Khóa luận: Thành phần hóa học và tác dụng kháng vi sinh vật của lá Hẹ - Trường Đại học Dược Hà Nội

Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng kháng vi sinh vật của lá hẹ trong khóa luận tốt nghiệp dược sĩ của Nguyễn Thị Thùy Dung.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thùy Dung
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thái An
• Trường học: Trường Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược sĩ
• Đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật của lá Hẹ
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tên khoa học và vị trí phân loại
• 1.2. Đặc điểm thực vật và vị trí phân bố
• 1.3. Thành phần hóa học
• 1.4. Tác dụng kháng khuẩn
• 1.5. Tác dụng bảo vệ gan
• 1.6. Giảm đường huyết
• 1.7. Chống ung thư
• 1.8. Chống côn trùng, ký sinh trùng
• 1.9. Một số bài thuốc dân gian từ Hẹ
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng, phương tiện nghiên cứu
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Phương tiện nghiên cứu
• 2.4. Trang thiết bị nghiên cứu
• 2.5. Nội dung nghiên cứu
• 2.6. Thu mẫu và xác định hàm lượng tinh dầu trong mẫu nghiên cứu
• 2.7. Định tính thành phần hóa học của lá Hẹ
• 2.8. Phân tích thành phần tinh dầu lá Hẹ
• 2.9. Đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật của tinh dầu lá Hẹ
• 2.10. Phương pháp nghiên cứu
• 2.11. Thu mẫu nghiên cứu và giám định tên khoa học
• 2.12. Định tính sơ bộ thành phần hóa học của lá Hẹ
• 2.13. Xác định hàm lượng tinh dầu trong mẫu nghiên cứu
• 2.14. Xác định hàm ẩm của mẫu nghiên cứu
• 2.15. Định tính tinh dầu lá Hẹ bằng sắc ký lớp mỏng
• 2.16. Phân tích thành phần tinh dầu bằng sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC/MS)
• 2.17. Đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật của tinh dầu lá Hẹ
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu
• 3.2. Đặc điểm hình thái mẫu nghiên cứu
• 3.3. Kết quả giám định mẫu nghiên cứu
• 3.4. Xác định hàm lượng tinh dầu mẫu nghiên cứu
• 3.5. Định tính sơ bộ thành phần hóa học
• 3.6. Định tính sơ bộ thành phần hóa học trong lá Hẹ bằng các phản ứng hóa học
• 3.7. Định tính dịch chiết toàn phần lá Hẹ bằng SKLM
• 3.8. Kết quả định tính tinh dầu lá Hẹ bằng sắc ký lớp mỏng
• 3.9. Phân tích thành phần tinh dầu bằng sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC/MS)
• 3.10. Đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật kiểm định của tinh dầu lá Hẹ
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Về định tính sơ bộ thành phần hóa học của mẫu nghiên cứu
• 4.2. Về định tính thành phần tinh dầu bằng sắc ký lớp mỏng
• 4.3. Về phân tích thành phần tinh dầu bằng sắc ký khí kết hợp phối khổ (GC/MS)
• 4.4. Về đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu lá Hẹ
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về tác dụng kháng vi sinh vật của lá hẹ

Lá hẹ (Allium tuberosum) không chỉ là một loại gia vị phổ biến trong ẩm thực mà còn được biết đến với nhiều tác dụng dược lý. Nghiên cứu cho thấy lá hẹ có khả năng kháng vi sinh vật mạnh mẽ, nhờ vào các thành phần hóa học đặc biệt. Các hợp chất như odorin và các hợp chất sulfid trong lá hẹ đã được chứng minh có tác dụng kháng khuẩn đối với nhiều loại vi khuẩn gây bệnh. Điều này mở ra hướng đi mới trong việc sử dụng lá hẹ như một loại dược liệu tự nhiên trong y học.

1.1. Thành phần hóa học của lá hẹ và tác dụng kháng vi sinh vật

Lá hẹ chứa nhiều hợp chất hóa học như flavonoid, saponin, và các hợp chất sulfid. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hợp chất này có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn, bao gồm Staphylococcus aureus và Escherichia coli. Đặc biệt, odorin trong lá hẹ có tác dụng kháng khuẩn mạnh mẽ, giúp bảo vệ cơ thể khỏi các tác nhân gây bệnh.

1.2. Nghiên cứu về tác dụng kháng vi sinh vật của lá hẹ

Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật của lá hẹ. Một nghiên cứu cho thấy nước ép từ lá hẹ có khả năng ức chế sự phát triển của Salmonella typhi và Shigella flexneri. Kết quả này cho thấy lá hẹ không chỉ có giá trị dinh dưỡng mà còn có tiềm năng lớn trong việc phát triển các sản phẩm kháng khuẩn tự nhiên.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu lá hẹ

Mặc dù lá hẹ đã được biết đến với nhiều tác dụng dược lý, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc nghiên cứu và ứng dụng. Một trong những vấn đề lớn là thiếu thông tin về các thành phần hóa học cụ thể và cơ chế hoạt động của chúng. Điều này làm hạn chế khả năng phát triển các sản phẩm từ lá hẹ trong y học.

2.1. Thiếu thông tin về thành phần hóa học

Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về lá hẹ, nhưng thông tin về thành phần hóa học cụ thể vẫn còn hạn chế. Việc xác định chính xác các hợp chất có hoạt tính kháng vi sinh vật là rất cần thiết để phát triển các sản phẩm dược liệu hiệu quả.

2.2. Khó khăn trong việc ứng dụng thực tiễn

Việc ứng dụng lá hẹ trong y học còn gặp nhiều khó khăn do thiếu các nghiên cứu lâm sàng. Cần có thêm các nghiên cứu để chứng minh hiệu quả và độ an toàn của lá hẹ khi sử dụng trong điều trị bệnh.

III. Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng vi sinh vật của lá hẹ

Để đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật của lá hẹ, các phương pháp nghiên cứu hiện đại như sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC-MS) và phương pháp khuếch tán qua giếng thạch đã được áp dụng. Những phương pháp này giúp xác định chính xác các thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của chúng.

3.1. Phương pháp sắc ký khí kết hợp khối phổ

Sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC-MS) là một trong những phương pháp hiệu quả nhất để phân tích thành phần hóa học trong lá hẹ. Phương pháp này cho phép xác định các hợp chất có trong tinh dầu lá hẹ và đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của chúng.

3.2. Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch

Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch được sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của nước ép lá hẹ. Kết quả từ phương pháp này cho thấy lá hẹ có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn gây bệnh.

IV. Ứng dụng thực tiễn của lá hẹ trong y học

Lá hẹ không chỉ được sử dụng trong ẩm thực mà còn có nhiều ứng dụng trong y học. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng lá hẹ có tác dụng kháng khuẩn, bảo vệ gan, và giảm đường huyết. Những ứng dụng này mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm từ lá hẹ trong điều trị bệnh.

4.1. Tác dụng kháng khuẩn và bảo vệ gan

Lá hẹ đã được chứng minh có tác dụng kháng khuẩn mạnh mẽ và bảo vệ gan. Nghiên cứu cho thấy chiết xuất từ lá hẹ có khả năng giảm nồng độ enzyme gan, giúp bảo vệ gan khỏi tổn thương.

4.2. Giảm đường huyết và ứng dụng trong điều trị tiểu đường

Nghiên cứu cho thấy lá hẹ có khả năng giảm đường huyết hiệu quả. Điều này mở ra cơ hội cho việc sử dụng lá hẹ như một phương pháp hỗ trợ điều trị tiểu đường tự nhiên.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu lá hẹ

Nghiên cứu về lá hẹ đã chỉ ra rằng loại cây này có nhiều tiềm năng trong việc phát triển các sản phẩm kháng vi sinh vật tự nhiên. Tuy nhiên, cần có thêm nhiều nghiên cứu để xác định rõ hơn về thành phần hóa học và cơ chế hoạt động của chúng. Tương lai của nghiên cứu lá hẹ hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho y học và sức khỏe cộng đồng.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu tiếp theo

Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc xác định các hợp chất hoạt tính trong lá hẹ và cơ chế tác động của chúng. Điều này sẽ giúp phát triển các sản phẩm dược liệu hiệu quả hơn.

5.2. Hướng đi mới trong phát triển sản phẩm từ lá hẹ

Việc phát triển các sản phẩm từ lá hẹ không chỉ giúp nâng cao giá trị kinh tế của loại cây này mà còn góp phần vào việc bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Cần có sự hợp tác giữa các nhà nghiên cứu, doanh nghiệp và cơ quan chức năng để thúc đẩy nghiên cứu và ứng dụng lá hẹ trong y học.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong xu thế phát triển của y dược học hiện đại, nhu cầu khai thác và ứng dụng các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao từ nguồn dược liệu bản địa ngày càng gia tăng. Việt Nam sở hữu hệ thực vật nhiệt đới gió mùa phong phú với mức độ đa dạng sinh học cao, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của các loài thực vật thuộc chi Hành (Allium L.), tiêu biểu là cây Hẹ (Allium tuberosum Rottler ex Spreng). Cây Hẹ từ lâu đã được sử dụng phổ biến trong đời sống hàng ngày vừa làm thực phẩm, vừa làm vị thuốc dân gian điều trị các chứng bệnh như ho ở trẻ em, hen suyễn, rối loạn tiêu hóa, giun kim, lỵ amip và nhiễm trùng ngoài da.

Mặc dù các nghiên cứu trước đây đã phân lập được nhiều nhóm hoạt chất từ lá và hạt Hẹ (như flavonoid, saponin steroid, alkaloid), các công trình nghiên cứu chuyên sâu về thành phần hóa học của tinh dầu lá Hẹ cũng như việc xác định định lượng hoạt tính kháng vi sinh vật tại Việt Nam vẫn còn hạn chế. Đa phần các thử nghiệm kháng khuẩn trước đó chỉ dừng lại ở phương pháp khuếch tán định tính mà chưa xác định được nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) một cách chuẩn xác. Nhằm cung cấp cơ sở khoa học thực nghiệm và định hướng khai thác giá trị dược liệu của cây Hẹ, đề tài "Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật của lá Hẹ" được thực hiện với 3 nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

1. Định tính thành phần hóa học của lá Hẹ.
2. Phân tích thành phần tinh dầu lá Hẹ bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) và sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC-MS).
3. Đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật của tinh dầu lá Hẹ.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Toàn cây và phần trên mặt đất (chủ yếu là lá) của cây Hẹ (Allium tuberosum Rottler ex Spreng).
• Phạm vi không gian: Mẫu dược liệu được thu hái tại quận Nam Từ Liêm, thành phố Hà Nội.
• Phạm vi thời gian: Thời điểm thu hái mẫu vào tháng 4 năm 2022; các thực nghiệm chiết xuất, phân tích hóa lý và thử hoạt tính sinh học được hoàn thành trong năm 2022 tại Bộ môn Dược liệu và Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội, phối hợp cùng Viện Hóa sinh biển (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam).

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung phân loại và cơ sở lý thuyết

Cây Hẹ thuộc chi Hành (Allium L.), phân họ Hành (Allioideae), họ Thủy Tiên (Amaryllidaceae), bộ Măng tây (Asparagales), lớp Hành (Liliopsida), ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) theo hệ thống phân loại phát sinh chủng loài thực vật hạt kín APG IV (2016). Về mặt hóa thực vật, các loài thuộc chi Allium đặc trưng bởi các hợp chất chứa lưu huỳnh hữu cơ (organosulfur compounds) bay hơi như các thiosulfinat, mono-, di-, tri- và tetrasulfid, cùng các nhóm polyphenol (flavonoid) và saponin steroid. Về mặt sinh học, các hợp chất lưu huỳnh có tính kỵ nước cao, có khả năng xâm nhập qua màng phospholipid kép của vi sinh vật, làm thay đổi tính thấm màng, gây rò rỉ chất nội bào hoặc can thiệp vào các nhóm thiol (-SH) của protein và enzym thiết yếu, tạo nên hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Khóa luận áp dụng hệ thống phương pháp thực nghiệm dược học đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V (DĐVN V) và các tiêu chuẩn phân tích quốc tế:

• Giám định thực vật: Quan sát, mô tả chi tiết đặc điểm hình thái rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt; đối chiếu tài liệu phân loại thực vật học chuyên khảo và giám định chuyên gia; ép tiêu bản lưu trữ.
• Xác định hàm ẩm: Phương pháp sấy tĩnh ở 130°C bằng máy đo hàm ẩm Ohaus tự động.
• Chiết xuất tinh dầu: Phương pháp cất kéo hơi nước từ 5 kg dược liệu tươi bằng bộ dụng cụ chuyên dụng cho tinh dầu nặng hơn nước (tiêu chuẩn Dược điển Mỹ) trong thời gian 3 giờ liên tục.
• Định tính hóa thực vật sơ bộ: Thực hiện các phản ứng tạo màu và kết tủa ống nghiệm đặc trưng cho từng nhóm hợp chất: phản ứng Cyanidin, phản ứng với NaOH 10%, FeCl3 5%, thuốc thử Diazo (flavonoid); phản ứng tạo bọt (saponin); phản ứng với chì acetat 10%, gelatin 1%, FeCl3 5% (tanin); phản ứng huỳnh quang, diazo hóa, mở/đóng vòng lacton (coumarin); phản ứng Baljet, Legal, Keller-Kiliani, Liebermann-Burchard (glycosid tim); phản ứng với thuốc thử Mayer, Bouchardat, Dragendorff (alkaloid); thuốc thử Fehling A và B (đường khử); Na2CO3 (acid hữu cơ); Ninhydrin 3% (acid amin).
• Sắc ký lớp mỏng (SKLM): Sử dụng bản mỏng tráng sẵn Silicagel 60 F254 Merck (hoạt hóa 110°C trong 1 giờ), thiết bị phun mẫu tự động Limonat 5, bình triển khai sắc ký đôi CAMAG và hệ thống chụp ảnh sắc ký TLC Visualizer. Dung môi khảo sát cho dịch chiết cắn toàn phần gồm 4 hệ dung môi (chọn hệ Toluen – Ethyl acetat – Acid formic tỉ lệ 5:4:1); dung môi cho tinh dầu gồm 3 hệ (chọn hệ n-hexan – Ethyl acetat tỉ lệ 9:1). Thuốc thử hiện màu: Vanilin 1% / H2SO4 5% trong ethanol, sấy 110°C, quan sát dưới ánh sáng thường và UV 254 nm, 366 nm.
• Sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC-MS): Thiết bị GC Agilent 7890A kết nối detector MS Agilent 5975C, cột sắc ký HP-5MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm), khí mang Heli (tốc độ 1 mL/phút), thể tích tiêm 1 µL mẫu tinh dầu pha loãng trong toluen (1:30), tỉ lệ chia dòng 50:1. Chương trình nhiệt độ: 45°C (giữ 3 phút), tăng 5°C/phút lên 180°C (giữ 4 phút), tăng 10°C/phút lên 250°C (giữ 2 phút), tổng thời gian 43 phút. Định danh cấu tử bằng cách so sánh phổ khối với thư viện chuẩn NIST và tính toán chỉ số lưu giữ tuyến tính (Retention Index - RI) đối chiếu với dãy đồng đẳng n-alkan chuẩn C9–C20.
• Đánh giá tác dụng kháng vi sinh vật: Phương pháp pha loãng đa nồng độ (microdilution theo Hadacek F.) trên phiến nhựa 96 giếng với môi trường LB để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC, µg/mL). Dải nồng độ tinh dầu thử nghiệm: từ 2 đến 512 µg/mL (pha loãng bậc 2 trong DMSO). Nồng độ vi sinh vật ban đầu: $2 \times 10^5 \text{ CFU/mL}$, ủ ở 37°C trong 24 giờ. Đo độ đục quang học bằng máy quang phổ Biotek kết hợp phần mềm Raw data.

Nguồn vật liệu và chủng vi sinh vật kiểm định

• Hóa chất: Đạt tiêu chuẩn phân tích DĐVN V.
• Chủng vi sinh vật thử nghiệm: 4 chủng vi khuẩn Gram (+) (Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Enterococcus faecalis ATCC 299212, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus cereus ATCC 14579); 2 chủng vi khuẩn Gram (-) (Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella enterica ATCC 13076); 1 chủng nấm men (Candida albicans ATCC 10231).
• Thuốc đối chứng: Kháng sinh Streptomycin (đối chứng vi khuẩn) và Cycloheximid (đối chứng nấm).

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở dữ liệu thực vật học, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Hẹ (Allium tuberosum):

• Thực vật và phân bố: Mô tả hình thái học cơ bản (thân hành hình nón - trụ mọc túm, lá dẹt dài 10–27 cm, hoa trắng dạng tán giả nở vào tháng 6–8, quả nang nở tháng 8–10). Nguồn gốc Trung và Bắc Á, hiện phân bố rộng rãi tại Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản, Việt Nam.
• Hóa thực vật: Tổng hợp 14 hợp chất flavonoid phân lập từ lá Hẹ (các dẫn xuất glycosid của kaempferol và quercetin liên kết acid ferulic hoặc acid p-coumaric); các saponin steroid (13 tuberosid A–M, 8 tuberosid N–U từ hạt và tuberosin A–C từ rễ); 4 hợp chất nucleosid/nucleotid từ cắn EtOH 70% (uracil 0,756 mg/g, thymin 0,543 mg/g, thymidin 0,435 mg/g, adenosin 0,480 mg/g); các acid amin tự do chính (alanin 9,9%, acid glutamic 8,67%, valin 7,44%, acid aspartic 6,31%).
• Dược lý thực nghiệm: Tổng quan các nghiên cứu chứng minh tác dụng kháng khuẩn của odorin và nước ép Hẹ; tác dụng bảo vệ gan trên chuột cống trắng Wistar tổn thương do doxorubicin (liều 1000 mg/kg làm giảm SGOT, SGPT, MDA); tác dụng hạ đường huyết trên chuột gây tiểu đường bằng alloxan (liều 100–400 mg/kg); tác dụng chống ung thư vú MCF-7, ung thư ruột kết HT-29 và ung thư tuyến tiền liệt Rc-58T/h/#4 thông qua kích hoạt caspase-3, -8, -9; tác dụng diệt tuyến trùng Meloidogyne incognita J2 và ấu trùng Plutella xylostella; tác dụng chống đông máu qua ức chế thụ thể GP-IIb/IIIa.
• Y học cổ truyền: Trình bày tính vị, quy kinh, công năng kiện vị, hành khí, tán ứ, chỉ hãn của lá và bổ thận tráng dương của hạt Hẹ, kèm theo 6 bài thuốc kinh nghiệm điều trị ho trẻ em, hen suyễn, ợ chua, giun kim, di mộng tinh.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả tường minh quy trình thu mẫu thực địa tại Nam Từ Liêm (Hà Nội), quy trình xử lý nguyên liệu, danh mục trang thiết bị phân tích hiện đại (máy đo hàm ẩm Ohaus, cân phân tích AND GR-200, hệ thống HPTLC CAMAG, hệ thống GC-MS Agilent 7890A/5975C, máy đọc Biotek). Chương này chuẩn hóa toàn bộ điều kiện vận hành thiết bị, quy trình chuẩn bị dịch chiết cắn toàn phần, quy trình cất tinh dầu nặng hơn nước, các hệ dung môi sắc ký tối ưu và phương pháp vi pha loãng xác định MIC trên 7 chủng vi sinh vật chuẩn.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được:

• Giám định mẫu: Xác định mẫu nghiên cứu là Allium tuberosum Rottler ex Spreng; tiêu bản thực vật được lưu trữ tại Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội dưới mã số HNIP/18678/22.
• Chỉ số lý - hóa: Hàm ẩm trung bình của phần trên mặt đất là 73,31% (qua 3 lần đo: 73,51%, 73,05%, 73,36%). Hàm lượng tinh dầu trung bình đạt 0,046% tính theo dược liệu khô tuyệt đối (lần 1: 0,048%, lần 2: 0,044%). Tinh dầu có màu vàng đậm, mùi hăng nồng đặc trưng, chất lỏng sánh, nặng hơn nước.
• Định tính hóa thực vật:

STT	Nhóm hợp chất	Phản ứng / Thuốc thử sử dụng	Kết quả	Kết luận
1	Flavonoid	NaOH 10%, FeCl3 5%, Diazo, Cyanidin	Dương tính (+ đến +++)	Có mặt
2	Saponin	Quan sát hiện tượng tạo bọt	Dương tính (+)	Có mặt
3	Tanin	Chì acetat 10%, Gelatin 1%, FeCl3 5%	Dương tính (+ đến +++)	Có mặt
4	Coumarin	Huỳnh quang, Diazo hóa, Mở/đóng vòng lacton	Âm tính (-)	Không phát hiện
5	Glycosid tim	Liebermann-Burchard, Baljet, Legal, Keller-Kiliani	Âm tính (-)	Không phát hiện
6	Alkaloid	Mayer, Bouchardat, Dragendorff	Âm tính (-)	Không phát hiện
7	Đường khử	Thuốc thử Fehling A và Fehling B	Dương tính rất rõ (+++)	Có mặt
8	Acid hữu cơ	Phản ứng sủi bọt với tinh thể Na2CO3	Dương tính (+)	Có mặt
9	Acid amin	Thuốc thử Ninhydrin 3%	Dương tính rất rõ (+++)	Có mặt

• Sắc ký lớp mỏng (SKLM):
  • Dịch chiết cắn toàn phần (hệ Toluen – Ethyl acetat – Acid formic 5:4:1): Quan sát thấy ít nhất 10 vết sắc ký với dải $R_f \times 100$ từ 5,9 đến 84,7 sau khi hiện màu bằng vanilin/H2SO4.
  • Tinh dầu lá Hẹ (hệ n-hexan – Ethyl acetat 9:1): Tách được 5 vết sắc ký chính ($R_f$: 0,15; 0,20; 0,35; 0,42; 0,53). Trong đó, vết số 3 có màu vàng cam ($R_f = 0,35$) chiếm diện tích lớn nhất (29,25%).
• Thành phần hóa học tinh dầu qua GC-MS: Định danh được 24 cấu tử, chiếm 83,76% tổng hàm lượng tinh dầu. Hợp chất chứa lưu huỳnh chiếm ưu thế tuyệt đối với 68,75% (trisulfid chiếm 36,73%, disulfid chiếm 24,33%). Cấu tử chiếm tỷ lệ cao nhất là Dimethyl trisulfid (29,56%), tiếp theo là 1,4-Dithian (16,64%), Methyl-2-propenyl trisulfid (7,17%), 2-(methoxymethyl)-3-propylthiiran (5,78%), (E)-2-Hexenal (5,74%), và cấu tử $C_6H_{10}S_2$ (4,79%).
• Hoạt tính kháng vi sinh vật:

Nhóm vi sinh vật	Chủng vi sinh vật thử nghiệm	MIC Tinh dầu Hẹ ($\mu\text{g/mL}$)	MIC Streptomycin ($\mu\text{g/mL}$)	MIC Cycloheximid ($\mu\text{g/mL}$)
Vi khuẩn Gram (-)	Escherichia coli ATCC 25922	256	32	-
	Salmonella enterica ATCC 13076	128	128	-
Vi khuẩn Gram (+)	Staphylococcus epidermidis ATCC 12228	128	128	-
	Enterococcus faecalis ATCC 299212	128	128	-
	Staphylococcus aureus ATCC 25923	128	256	-
	Bacillus cereus ATCC 14579	128	128	-
Nấm men	Candida albicans ATCC 10231	256	-	32

Chương 4: Bàn luận

Chương 4 tập trung giải luận và so sánh các kết quả thu được với các công bố khoa học trong và ngoài nước:

• Về định tính hóa học: Khóa luận chỉ ra sự sai khác với công bố của PT Nhut và cộng sự (2020) khi nhóm nghiên cứu trước ghi nhận kết quả dương tính với alkaloid. Tác giả giải thích nguyên nhân xuất phát từ sự khác biệt về địa điểm, mùa vụ thu hái, phương pháp xử lý mẫu hoặc dung môi chiết. Đối với coumarin, phản ứng huỳnh quang đơn lẻ không đủ tính đặc hiệu mà cần kết hợp phản ứng mở/đóng vòng lacton và diazo hóa.
• Về phân tích tinh dầu: Phân tích mối tương quan giữa vết chính màu vàng cam trên SKLM ($R_f = 0,35$, diện tích 29,25%) với pic cấu tử Dimethyl trisulfid (29,56%) trên GC-MS. Đối với cấu tử $C_6H_{10}S_2$ (RI = 1098), tra cứu NIST cho thấy độ tương đồng 90,1% với (E)-1-allyl-2-(pro-1-en-1-yl)disulfan (RI = 1103) nhưng cần thêm dữ liệu để khẳng định cấu trúc chính xác.
• So sánh quốc tế và trong nước: Thành phần chính của tinh dầu lá Hẹ đồng nhất với các nghiên cứu của Pino và CS (2001 - Cuba), Mnayer và CS (2014 - Pháp), Shi và CS (2015 - Trung Quốc), Lê Thị Hóa (2014 - Huế) và Huỳnh Thị Ngọc Ni (2019 - Phú Yên) ở chỗ nhóm disulfid và trisulfid luôn chiếm tỷ lệ chủ đạo. Sự chênh lệch tỷ lệ cấu tử cụ thể được quy định bởi điều kiện khí hậu thổ nhưỡng, thiết bị cất (Clevenger, Likens-Nickerson hay nồi áp suất) và chương trình sắc ký.
• Về hoạt tính kháng vi sinh vật: Cơ chế kháng khuẩn được làm rõ thông qua tính kỵ nước của khung polysulfid làm rối loạn màng tế bào vi khuẩn và phản ứng tạo cầu disulfid với nhóm thiol protein nội bào. Điểm nổi bật là tinh dầu thể hiện hoạt tính ức chế S. aureus mạnh gấp đôi kháng sinh đối chứng Streptomycin ($\text{MIC} = 128 \text{ }\mu\text{g/mL}$ so với $256 \text{ }\mu\text{g/mL}$).

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả định lượng cốt lõi

Khóa luận đã xác lập bộ dữ liệu thực nghiệm hoàn chỉnh về mẫu Hẹ (Allium tuberosum) thu hái tại Hà Nội:

1. Xác định hàm ẩm dược liệu đạt 73,31%; hàm lượng tinh dầu đạt 0,046% (so với dược liệu khô tuyệt đối). Tinh dầu có tỷ trọng nặng hơn nước.
2. Xác định dịch chiết lá Hẹ chứa flavonoid, saponin, tanin, đường khử, acid hữu cơ và acid amin; không chứa alkaloid, coumarin và glycosid tim.
3. Nhận diện 24 cấu tử trong tinh dầu bằng GC-MS, chiếm 83,76% tổng hàm lượng, trong đó các hợp chất sulfid hữu cơ chiếm 68,75% (trisulfid: 36,73%; disulfid: 24,33%). Dimethyl trisulfid là cấu tử chiếm tỷ lệ cao nhất (29,56%).
4. Đo lường chính xác nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của tinh dầu lá Hẹ: kháng tốt trên vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) với MIC đạt 128 µg/mL đối với S. aureus, S. epidermidis, E. faecalis, B. cereus, S. enterica; MIC đạt 256 µg/mL đối với E. coli và nấm men C. albicans.

Đóng góp khoa học so với các nghiên cứu trước

• Khắc phục hạn chế của các nghiên cứu kháng khuẩn thực vật trước đây tại Việt Nam (thường chỉ đo đường kính vòng kháng khuẩn định tính qua giếng thạch), khóa luận đã áp dụng phương pháp vi pha loãng đa nồng độ chuẩn hóa, cung cấp giá trị MIC định lượng cụ thể cho tinh dầu lá Hẹ.
• Cung cấp bằng chứng thực nghiệm giải thích cơ sở khoa học của các bài thuốc dân gian dùng lá Hẹ điều trị nhiễm khuẩn hô hấp, rối loạn tiêu hóa và nhiễm trùng vết thương, đồng thời mở ra tiềm năng nghiên cứu ứng dụng tinh dầu Hẹ làm phụ gia bảo quản thực phẩm tự nhiên hoặc kết hợp hiệp đồng với kháng sinh.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế được ghi nhận

• Cấu tử có công thức $C_6H_{10}S_2$ (chiếm 4,79%, RI = 1098) mới chỉ xác định được độ tương đồng phổ khối 90,1% với (E)-1-allyl-2-(pro-1-en-1-yl)disulfan mà chưa khẳng định được cấu trúc tuyệt đối do hạn chế về chuẩn đối chiếu.
• Hệ dung môi triển khai sắc ký lớp mỏng cắn chiết toàn phần (Toluen – Ethyl acetat – Acid formic 5:4:1) và tinh dầu (n-hexan – Ethyl acetat 9:1) chưa đạt độ phân tách tuyệt đối giữa các vết sắc ký lân cận.
• Mẫu thực vật mới chỉ được khảo sát tại một địa điểm duy nhất (Nam Từ Liêm, Hà Nội) vào một thời điểm trong năm (tháng 4/2022).

Hướng nghiên cứu tiếp theo (Kiến nghị từ tác giả)

1. Mở rộng nghiên cứu biến thiên hàm lượng và thành phần cấu tử tinh dầu Hẹ theo các mùa vụ và vùng sinh thái địa lý khác nhau tại Việt Nam.
2. Tiếp tục tối ưu hóa hệ dung môi sắc ký và sử dụng thuốc thử hiện màu đặc hiệu nhằm nâng cao khả năng phân tách trên SKLM.
3. Đánh giá mối tương quan giữa các nhóm hoạt chất trong dịch chiết toàn phần (như polyphenol, flavonoid) với hoạt tính kháng sinh học của lá Hẹ.
4. Triển khai các thử nghiệm đánh giá tác dụng hiệp đồng (synergistic effect) giữa tinh dầu lá Hẹ và các kháng sinh thương mại trên các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng thụ hưởng: Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên sau đại học và nghiên cứu viên các chuyên ngành Dược học, Hóa thực vật, Dược liệu học, Công nghệ sinh học và Kiểm nghiệm thuốc.
• Nội dung có giá trị ứng dụng cao:
  • Quy trình chiết xuất tinh dầu chứa hợp chất lưu huỳnh nặng hơn nước và quy trình vận hành GC-MS phân tích chỉ số lưu giữ RI dựa trên dãy đồng đẳng n-alkan C9–C20.
  • Phương pháp chuẩn độ vi pha loãng 96 giếng xác định MIC vi sinh vật bằng máy quang phổ và phần mềm Raw data.
  • Tổng quan có hệ thống về cấu trúc các saponin steroid (tuberosin, tuberosid) và flavonoid đặc hữu của chi Allium.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Mẫu thực vật sử dụng trong khóa luận được thu hái ở đâu, định danh như thế nào và lưu giữ tại đâu?

Mẫu nghiên cứu là toàn cây Hẹ thu hái vào tháng 4 năm 2022 tại quận Nam Từ Liêm, thành phố Hà Nội. Mẫu được mô tả hình thái và giám định khoa học bởi TS. Hoàng Quỳnh Hoa (Chủ nhiệm Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội), xác định tên khoa học chính xác là Allium tuberosum Rottler ex Spreng (họ Amaryllidaceae). Tiêu bản thực vật được ép và lưu trữ chính thức tại Phòng tiêu bản Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội dưới mã số HNIP/18678/22.

2. Hàm lượng và tính chất cảm quan của tinh dầu lá Hẹ thu được trong nghiên cứu này như thế nào?

Từ 5 kg lá Hẹ tươi cất kéo hơi nước liên tục trong 3 giờ bằng bộ dụng cụ cho tinh dầu nặng hơn nước, hàm lượng tinh dầu trung bình thu được là 0,046% tính theo khối lượng dược liệu khô tuyệt đối (độ ẩm nguyên liệu tươi là 73,31%). Tinh dầu thu được ở trạng thái lỏng sánh, màu vàng đậm, mùi hăng nồng đặc trưng và có tỷ trọng nặng hơn nước.

3. Thành phần hóa học nào chiếm hàm lượng cao nhất trong tinh dầu lá Hẹ qua phân tích GC-MS?

Qua phân tích GC-MS trên cột HP-5MS, nhóm hợp chất trisulfid chiếm tỷ lệ cao nhất (36,73%), trong đó cấu tử Dimethyl trisulfid là đơn chất chiếm hàm lượng lớn nhất với 29,56% tổng diện tích pic sắc ký (thời gian lưu 7,988 phút; RI tính toán 965), tiếp theo là 1,4-Dithian (16,64%) và Methyl-2-propenyl trisulfid (7,17%). Tổng các hợp chất chứa lưu huỳnh chiếm tới 68,75% tinh dầu.

4. Khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu lá Hẹ trên các chủng kiểm định thể hiện ra sao?

Tinh dầu lá Hẹ có phổ ức chế rộng trên 7 chủng vi sinh vật chuẩn ATCC với giá trị MIC dao động từ 128 đến 256 µg/mL. Hoạt tính mạnh nhất ghi nhận trên chủng vi khuẩn Gram (+) Staphylococcus aureus ATCC 25923 với giá trị $\text{MIC} = 128 \text{ }\mu\text{g/mL}$, cho hiệu quả ức chế mạnh gấp đôi kháng sinh đối chứng Streptomycin ($\text{MIC} = 256 \text{ }\mu\text{g/mL}$). Tinh dầu đạt MIC = 128 µg/mL tương đương Streptomycin trên các chủng S. enterica, S. epidermidis, E. faecalis, B. cereus, nhưng tác dụng yếu hơn trên E. coli và nấm men C. albicans ($\text{MIC} = 256 \text{ }\mu\text{g/mL}$).

5. Vì sao có sự khác biệt về kết quả định tính alkaloid giữa khóa luận này và nghiên cứu của PT Nhut (2020)?

Trong khóa luận này, phản ứng định tính alkaloid với 3 thuốc thử Mayer, Bouchardat, Dragendorff đều cho kết quả âm tính hoàn toàn, trong khi nghiên cứu của PT Nhut và cộng sự (2020) báo cáo dương tính. Sự sai khác này được giải thích do sự biến thiên hóa thực vật phụ thuộc vào nguồn gốc thổ nhưỡng, vị trí địa lý, thời điểm thu hái dược liệu, hoặc sự khác biệt trong quy trình chiết xuất và thao tác thực nghiệm.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ của tác giả Nguyễn Thị Thùy Dung đã khảo sát có hệ thống đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hóa thực vật và hoạt tính sinh học của lá Hẹ (Allium tuberosum Rottler ex Spreng) thu hái tại Hà Nội. Nghiên cứu đã xác định hàm lượng tinh dầu đạt 0,046%, định danh 24 cấu tử bằng GC-MS với ưu thế vượt trội của các hợp chất lưu huỳnh hữu cơ (68,75%), đứng đầu là Dimethyl trisulfid (29,56%). Hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu được lượng hóa chính xác với giá trị MIC đạt 128–256 µg/mL trên 7 chủng vi sinh vật chuẩn, đặc biệt vượt trội hơn Streptomycin đối với chủng Staphylococcus aureus. Các dữ liệu thực nghiệm này cung cấp cơ sở khoa học vững chắc cho việc ứng dụng cây Hẹ trong điều trị nhiễm khuẩn y học cổ truyền và định hướng phát triển dược liệu trong tương lai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1. Tên khoa học và vị trí phân loại Hẹ có tên khoa học là Allium tuberosum Rottler ex Spreng [3], [22] và nhiều tên đồng nghĩa như Allium odorum L. Hẹ thuộc chi Hành (Allium L. Theo hệ thống phân loại của nhóm phát sinh chủng loài thực vật hạt kín APG IV (2016), vị trí phân loại của chi Allium L.

như sau [10], [21], [22]: Giới: Thực vật (Plantae) Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp: Hành (Liliopsida) Bộ: Măng tây (Asparagales) Họ: Thủy Tiên (Amaryllidaceae) Phân họ: Hành (Allioideae) Chi: Hành (Allium L.) Loài: Allium tuberosum R. Đặc điểm thực vật và vị trí phân bố 1. Đặc điểm thực vật Hẹ là cây cỏ nhỏ, cao 20 – 45cm, toàn cây có mùi đặc biệt. Thân hành, nhỏ gầy, thường hợp thành túm, hình nón – trụ, có áo mỏng màu nâu vàng, bị xé thành sợi [4].

Thân rễ mọc ngang, chếch [4]. Lá hẹp, dài, dày, thường là 4 – 5 lá, dài 10 – 27 cm rộng 1,5 – 9 mm, bẹ lá dài và mỏng, đầu nhọn, mọc ốp vào nhau thành hai dãy [1], [7]. Cây có cụm củ hình trụ ở thân rễ nằm ngang, màu vàng nâu [30]. Cụm hoa tụ thành hình xim nhưng co ngắn lại thành tán giả, mọc trên một cán dài hơn lá, dài 15 – 30 cm, hình trụ hoặc 3 cạnh, có vạch dọc.

Hoa nhiều có cuống dài, bao hoa màu trắng gồm 6 phiến thuôn, mũi mác, xếp thành 2 vòng, nhị có gốc đính vào các mảnh của bao hoa, cuống hoa dài chừng 10 – 15 mm, đường kính 4 mm [1], [7]. Lá bắc tổng bao dạng mo, mỏng, xẻ 1 bên hoặc xẻ 2 – 3 mảnh, ngắn hơn cụm hoa. Nhị 6, gốc chỉ nhị hợp và dính với bao hoa, dài bằng ½ bao hoa; bao phấn đính lưng, 2 ô mở bằng khe dọc. Bầu thượng, hình chùy ngược, phía ngoài có những nốt nhỏ, 3 cạnh tròn, 3 ô, đính noãn trung trụ, mỗi ô nhiều noãn, vòi nhụy rất ngắn, đầu nhụy không rõ [4].

Quả nang, hình trái xoan ngược hoặc hình cầu hơi dẹt, chia 3 mảnh. Hạt nhỏ, màu đen [1], [4], [3]. Cây mọc bằng hạt hoặc bằng cách phân thành từng khóm [22]. Cây phát triển tốt trong điều kiện đất ẩm, râm mát, 2 đất hữu cơ sẽ cho năng suất tốt hơn [1], [30].

Vào mùa đông, lá tiêu biến dần, chỉ còn lại rễ và thân rễ nhưng sẽ mọc lại và phát triển bình thường vào mùa xuân [30]. Mùa hoa thường vào tháng 6 – 8. Mùa quả thường vào tháng 8 – 10 [7]. Vị trí phân bố Chi Allium L.

thuộc họ Amaryllidaceae với hơn 850 loài khác nhau [21] và được tìm thấy trên khắp Bắc Mỹ, Bắc Phi, Châu Âu, Châu Á [33]. Hẹ có nguồn gốc hoang dại ở vùng Trung và Bắc Á. Cây được người Trung Quốc đưa vào trồng khoảng 200 năm trước Công nguyên. Sau đó là các nước Triều Tiên, Nhật Bản, Nepal, Ấn Độ, Thái Lan, Philippin, Indonesia, Hoa Kỳ.

Hiện nay, Trung Quốc là nước trồng hẹ nhiều nhất thế giới. Ở Việt Nam, Hẹ cũng được trồng từ rất lâu và được trồng khắp nơi để làm thực phẩm, gia vị hoặc để làm thuốc [1]. Thành phần hóa học Trong lá Hẹ có chứa flavonoid, saponin, tanin, đường khử, các hợp chất sulfid, alkaloid [29]. Trong 100g Hẹ có chứa 93g nước, 2,2g protein, 0,1g chất béo, 2,8g carbohydrat, 0,9g chất xơ, 4mg caroten và 25mg vitamin C.

Hẹ có 4 loại đường là fructose, glucose, galactose và saccharose [1]. Trong thành phần của Hẹ còn chứa odorin có tác dụng kháng khuẩn đối với một số vi khuẩn như Staphylococcus aureus và Bacillus coli [7]. Tinh dầu Các thành phần được tìm thấy trong tinh dầu lá Hẹ chia thành các nhóm: monosulfid, disulfid, trisulfid, tetrasulfid, pentasulfid, hợp chất chứa oxy và terpen.