Nghiên Cứu Tác Dụng Kháng Ung Thư Đại Tràng Của Vaccine Sởi Và Quai Bị

Ung thư đại trực tràng (CRC) là một thách thức lớn đối với sức khỏe cộng đồng. 167 trang · Học viện Quân y · 2019.

• Tác giả: Lê Duy Cương
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Lĩnh Toàn
• Trường học: Học viện Quân y
• Chuyên ngành: Khoa học y sinh
• Đề tài: Nghiên Cứu Tác Dụng Kháng Ung Thư Đại Tràng Của Vaccine Sởi Và Quai Bị
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu chung
• 1.2. Ung thư đại trực tràng
• 1.3. Tình hình ung thư đại trực tràng
• 1.4. Nguyên nhân ung thư đại trực tràng
• 1.5. Cơ chế bệnh sinh của ung thư đại trực tràng
• 1.6. Liệu pháp virus vaccine sởi và quai bị điều trị ung thư đại trực tràng người
• 1.7. Sinh học virus sởi và quai bị
• 1.8. Virus vaccine sởi và quai bị lây nhiễm đặc hiệu tế bào ung thư đại trực tràng
• 1.9. Các cơ chế virus vaccine sởi và quai bị ly giải tế bào ung thư đại trực tràng
• 1.10. Các nghiên cứu virus vaccine sởi và quai bị điều trị ung thư trên lâm sàng
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Chất liệu nghiên cứu
• 2.3. Trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Phương pháp nuôi cấy và tăng sinh các dòng tế bào
• 2.4.2. Phương pháp tăng sinh và chuẩn độ virus vaccine sởi và quai bị từ nguồn virus vaccine
• 2.4.3. Phương pháp đánh giá virus vaccine sởi và quai bị ly giải tế bào bằng thử nghiệm 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5 diphenyl tetrazolium bromide
• 2.4.4. Chuẩn bị mẫu tế bào HT-29 nhiễm virus vaccine sởi và quai bị đánh giá tỉ lệ tế bào chết theo chương trình và tế bào hoại tử bằng phương pháp dòng chảy
• 2.4.5. Đánh giá tỉ lệ tế bào ung thư đại tràng người HT-29 chết theo chương trình và hoại tử bằng phương pháp phân tích tế bào dòng chảy
• 2.4.6. Phương pháp nuôi chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude)
• 2.4.7. Phương pháp tạo khối u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 trên dùi chuột thiếu hụt miễn dịch và tính kích thước khối u
• 2.4.8. Phương pháp điều trị chuột nude bằng virus vaccine sởi và quai bị
• 2.4.9. Phương pháp đánh giá đáp ứng điều trị bằng virus vaccine sởi và quai bị trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối u tế bào HT-29
• 2.4.10. Phương pháp phẫu tích lấy mô u và lách chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối u tế bào HT-29 sau điều trị bằng virus vaccine sởi và quai bị
• 2.4.11. Đánh giá tỉ lệ các tế bào miễn dịch ở lách chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối u tế bào HT-29 sau điều trị virus vaccine sởi và quai bị bằng phương pháp phân tích tế bào dòng chảy
• 2.4.12. Phương pháp phân tích siêu cấu trúc tế bào u HT-29 sau điều trị bằng virus vaccine sởi và quai bị
• 2.4.13. Phương pháp phân tích kết quả
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Tăng sinh dòng tế bào HT-29, Vero, virus vaccine sởi và quai bị
• 3.2. Tăng sinh các dòng tế bào HT-29 và Vero
• 3.3. Tăng sinh virus vaccine sởi và quai bị từ nguồn virus vaccine
• 3.4. Chuẩn độ virus vaccine sởi và quai bị theo phương pháp TCID50
• 3.5. Virus vaccine sởi và quai bị ly giải trực tiếp dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 in vitro
• 3.6. Tế bào HT-29 nhiễm virus vaccine sởi và quai bị tạo hợp bào in vitro
• 3.7. Kết quả đánh giá hiệu quả ly giải tế bào ung thư đại tràng người HT-29 của virus vaccine sởi và quai bị bằng nghiệm pháp 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5 diphenyl tetrazolium bromide
• 3.8. Đánh giá tỉ lệ tế bào ung thư đại tràng người HT-29 chết theo chương trình và hoại tử sau nhiễm virus vaccine sởi và quai bị in vitro
• 3.9. Virus vaccine sởi và quai bị kháng u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 cấy ghép trên chuột thiếu hụt miễn dịch
• 3.10. Kết quả ghép u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29
• 3.11. Kết quả điều trị chuột nude mang khối u tế bào ung thư đại tràng người HT-29 bằng virus vaccine sởi và quai bị
• 3.12. Tỉ lệ tế bào miễn dịch trong lách chuột thiếu hụt miễn dịch ở các nhóm nghiên cứu sau điều trị bằng virus vaccine sởi và quai bị
• 3.13. Hình ảnh siêu cấu trúc tế bào u đại tràng người HT-29 sau điều trị bằng virus vaccine sởi và quai bị
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Tăng sinh các dòng tế bào Vero và tế bào ung thư đại tràng người HT-29 in vitro
• 4.2. Tăng sinh dòng tế bào Vero
• 4.3. Nuôi cấy, tăng sinh dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29
• 4.4. Tăng sinh virus vaccine sởi, quai bị và Chuẩn độ TCID50
• 4.5. Virus vaccine sởi và quai bị ly giải tế bào ung thư đại tràng người HT-29 in vitro
• 4.6. Virus vaccine sởi và quai bị ly giải trực tiếp tế bào ung thư đại tràng người HT-29 bằng cách tạo hợp bào in vitro
• 4.7. Đánh giá khả năng ly giải tế bào HT-29 của virus vaccine sởi và quai bị bằng nghiệm pháp 3 - (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) - 2,5 diphenyl tetrazolium bromide
• 4.8. Virus vaccine sởi và quai bị ly giải tế bào HT-29 thông qua kích hoạt con đường tế bào chết theo chương trình in vitro
• 4.9. Virus vaccine sởi và quai bị kháng u tế bào ung thư đại tràng người HT-29 trên chuột thiếu hụt miễn dịch
• 4.10. Đánh giá độc tính của virus vaccine sởi và quai bị trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối u tế bào ung thư đại tràng người HT-29
• 4.11. Virus vaccine sởi và quai bị kháng u tế bào ung thư đại tràng người HT-29 trên chuột thiếu hụt miễn dịch
• 4.12. Virus vaccine sởi và quai bị kích thích miễn dịch đặc hiệu kháng u tế bào ung thư đại tràng người HT-29 trên chuột thiếu hụt miễn dịch
• 4.13. Kết quả siêu cấu trúc tế bào u đại tràng người HT-29 ghép trên chuột thiếu hụt miễn dịch sau điều trị bằng virus vaccine sởi và quai bị
• 4.14. Phối hợp virus vaccine sởi và quai bị có hiệu quả ly giải trực tiếp và kích hoạt con đường chết tế bào apoptosis in vitro ở dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29
• 4.15. Phối hợp virus vaccine sởi và quai bị có hiệu quả kháng u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 cấy ghép trên chuột nude
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI, LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới Thiệu Nghiên Cứu Tác Dụng Kháng Ung Thư Đại Tràng

Ung thư đại trực tràng (CRC) là một thách thức lớn đối với sức khỏe cộng đồng. Số lượng ca mắc và tử vong do CRC vẫn tiếp tục gia tăng. Các phương pháp điều trị mới như liệu pháp miễn dịch, gen trị liệu, và điều trị đích đã được phát triển, nhưng hiệu quả còn hạn chế. Nghiên cứu này tập trung vào tiềm năng của vaccine sởi và vaccine quai bị trong việc kháng ung thư đại tràng. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng virus vaccine có thể lây nhiễm và ly giải chọn lọc các tế bào ung thư, đồng thời kích thích miễn dịch ung thư. Nghiên cứu này khám phá cơ chế và hiệu quả của việc sử dụng phối hợp virus vaccine sởi và quai bị trong điều trị ung thư đại tràng trên mô hình thực nghiệm. Dữ liệu cho thấy các chủng MeV và MuV rất khó gây bệnh trở lại vì hầu hết mọi người đều đã được chủng ngừa. Bên cạnh đó, hầu hết các nghiên cứu lâm sàng và tiền lâm sàng cũng đã chứng minh sử dụng MeV, MuV điều trị ung thư là an toàn và rất ít tác dụng phụ.

1.1. Tổng Quan Về Ung Thư Đại Tràng Và Các Phương Pháp Điều Trị Hiện Tại

Ung thư đại trực tràng là bệnh lý ác tính phát sinh từ đại tràng hoặc trực tràng, do sự tăng sinh bất thường của các tế bào. Các phương pháp điều trị hiện nay bao gồm phẫu thuật, hóa trị, xạ trị, và các liệu pháp nhắm mục tiêu. Tuy nhiên, tỷ lệ sống sót sau 5 năm của bệnh nhân CRC di căn vẫn còn thấp, cho thấy sự cần thiết phải phát triển các phương pháp điều trị mới. Liệu pháp sử dụng các chủng virus vaccine sởi (MeV) và virus vaccine quai bị (MuV) sống, giảm độc lực điều trị ung thư người đã được chứng minh có hiệu quả.

1.2. Tiềm Năng Của Vaccine Sởi Và Quai Bị Trong Liệu Pháp Miễn Dịch Ung Thư

Vaccine sởi và vaccine quai bị, vốn được sử dụng rộng rãi để phòng ngừa bệnh truyền nhiễm, gần đây đã được nghiên cứu về khả năng kháng ung thư. Cơ chế hoạt động tiềm năng bao gồm khả năng ly giải tế bào ung thư và kích thích hệ miễn dịch của cơ thể chống lại khối u. Các thử nghiệm lâm sàng ban đầu đã cho thấy kết quả hứa hẹn. Bên cạch đó, hầu hết các nghiên cứu lâm sàng và tiền lâm sàng cũng đã chứng minh sử dụng MeV, MuV điều trị ung thư là an toàn và rất ít tác dụng phụ.

II. Thách Thức Trong Điều Trị Ung Thư Đại Tràng Hiện Nay

Mặc dù có nhiều tiến bộ trong điều trị ung thư đại tràng, vẫn còn những thách thức đáng kể. Tình trạng kháng thuốc, tác dụng phụ của các phương pháp điều trị hiện tại, và sự tái phát bệnh là những vấn đề nan giải. Liệu pháp miễn dịch ung thư hứa hẹn mang lại kết quả tốt hơn, nhưng không phải bệnh nhân nào cũng đáp ứng với liệu pháp này. Các nghiên cứu sử dụng virus ly giải tế bào u (OV) điều trị ung thư là một phương thức biến sự sao chép của virus thành vũ khí tiêu diệt các tế bào ung thư và hầu như không ảnh hưởng đến các tế bào lành. Cần có những nghiên cứu sâu hơn để tối ưu hóa hiệu quả và giảm thiểu tác dụng phụ của các phương pháp điều trị mới, bao gồm cả việc sử dụng vaccine sởi và quai bị.

2.1. Kháng Thuốc Và Tái Phát Các Rào Cản Trong Điều Trị CRC

Sự phát triển kháng thuốc là một vấn đề lớn trong điều trị CRC, khiến cho các loại thuốc hóa trị trở nên kém hiệu quả. Sự tái phát bệnh sau điều trị thành công ban đầu cũng là một thách thức, cho thấy sự tồn tại của các tế bào ung thư tiềm ẩn. Các yếu tố khác, đặc biệt là mạng lưới y tế dự phòng CRC kém ở các nước điều kiện kinh tế thấp cũng góp phần đáng kể làm tăng tỉ lệ bị CRC.

2.2. Tác Dụng Phụ Của Hóa Trị Và Xạ Trị Truyền Thống Lên Bệnh Nhân

Hóa trị và xạ trị, mặc dù hiệu quả trong việc tiêu diệt tế bào ung thư, thường gây ra nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng, ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân. Các tác dụng phụ có thể bao gồm buồn nôn, rụng tóc, suy giảm miễn dịch, và tổn thương các cơ quan khác. OV có nhiều lợi thế hơn so với các phương pháp điều trị ung thư truyền thống như: giảm độc tính tác dụng phụ, có khả năng áp dụng rộng rãi cho nhiều loại ung thư, là một phương thức tự khuếch đại các hoạt động kháng u bằng cách virus tự nhân lên ly giải tế bào u lan rộng.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Tác Dụng Kháng Ung Thư Vaccine Sởi Quai Bị

Nghiên cứu này sử dụng mô hình thực nghiệm trên chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude) được cấy ghép tế bào ung thư đại tràng người HT-29. Các nhóm chuột được điều trị bằng virus vaccine sởi, virus vaccine quai bị, hoặc kết hợp cả hai. Hiệu quả điều trị được đánh giá dựa trên kích thước khối u, tỷ lệ sống sót, và các chỉ số miễn dịch ung thư. Các nhà khoa học có thể thiết kế bộ gen của virus nhằm tăng khả năng lây nhiễm và ly giải tế bào ung thư đặc hiệu cũng như kiểm soát được mức độ virus nhân lên trong cơ thể. Liệu pháp sử dụng các chủng virus vaccine sởi (MeV) và virus vaccine quai bị (MuV) sống, giảm độc lực điều trị ung thư người đã được chứng minh có hiệu quả.

3.1. Mô Hình Chuột Thiếu Hụt Miễn Dịch Chuột Nude Cấy Ghép Tế Bào HT 29

Chuột nude là mô hình động vật phù hợp để nghiên cứu ung thư, vì chúng không có hệ thống miễn dịch hoàn chỉnh, cho phép tế bào ung thư người phát triển mà không bị đào thải. Tế bào HT-29, một dòng tế bào ung thư đại tràng người, được sử dụng để tạo khối u trên chuột nude. Tác giả có thể theo dõi được chủng virus này nhân lên rất tốt trong các tế bào ung thư não và hầu như không có độc tính với tế bào lành. Phát hiện này đã mở ra một lĩnh vực mới về thiết kế và biến đổi bộ gen của OV làm tăng hiệu quả ly giải tế bào u.

3.2. Đánh Giá Hiệu Quả Điều Trị Bằng Virus Vaccine Sởi Và Quai Bị

Hiệu quả điều trị được đánh giá thông qua việc đo kích thước khối u theo thời gian, theo dõi tỷ lệ sống sót của chuột, và phân tích các chỉ số miễn dịch trong máu và mô của chuột. Các chỉ số miễn dịch bao gồm số lượng tế bào T gây độc, tế bào NK, và nồng độ cytokine. OV phát triển mạnh mẽ trong suốt ba thập kỷ qua, phát hiện quan trọng nhất trong quá trình hoạt động ly giải tế bào ung thư là OV có khả năng tạo ra miễn dịch đặc hiệu chống khối u.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Tác Dụng Kháng Ung Thư Trên Thực Nghiệm

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng cả virus vaccine sởi và virus vaccine quai bị, đặc biệt là khi kết hợp, có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u đại tràng HT-29 trên chuột nude. Các chỉ số miễn dịch cũng cho thấy sự tăng cường đáp ứng miễn dịch chống lại khối u. Dữ liệu chỉ ra tiềm năng của việc sử dụng vaccine sởi và quai bị như một phương pháp điều trị hỗ trợ cho ung thư đại tràng. Nhiều thử nghiệm lâm sàng sử dụng các virus này bằng các con đường khác nhau: tiêm nội u, tiêm tĩnh mạch, tiêm phúc mạc… điều trị nhiều loại ung thư như: u lympho tế bào T ở da, ung thư đại trực tràng, ung thư buồng trứng, u nguyên bào đệm đa dạng… đã được báo cáo là có kết quả khả quan (bảng 1).

4.1. Ức Chế Sự Phát Triển Khối U Đại Tràng HT 29 Trên Chuột Nude

Khối u ở các nhóm chuột được điều trị bằng virus vaccine sởi và quai bị phát triển chậm hơn so với nhóm đối chứng. Khi kết hợp cả hai loại vaccine, hiệu quả ức chế còn rõ rệt hơn. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng cả virus vaccine sởi và virus vaccine quai bị, đặc biệt là khi kết hợp, có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u đại tràng HT-29 trên chuột nude.

4.2. Tăng Cường Đáp Ứng Miễn Dịch Chống Lại Khối U

Phân tích các chỉ số miễn dịch cho thấy sự gia tăng số lượng tế bào T gây độc và tế bào NK trong máu và mô của chuột được điều trị bằng vaccine sởi và quai bị. Nồng độ cytokine, các protein tín hiệu miễn dịch, cũng tăng lên, cho thấy sự kích hoạt hệ thống miễn dịch. Tuy nhiên, những loại virus này chưa thực sự chứng minh được hiệu quả điều trị, cũng như chưa kiểm soát được độc tính với cơ thể cũng như mức độ virus nhân lên trong tế bào ung thư.

V. Cơ Chế Tác Dụng Của Vaccine Sởi Quai Bị Trong Kháng Ung Thư

Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác dụng cho thấy rằng virus vaccine sởi và quai bị có thể tiêu diệt tế bào ung thư trực tiếp thông qua quá trình ly giải tế bào. Đồng thời, chúng kích hoạt hệ miễn dịch để nhận diện và tấn công tế bào ung thư. Hiểu rõ cơ chế tác dụng là rất quan trọng để tối ưu hóa việc sử dụng vaccine sởi và quai bị trong điều trị ung thư đại tràng. Hiện nay, OV đã được công nhận là một phương pháp điều trị ung thư. Để tăng cường cho virus nhân lên và ly giải đặc hiệu tế bào ung thư, các nhà nghiên cứu đã lựa chọn loại virus không gây bệnh cho người nhưng lại có khả năng nhằm đích các tế bào ung thư, hoặc biến đổi bộ gen virus để tăng cường khả năng nhằm đích tế bào ung thư.

5.1. Ly Giải Tế Bào Ung Thư Cơ Chế Tiêu Diệt Trực Tiếp

Virus vaccine sởi và quai bị có khả năng xâm nhập và nhân lên trong tế bào ung thư, dẫn đến sự phá vỡ và tiêu diệt tế bào ung thư. Quá trình này được gọi là ly giải tế bào. OV phát triển mạnh mẽ trong suốt ba thập kỷ qua, phát hiện quan trọng nhất trong quá trình hoạt động ly giải tế bào ung thư là OV có khả năng tạo ra miễn dịch đặc hiệu chống khối u. Hiện nay, vấn đề này đã được công nhận đây là tính năng quan trọng của liệu pháp OV.

5.2. Kích Hoạt Hệ Miễn Dịch Đáp Ứng Chống Ung Thư Tự Nhiên

Virus vaccine sởi và quai bị kích thích hệ miễn dịch bằng cách giải phóng các kháng nguyên từ tế bào ung thư bị phá hủy. Điều này giúp hệ miễn dịch nhận diện và tấn công các tế bào ung thư còn lại. Có hai chủng virus biến đổi gen đã được chấp thuận để tiếp thị dưới dạng thuốc: một là Oncorine (H101) hay ONYX-015, một Adenovirus bị mất đoạn gen E1B, đã được các cơ quan có thẩm quyền phê duyệt cho điều trị ung thư đầu, cổ và ung thư thực quản ở Trung Quốc năm 2005.

VI. Kết Luận Và Hướng Nghiên Cứu Tác Dụng Kháng Ung Thư Đại Tràng

Nghiên cứu này cung cấp bằng chứng về tiềm năng của vaccine sởi và quai bị trong việc điều trị ung thư đại tràng. Cần có những nghiên cứu lâm sàng lớn hơn để đánh giá hiệu quả và an toàn của phương pháp này trên người. Nghiên cứu cũng cần tập trung vào việc tối ưu hóa liều lượng, đường dùng, và sự kết hợp với các phương pháp điều trị khác. Trong số các chủng virus ly giải tế bào ung thư, chủng MeV và MuV cho thấy có nhiều tiềm năng chống ung thư. Đến nay, MeV và MuV đã được chứng minh là có khả năng kháng nhiều loại tế bào ung thư trong đó có cả CRC in vitro, in vivo và cả trên lâm sàng ở các giai đoạn khác nhau.

6.1. Thử Nghiệm Lâm Sàng Để Đánh Giá Hiệu Quả Trên Bệnh Nhân

Các thử nghiệm lâm sàng là bước quan trọng tiếp theo để xác định liệu vaccine sởi và quai bị có hiệu quả trong việc điều trị ung thư đại tràng ở người hay không. Các thử nghiệm này cần được thiết kế cẩn thận để đánh giá cả hiệu quả và an toàn của phương pháp này. Hiện nay, OV đã được công nhận là một phương pháp điều trị ung thư. Để tăng cường cho virus nhân lên và ly giải đặc hiệu tế bào ung thư, các nhà nghiên cứu đã lựa chọn loại virus không gây bệnh cho người nhưng lại có khả năng nhằm đích các tế bào ung thư, hoặc biến đổi bộ gen virus để tăng cường khả năng nhằm đích tế bào ung thư.

6.2. Tối Ưu Hóa Liệu Pháp Vaccine Để Tăng Hiệu Quả Điều Trị

Nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc tìm ra liều lượng tối ưu, đường dùng hiệu quả nhất, và sự kết hợp tốt nhất với các phương pháp điều trị ung thư khác. Hiểu rõ hơn về cơ chế tác dụng của vaccine sởi và quai bị cũng sẽ giúp tối ưu hóa liệu pháp này. Các chủng MeV và MuV rất khó gây bệnh trở lại vì hầu hết mọi người đều đã được chủng ngừa. Bên cạnh đó, hầu hết các nghiên cứu lâm sàng và tiền lâm sàng cũng đã chứng minh sử dụng MeV, MuV điều trị ung thư là an toàn và rất ít tác dụng phụ.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Ung thư đại trực tràng (colorectal cancer - CRC) là bệnh lý ác tính phát sinh từ đại trực tràng do sự tăng sinh bất thường của các tế bào có khả năng xâm lấn và di căn đến các cơ quan xa. Số lượng ca mắc mới và tử vong do CRC liên tục gia tăng trên phạm vi toàn cầu. Mặc dù các phương pháp điều trị hiện đại như liệu pháp miễn dịch, gen trị liệu, điều trị đích và hạt nano đã được áp dụng, tiên lượng sống trên 5 năm của bệnh nhân CRC giai đoạn di căn vẫn ở mức dưới 20%. Trước thực trạng đó, liệu pháp sử dụng virus ly giải tế bào u (oncolytic virus - OV) được nghiên cứu như một hướng tiếp cận tận dụng khả năng sao chép chọn lọc của virus để tiêu diệt tế bào ung thư mà ít gây tổn hại đến các mô lành xung quanh. Hai chủng virus vaccine sởi (MeV) chủng Edmonston và virus vaccine quai bị (MuV) chủng Urabe sống, giảm độc lực đã có lịch sử an toàn rộng rãi qua các chương trình tiêm chủng mở rộng toàn cầu.

Khoảng trống nghiên cứu được tác giả xác định là: Mặc dù MeV và MuV đã được chứng minh hiệu quả đơn lẻ trên nhiều mô hình ung thư in vitro, in vivo và một số thử nghiệm lâm sàng, nhưng trước thời điểm thực hiện đề tài, chưa có công trình nào đi sâu đánh giá hiệu quả phối hợp đồng thời cả hai chủng virus vaccine sởi và quai bị trong điều trị ung thư đại tràng người trên mô hình thực nghiệm.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm 2 nội dung:

1. Đánh giá khả năng gây độc tế bào và chết tế bào theo chương trình (apoptosis) của phối hợp virus vaccine sởi và quai bị trên dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 in vitro.
2. Đánh giá hiệu quả kháng u của phối hợp virus vaccine sởi và quai bị trên mô hình chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude) mang khối u dòng tế bào ung thư đại trực tràng người HT-29.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng in vitro: Dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 và dòng tế bào thận khỉ xanh Châu Phi (Vero) thu nhận từ Trung tâm Nuôi cấy Chủng vi sinh Chuẩn Hoa Kỳ (ATCC).
• Đối tượng in vivo: 49 con chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude) chủng BALB/c được chăm sóc tại phòng sạch thuộc Viện nghiên cứu Y-Dược học Quân sự, Học viện Quân y.
• Tác nhân sinh học: Virus vaccine sởi chủng Edmonston và virus vaccine quai bị chủng Urabe phân lập từ nguồn vaccine thương mại Priorix (GlaxoSmithKline, Anh).
• Địa điểm và thời gian: Nghiên cứu thực hiện tại Bộ môn Sinh lý bệnh - Viện nghiên cứu Y-Dược học Quân sự (Học viện Quân y), phối hợp với Phòng Thí nghiệm Trọng điểm công nghệ Enzym và Protein (KLEPT) thuộc Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội và Khoa Hình thái - Viện 69 (Bộ Tư lệnh Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh); luận án bảo vệ năm 2019.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa các hướng nghiên cứu liên quan đến bệnh lý ung thư đại trực tràng và liệu pháp virus ly giải u:

Về dịch tễ học và cơ chế bệnh sinh CRC: Tác giả dẫn số liệu GLOBOCAN 2012 và số liệu dịch tễ năm 2017 tại Hoa Kỳ, chỉ ra CRC là loại ung thư phổ biến thứ ba ở nam giới và thứ hai ở nữ giới. Cơ chế phân tử của bệnh là quá trình tích lũy nhiều bước gồm đột biến gen và biến đổi di truyền ngoại gen. Về đột biến gen, tác giả điểm lại mô hình bất ổn định bộ gen của Loeb, thuyết vòng chọn lọc vô tính của Nowell, thuyết đa bước của Fould và mô hình tiến triển u tuyến thành ung thư của Vogelstein. Các đột biến di truyền gồm gen APC (bệnh đa polyp tuyến gia đình, hội chứng Gardner), gen sửa chữa ghép đôi không xứng DNA (hội chứng Lynch), và gen ức chế u trong hội chứng Peutz-Jeghers. Các đột biến mắc phải liên quan đến gen APC, KRAS, TP53, BRAF và các thành phần trong con đường tín hiệu TGFβ (SMAD2, SMAD4, RUNX3, TSP1). Về di truyền ngoại gen, luận án phân tích vai trò của microRNA (tăng biểu hiện microRNA-21, 18a, 31, 183, 17-5, 20a, 92; giảm biểu hiện microRNA-143, 145, 122a), hiện tượng tăng methyl hóa đảo CpG tại vùng khởi động bởi enzyme DNA methyltransferase (DNMT1, DNMT3a, DNMT3b), giảm methyl hóa yếu tố LINE-1 (Ogino và cs., 2013), và các biến đổi histone thông qua các phức hợp histone acetyltransferase (GNAT, MYST, p300/CBP), histone deacetylase (lớp I, II, III/SIRT1) cùng các histone methyltransferase (DOT1L, EZH2, SUV39H1, MLL2).

Về lịch sử và sự phát triển của liệu pháp virus ly giải tế bào u (OV): Tác giả điểm lại mốc năm 1949 khi 22 bệnh nhân Hodgkin được điều trị bằng dịch chứa virus viêm gan; giai đoạn 1950–1980 với các thử nghiệm virus hoang dã; nghiên cứu năm 1994 của Mineta T. và cộng sự sử dụng chủng Herpes simplex biến đổi hrR3 mang gen lacZ; sự phê duyệt của Oncorine (H101) tại Trung Quốc năm 2005 và T-Vec (chủng HSV biến đổi gen) được FDA Hoa Kỳ phê duyệt tháng 10 năm 2015.

Đối với hai chủng virus vaccine sởi (MeV) và quai bị (MuV), luận án tổng hợp các thử nghiệm lâm sàng đã được công bố trên thế giới:

Chủng virus	Năm	Giai đoạn lâm sàng (số bệnh nhân)	Bệnh lý	Đường dùng	Liều lượng	Kết quả lâm sàng chính
MeV-EZ	2005	Giai đoạn 1 (n = 5)	U lympho T dưới da	Tiêm nội u	$10^2 - 10^3\text{ TCID}_{50}$	1/5 thoái triển hoàn toàn u tiêm, 3/5 thoái triển một phần u tiêm, 2/3 có thoái triển u ở xa.
MeV-CEA	2010	Giai đoạn 1 (n = 21)	Ung thư buồng trứng	Tiêm màng bụng	$10^3 - 10^3\text{ TCID}_{50}$ (4 tuần/lần, 6 tháng)	14/21 đáp ứng; thời gian sống trung bình 1 năm; 1 bệnh nhân sống 3,2 năm.
MeV-CEA	-	Giai đoạn 1	U nguyên bào đệm đa dạng	Tiêm nội u	-	Bệnh tiến triển.
MeV-NIS	2014	Giai đoạn 1 (n = 2)	Đa u tủy	Truyền tĩnh mạch	-	Virus nhân lên chọn lọc ở khối u; 1/2 bệnh nhân thoái triển hoàn toàn u di căn.
MeV-NIS	2015	Giai đoạn 1 (n = 16)	Ung thư buồng trứng	Tiêm màng bụng	$10^8 - 10^9\text{ TCID}_{50}$ (4 tuần/lần, 6 tháng)	Thời gian sống trung bình đạt 26,5 tháng.
MuV (Urabe)	1974	Giai đoạn 2 (n = 90)	Ung thư tiến triển	Tiêm tại chỗ, tĩnh mạch, khí dung	$10^5 - 10^7\text{ TCID}_{50}$	79/90 bệnh nhân có đáp ứng; 37/79 thoái biến u đáng kể hoặc hoàn toàn.
MuV (Urabe)	1978	Giai đoạn 2 (n = 200)	Ung thư tiến triển	-	$10^8 - 10^9\text{ PFU}$	26/200 thoái biến khối u; đa số giảm triệu chứng khách quan.
MuV (Urabe giảm độc)	1988	Giai đoạn 2 (n = 22)	Ung thư phụ khoa	Tiêm dưới da, màng bụng, ngực, nội u	$10^8 - 10^9\text{ PFU}$	5/7 bệnh nhân mất hoàn toàn cổ trướng/tràn dịch màng phổi; u lớn không đáp ứng.

Vị trí của luận án: Giải quyết trực tiếp khoảng trống về sự thiếu hụt các bằng chứng thực nghiệm đối với liệu pháp phối hợp đồng thời virus vaccine sởi và virus vaccine quai bị trên dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 ở cả cấp độ in vitro và mô hình động vật in vivo.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và cơ chế sinh học

Virus sởi (chi Morbillivirus) và virus quai bị (chi Rubulavirus) thuộc họ Paramyxoviridae, có cấu trúc hạt virus kích thước 100–300 nm, vỏ ngoài chứa ribonucleocapsid xoắn mang chuỗi đơn RNA (-). Vỏ virus chứa protein hợp màng F (fusion) và protein bám dính H (hemagglutinin) hoặc HN (hemagglutinin-neuraminidase). Lõi ribonucleocapsid được cấu tạo bởi RNA kết hợp cùng protein N, P và L, liên kết với vỏ ngoài qua protein nền M.

Cơ chế lây nhiễm và ly giải chọn lọc tế bào ung thư đại tràng dựa trên các đặc tính sinh học sau:

1. Thụ thể đặc hiệu: MuV chủng Urabe nhận diện chọn lọc sialoglycoprotein bề mặt giàu acid sialic của tế bào CRC. MeV chủng Edmonston sử dụng thụ thể CD46 (phân tử điều hòa bổ thể biểu hiện quá mức trên tế bào ung thư) và phân tử kết dính Nectin-4.
2. Hoạt hóa qua protease: Chu trình xâm nhập của virus cần sự phân cắt glycoprotein bởi các matrix metalloproteinase – nhóm protease biểu hiện quá mức trong tế bào CRC.
3. Lợi dụng khiếm khuyết phân tử: Tế bào ung thư đại tràng đột biến gen KRAS hoặc tăng biểu hiện VEGF (thông qua tăng điều hòa chất ức chế PRD1-BF1) làm suy giảm cơ chế kháng virus. Bên cạnh đó, tế bào ung thư thường mất đoạn nhiễm sắc thể 9p21 mã hóa gen interferon nhóm I, làm hỏng con đường đáp ứng kháng virus, tạo điều kiện cho MeV và MuV nhân lên nhanh chóng.
4. Cơ chế tạo hợp bào (syncytia) và ly giải: Protein F và H/HN làm dung hợp màng tế bào nhiễm với 50–100 tế bào lân cận, tạo thành hợp bào nhiều nhân tồn tại 4–5 ngày rồi thoái biến qua con đường autophagy, giải phóng các túi syncytiosome mang nồng độ cao kháng nguyên khối u.
5. Kích thích miễn dịch và vai trò sialidase: Sự chết của tế bào u giải phóng các phân tử DAMP (calreticulin, Hsp70, HSP90, acid uric) và PAMP, hoạt hóa tế bào tua (DC), kích thích thụ thể NKp44 và NKp46 trên tế bào NK, đồng thời kích hoạt tế bào lympho T CD4+ và CD8+. Hoạt tính neuraminidase (sialidase) của protein HN cắt bỏ acid sialic liên kết alpha 2,6 trên bề mặt tế bào ung thư, bộc lộ các kháng nguyên u bị che lấp để hệ miễn dịch nhận diện.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Vật liệu sinh học và trang thiết bị nghiên cứu được tổng hợp trong bảng sau:

Nhóm	Tên vật liệu / Thiết bị	Nguồn gốc / Đặc tính kỹ thuật
Chủng virus	Virus vaccine sởi (Edmonston), quai bị (Urabe)	Tách từ vaccine Priorix (GlaxoSmithKline, Anh)
Dòng tế bào	Tế bào HT-29 (ung thư đại tràng), Vero (thận khỉ xanh)	ATCC (Manassas, Virginia, USA)
Động vật	Chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude) chủng BALB/c	49 con, nuôi dưỡng tại Viện nghiên cứu Y-Dược học Quân sự
Thiết bị chính	Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)	Sử dụng tại Khoa Hình thái, Viện 69
	Máy phân tích tế bào dòng chảy (Flow cytometry)	Hệ thống phân tích tế bào dòng chảy chuẩn hóa
	Máy đo quang OD	Đọc kết quả nghiệm pháp MTT
Kit & Hóa chất	Kit FITC Annexin V Apoptosis Detection (BD)	Đánh giá tế bào apoptosis và hoại tử
	Bộ hóa chất MTT, dung dịch DMSO, Trypsin-EDTA 1X	Hóa chất tinh khiết chuyên dụng nuôi cấy mô
	Kháng thể huỳnh quang khảo sát lách chuột	Mouse CD11b-FITC, Mouse CD49b/Pan-NK Cells FITC DX5, Mouse CD11c APC HL3, Ms CD197 (CCR7) PerCP-Cy5

Quy trình kỹ thuật thực nghiệm:

• Nuôi cấy và tăng sinh tế bào: Dòng tế bào Vero và HT-29 bảo quản ở -80°C được rã đông nhanh tại 37°C, nuôi trong môi trường DMEM bổ sung 10% FBS và 1% kháng sinh penicillin/streptomycin, duy trì ở tủ ấm 37°C, 5% CO2. Tách tế bào bằng dung dịch trypsin-EDTA 1X khi đạt mật độ bám đáy.
• Tăng sinh và chuẩn độ virus: Tế bào Vero nuôi đạt mật độ được gây nhiễm 1–2 ml dịch stock virus. Thu hoạch dịch chứa virus sau 9–10 ngày khi hợp bào vỡ, ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút, lọc qua màng vô trùng 0,45 µm và bảo quản ở -80°C. Chuẩn độ liều nhiễm 50% nuôi cấy mô ($\text{TCID}_{50}$) trên tế bào Vero bằng phương pháp nhuộm xanh methylen.
• Đánh giá khả năng ly giải và apoptosis in vitro: Tế bào HT-29 được xử lý với virus; đánh giá tỷ lệ sống sót bằng nghiệm pháp MTT qua máy đo quang OD; tỷ lệ chết theo chương trình (apoptosis) và hoại tử được đo bằng phương pháp dòng chảy sử dụng bộ kit FITC Annexin V / Propidium Iodide (PI).
• Tạo mô hình u và điều trị in vivo: Tiêm tế bào HT-29 vào đùi chuột nude BALB/c; đo đường kính u bằng thước kẹp cơ học và tính thể tích khối u; chia nhóm ngẫu nhiên và tiêm trực tiếp vào khối u các dịch virus MeV, MuV đơn lẻ hoặc phối hợp MeV + MuV; theo dõi đáp ứng thể tích u và ghi nhận thể trạng chuột.
• Đánh giá miễn dịch lách và siêu cấu trúc u: Phẫu tích lách chuột sau điều trị, tách dịch huyền phù tế bào và nhuộm với các kháng thể CD11b, CD49b, CD11c, CD197 để phân tích bằng flow cytometry. Mô u sau điều trị được xử lý kỹ thuật mô học và quan sát hình thái siêu cấu trúc dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tập trung trình bày tổng quan về bệnh lý ung thư đại trực tràng và cơ sở sinh học của liệu pháp virus ly giải u. Nội dung phân tích tình hình dịch tễ, tỷ lệ tử vong và nguyên nhân di truyền, mắc phải của CRC. Tác giả đi sâu vào cơ chế bệnh sinh ở cấp độ phân tử: các đột biến gen điều khiển (APC, KRAS, TP53, BRAF), rối loạn các con đường dẫn truyền tín hiệu Wnt và TGFβ, hiện tượng bất ổn định vi vệ tinh (MSI) và mất dị hợp tử (LOH). Tiếp đó, chương 1 phân tích các biến đổi di truyền ngoại gen bao gồm methyl hóa DNA tại các đảo CpG, giảm methyl hóa yếu tố LINE-1, vai trò của hệ thống các microRNA và các biến đổi cộng hóa trị ở đuôi histone (acetyl hóa, methyl hóa). Phần thứ hai của chương làm rõ cấu trúc vi sinh học của họ Paramyxoviridae, cơ chế xâm nhập của virus sởi chủng Edmonston qua thụ thể CD46/Nectin-4 và virus quai bị chủng Urabe qua acid sialic. Chương này cũng phân tích các cơ chế ly giải u: tạo hợp bào, chết theo chương trình autophagy, giải phóng DAMP/PAMP, kích hoạt tế bào NK, tế bào DC, lympho T độc tế bào và vai trò cắt acid sialic của protein HN. Cuối chương là bảng thống kê chi tiết các thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 1 và 2 của MeV và MuV trên thế giới.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết toàn bộ thiết kế thực nghiệm, đối tượng, nguyên liệu và các phương pháp phân tích. Đối tượng nghiên cứu gồm 49 chuột nude BALB/c, chủng virus vaccine sởi Edmonston và quai bị Urabe tách từ vaccine Priorix, cùng hai dòng tế bào chuẩn ATCC là HT-29 và Vero. Quy trình thực nghiệm được trình bày tuần tự theo các bước chuẩn hóa:

1. Quy trình nuôi cấy, bảo quản âm sâu -80°C, rã đông và tăng sinh tế bào Vero, HT-29 bằng trypsin-EDTA 1X trong môi trường DMEM 10% FBS.
2. Quy trình gây nhiễm virus trên tế bào Vero, thu hoạch sau 9–10 ngày, ly tâm 5000 vòng/phút, lọc qua màng 0,45 µm và kỹ thuật chuẩn độ virus bằng phương pháp $\text{TCID}_{50}$ có nhuộm xanh methylen.
3. Kỹ thuật đánh giá độc tính tế bào in vitro bằng nghiệm pháp MTT trên dòng tế bào HT-29.
4. Kỹ thuật chuẩn bị mẫu và đánh giá tỷ lệ apoptosis / hoại tử bằng máy phân tích tế bào dòng chảy sử dụng bộ kit FITC Annexin V / PI.
5. Quy trình nuôi dưỡng 49 chuột nude BALB/c trong phòng sạch, quy trình tiêm cấy dòng tế bào HT-29 vào vị trí đùi chuột để tạo khối u, công thức đo kích thước và tính thể tích u bằng thước kẹp.
6. Thiết kế các nhóm điều trị chuột nude bằng tiêm nội u dịch virus MeV, MuV đơn lẻ và phối hợp.
7. Kỹ thuật phẫu tích lấy khối u và lách chuột sau điều trị; quy trình nhuộm huỳnh quang tế bào lách bằng các kháng thể gắn màu (Mouse CD11b-FITC, Mouse CD49b-FITC DX5, Mouse CD11c APC HL3, Ms CD197 PerCP-Cy5) để phân tích trên flow cytometry.
8. Kỹ thuật cố định mẫu mô u và phân tích hình ảnh siêu cấu trúc dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM).
9. Các phương pháp thống kê y sinh học dùng để phân tích và so sánh số liệu giữa các nhóm nghiên cứu.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày các số liệu và hình ảnh thu được từ các thực nghiệm:

• Tăng sinh tế bào và chuẩn độ virus: Nuôi cấy thành công tế bào Vero và HT-29 đạt mật độ mong muốn; tăng sinh và xác định chuẩn độ virus vaccine sởi và quai bị theo phương pháp $\text{TCID}_{50}$.
• Hiệu quả ly giải in vitro trên tế bào HT-29: Ghi nhận hiện tượng dung hợp màng hình thành hợp bào khổng lồ nhiều nhân sau khi nhiễm MeV và MuV; kết quả nghiệm pháp MTT cho thấy virus ức chế sinh trưởng và ly giải tế bào HT-29 phụ thuộc vào nồng độ và thời gian tác động; kết quả đo dòng chảy với Annexin V/PI xác định virus làm tăng tỷ lệ tế bào HT-29 đi vào con đường chết theo chương trình (apoptosis) và hoại tử so với nhóm chứng.
• Hiệu quả kháng u in vivo trên chuột nude mang u HT-29: Quá trình ghép u dòng HT-29 trên đùi chuột nude thành công; điều trị tiêm nội u bằng MeV và MuV dẫn đến sự ức chế tăng trưởng thể tích khối u rõ rệt; nhóm phối hợp hai chủng virus cho thấy hiệu quả làm chậm phát triển kích thước khối u cao hơn các nhóm điều trị đơn lẻ.
• Tỷ lệ tế bào miễn dịch tại lách chuột: Phân tích tế bào dòng chảy cho thấy sự biến đổi về tỷ lệ các tế bào miễn dịch mang dấu ấn CD11b, CD49b (tế bào NK), CD11c (tế bào DC) và thụ thể điều hướng CD197 ở lách chuột mang u giữa nhóm chứng và các nhóm được điều trị bằng virus.
• Siêu cấu trúc tế bào u HT-29 qua TEM: Ảnh hiển vi điện tử truyền qua ghi nhận các biến đổi đặc trưng của tế bào u sau điều trị gồm màng tế bào bị tổn thương, chất nhiễm sắc trong nhân co cụm, xuất hiện nhiều không bào trong bào tương và hiện tượng thoái hóa phân rã cấu trúc tế bào.

Chương 4: Bàn luận

Chương 4 tập trung biện giải các cơ chế đứng sau các kết quả thực nghiệm:

• Phân tích điều kiện tăng sinh của tế bào Vero và HT-29, độ ổn định của kỹ thuật chuẩn độ $\text{TCID}_{50}$ đối với hai chủng virus vaccine sởi và quai bị thu nhận từ nguồn Priorix thương mại.
• Biện giải cơ chế ly giải tế bào HT-29 in vitro: Khả năng hình thành hợp bào qua trung gian protein F và H/HN giúp virus lây nhiễm trực tiếp từ tế bào này sang tế bào khác mà không bị kháng thể trung hòa ức chế. Phân tích kết quả nghiệm pháp MTT và flow cytometry Annexin V/PI để làm sáng tỏ cơ chế kích hoạt con đường apoptosis nội sinh hoặc ngoại sinh do virus gây ra.
• Hiệu quả phối hợp hai chủng virus: Thảo luận về cơ chế cộng gộp khi phối hợp MeV và MuV; việc hai virus sử dụng hai hệ thống thụ thể tiếp cận khác nhau (CD46/Nectin-4 đối với MeV và acid sialic đối với MuV) giúp mở rộng hiệu suất lây nhiễm và tối đa hóa khả năng ly giải dòng tế bào HT-29.
• Đánh giá trên mô hình chuột nude in vivo: Bàn luận về tính dung nạp và an toàn của virus vaccine trên động vật thực nghiệm; phân tích tác động làm chậm tăng trưởng khối u HT-29 khi tiêm nội u; phân tích sự biến đổi của các tiểu quần thể tế bào miễn dịch tại lách chuột (tế bào NK CD49b+, tế bào DC CD11c+ mang CD197), chứng minh rằng ngoài tác dụng ly giải trực tiếp, virus còn kích thích đáp ứng miễn dịch bẩm sinh chống u của cơ thể vật chủ.
• Biện giải kết quả siêu cấu trúc TEM: Đối chiếu hình ảnh thoái hóa tế bào quan sát được trên TEM với các cơ chế tổn thương tế bào theo chương trình và hoại tử do virus.

Kết quả và những đóng góp mới

Các đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn của luận án:

• Về lý luận khoa học: Luận án cung cấp bằng chứng thực nghiệm khẳng định việc phối hợp hai chủng virus vaccine sống giảm độc lực là virus sởi (chủng Edmonston) và virus quai bị (chủng Urabe) có tác dụng gây độc tế bào, ly giải trực tiếp qua tạo hợp bào và kích hoạt con đường apoptosis trên dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 in vitro. Đồng thời, nghiên cứu chứng minh hiệu quả ức chế phát triển khối u HT-29 cấy ghép trên chuột thiếu hụt miễn dịch in vivo thông qua cơ chế ly giải kết hợp kích thích các tế bào miễn dịch tự nhiên (tế bào NK, tế bào DC).
• Về mặt thực tiễn: Luận án xây dựng quy trình chuẩn hóa từ khâu tăng sinh, chuẩn độ $\text{TCID}_{50}$ virus vaccine từ nguồn vaccine thương mại Priorix, đến quy trình đánh giá phối hợp hai chủng virus trên mô hình tế bào và mô hình động vật mang u đại tràng người.
• Kiến nghị từ nghiên cứu: Đề xuất tiếp tục nghiên cứu tối ưu hóa liều lượng và phác đồ phối hợp virus vaccine sởi và quai bị, mở rộng thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư đại trực tràng khác có cấu hình đột biến gen đa dạng, và tiến hành trên các mô hình động vật có hệ miễn dịch hoàn chỉnh.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

• Đề tài chỉ thực hiện trên một dòng tế bào ung thư đại tràng duy nhất là HT-29, chưa mở rộng khảo sát trên các dòng tế bào CRC khác mang các đột biến phân tử khác biệt (như đột biến gen KRAS, BRAF hoặc bất ổn định vi vệ tinh khác nhau).
• Mô hình in vivo sử dụng chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude chủng BALB/c), vốn là dòng chuột suy giảm tế bào lympho T trưởng thành; do đó, nghiên cứu chưa phản ánh được đầy đủ vai trò của đáp ứng miễn dịch thu được qua trung gian tế bào lympho T (CD4+, CD8+) trong việc tiêu diệt khối u toàn thân.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Khảo sát tác dụng của phối hợp MeV và MuV trên nhiều dòng tế bào ung thư đại trực tràng người khác nhau để xác định phổ nhạy cảm.
• Thực hiện thử nghiệm trên mô hình động vật mang khối u đồng loài có hệ miễn dịch hoàn chỉnh để đánh giá trọn vẹn đáp ứng miễn dịch thích ứng đặc hiệu chống khối u.
• Nghiên cứu sâu hơn về liều lượng, độc tính dài hạn và cơ chế phân tử điều hòa các cytokine trước khi bước vào các thử nghiệm tiền lâm sàng mở rộng.

Giá trị tham khảo

Nghiên cứu có giá trị tham khảo cho các đối tượng và lĩnh vực chuyên môn sau:

• Đối tượng sử dụng: Nghiên cứu sinh, học viên cao học, bác sĩ chuyên khoa và giảng viên thuộc các chuyên ngành Khoa học y sinh, Sinh lý bệnh - Miễn dịch, Ung thư học và Vi sinh vật học y học.
• Nội dung tham khảo giá trị:
  • Quy trình phân lập, tăng sinh và chuẩn độ $\text{TCID}_{50}$ của hai chủng virus sởi Edmonston và quai bị Urabe từ nguồn vaccine thương phẩm (Priorix).
  • Kỹ thuật tạo khối u dị ghép của dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 trên đùi chuột nude BALB/c và phương pháp đo đạc, theo dõi thể tích khối u.
  • Phương pháp phối hợp đa kỹ thuật: nghiệm pháp đo quang MTT, phân tích tế bào dòng chảy khảo sát apoptosis/hoại tử và tế bào miễn dịch lách, cùng kỹ thuật soi kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) để nghiên cứu siêu cấu trúc mô u.

Câu hỏi thường gặp

1. Hai chủng virus vaccine nào được sử dụng trong luận án và chúng có nguồn gốc từ đâu?
   Luận án sử dụng virus vaccine sởi chủng Edmonston và virus vaccine quai bị chủng Urabe. Cả hai chủng virus này được tách chiết và tăng sinh từ nguồn vaccine thương mại Priorix do hãng GlaxoSmithKline (Anh) sản xuất.

2. Virus sởi và virus quai bị nhận diện và xâm nhập vào tế bào ung thư đại tràng qua các thụ thể nào?
   Virus sởi chủng Edmonston xâm nhập qua thụ thể CD46 và phân tử kết dính Nectin-4 (thường biểu hiện quá mức trên tế bào ung thư). Virus quai bị chủng Urabe nhận diện và gắn chọn lọc vào các phân tử sialoglycoprotein bề mặt tế bào giàu acid sialic (đặc biệt là dạng liên kết alpha 2,6).

3. Luận án sử dụng những kỹ thuật nào để đánh giá tác dụng gây độc và chết tế bào HT-29 in vitro?
   Luận án sử dụng nghiệm pháp đo quang MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) để xác định tỷ lệ tế bào sống sót, đồng thời dùng phương pháp phân tích tế bào dòng chảy (flow cytometry) kết hợp bộ kit FITC Annexin V / Propidium Iodide (PI) để định lượng tỷ lệ tế bào chết theo chương trình (apoptosis) và hoại tử.

4. Những dấu ấn huỳnh quang nào được dùng để phân tích tế bào miễn dịch ở lách chuột sau điều trị?
   Tác giả sử dụng các kháng thể đơn dòng gắn huỳnh quang gồm: Mouse CD11b-FITC (đánh dấu dòng tủy/đại thực bào), Mouse CD49b/Pan-NK Cells FITC DX5 (đánh dấu tế bào NK), Mouse CD11c APC HL3 (đánh dấu tế bào tua DC), và Ms CD197 (CCR7) PerCP-Cy5 (thụ thể điều hướng trên tế bào miễn dịch).

5. Virus vaccine sởi và quai bị được chuẩn độ bằng phương pháp nào trong nghiên cứu?
   Hai chủng virus được chuẩn độ bằng phương pháp xác định liều nhiễm 50% nuôi cấy mô ($\text{TCID}_{50}$) trên nền dòng tế bào thận khỉ xanh Châu Phi (Vero), kết hợp sử dụng thuốc nhuộm xanh methylen để phát hiện hiệu ứng bệnh lý tế bào.

Kết luận

Luận án của tác giả Lê Duy Cương đã hoàn thành việc đánh giá thực nghiệm tác dụng kháng ung thư đại tràng người của phối hợp virus vaccine sởi chủng Edmonston và virus vaccine quai bị chủng Urabe. Kết quả in vitro xác nhận hai chủng virus có khả năng hiệp đồng ly giải trực tiếp qua tạo hợp bào và kích hoạt con đường apoptosis trên dòng tế bào HT-29. Trên mô hình chuột nude mang khối u thực nghiệm, liệu pháp tiêm phối hợp hai virus thể hiện khả năng ức chế tăng trưởng thể tích u và kích thích các quần thể tế bào miễn dịch tự nhiên tại lách. Công trình đã cung cấp dữ liệu thực nghiệm có hệ thống về hướng tiếp cận phối hợp đa virus ly giải u trên nền tảng các chủng virus vaccine an toàn sẵn có.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu chung OV gần đây đã được công nhận là một phương pháp điều trị ung thư có nhiều hứa hẹn. OV có thể là virus tự nhiên hoặc là virus đã biến đổi gen, có khả năng nhân lên và giết chết các tế bào ung thư một cách chọn lọc mà hầu như không làm tổn hại các tế bào bình thường xung quanh. Khác với liệu pháp gen, OV không đơn thuần là một chất mang gen trị liệu, nó là tác nhân thuốc điều trị ung thư.

Giả thuyết nhiễm virus có thể kháng ung thư bắt đầu bằng phát hiện khối u bị thoái triển trong và sau khi nhiễm virus [1]. Năm 1949, có 22 bệnh nhân bị bệnh Hodgkin được điều trị bằng chế phẩm chiết xuất từ huyết thanh hoặc mô có chứa virus viêm gan, kết quả cho thấy virus làm thoái triển các khối [2]. Từ năm 1950 đến 1980, các thử nghiệm lâm sàng điều trị ung thư được thực hiện bằng các chủng virus hoang dã hoặc các virus tự nhiên, giảm độc lực, bao gồm cả virus viêm gan, virus West Nile, virus dengue và các adenovirus… [3] Tuy nhiên, những loại virus này chưa thực sự chứng minh được hiệu quả điều trị, cũng như chưa kiểm soát được độc tính với cơ thể cũng như mức độ virus nhân lên trong tế bào ung thư. Hiện nay, OV đã được công nhận là một phương pháp điều trị ung thư.

Để tăng cường cho virus nhân lên và ly giải đặc hiệu tế bào ung thư, các nhà nghiên cứu đã lựa chọn loại virus không gây bệnh cho người nhưng lại có khả năng nhằm đích các tế bào ung thư, hoặc biến đổi bộ gen virus để tăng cường khả năng nhằm đích tế bào ung thư. Đại diện cho chiến lược này là virus chủng reolysin, một biến thể của reovirus, có thuộc tính ly giải tế bào u thông qua hoạt hóa tín hiệu RAS, do đó hạn chế được mức độ gây độc cho các tế bào bình thường. Vào năm 1994, Mineta T và cộng sự đã chúng minh chủng virus herpes simplex là hrR3 đột biến mang gen lacZ của Esckerichia coli, có 4 khả năng điều trị khối u não in vivo hiệu quả hơn nhiều so với các chủng hoang dã [4]. Tác giả có thể theo dõi được chủng virus này nhân lên rất tốt trong các tế bào ung thư não và hầu như không có độc tính với tế bào lành.

Phát hiện này đã mở ra một lĩnh vực mới về thiết kế và biến đổi bộ gen của OV làm tăng hiệu quả ly giải tế bào u. OV phát triển mạnh mẽ trong suốt ba thập kỷ qua, phát hiện quan trọng nhất trong quá trình hoạt động ly giải tế bào ung thư là OV có khả năng tạo ra miễn dịch đặc hiệu chống khối u [5]. Hiện nay, vấn đề này đã được công nhận đây là tính năng quan trọng của liệu pháp OV. Có hai chủng virus biến đổi gen đã được chấp thuận để tiếp thị dưới dạng thuốc: một là Oncorine (H101) hay ONYX-015, một Adenovirus bị mất đoạn gen E1B, đã được các cơ quan có thẩm quyền phê duyệt cho điều trị ung thư đầu, cổ và ung thư thực quản ở Trung Quốc năm 2005 [6].

Cho đến nay, việc sử dụng Oncorine trên lâm sàng vẫn còn hạn chế. Hai là T-Vec, 1 chủng virus herpes biến đổi gen, được cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ chấp thuận cho điều trị u tế bào hắc tố vào tháng 10 năm 2015, sau đó được phê duyệt ở Châu Âu vào tháng 1 năm 2016 và tại Úc vào tháng 5 năm 2016 [7]. Nhiều thử nghiệm T-Vec trên lâm sàng hiện đang được các công ty dược phẩm thực hiện trên toàn thế giới nhằm mở rộng ứng dụng và thị trường. Trong số các chủng virus ly giải tế bào ung thư, chủng MeV và MuV cho thấy có nhiều tiềm năng chống ung thư.

Đến nay, MeV và MuV đã được chứng minh là có khả năng kháng nhiều loại tế bào ung thư trong đó có cả CRC in vitro, in vivo và cả trên lâm sàng ở các giai đoạn khác nhau. Ngoài tính lựa chọn đặc hiệu tế bào ung thư, MeV và MuV còn kích hoạt mạnh đáp ứng miễn dịch của vật chủ góp phần rất quan trọng vào hiệu quả ly giải tế bào ung thư [8], [9]. Ung thư đại trực tràng 1. Tình hình ung thư đại trực tràng CRC vẫn là một gánh nặng sức khỏe rất lớn cho cộng đồng.

Trên thế giới, nó là loại ung thư phổ biến thứ ba ở nam giới và phổ biến thứ hai ở nữ giới, là nguyên nhân đứng thứ ba gây tử vong liên quan đến ung thư. Trong năm 2017, ước tính có khoảng 95.520 trường hợp ung thư đại tràng và 39.910 trường hợp ung thư trực tràng mới được chẩn đoán tại Mỹ. Trong khi số liệu cho thấy ung thư đại tràng ở nam giới (47.700 trường hợp) và nữ giới (47.820 trường hợp) là khá bằng nhau, nhưng ung thư trực tràng ở nam giới (23.720 trường hợp) lại cao hơn nữ giới (16.190 trường hợp). Tỷ lệ mắc bệnh cao nhất ở thổ dân Alaska (91/100.000 người), người Mỹ gốc Phi (49/100.000 người), thấp nhất ở người Mỹ gốc Á và người dân đảo Thái Bình Dương (32/100.150 bệnh nhân nam giới và 23.110 nữ giới sẽ chết vì CRC vào năm 2017 [10].

Tỉ lệ mắc CRC rất đa dạng về tuổi, chủng tộc, sắc tộc và kiểu mắc. Ở các nước thu nhập cao, tỉ lệ ung thư đại tràng cao hơn ung thư trực tràng và tăng khởi phát sau tuổi 50 là đặc trưng của ung thư trực tràng. Tỷ lệ mắc CRC đang có xu hướng trẻ hóa người mắc. Tỉ lệ mắc CRC tiếp tục giảm ở những người từ 50 tuổi trở lên (giảm 32% kể từ năm 2000).

Có được xu hướng này là do sàng lọc CRC có hiệu quả, có thể ngăn ngừa CRC sớm bằng cách phát hiện và loại bỏ polyp tiền ung thư. Tỷ lệ mắc CRC giảm nhanh nhất ở những người từ 65 tuổi trở lên và đối với các khối u nằm ở đại tràng xa. Trong khi đó tỷ lệ giảm chậm nhất ở những người từ 50-64 tuổi và đối với các khối u trực tràng (giảm 9% tỷ lệ mắc khối u trực tràng ở nam giới từ 50-64 tuổi và giảm không đáng kể ở phụ nữ trong độ tuổi này; giảm 38% ở nam giới và 41% nữ giới ở độ tuổi từ 65 tuổi trở lên). Tỷ lệ mắc CRC ở những người từ 50 tuổi trở lên đang giảm ở hầu hết các tiểu bang của Mỹ, với mức giảm hơn 5% hàng năm từ năm 2009-2013 tại bảy tiểu bang (Nebraska, Maine, Rhode 6 Island, Delaware, Massachusetts, South Dakota và California).

Đáng chú ý, các bang có tỷ lệ mắc cao nhất như: bang Kentucky, Mississippi và Louisiana. Trái ngược hoàn toàn với xu hướng tỷ lệ mắc CRC ở những người từ 50 tuổi trở lên, tỷ lệ mới mắc ở những người dưới 50 tuổi tiếp tục tăng, tăng 22% từ năm 2000-2013. Tương tự như mô hình tỷ lệ mắc, tỷ lệ tử vong của CRC giảm 34% ở những người từ 50 tuổi trở lên trong giai đoạn 2000-2014, nhưng lại tăng 13% ở những người dưới 50 tuổi [10]. Năm 2012, dữ liệu từ GLOBOCAN cho thấy tỉ lệ mắc CRC cao nhất ở Australia, New Zealand, Europe, Bắc Mỹ, tỉ lệ mắc thấp nhất được tìm thấy ở Châu Phi và Trung Nam Châu Á.

Tỉ lệ mắc CRC ở các khu vực khác nhau về địa lý có thể là do thay đổi ở chế độ ăn uống, môi trường tiếp xúc kết hợp với sự nhạy cảm về di truyền đã có từ trước ở từng khu vực [11]. Tình trạng kinh tế xã hội thấp cũng liên quan với việc gia tăng nguy cơ phát triển CRC, nguy cơ CRC tăng lên ở nơi tình trạng kinh tế xã hội thấp. Các nguy cơ có khả năng thay đổi được như: không hoạt động thể chất, chế độ ăn uống không khoa học, hút thuốc lá, và béo phì… chiếm một tỉ lệ đáng kể [12]. Các yếu tố khác, đặc biệt là mạng lưới y tế dự phòng CRC kém ở các nước điều kiện kinh tế thấp cũng góp phần đáng kể làm tăng tỉ lệ bị CRC.

Nguyên nhân ung thư đại trực tràng Ung thư đã được xác định là do biến đổi DNA trong tế bào gây ra. DNA là một chất trong nhân tế bào chứa đựng các gen điều khiển chức năng tế bào. Hiện nay, hiểu biết về các biến đổi DNA làm cho tế bào bình thường chuyển thành ung thư đã rõ ràng hơn. Trong DNA có những gen với chức năng điều khiển tăng trưởng tế bào, chia tách, chết tế bào, có các gen gây ung thư và gen ức chế khối u… Đáng chú ý, quá trình hình thành ung thư là do các đột biến DNA làm cho gen gây ung thư hoạt động hoặc làm bất hoạt gen ức chế khối u.

Ngoài ra, sự thay đổi trong một số gen khác cũng có vai trò gây ra CRC. Đột biến gen di truyền Bệnh đa polyp tuyến và hội chứng Gardner: là do các đột biến di chuyền ở gen coli gây polyp tuyến (APC), đây là một gen ức chế khối u, bình thường nó duy trì tế bào tăng trưởng trong giới hạn kiểm soát. Những người bị đột biến ở gen này, sự kìm hãm phát triển khối u trong tế bào bị “tắt”, do đó, hình thành hàng trăm polyp ở đại tràng. Theo thời gian, các đột biến gen mới tiếp theo sẽ xảy ra ở tế bào trong các polyp này và hình thành ung thư.

Hội chứng Lynch: là do những biến đổi ở các gen hỗ trợ sửa chữa DNA. Đột biến một trong các gen mã hóa các enzyme sửa chữa DNA làm cho DNA bắt cặp sai, dẫn đến phát triển ung thư. Hội chứng Peutz-Jeghers: là do những biến đổi di truyền ở gen ức chế khối u, làm chúng không hoạt động và kết quả là hình thánh các khối u. Các đột biến gen mắc phải Một số đột biến gen xảy ra trong thời gian sống và không truyền qua các thế hệ, chúng chỉ có ở các tế bào sinh ra từ tế bào gốc bị đột biến.

Trong hầu hết các trường hợp bị CRC, đột biến gen mắc phải gây ra ung thư nhiều hơn so với các đột biến gen di truyền. Các yếu tố nguy cơ CRC đóng một vai trò quan trọng trong việc tạo ra các đột biến mắc phải. Không có đột biến gen đơn gây ra CRC, hầu hết đột biến đầu tiên xảy ra ở gen ức chế khối u hay gen gây ung thư, dẫn đến tế bào đại trực tràng tăng sinh không kiểm soát, các đột biến tiếp theo có thể xảy ra sau đó ở các gen khác và gây ra CRC. Cơ chế bệnh sinh của ung thư đại trực tràng 1.