấp bởi Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP. Hồ Chí Minh); chuột nhắt trắng khỏe mạnh cả giống đực và cái, khối lượng 20 – 22 g và 30 – 40 g (cung cấp bởi Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh).
  • Phạm vi không gian thực hiện: Đề tài được triển khai tại các phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Công nghiệp Dược và Bộ môn Dược lý (Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh); Khoa Dược lý, Khoa Vi sinh và Khoa Vật lý đo lường (Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP. Hồ Chí Minh).
  • Phạm vi điều kiện bảo quản và đánh giá: Nghiên cứu độ ổn định thành phẩm được thiết kế theo hướng dẫn của WHO và ICH áp dụng cho Vùng khí hậu IVB (điều kiện nóng ẩm cao: nhiệt độ 30 °C ± 2 °C, độ ẩm tương đối 75% ± 5% RH).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước đây được điểm lại

Tác giả đã hệ thống hóa các thành tựu nghiên cứu quốc tế và trong nước về cấu trúc, tính chất hóa lý, các giải pháp cải thiện độ tan và các mô hình tiền lâm sàng của paclitaxel:

  1. Nghiên cứu cấu trúc và tính chất hóa lý của PTX: Wall và Mansukh C. Wani phân lập thành công PTX từ vỏ Taxus brevifolia. Hoạt chất có công thức phân tử C47H51NO14, khối lượng phân tử 853,91 Da, nhiệt độ nóng chảy 216 – 217 °C. Dược chất rất kém tan trong nước, tan khoảng 46 mM trong ethanol, khoảng 20 mM trong methylen clorid hoặc acetonitril, và 14 mM trong isopropanol.
  2. Cải tiến công thức thuốc tiêm truyền nhằm thay thế Cremophor® EL: Dung dịch tiêm Taxol® truyền thống sử dụng hệ dung môi Cremophor® EL và ethanol khan, dễ gây phản ứng quá mẫn, co thắt phế quản, tụt huyết áp do giải phóng histamin. Các giải pháp cải tiến đã được công bố trên thế giới bao gồm:
    • Hệ đồng dung môi và hỗn dịch: Tarr và Yalkowsky (1987) nghiên cứu hệ đồng dung môi PTX 5 mg/mL chứa ethanol: Tween 80: Pluronic L64 (tỷ lệ thể tích 3:1:6), và hệ nhũ tương dầu/nước dùng triacetin (75 mg/mL) nhưng dễ kết tủa khi pha loãng với dextrose 5%. Tarr và cộng sự tiếp tục bào chế hỗn dịch tiêm chứa 10 – 15 mg/mL PTX gồm 50% triacetin, 1,5% lecithin đậu nành, 1,5% Pluronic F68 và 2% ethyl oleat, bổ sung 10% glycerol nhưng lượng triacetin gây độc trên chuột. Lundberg (2005) bào chế hỗn dịch với triolein, dipalmityl-phosphatidylcholin, Tween 80 và PEG-dipalmitoyl phosphatidylethanolamin, đông khô với dextrose 5%. Constantinides và cộng sự (2000) bào chế vi nhũ tương 8 – 10 mg/mL chứa tocopherol, giảm triệu chứng quá mẫn trên lợn Ghine từ cấp độ 3 xuống cấp độ 1. Nornoo và cộng sự (2008) phát triển hai hệ vi nhũ tương không chứa cremophor là LBMW (lecithin: butanol: myvacet: nước) và CMW (capmul: myvacet: nước), làm tăng độ tan của PTX trong dầu myvacet lên 1389 lần so với nước.
    • Bào chế tiền chất (Prodrug): Mellado và cộng sự (1984) ester hóa vị trí C-2' với acid succinic, glutaric, sulfonic; Nuijen, Vyas và cộng sự (2014) tổng hợp dẫn xuất phosphat tại C-2' và C-7'; Ueda và cộng sự (1993) tổng hợp este phosphonoxyphenyl-propionat và dẫn chất 2'-Oxycarbonyl paclitaxel; Nicolaou và cộng sự (1993) nghiên cứu nhóm "protaxol"; Steven và cộng sự (2004) phát triển tiền chất Paclitaxel-7-carbonyl-cholesterol (Tax-Chol) hướng đích thụ thể folate.
    • Tiểu phân nano và micel: Hạt nano Abraxane® (Celgene, 2005) gắn PTX với albumin người tạo tiểu phân kích thước ~130 nm; Li Mu và Sizhe Feng (2003) dùng chất nhũ hóa vitamin E TPGS; Sung Chung Kim và cộng sự (2001) dùng micel polymer mPEG-PDLLA phân hủy sinh học; thuốc tiêm Paclitaxel poliglumex (Xytotax®/Opaxio®) liên kết acid poly-L-glutamic; Genexol-PM® dùng cấu trúc polymeric-micellar liên kết acid béo DHA.
    • Cấu trúc Liposom: Sharma và Straubinger (1994) dùng PC:PG (tỷ lệ mol 9:1); Sampedro và cộng sự (1994) dùng DMPC:DMPG (7:3 và 9:1) bổ sung 5% cholesterol; Crosasso và cộng sự (2000) dùng liposom PEGylated nạp PTX với tỷ lệ dược chất:lipid là 1:30, duy trì hiệu quả kết hợp 95%; thuốc tiêm EndoTAG-1 phối hợp PTX vào liposom cation hóa; J. Zhang và cộng sự (2005) đông khô PTX dạng liposom từ tính.
    • Tạo phức cyclodextrin và đông khô: Cserhati và cộng sự (1995) dùng hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β-CyD) tạo phức bao khoang kỵ nước đường kính 0,62 nm. Các nghiên cứu tổng quan của tác giả chỉ ra HP-β-CyD có khả năng làm tăng độ tan của PTX lên đến 2000 lần.
  3. Nghiên cứu tiền lâm sàng và phân bố sinh học: Guo Wei và Jenifer L. Johnson (2005), Ling Zhao và Wei Yu-Meng (2009), Shane Bermingham (2010), Wang Ying và Ke-Chun Wu (2011), Liu Xiangrui và Sun Jiabei (2012) đã phát triển các quy trình chiết mẫu sinh học (PP, LLE, SPE) và định lượng HPLC; Bartoli và cộng sự (1990), Fujita và cộng sự (1994), Wang Feihu và cộng sự (2013), Yonglu Wang và cộng sự (2011), Yang T. và cộng sự (2007) so sánh thông số dược động học và diện tích dưới đường cong (AUC) của PTX trên các mô chuột và thỏ.
  4. Nghiên cứu trong nước: Trần Như Nguyện và cộng sự (2017) khảo sát tác động kháng u gan HepG2 của chế phẩm liposom PTX-Monta trên chuột Swiss albino; Đỗ Thị Hồng Tươi và cộng sự (2017) khảo sát tác dụng kháng ung thư phổi của thuốc tiêm liposom PTX trên chuột Swiss albino gây ung thư bằng benzopyren so sánh với Anzatax®.

Khoảng trống luận án giải quyết

Mặc dù đã có các nghiên cứu bước đầu về bào chế thuốc tiêm dung dịch đậm đặc và liposom chứa PTX, tại Việt Nam chưa có công bố nghiên cứu nào hoàn thiện công thức và quy trình bào chế PTX dạng bột đông khô pha tiêm truyền. Đồng thời, các nghiên cứu trong nước trước đây chỉ tập trung vào hiệu lực ức chế khối u, hoàn toàn thiếu vắng quy trình phân tích định lượng đạt chuẩn quốc tế (FDA, EMA) để khảo sát thông số dược động học và sự phân bố sinh học của thuốc tiêm PTX trên mô tạng động vật thí nghiệm. Luận án lựa chọn giải quyết trực tiếp hai khoảng trống này.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và khái niệm sử dụng

  • Phân loại sinh dược học (BCS): PTX được xếp vào nhóm IV theo hệ thống phân loại BCS do có độ tan kém và tính thấm màng thấp. Để bào chế thuốc tiêm nhóm IV, luận án ứng dụng lý thuyết sử dụng hệ tá dược trợ tan, chất diện hoạt và tạo phức bao tương tự nhóm II nhằm tối ưu hóa độ tan và tính thấm.
  • Lý thuyết tạo phức bao Cyclodextrin: Sử dụng dẫn xuất Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin (HP-β-CyD, khối lượng phân tử 1400 Da, độ tan trong nước > 600 mg/mL). Với khoang rỗng kỵ nước có kích thước đường kính 0,62 nm, HP-β-CyD tạo phức bao phân tử với khung taxan cồng kềnh của PTX, làm tăng độ tan của dược chất trong nước lên gấp 2000 lần.
  • Nguyên lý đông khô (Lyophilization): Dựa trên giản đồ pha áp suất – nhiệt độ của nước và điểm ba (triple point), quy trình đông khô được vận hành qua 3 giai đoạn: (1) Đông lạnh dưới điểm ba; (2) Làm khô sơ cấp (áp suất giảm xuống vài millibar, thăng hoa 95% lượng nước tự do); (3) Làm khô thứ cấp (tăng nhiệt độ trên 0 °C nhằm loại bỏ nước liên kết/hấp phụ).
  • Tiêu chuẩn kiểm nghiệm và độ ổn định: Áp dụng hướng dẫn ICH, WHO, Dược điển Mỹ (USP 35, USP 36), Dược điển Anh (BP 2014) và Dược điển Việt Nam V (DĐVN V) cho vùng khí hậu IVB (30 °C ± 2 °C / 75% ± 5% RH).
  • Thẩm định phân tích dịch sinh học: Tuân thủ hướng dẫn thẩm định của FDA và EMEA với 7 chỉ tiêu: tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, giới hạn định lượng dưới (LLOQ), độ đúng và độ chính xác trong ngày/liên ngày, hiệu suất chiết, độ ổn định mẫu.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  • Bào chế dung dịch đậm đặc: Phương pháp hòa tan đơn giản. Khảo sát tỷ lệ chất diện hoạt Tween 80 và Kolliphor® ELP trong dung môi ethanol khan từ (1:4) đến (4:1) kết hợp khảo sát nồng độ chất ổn định acid citric 0,01 M. Pha loãng kiểm tra độ ổn định cảm quan và hàm lượng trong NaCl 0,9% và Glucose 5% ở 3 mức nồng độ lâm sàng: 0,3; 0,6 và 1,2 mg/mL tại các mốc 0, 24, 48 và 72 giờ.
  • Bào chế thuốc bột đông khô: Nghiên cứu tạo phức bao PTX với HP-β-CyD (khảo sát nồng độ 0,1 – 0,4%), phối hợp các tá dược ổn định phức và trợ tan gồm PVP K30, PEG 400, Tween 80, Poloxamer 188. Khảo sát tá dược tạo khối xốp (D-manitol, lactose, glucose, sorbitol, leucin) và dung môi hòa tan (ethanol, tert-butanol, DMSO). Tối ưu hóa chu trình đông khô trên thiết bị Christ Delta 2-24 LSC Plus, khảo sát độ lặp lại trên quy mô 5 lọ/lô qua 3 lô liên tiếp và nâng quy mô lên 50 lọ/lô.
  • Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Sử dụng hệ thống HPLC LC-20A (Shimadzu), đầu dò PDA.
    • Định lượng PTX trong chế phẩm: Cột C18, bước sóng phát hiện 227 nm, tốc độ dòng 1,0 – 1,5 mL/phút. Thẩm định tính tương thích hệ thống (RSD ≤ 2%), tính tuyến tính (100 – 1400 µg/mL), độ đúng (độ thu hồi 98 – 102%).
    • Xác định tạp liên quan: Cột C18, pha động gradient nước - acetonitril, bước sóng 227 – 230 nm, kiểm soát các tạp Baccatin III, dẫn xuất Ethyl ester, 10-Deacetylpaclitaxel, 10-Deacetyl-7-epipaclitaxel (tạp chuẩn B) và 7-Epipaclitaxel.
  • Nghiên cứu độc tính cấp tiền lâm sàng: Xác định liều LD50 trên chuột nhắt trắng bằng phương pháp Karber và Behrens. Giai đoạn thăm dò liều LD0 và LD100 dùng 60 chuột (15 nhóm x 4 con, tiêm tĩnh mạch đuôi liều 6 đến 60 mg/kg). Giai đoạn xác định LD50 dùng 64 chuột (8 nhóm x 8 con, liều 12 đến 54 mg/kg), theo dõi biểu hiện nhiễm độc và tử vong trong 72 giờ.
  • Xử lý mẫu sinh học và xác định phân bố mô:
    • Mẫu máu thỏ (lấy ở tĩnh mạch tai) và chuột (lấy từ tim) chống đông bằng EDTA 1%, ly tâm tách huyết tương, bảo quản ở -80 °C.
    • Mẫu mô (gan, thận, phổi) được rửa sạch bằng NaCl 0,9%, thấm khô, cân khối lượng, đồng nhất hóa với dung dịch NaCl 0,9% theo tỷ lệ thể tích:khối lượng là 1 mL:1 g (mô thỏ) hoặc 5 mL:1 g (mô chuột).
    • Chiết mẫu bằng dung môi acetonitril hoặc diethyl ether, sử dụng diazepam hoặc carbamazepin làm chuẩn nội (IS).
    • Quy đổi nồng độ thuốc trong dịch mô về đơn vị phân bố sinh học (µg PTX/g mô) thông qua tỷ trọng thô dịch mô ($d_A$) và tỷ trọng dung dịch NaCl 0,9% ($d_0$):
      • Chuột: $\text{Nồng độ trong mô} = \frac{\text{Nồng độ dịch mô } (\mu\text{g/mL}) \times (1 + 5 \cdot d_0)}{d_A}$
      • Thỏ: $\text{Nồng độ trong mô} = \frac{\text{Nồng độ dịch mô } (\mu\text{g/mL}) \times (1 + d_0)}{d_A}$
  • Xử lý số liệu và dược động học: Tính toán các thông số $C_{\max}$, $t_{\max}$, $AUC_{0 \to t}$, $AUC_{0 \to \infty}$ theo phương pháp hình thang bằng phần mềm Microsoft Excel 2013, kiểm định trắc nghiệm $t$ với khoảng tin cậy 95% ($p = 0,05$).

Nguồn nguyên vật liệu và thiết bị

  • Chất chuẩn đối chiếu: Paclitaxel (99,4%, EDQM Pháp; 100,7%, Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP.HCM), Diazepam (99,9%), Carbamazepin (99,51%), Tạp chuẩn B 10-deacetyl-7-epipaclitaxel (100,0%, USP).
  • Dược chất và tá dược: Paclitaxel đạt chuẩn USP 35 (Trung Quốc); Kolliphor® ELP đạt chuẩn EP (BASF, Đức); Polysorbat 80 (Merck, Đức); HP-β-CyD Kleptose® (Carbosynth, Mỹ); D-Manitol Pearlitol®, PVP K30, Poloxamer 188, Lactose (Sigma, Mỹ); Ethanol PA (Prolabo, Pháp); Tert-butanol, DMSO, Acetonitril, Methanol, Diethyl ether (Merck, Fisher, J.T Baker).
  • Thiết bị chính: Hệ thống HPLC Shimadzu LC-20A (Nhật), Máy đông khô Christ Delta 2-24 LSC Plus (Nhật), Máy siêu âm phá tế bào QSONICA 125 (Mỹ), Cân phân tích Mettler Toledo (Đức), Cân kỹ thuật Sartorius (Đức), Tủ đông -80 °C Sanyo (Nhật).

Nội dung chính theo từng chương

1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương này phân tích toàn diện cơ sở khoa học về hoạt chất PTX, các chiến lược công nghệ cải tiến độ tan và đánh giá tiền lâm sàng:

  • Trình bày đặc tính lý hóa của PTX, công thức cấu tạo phân tử, cơ chế tác động lên vi ống và các tiêu chuẩn kiểm nghiệm định tính, định lượng, giới hạn tạp chất theo Dược điển Mỹ (USP 2014) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao.
  • Phân loại các nhóm tá dược và kỹ thuật tăng độ tan cho dược chất nhóm IV: hệ đồng dung môi, hệ hỗn dịch và vi nhũ tương, tổng hợp tiền chất hóa học, bao màng nano/albumin (Abraxane®), hệ phân tán micel, liposom và tạo phức bao cyclodextrin.
  • Phân tích chi tiết quy trình đông khô thuốc tiêm: giản đồ pha 3 trạng thái, các thông số kỹ thuật của quá trình đông lạnh, thăng hoa sơ cấp và giải hấp thứ cấp; phân loại các hệ tá dược đệm, tá dược độn tạo khối (manitol, lactose, leucin), tá dược bảo vệ phức và chất diện hoạt.
  • Tổng hợp các yêu cầu thẩm định phương pháp phân tích mẫu sinh học theo FDA và EMEA; nguyên lý chiết xuất mẫu mô và huyết tương; tổng hợp các dữ liệu nghiên cứu tiền lâm sàng đã công bố về phân bố mô và dược động học của PTX trên chuột và thỏ.

Bảng tổng hợp dữ liệu AUC phân bố PTX trong mô chuột từ các nghiên cứu quốc tế được luận án trích dẫn:

Cơ quan Giá trị $AUC_{0-8h}$ của Taxol® (liều 15 mg/kg) [40] ($\mu\text{g/g}\cdot\text{giờ}$) Giá trị $AUC_{0-8h}$ của PTX hỗn dịch (liều 15 mg/kg) [40] ($\mu\text{g/g}\cdot\text{giờ}$) Giá trị $AUC_{0-12h}$ của PTX-NO (liều 10 mg/kg) [62] ($\mu\text{g/g}\cdot\text{giờ}$) Giá trị $AUC_{0-12h}$ của PTX-INJ (liều 10 mg/kg) [62] ($\mu\text{g/g}\cdot\text{giờ}$)
Gan $58,55 \pm 12,04$ $54,84 \pm 9,10$ $687,58 \pm 117,56$ $60,45 \pm 20,49$
Thận $34,94 \pm 3,02$ $31,62 \pm 1,94$ $21,91 \pm 10,93$ $22,68 \pm 9,47$
Phổi $28,52 \pm 5,17$ $23,81 \pm 2,58$ $104,48 \pm 24,73$ $43,92 \pm 34,92$
Lách $33,70 \pm 11,29$ $23,13 \pm 2,05$ $613,06 \pm 218,34$ $53,52 \pm 29,55$
Tim $16,54 \pm 3,27$ $13,10 \pm 1,05$ $14,51 \pm 6,21$ $18,02 \pm 5,84$
Não Rất thấp Rất thấp $9,48 \pm 3,45$ $0,03 \pm 0,03$
Buồng trứng $4,43 \pm 0,65$ 15,20 Không khảo sát Không khảo sát

2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương này thiết lập đầy đủ quy trình thực nghiệm, mô hình động vật và các thuật toán tính toán:

  • Xác định tiêu chuẩn hóa chất, dung môi, thiết bị phân tích và nguồn gốc động vật thí nghiệm (thỏ trắng cái 2,0 – 2,5 kg, chuột nhắt trắng 20 – 40 g).
  • Xây dựng quy trình bào chế dung dịch đậm đặc và bột đông khô; tiêu chí đánh giá độ ổn định của dịch truyền sau khi pha loãng với NaCl 0,9% và Glucose 5% ở 3 mức nồng độ (0,3; 0,6 và 1,2 mg/mL).
  • Xây dựng quy trình thẩm định HPLC định lượng hoạt chất và kiểm soát tạp chất liên quan theo tiêu chuẩn USP 36 và BP 2014; thiết lập các điều kiện khảo sát độ ổn định thành phẩm trong điều kiện lão hóa cấp tốc và dài hạn theo vùng IVB.
  • Thiết lập phương pháp thử độc tính cấp LD50 theo Karber và Behrens trên chuột nhắt trắng với các dãy liều từ 6 đến 60 mg/kg tiêm tĩnh mạch.
  • Chuẩn hóa quy trình xử lý dịch sinh học: thời điểm lấy mẫu máu thỏ (từ 5 đến 360 phút) và chuột (từ 5 đến 360 phút); thời điểm thu hoạch mô thỏ (0,5; 2; 4; 8 giờ) và chuột (0,5; 1; 2; 4; 6; 8 giờ); kỹ thuật chiết tách và thẩm định định lượng HPLC trong mô và huyết tương; công thức toán học tính tỷ trọng dịch mô và tích phân diện tích dưới đường cong AUC.

3. XÂY DỰNG CÔNG THỨC VÀ QUY TRÌNH ĐIỀU CHẾ THUỐC TIÊM CHỨA PTX VỚI HAI DẠNG BÀO CHẾ DUNG DỊCH ĐẬM ĐẶC VÀ BỘT ĐÔNG KHÔ PHA TIÊM TRUYỀN

Chương này trình bày các số liệu thực nghiệm bước đầu trong việc khảo sát thuốc đối chứng và xây dựng công thức dung dịch đậm đặc chứa PTX:

  1. Khảo sát thuốc đối chứng Stragen® (6 mg PTX/mL): Khi pha loãng trong NaCl 0,9% và Glucose 5% ở các nồng độ 0,3; 0,6 và 1,2 mg/mL bảo quản ở 2 – 8 °C, hàm lượng PTX duy trì ổn định > 90% liên tục đến 72 giờ:

    • Trong NaCl 0,9%: Hàm lượng ở thời điểm 72 giờ lần lượt là 95,61% (nồng độ 1,2 mg/mL); 97,40% (nồng độ 0,6 mg/mL); 97,43% (nồng độ 0,3 mg/mL).
    • Trong Glucose 5%: Hàm lượng ở thời điểm 72 giờ lần lượt là 98,17% (nồng độ 1,2 mg/mL); 90,30% (nồng độ 0,6 mg/mL); 94,90% (nồng độ 0,3 mg/mL).

  2. Khảo sát tỷ lệ chất diện hoạt Tween 80 (T80) và Kolliphor® ELP (K) trong ethanol khan (E): Các công thức từ T1 đến T7 và K1 đến K7 được pha loãng 10 lần (nồng độ 0,6 mg/mL) để sàng lọc độ ổn định cảm quan và hàm lượng trong vòng 24 giờ.

Bảng kết quả cảm quan và hàm lượng PTX (%) sau khi pha loãng trong dung dịch NaCl 0,9%:

Tỷ lệ diện hoạt/E Công thức 0 giờ 24 giờ Công thức 0 giờ 24 giờ
(1:4) T1 Tủa đục (-) Tủa đục (-) K1 Tủa đục (-) Tủa đục (-)
(1:3) T2 Tủa đục (-) Tủa đục (-) K2 Tủa đục (-) Tủa đục (-)
(1:2) T3 Tủa đục (-) Tủa đục (-) K3 Đục mờ ($\pm$) (88,60%) Tủa đục (-) (60,33%)
(1:1) T4 Trong (+) (92,73%) Tủa đục (-) (68,01%) K4 Trong (+) (98,64%) Trong (+) (93,89%)
(2:1) T5 Trong (+) (98,93%) Trong (+) (97,21%) K5 Trong (+) (95,34%) Trong (+) (94,64%)
(3:1) T6 Trong (+) (99,14%) Trong (+) (93,15%) K6 Trong (+) (97,84%) Trong (+) (95,41%)
(4:1) T7 Trong (+) (95,70%) Trong (+) (91,96%) K7 Trong (+) (97,70%) Trong (+) (96,34%)

Bảng kết quả cảm quan và hàm lượng PTX (%) sau khi pha loãng trong dung dịch Glucose 5%:

Tỷ lệ diện hoạt/E Công thức 0 giờ 24 giờ Công thức 0 giờ 24 giờ
(1:4) T1 Tủa đục (-) Tủa đục (-) K1 Tủa đục (-) Tủa đục (-)
(1:3) T2 Tủa đục (-) Tủa đục (-) K2 Tủa đục (-) Tủa đục (-)
(1:2) T3 Tủa đục (-) Tủa đục (-) K3 Đục mờ ($\pm$) (90,01%) Tủa đục (-) (83,57%)
(1:1) T4 Trong (+) (103,82%) Tủa đục (-) (86,12%) K4 Trong (+) (99,17%) Trong (+) (94,69%)
(2:1) T5 Trong (+) (100,82%) Trong (+) (97,70%) K5 Trong (+) (93,85%) Trong (+) (92,74%)
(3:1) T6 Trong (+) (93,98%) Trong (+) (93,71%) K6 Trong (+) (102,49%) Trong (+) (98,40%)
(4:1) T7 Trong (+) (95,87%) Trong (+) (94,12%) K7 Trong (+) (95,63%) Trong (+) (94,52%)

Kết quả sàng lọc cho thấy các công thức T5, T6, T7 (tỷ lệ Tween 80:ethanol từ 2:1 trở lên) và K4, K5, K6, K7 (tỷ lệ Kolliphor ELP:ethanol từ 1:1 trở lên) giữ được độ trong và hàm lượng > 90% sau 24 giờ. Luận án chọn hai công thức có tỷ lệ chất diện hoạt thấp nhất đạt yêu cầu là T5 (2:1) và K4 (1:1) để tiếp tục tối ưu hóa với chất ổn định acid citric.

  1. Khảo sát ảnh hưởng của acid citric 0,01 M lên độ ổn định sau khi pha loãng: Việc bổ sung acid citric 0,01 M (+AC) giúp cải thiện độ ổn định của công thức K4 khi pha loãng ở các nồng độ trị liệu (0,3; 0,6 và 1,2 mg PTX/mL trong NaCl 0,9%) theo thời gian.

Bảng kết quả hàm lượng PTX (%) và cảm quan theo thời gian khi có và không có acid citric (pha trong NaCl 0,9%):

Công thức Mẫu nồng độ 0 giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ
K4 (không AC) K41 (1,2 mg/mL) 97,31% (+) 93,27% (+) 62,39% (-) 56,22% (-)
K42 (0,6 mg/mL) 100,58% (+) 95,59% (+) 91,60% (+) 71,43% ($\pm$)
K43 (0,3 mg/mL) 98,29% (+) 93,57% (+) 82,80% ($\pm$) 75,37% ($\pm$)
K4 + AC (có AC 0,01 M) K41+AC (1,2 mg/mL) 96,11% (+) 95,05% (+) 90,67% ($\pm$) 82,43% ($\pm$)
K42+AC (0,6 mg/mL) 99,48% (+) 98,25% (+) 94,52% (+) 93,46% (+)
K43+AC (0,3 mg/mL) 99,75% (+) 98,78% (+) 95,61% (+) 92,14% (+)
T5 (không AC) T51 (1,2 mg/mL) 96,73% (+) 94,07% (+) 94,01% (+) 93,93% (+)
T52 (0,6 mg/mL) 98,33% (+) 96,36% (+) 94,58% (+) 94,37% (+)
T53 (0,3 mg/mL) 101,89% (+) 99,26% (+) 95,76% (+) 93,60% (+)
T5 + AC (có AC 0,01 M) T51+AC (1,2 mg/mL) 96,98% (+) 94,26% (+) 93,94% (+) 93,62% (*)
T52+AC (0,6 mg/mL) 98,32% (+) 97,66% (+) 96,76% (+) 95,85% (*)
T53+AC (0,3 mg/mL) 101,89% (+) 99,26% (+) 96,98% (+) 94,69% (+)

Ghi chú ký hiệu: (+): dung dịch trong; (-): dung dịch tủa đục; ($\pm$): dung dịch đục mờ; (): dung dịch xuất hiện tủa li ti màu trắng.*

Kết quả cho thấy ở công thức K4 không có acid citric, mẫu K41 bị tủa đục nghiêm trọng tại 48 giờ (hàm lượng còn 62,39%) và 72 giờ (56,22%). Khi bổ sung acid citric 0,01 M, mẫu K42+AC và K43+AC duy trì được độ trong và hàm lượng trên 92% đến 72 giờ. Đối với hệ Tween 80 (T5), khi bổ sung acid citric có hiện tượng xuất hiện tủa li ti màu trắng tại thời điểm 72 giờ ở nồng độ 1,2 và 0,6 mg/mL.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận

  • Thiết lập thành công cơ sở khoa học cho việc tạo phức bao phân tử giữa paclitaxel và tá dược Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β-CyD) ứng dụng trong công nghệ đông khô thuốc tiêm chống ung thư tại Việt Nam, khắc phục nhược điểm kém tan của dược chất nhóm IV theo hệ thống phân loại sinh dược học BCS.
  • Xây dựng và thẩm định hoàn chỉnh phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) định lượng PTX trong các dịch sinh học phức tạp (huyết tương và mô gan, thận, phổi) theo các tiêu chuẩn thẩm định của FDA và EMEA, làm giàu thêm lý luận về kiểm nghiệm sinh học và dược động học tiền lâm sàng.
  • Thiết lập công thức toán học thực nghiệm xác định nồng độ thuốc trong mô tạng ($\mu\text{g PTX/g mô}$) dựa trên thông số tỷ trọng thô của dịch mô đồng nhất ($d_A$) và tỷ trọng dung dịch sinh lý ($d_0$).

Đóng góp mới về mặt thực tiễn

  • Lần đầu tiên tại Việt Nam xây dựng công thức và quy trình bào chế thuốc bột đông khô pha tiêm truyền chứa PTX (24 mg/lọ), mở ra khả năng sản xuất chế phẩm đơn liều tiện dụng, giảm thiểu rủi ro phải chia liều từ dung dịch đậm đặc.
  • Xác định được tỷ lệ thành phần tối ưu cho dung dịch đậm đặc pha tiêm PTX 6 mg/mL: hệ Kolliphor® ELP:ethanol khan tỷ lệ 1:1 phối hợp acid citric 0,01 M giúp dung dịch sau khi pha loãng trong NaCl 0,9% ở các nồng độ trị liệu duy trì độ trong và hàm lượng ổn định (> 92%) đến 72 giờ ở 2 – 8 °C.
  • Xây dựng thành công tiêu chuẩn chất lượng cơ sở cho hai dạng chế phẩm dựa trên Dược điển Mỹ (USP) và Dược điển Việt Nam V; xây dựng mô hình thử nghiệm độc tính cấp (LD50 theo Karber – Behrens) và quy trình đánh giá phân bố sinh học trên thỏ và chuột so sánh với biệt dược đối chứng ngoại nhập (Stragen®, Anzatax®).

Đề xuất và giải pháp

  • Đề xuất ứng dụng quy trình phân tích sắc ký dịch sinh học đã thẩm định vào các nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học tiền lâm sàng cho các thuốc chống ung thư sản xuất trong nước.
  • Ứng dụng công thức Kolliphor® ELP/ethanol khan (1:1) bổ sung acid citric 0,01 M để nâng cấp quy mô sản xuất dung dịch đậm đặc tiêm truyền ở quy mô công nghiệp.
  • Tiếp tục theo dõi thử nghiệm độ ổn định dài hạn ở điều kiện vùng IVB (30 °C ± 2 °C / 75% ± 5% RH) để xác định chính xác tuổi thọ và hạn dùng của chế phẩm bột đông khô và dung dịch đậm đặc.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Các thử nghiệm dược động học và phân bố sinh học trong khuôn khổ quy trình xây dựng mới được tiến hành trên động vật thí nghiệm sinh lý lành mạnh (thỏ trắng cái, chuột nhắt trắng), chưa triển khai đồng thời trên mô hình động vật mang khối u thực nghiệm để đánh giá tỷ lệ tích lũy thuốc chọn lọc tại mô bệnh lý.
  • Công thức dung dịch đậm đặc chứa Tween 80 khi có mặt acid citric 0,01 M xuất hiện hiện tượng tủa li ti màu trắng sau 72 giờ pha loãng ở các nồng độ cao (0,6 và 1,2 mg/mL).
  • Quá trình khảo sát dung môi đông khô (tert-butanol, DMSO) và các tá dược tạo khối xốp (manitol, lactose, leucin) mới được thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm và nâng lô bước đầu (50 lọ), cần tiếp tục theo dõi độ ẩm tồn dư và độ đồng đều bánh đông khô khi vận hành ở quy mô lớn hơn.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Mở rộng đánh giá phân bố sinh học và hiệu lực ức chế khối u của chế phẩm bột đông khô PTX trên các dòng động vật mang khối u thực nghiệm (ung thư gan, ung thư phổi, ung thư vú).
  • Nghiên cứu cơ chế tương tác gây tủa li ti giữa Tween 80 và acid citric để tìm tá dược ổn định thay thế thích hợp hơn.
  • Hoàn thiện dữ liệu thử nghiệm độ ổn định thành phẩm sau 24 tháng bảo quản ở điều kiện dài hạn vùng IVB (30 °C ± 2 °C, 75% ± 5% RH đối với dung dịch đậm đặc và 5 °C ± 3 °C đối với bột đông khô).

Giá trị tham khảo

Đối tượng thụ hưởng

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và dược sĩ chuyên ngành Bào chế và Công nghệ Dược phẩm: Tham khảo quy trình xây dựng công thức thuốc tiêm truyền khó tan, phương pháp tạo phức bao cyclodextrin và kỹ thuật đông khô thuốc tiêm.
  • Nghiên cứu viên và giảng viên chuyên ngành Kiểm nghiệm thuốc và Dược lý – Dược động học: Sử dụng các thông số thẩm định HPLC định lượng dược chất trong dịch sinh học (huyết tương, mô gan, thận, phổi) theo tiêu chuẩn FDA/EMEA, cũng như phương pháp xác định LD50 theo Karber – Behrens.
  • Các nhà sản xuất dược phẩm và cơ quan quản lý dược: Cung cấp dữ liệu thực nghiệm phục vụ việc xây dựng tiêu chuẩn chất lượng, thẩm định quy trình sản xuất và đăng ký lưu hành thuốc generic chống ung thư sản xuất trong nước.

Các nội dung có giá trị tham khảo cao

  • Bảng thông số điều kiện sắc ký chi tiết đối với định tính, định lượng và kiểm tra giới hạn 5 tạp chất phân hủy của PTX theo tiêu chuẩn Dược điển Mỹ.
  • Quy trình xử lý mẫu mô sinh học, công thức hiệu chỉnh nồng độ theo tỷ trọng dịch mô thô ($d_A$), và chương trình dung môi thẩm định phân tích dược chất nồng độ thấp trong nền sinh học.
  • Dữ liệu thực nghiệm về tỷ lệ phối hợp tá dược diện hoạt Kolliphor® ELP/ethanol khan và vai trò của acid citric 0,01 M trong việc chống kết tủa dược chất khi pha loãng với dung dịch truyền tĩnh mạch NaCl 0,9%.

Câu hỏi thường gặp

1. Paclitaxel thuộc nhóm dược chất nào theo hệ thống phân loại sinh dược học (BCS) và có đặc tính độ tan ra sao?

Paclitaxel thuộc nhóm IV theo hệ thống phân loại sinh dược học (BCS), đặc trưng bởi độ tan rất kém trong nước và tính thấm màng sinh học thấp. Hoạt chất tan rất kém trong hầu hết các dung môi dùng trong dược phẩm, tan trong methanol, tan khoảng 46 mM trong ethanol, khoảng 20 mM trong methylen clorid hoặc acetonitril, và 14 mM trong isopropanol. Nhiệt độ nóng chảy của hoạt chất là 216 – 217 °C.

2. Tại sao luận án lựa chọn nghiên cứu dạng bột đông khô bên cạnh dạng dung dịch đậm đặc?

Luận án phát triển dạng bột đông khô vì tại Việt Nam chưa có nghiên cứu công bố nào về dạng bào chế này cho PTX. Dạng bột đông khô có ưu điểm vượt trội là cho phép đóng gói hàm lượng phân liều nhỏ trong mỗi đơn vị sản phẩm (24 mg/lọ), giúp nhân viên y tế sử dụng 1 lần/1 đơn vị theo chỉ định mà không phải thực hiện thao tác chia nhỏ liều từ lọ dung dịch đậm đặc thể tích lớn, hạn chế nguy cơ sai sót liều và giảm thiểu phản ứng phân hủy hoạt chất do quá trình làm khô diễn ra ở nhiệt độ thấp.

3. Trong nghiên cứu dung dịch đậm đặc, tỷ lệ chất diện hoạt nào đạt độ ổn định hàm lượng trong vòng 24 giờ sau khi pha loãng?

Khi khảo sát pha loãng 10 lần trong NaCl 0,9% và Glucose 5% ở nồng độ 0,6 mg/mL, các công thức sử dụng Tween 80/ethanol khan từ tỷ lệ 2:1 trở lên (T5 tỷ lệ 2:1, T6 tỷ lệ 3:1, T7 tỷ lệ 4:1) và các công thức sử dụng Kolliphor® ELP/ethanol khan từ tỷ lệ 1:1 trở lên (K4 tỷ lệ 1:1, K5 tỷ lệ 2:1, K6 tỷ lệ 3:1, K7 tỷ lệ 4:1) đều duy trì được độ trong và hàm lượng PTX trên 90% sau 24 giờ.

4. Bổ sung acid citric 0,01 M có tác động thực nghiệm như thế nào đối với dung dịch tiêm pha loãng?

Đối với công thức K4 (Kolliphor® ELP:ethanol 1:1), khi không có acid citric, mẫu pha loãng nồng độ 1,2 mg/mL bị tủa đục ở 48 giờ (hàm lượng còn 62,39%) và 72 giờ (56,22%). Khi thêm acid citric 0,01 M, dung dịch giữ được độ trong và duy trì hàm lượng hoạt chất đạt 93,46% (mẫu 0,6 mg/mL) và 92,14% (mẫu 0,3 mg/mL) sau 72 giờ. Tuy nhiên, đối với hệ Tween 80 (T5), việc thêm acid citric làm xuất hiện tủa li ti màu trắng sau 72 giờ ở nồng độ 0,6 và 1,2 mg/mL.

5. Phương pháp tính toán nồng độ PTX trong các mô động vật thí nghiệm được tiến hành như thế nào?

Mô gan, thận, phổi được cân, đồng nhất hóa với dung dịch NaCl 0,9% theo tỷ lệ 1 mL:1 g (mô thỏ) hoặc 5 mL:1 g (mô chuột). Sau khi định lượng bằng HPLC qua phương pháp chuẩn nội để thu được nồng độ dịch mô ($\mu\text{g/mL}$), giá trị được quy đổi về nồng độ phân bố trong mô ($\mu\text{g PTX/g mô}$) thông qua công thức chứa tỷ trọng thô dịch mô ($d_A$) và tỷ trọng dung dịch sinh lý ($d_0$): lấy nồng độ dịch mô nhân với $(1 + 5 \cdot d_0)$ chia cho $d_A$ đối với chuột, hoặc nhân với $(1 + d_0)$ chia cho $d_A$ đối với thỏ.

Kết luận

Luận án đã giải quyết thành công các vấn đề công nghệ cốt lõi trong việc xây dựng công thức và quy trình bào chế thuốc tiêm paclitaxel dưới hai dạng: dung dịch đậm đặc (30 mg/5 mL) và bột đông khô (24 mg/lọ) sử dụng tá dược HP-β-CyD. Nghiên cứu đã hoàn thiện và thẩm định hệ thống phương pháp phân tích HPLC xác định hoạt chất, tạp liên quan và định lượng dịch sinh học tuân thủ các quy chuẩn quốc tế USP, FDA và EMEA. Đồng thời, đề tài đã thiết lập thành công mô hình tiền lâm sàng hoàn chỉnh trên thỏ và chuột nhằm xác định độc tính cấp LD50 và đánh giá sự phân bố sinh học của paclitaxel trong các cơ quan mô tạng, cung cấp dữ liệu khoa học tin cậy cho việc phát triển các dạng thuốc tiêm chống ung thư sản xuất trong nước.