Luận án về sinh khả dụng và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin

Nghiên cứu bào chế phytosome silybin, đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan, mang lại tiềm năng điều trị mới.

• Tác giả: Đặng Trường Giang
• Người hướng dẫn: Nguyễn Hữu Mỹ
• Trường học: Học viện Quân y
• Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm và bào chế thuốc
• Đề tài: Nghiên Cứu Sinh Khả Dụng Và Tác Dụng Bảo Vệ Gan Của Phytosome Silybin
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ SILYBIN
• 1.1. Công thức hóa học
• 1.2. Dược động học
• 1.3. Công dụng, liều dùng, tác dụng không mong muốn
• 1.4. Một số biện pháp cải thiện sinh khả dụng đường uống của silybin
• 1.5. Thành phần của phytosome
• 1.6. Ưu, nhược điểm của phytosome
• 1.7. Phương pháp bào chế phytosome
• 1.8. Các chỉ tiêu đánh giá phytosome
• 1.9. Một số nghiên cứu về bào chế phytosome silybin
• 1.10. MỘT SỐ NỘI DUNG ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO GAN CỦA PHYTOSOME
• 1.10.1. Nội dung đánh giá sinh khả dụng của phytosome
• 1.10.2. Nội dung đánh giá tác dụng bảo vệ gan của phytosome
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
• 2.1.1. Nguyên vật liệu
• 2.1.2. Thiết bị nghiên cứu
• 2.1.3. Động vật thí nghiệm
• 2.1.4. Địa điểm thực hiện nghiên cứu
• 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu bào chế phytosome silybin
• 2.2.2. Nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng, độc tính cấp, bán trường diễn và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin
• 2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. KẾT QUẢ BÀO CHẾ PHYTOSOME SILYBIN
• 3.1.1. Kết quả nghiên cứu một số tính chất của silybin và phospholipid
• 3.1.2. Kết quả nghiên cứu bào chế phytosome silybin quy mô phòng thí nghiệm
• 3.1.3. Kết quả bào chế, đánh giá một số đặc tính và chỉ tiêu chất lượng của phytosome silybin ở quy mô 150g/mẻ
• 3.1.4. Theo dõi độ ổn định của phytosome silybin
• 3.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG, ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO GAN CỦA PHYTOSOME SILYBIN
• 3.2.1. Kết quả đánh giá sinh khả dụng của phytosome silybin
• 3.2.2. Kết quả đánh giá tác dụng độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của phytosome silybin trên thực nghiệm
• 3.2.3. Kết quả nghiên cứu tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin trên chuột cống trắng thực nghiệm
• 4. CHƯƠNG 4: VỀ NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ PHYTOSOME SILYBIN
• 4.1. Về nghiên cứu một số tính chất của silybin và phospholipid
• 4.2. Về nghiên cứu bào chế phytosome silybin quy mô phòng thí nghiệm
• 4.3. Về đánh giá một số đặc tính của phytosome silybin
• 4.4. Về theo dõi độ ổn định của phytosome silybin
• 4.5. VỀ ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG, ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO GAN CỦA PHYTOSOME SILYBIN
• 4.5.1. Về đánh giá sinh khả dụng của phytosome silybin
• 4.5.2. Về đánh giá độc tính của phytosome silybin
• 4.5.3. Về đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin
• 4.6. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
• KẾT LUẬN
• KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về silybin

Silybin, một flavonoid chính trong cây kế sữa, có nhiều tác dụng sinh học quan trọng, đặc biệt là trong việc bảo vệ gan. Tuy nhiên, sinh khả dụng của silybin qua đường uống rất thấp do độ tan kém và tính thấm hạn chế. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng phytosome là một phương pháp hiệu quả để cải thiện sinh khả dụng của silybin. Phytosome kết hợp silybin với phospholipid, tạo ra cấu trúc tương tự màng tế bào, giúp tăng cường khả năng hấp thu qua đường tiêu hóa. Nghiên cứu cho thấy rằng phytosome có thể cải thiện đáng kể khả năng hấp thu và giảm thiểu chuyển hóa bước 1 qua gan, từ đó nâng cao hiệu quả điều trị.

1.1. Tác dụng của silybin

Silybin có tác dụng chống oxy hóa mạnh, giúp bảo vệ tế bào gan khỏi tổn thương do các tác nhân độc hại như rượu và thuốc. Nghiên cứu đã chứng minh rằng silybin có khả năng ức chế sự hình thành gốc tự do, từ đó giảm thiểu tổn thương tế bào. Tác dụng này không chỉ giúp cải thiện chức năng gan mà còn hỗ trợ tái tạo tế bào gan. Tuy nhiên, để phát huy tối đa tác dụng của silybin, việc cải thiện sinh khả dụng là rất cần thiết.

II. Phytosome và ứng dụng trong bảo vệ gan

Phytosome là một dạng bào chế mới, kết hợp giữa các hoạt chất tự nhiên và phospholipid, giúp cải thiện đáng kể sinh khả dụng của các hoạt chất như silybin. Phytosome không chỉ tăng cường độ tan mà còn cải thiện khả năng hấp thu qua màng tế bào. Nghiên cứu cho thấy rằng phytosome silybin có thể được hấp thu qua cơ chế chủ động, giúp giảm thiểu chuyển hóa bước 1 qua gan. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao hiệu quả điều trị các bệnh liên quan đến gan.

2.1. Tác dụng bảo vệ gan của phytosome silybin

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng phytosome silybin có tác dụng bảo vệ tế bào gan hiệu quả hơn so với silybin thông thường. Các thí nghiệm trên chuột cho thấy phytosome silybin giúp giảm thiểu tổn thương gan do các tác nhân độc hại, đồng thời cải thiện các chỉ số chức năng gan như ALT và AST. Điều này cho thấy rằng phytosome không chỉ cải thiện sinh khả dụng mà còn nâng cao tác dụng bảo vệ gan của silybin.

III. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy phytosome silybin có khả năng cải thiện sinh khả dụng và tác dụng bảo vệ gan một cách rõ rệt. Các chỉ tiêu đánh giá cho thấy phytosome silybin có độ ổn định cao và khả năng hấp thu tốt hơn so với dạng silybin thông thường. Điều này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các sản phẩm bảo vệ sức khỏe từ silybin, đặc biệt là trong lĩnh vực dược phẩm và thực phẩm chức năng.

3.1. Ứng dụng trong sản xuất dược phẩm

Phytosome silybin có thể được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất các chế phẩm bảo vệ gan. Việc cải thiện sinh khả dụng của silybin thông qua phytosome không chỉ giúp nâng cao hiệu quả điều trị mà còn giảm thiểu tác dụng phụ. Các sản phẩm từ phytosome silybin có thể trở thành lựa chọn hàng đầu cho những người có nguy cơ mắc bệnh gan, đồng thời góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ dược học với đề tài "Nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin" được thực hiện bởi nghiên sinh Đặng Trường Giang dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Nguyễn Hữu Mỹ và TS. Nguyễn Văn Long tại Học viện Quân y vào năm 2023. Đề tài thuộc chuyên ngành Công nghệ dược phẩm và bào chế thuốc, mã số đào tạo 972 02 02.

Về tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu, silybin là thành phần hoạt chất chính chiếm tỷ lệ từ 50% đến 70% trong nhóm flavonoid chiết xuất từ quả và hạt cây Kế sữa (Silybum marianum (L.) Gaertn), họ Cúc (Asteraceae). Hoạt chất này đã được chứng minh có tác dụng chống oxy hóa, ức chế hủy hoại tế bào gan do rượu và hóa chất, kích thích tái tạo nhu mô gan và cải thiện chức năng gan mật. Tuy nhiên, silybin được xếp vào nhóm IV theo Hệ thống phân loại sinh dược học (BCS) do đặc tính đồng thời ít tan trong nước (độ tan dưới 0,04 mg/mL) và tính thấm qua màng sinh học kém (hệ số thấm $P_{app} < 2 \times 10^{-6}\text{ cm/s}$), dẫn đến sinh khả dụng đường uống rất thấp (chỉ đạt khoảng 0,73% trên mô hình chuột cống). Ngoài ra, silybin bị chuyển hóa bước một mạnh mẽ tại gan và thải trừ nhanh chóng qua dịch mật. Tại Việt Nam, trước thời điểm nghiên cứu chưa có công trình nào công bố về quy trình bào chế phytosome silybin hoàn chỉnh, nguồn nguyên liệu phytosome thương mại chủ yếu phải nhập khẩu với giá thành cao. Do đó, việc nghiên cứu công nghệ bào chế phức hợp phytosome silybin nhằm nâng cao độ tan, tính thấm, cải thiện sinh khả dụng và đánh giá an toàn, hiệu quả bảo vệ gan là một yêu cầu thực tiễn của ngành dược phẩm.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm hai nội dung chính:

1. Bào chế được phytosome silybin quy mô phòng thí nghiệm (đạt quy mô 150 g/mẻ, đánh giá các đặc tính lý hóa, độ ổn định và xây dựng dự thảo tiêu chuẩn cơ sở).
2. Đánh giá được sinh khả dụng, độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin trên thực nghiệm (in vivo).

Đối tượng nghiên cứu bao gồm: nguyên liệu silybin chiết xuất tự nhiên (độ tinh khiết $\ge 95%$, gồm hai đồng phân diastereomer là silybin A và silybin B), phosphatidylcholin (PC) đậu nành (độ tinh khiết 50% và 90%), phức hợp phytosome silybin dạng hỗn dịch và dạng bột phun sấy (kết hợp tá dược maltodextrin và aerosil). Đối tượng sinh học phục vụ thử nghiệm gồm có: chó ta giống đực khỏe mạnh (khối lượng 10–12 kg) dùng để đánh giá dược động học và sinh khả dụng; chuột nhắt trắng chủng Swiss (18–22 g) và chuột cống trắng chủng Wistar giống cái (190 ± 20 g) dùng để đánh giá độc tính cấp; chuột cống trắng Wistar cả hai giống (180 ± 20 g) dùng để đánh giá độc tính bán trường diễn trong 28 ngày; chuột cống trắng (120 ± 20 g) dùng để thử nghiệm tác dụng bảo vệ tế bào gan trên mô hình gây độc bằng paracetamol.

Phạm vi không gian và thời gian: Nghiên cứu được triển khai thực hiện và hoàn thành tại Trung tâm Nghiên cứu, Ứng dụng và Sản xuất thuốc - Học viện Quân y, phối hợp cùng Bộ môn Dược lý - Trường Đại học Y Hà Nội, Trung tâm Nghiên cứu động vật thực nghiệm - Học viện Quân y, Khoa Hóa học và Khoa Vật lý - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (Đại học Quốc gia Hà Nội), Viện Khoa học vật liệu và Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã tổng quan hệ thống các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến cấu trúc hóa học, dược động học của silybin cũng như các hệ phân phối thuốc nhằm cải thiện sinh khả dụng của hoạt chất này:

Về cấu trúc và dược động học của silybin: Tác giả Biedermann D. và cộng sự (2014) xác định công thức phân tử silybin là $\text{C}{25}\text{H}{22}\text{O}{10}$ (khối lượng phân tử 482,44 g/mol), cấu trúc phân tử gồm khung taxifolin liên kết với đơn vị conyferil alcohol qua cầu nối oxeran, tồn tại dưới hai dạng đồng phân quang học là silybin A và silybin B với tỷ lệ xấp xỉ 1:1. Tác giả Wu J. và cộng sự chứng minh sinh khả dụng đường uống của silybin nguyên liệu trên chuột cống chỉ đạt 0,73%. Về chuyển hóa và thải trừ, tác giả Xie Y. và cộng sự (2019) mô tả silybin sau khi hấp thu bị chuyển hóa pha I qua hệ enzym cytochrom P450 tạo O-demethylated silybin và mono/dihydroxy silybin; chuyển hóa pha II tạo các dẫn xuất liên hợp monoglucuronid, diglucuronid và sulfat. Hoạt chất thải trừ chủ yếu qua đường mật (chiếm khoảng 80%) nhờ chất vận chuyển qua màng MRP2, trong khi bài tiết qua nước tiểu rất thấp (1–2% đến 3–8%). Thời gian bán thải ($t{1/2}$) của silybin tự do ngắn, chỉ từ 1 đến 3 giờ.

Về các giải pháp công nghệ nâng cao sinh khả dụng của silybin:

• Hệ nano hỗn dịch/nhũ tương: Parveen R. và cộng sự cải thiện độ ổn định của silymarin bằng nano nhũ tương chứa Tween 80; hệ phân tán chứa lecithin 0,2% và poloxamer 188 0,1% trên chó Beagle đạt diện tích dưới đường cong $\text{AUC}_{0-\infty}$ là 9,552 mg$\cdot$h so với dạng thô.
• Hệ phân phối thuốc tự vi nhũ hóa (SMEDDS): Li X. và cộng sự bào chế hệ silymarin/ethyl linoleat/Cremophor EL/ethanol làm tăng độ hòa tan của silymarin lên 327 lần và tăng sinh khả dụng gấp 2,2 lần so với chế phẩm đối chứng Legalon®. Wu W. và cộng sự chứng minh hệ SMEDDS trên thỏ làm tăng sinh khả dụng tương đối gấp 1,88 đến 48,82 lần. Một nghiên cứu khác dùng hệ silymarin/glyceryl monooleat/polysorbat 20/HCO-50 trên chuột đạt $C_{max}$ $24,79 \pm 4,69\text{ }\mu\text{g/mL}$ so với viên Legalon® ($3,47 \pm 0,20\text{ }\mu\text{g/mL}$).
• Hệ phân tán rắn: Sử dụng chất mang PVP và Tween 80 theo tỷ lệ 5/2,5/2,5 (kl/kl) làm tăng độ tan gấp 650 lần, nâng giá trị $\text{AUC}_{0-24h}$ trên chuột từ 157,04 lên $366,49\text{ }\mu\text{g/mL}\cdot\text{h}$.
• Hệ liposome: Kumar N. và cộng sự (2014) ghi nhận liposome silymarin giải phóng 98,57% ở pH 1,2 và làm tăng $\text{AUC}{0-24h}$ gấp 3,5 lần; Gandey S. và cộng sự (2021) trên chuột Wistar ghi nhận liposome silybin đạt $C{max}$ $720,20\text{ ng/mL}$ so với $140,25\text{ ng/mL}$ của silybin thô.
• Hệ phytosome: Nghiên cứu trên mô hình chó ghi nhận phức hợp silybin-phosphatidylcholin đạt $C_{max}$ $1310 \pm 880\text{ ng/mL}$ và $\text{AUC}{0-24h}$ đạt $11200 \pm 6520\text{ ng/mL}\cdot\text{h}$, cao hơn rõ rệt so với cao chiết silymarin ($C{max}$ $472\text{ ng/mL}$, $\text{AUC}$ $3720\text{ ng/mL}\cdot\text{h}$). Yanyu X. và cộng sự (2006) bào chế phytosome silybin bằng dung môi ethanol khan, ghi nhận trên chuột cống giá trị $C_{max}$ đạt $126,72\text{ ng/mL}$ và $\text{AUC}_{0-\infty}$ đạt $1020,33\text{ ng/mL}\cdot\text{h}$ (so với silybin-N-methylglucamin là $104,29\text{ ng/mL}$ và $235,81\text{ ng/mL}\cdot\text{h}$), đồng thời độ tan trong nước tăng từ $40,83\text{ }\mu\text{g/mL}$ lên $78,25\text{ }\mu\text{g/mL}$ và trong n-octanol tăng từ $0,72\text{ }\mu\text{g/mL}$ lên $62,67\text{ }\mu\text{g/mL}$.

Về khoảng trống nghiên cứu mà luận án lựa chọn giải quyết: Mặc dù các hệ nano nhũ tương, SMEDDS, phân tán rắn và liposome đều cải thiện độ hòa tan nhưng tồn tại các nhược điểm kỹ thuật như sử dụng lượng lớn chất diện hoạt dễ gây kích ứng đường tiêu hóa, tính kém bền nhiệt động học, hiện tượng di chuyển dung môi làm biến tính vỏ nang gelatin, tá dược polymer dễ hút ẩm gây tái kết tinh hoạt chất hoặc tỷ lệ nạp thuốc thấp và dễ rò rỉ dược chất. Ngược lại, phytosome tạo phức hợp liên kết hydro giữa phân tử silybin và đầu phân cực phosphatidylcholin theo tỷ lệ mol xác định (tỷ lệ tải dược chất cao), tạo cấu trúc tương tự màng sinh học giúp hấp thu chủ động qua tế bào M ruột non vào hệ bạch huyết, tránh chuyển hóa qua gan. Luận án lựa chọn giải quyết khoảng trống: khảo sát các yếu tố công nghệ tạo phức hợp phytosome silybin bằng hệ dung môi thân thiện môi trường; tối ưu hóa quá trình hydrat hóa và sấy phun tạo bột rắn ở quy mô pilot phòng thí nghiệm 150 g/mẻ; thẩm định toàn diện các phương pháp phân tích, cấu trúc vi mô, độ ổn định và đánh giá đồng bộ sinh khả dụng in vivo, độc tính an toàn và tác dụng dược lý bảo vệ tế bào gan.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án được xây dựng dựa trên cơ sở lý thuyết về phức hợp phytosome giữa polyphenol/flavonoid với phospholipid. Phân tử phosphatidylcholin là chất diện hoạt lưỡng cực có đầu phosphatidylcholin thân nước mang điện tích và hai đuôi acid béo thân dầu. Phức hợp phytosome hình thành nhờ liên kết hydro giữa nguyên tử hydro linh động của nhóm hydroxy (-OH) trên khung flavonolignan của silybin với nhóm phosphat mang điện âm hoặc phần cholin của phosphatidylcholin. Khi phân tán vào môi trường nước, phức hợp tự sắp xếp tạo thành cấu trúc micell tương tự màng lipid kép của tế bào sinh học, giúp cải thiện độ hòa tan trong dịch vị và tăng cường khả năng khuếch tán qua lớp chất nhầy niêm mạc ruột.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được triển khai theo quy trình thực nghiệm định lượng chuẩn hóa:

1. Phương pháp phân tích và kiểm nghiệm hóa lý:

• Định lượng đồng thời silybin A và silybin B: Sử dụng hệ thống HPLC Waters e2695, detector PDA 2998 ở bước sóng 288 nm; cột Luna C18 ($250 \times 4,6\text{ mm}$, $5\text{ }\mu\text{m}$); nhiệt độ cột 40°C; tốc độ dòng 1,0 mL/phút. Pha động gồm hệ gradient methanol (A) và dung dịch acid phosphoric 0,5% trong nước (B) hoặc chạy đẳng dòng methanol : dung dịch acid phosphoric 0,5% (55:45). Phương pháp được thẩm định theo hướng dẫn ICH về tính tương thích hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại ($RSD \le 2%$), độ đúng (thu hồi 95,0–105,0%), LOD và LOQ.
• Định lượng phosphatidylcholin: Thực hiện trên hệ thống HPLC ở bước sóng 205 nm, pha động acetonitril : methanol : nước đẳng dòng.
• Xác định tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa (EE%): Tách silybin tự do bằng dung môi hòa tan chọn lọc (chloroform), silybin dạng phytosome hòa tan hoàn toàn trong chloroform trong khi silybin tự do không tan, sau đó ly tâm và định lượng bằng HPLC.
• Phân tích cấu trúc phân tử và trạng thái nhiệt: Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR Jasco 4700 LE); nhiệt quét vi sai (DSC8231 Rigaku); nhiễu xạ tia X (XRD D8 Advance Bruker); cộng hưởng từ hạt nhân đồng vị ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, $^{31}\text{P}$-NMR Bruker Ascend 500 MHz); phổ khối lượng phân giải cao (MS LTQ Orbitrap XL).
• Đánh giá đặc tính tiểu phân: Kích thước tiểu phân (KTTP), chỉ số đa phân tán (PDI) và thế Zeta đo bằng máy tán xạ ánh sáng động học Horiba ZT-100-Z; hình thái bề mặt và cấu trúc vi mô quan sát qua kính hiển vi điện tử quét (SEM Hitachi S-4800) và kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM JEM-2100).
• Khảo sát độ tan, hệ số phân bố dầu - nước ($\log P$) và độ hòa tan: Đo độ hòa tan in vitro bằng thiết bị cánh khuấy Copley NE6-COPD trong môi trường pH 1,2 (dịch dạ dày giả định) và pH 6,8 (dịch ruột giả định).

2. Phương pháp đánh giá sinh học in vivo:

• Thử nghiệm sinh khả dụng và dược động học: Thiết kế nghiên cứu đơn liều, chéo $2 \times 2$ trên 6 cá thể chó ta giống đực (10–12 kg), chia 2 giai đoạn thử thuốc cách nhau 7 ngày rửa trôi. Mẫu máu tĩnh mạch lấy tại các mốc thời gian từ 0 đến 24 giờ sau khi cho uống silybin nguyên liệu hoặc bột phytosome silybin. Huyết tương được xử lý tủa protein, chiết tách hoạt chất và định lượng bằng HPLC. Các thông số dược động học gồm $C_{max}$, $T_{max}$, $\text{AUC}{0-24h}$, $\text{AUC}{0-\infty}$, $t_{1/2}$, MRT được xử lý bằng phần mềm chuyên dụng.
• Đánh giá độc tính cấp: Xác định liều gây chết 50% ($LD_{50}$) hoặc liều dung nạp tối đa ($D_{max}$) theo đường uống trên chuột cống trắng Wistar và chuột nhắt trắng Swiss theo hướng dẫn của OECD.
• Đánh giá độc tính bán trường diễn: Chuột cống trắng được cho uống phytosome silybin hàng ngày liên tục trong 28 ngày tại Bộ môn Dược lý - Trường Đại học Y Hà Nội; theo dõi sự phát triển thể trọng, các chỉ số huyết học (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu), sinh hóa chức năng gan thận (AST, ALT, creatinin, ure, protein toàn phần) và giải phẫu bệnh vi thể gan, thận.
• Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan: Gây tổn thương gan cấp tính bằng paracetamol (PAR) liều đơn trên chuột cống trắng; chuột được uống thuốc thử nghiệm dự phòng và điều trị trước/sau gây độc; đánh giá mức độ giảm hoạt độ enzym AST, ALT trong huyết thanh và kiểm tra tổn thương hoại tử nhu mô gan trên tiêu bản mô bệnh học nhuộm Hematoxylin - Eosin (HE phóng đại 200/400 lần).

Nguồn tư liệu và dữ liệu phân tích: Dữ liệu thực nghiệm thu thập trực tiếp từ các lô mẻ bào chế, các bản ghi phổ phân tích hóa lý, tín hiệu sắc ký đồ HPLC, thông số huyết học, sinh hóa trên hệ thống Beckman Coulter AU5800/AU680 và ảnh chụp vi thể quang học, điện tử.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan về silybin

Chương 1 tổng thuật các cơ sở khoa học về nguồn gốc tự nhiên, cấu trúc hóa học, tính chất lý hóa, tác dụng sinh học và các đặc tính dược động học của silybin. Về hóa tính, silybin có 5 nhóm hydroxy (-OH) bao gồm ba nhóm phenolic (tại C-5, C-7, C-20), một nhóm ancol bậc hai (tại C-3) và một nhóm ancol bậc một (tại C-23), trong đó nhóm 5-OH liên kết hydro nội phân tử với nhóm oxo liền kề, còn nhóm 7-OH có khả năng phản ứng mạnh nhất do ít bị cản trở không gian. Về tính chất dược lý, silybin thể hiện khả năng chống oxy hóa qua việc quét gốc tự do superoxid anion, nitric oxid, ức chế peroxy hóa lipid màng, duy trì nồng độ glutathion nội bào; chống viêm thông qua ức chế yếu tố phiên mã NF-$\kappa$B và enzym cyclooxygenase (COX); chống xơ gan nhờ giảm biểu hiện các cytokin tăng sinh tế bào sợi và tạo phức chelat với ion sắt; ức chế virus viêm gan B (trên dòng HepG2, Hep3B) và viêm gan C (ức chế RNA polymerase phụ thuộc RNA với $\text{IC}_{50}$ từ 75 đến $100\text{ }\mu\text{M}$).

Chương này phân tích chi tiết cơ chế hình thành phức hợp phytosome, phân loại phospholipid tự nhiên/tổng hợp và các phương pháp bào chế (phương pháp bốc hơi dung môi, kết tủa kháng dung môi, phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn). Các tài liệu tổng kết cho thấy tỷ lệ mol hoạt chất/phospholipid trong phytosome thường dao động từ 1:1 đến 1:3; các dung môi aprotic như tetrahydrofuran (THF), aceton, dichloromethan (DCM) hoặc dung môi protic như ethanol khan được sử dụng tùy thuộc vào độ tan của hoạt chất và lipid. Tác giả cũng tổng quan các phương pháp xử lý dịch sinh học để định lượng hoạt chất trong đánh giá sinh khả dụng và các mô hình tổn thương gan thực nghiệm do hóa chất.

Chương 2. Nguyên vật liệu, thiết bị và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy chuẩn nguyên vật liệu, hệ thống máy móc phân tích và thiết kế thực nghiệm:

• Nguyên liệu: Silybin tinh khiết 95%, phosphatidylcholin 50% và 90%, chất chuẩn đối chiếu Silybin (98,0%), chuẩn PC (99,0%), chuẩn Catechin (97,0%) từ Sigma-Aldrich; tá dược mang maltodextrin (MD) và aerosil (AE); dung môi ethanol tuyệt đối, tetrahydrofuran (TKPT), methanol HPLC, chloroform, n-octanol.
• Thiết bị: Máy cất quay chân không Buchi/EYELA N1200B; máy sấy phun sương LPG5; hệ thống HPLC Waters e2695 đầu dò PDA 2998; kính hiển vi điện tử SEM HITACHI S-4800 và TEM JEM-2100; máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Ascend 500; máy khối phổ phân giải cao Orbitrap XL; máy đo kích xạ Horiba ZT-100-Z; máy quét nhiệt DSC8231 Rigaku; nhiễu xạ kế tia X D8 Advance Bruker; máy đo độ hòa tan Copley NE6-COPD; máy sinh hóa tự động Beckman Coulter AU5800/AU680.
• Quy trình nghiên cứu: Xây dựng và thẩm định các quy trình định lượng HPLC; khảo sát độ tan của silybin trong các dung môi (ethanol, THF, chloroform, nước cất, n-octanol); khảo sát độ bền nhiệt của silybin và PC; tối ưu hóa thông số tạo phức hợp phytosome (tỷ lệ mol Si:PC, loại dung môi, nhiệt độ, thời gian phản ứng, nồng độ); nghiên cứu quá trình phân tán hydrat hóa và phun sấy bột phytosome với tá dược chống dính/độn; thiết kế nghiên cứu dược động học chéo trên chó và các mô hình thử nghiệm độc tính, bảo vệ gan in vivo trên chuột.

                  +----------------------------------------------+
                  |           Silybin + Phosphatidylcholin       |
                  +----------------------------------------------+
                                         |
                                         v
                  +----------------------------------------------+
                  |  Phản ứng tạo phức trong EtOH tuyệt đối:THF  |
                  |     (Tỷ lệ mol Si:PC 1:3, 50°C, 4 giờ)       |
                  +----------------------------------------------+
                                         |
                                         v
                  +----------------------------------------------+
                  |     Bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm       |
                  +----------------------------------------------+
                                         |
                                         v
                  +----------------------------------------------+
                  | Hydrat hóa tạo hỗn dịch phytosome nano thô   |
                  +----------------------------------------------+
                                         |
                                         v
                  +----------------------------------------------+
                  | Phun sấy với tá dược mang (Maltodextrin, AE) |
                  |            -> Thu bột phytosome silybin      |
                  +----------------------------------------------+

Chương 3. Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình bào chế, đánh giá hóa lý, độ ổn định, sinh khả dụng và dược lý:

1. Kết quả bào chế và xác định đặc tính phytosome silybin:

• Thẩm định phương pháp định lượng HPLC: Thời gian lưu của silybin A và silybin B tách rời rõ nét, độ lặp lại có $RSD < 2%$, đường chuẩn tuyến tính đạt $R^2 \ge 0,999$ trong khoảng nồng độ 5–200 $\mu\text{g/mL}$, tỷ lệ thu hồi đạt 98,5–101,2%.
• Độ tan và độ bền nhiệt: Silybin tan tốt nhất trong THF ($> 150\text{ mg/mL}$) và tan vừa phải trong ethanol tuyệt đối ($14,2\text{ mg/mL}$), không tan trong chloroform ($< 0,05\text{ mg/mL}$). Hệ dung môi EtOH tuyệt đối : THF tỷ lệ 97:3 (tt/tt) hòa tan hoàn toàn cả hai thành phần ở nồng độ phản ứng. Silybin và PC đều bền vững về cấu trúc hóa học và phổ FTIR khi gia nhiệt đến 60°C trong 24 giờ.
• Thông số tạo phức: Tỷ lệ mol silybin : PC tối ưu là 1:3; nhiệt độ phản ứng 50°C; thời gian khuấy phản ứng 4 giờ; tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa (EE%) đạt trên 95%.
• Bào chế bột phun sấy quy mô 150 g/mẻ: Phức hợp Si-PC sau khi bốc hơi dung môi được phân tán trong nước (hydrat hóa), phối hợp tá dược maltodextrin và aerosil theo tỷ lệ thích hợp, tiến hành phun sấy bằng thiết bị LPG5 thu được bột tơi mịn màu vàng nhạt.

Thông số / Chỉ tiêu đánh giá	Silybin nguyên liệu	Phức hợp Si-PC khô	Bột phytosome silybin (150 g/mẻ)
Trạng thái vật lý	Bột kết tinh màu vàng nhạt	Khối dẻo sáp vô định hình	Bột tơi xốp, màu vàng sáng
Độ tan trong nước ($\mu\text{g/mL}$)	$38,42 \pm 1,15$	$92,15 \pm 2,40$	$128,60 \pm 3,52$
Hệ số phân bố dầu - nước ($\log P$)	$0,85 \pm 0,06$	$1,94 \pm 0,08$	$1,82 \pm 0,07$
Kích thước tiểu phân trung bình (nm)	Không phân tán hạt nano	$168,5 \pm 8,2$	$185,4 \pm 6,7$
Chỉ số đa phân tán (PDI)	-	$0,245 \pm 0,018$	$0,268 \pm 0,022$
Thế Zeta (mV)	-	$-38,2 \pm 1,5$	$-35,6 \pm 1,8$
Tỷ lệ hòa tan tại pH 6,8 sau 60 phút (%)	$18,25 \pm 1,42$	$74,80 \pm 2,15$	$88,65 \pm 1,95$
Tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa (EE%)	-	$96,4 \pm 0,8%$	$95,2 \pm 1,1%$

• Chứng minh tạo phức: Phổ DSC cho thấy biến mất đỉnh nóng chảy sắc nhọn của silybin ở 162–163°C; giản đồ XRD cho thấy các đỉnh nhiễu xạ tinh thể của silybin biến mất hoàn toàn, chuyển sang dạng vô định hình; phổ FTIR ghi nhận sự dịch chuyển và mở rộng số sóng của nhóm hydroxy (-OH) và liên kết $P=O$; phổ $^1\text{H}$-NMR và $^{13}\text{C}$-NMR khẳng định liên kết hydro giữa các proton phenolic của silybin với vùng đầu phân cực của phosphatidylcholin.
• Độ ổn định: Sau 6 tháng bảo quản ở điều kiện thực ($30^\circ\text{C} \pm 2^\circ\text{C}$, $\text{RH } 75% \pm 5%$) và điều kiện lão hóa cấp tốc ($40^\circ\text{C} \pm 2^\circ\text{C}$, $\text{RH } 75% \pm 5%$), các chỉ tiêu cảm quan, hàm lượng hoạt chất, độ ẩm, KTTP, thế Zeta và độ hòa tan của bột phytosome silybin không thay đổi có ý nghĩa thống kê.

2. Kết quả đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ gan:

• Dược động học trên chó: Sau khi uống bột phytosome silybin, nồng độ đỉnh trong huyết tương ($C_{max}$) và diện tích dưới đường cong ($\text{AUC}{0-24h}$, $\text{AUC}{0-\infty}$) tăng gấp nhiều lần so với silybin nguyên liệu; tốc độ hấp thu nhanh hơn, thời gian lưu trú trung bình (MRT) kéo dài hơn. Sinh khả dụng tương đối của phytosome silybin đạt mức tăng từ 3 đến 5 lần so với silybin thô.
• Độc tính cấp: Uống phytosome silybin ở liều tối đa có thể đưa qua đường tiêu hóa ($D_{max}$) trên chuột nhắt trắng và chuột cống trắng không ghi nhận cá thể nào bị chết, không xuất hiện triệu chứng ngộ độc cấp tính; không xác định được giá trị $LD_{50}$.
• Độc tính bán trường diễn: Sau 28 ngày dùng thuốc liều lặp lại trên chuột cống, các chỉ số huyết học, chức năng gan (AST, ALT), chức năng thận (creatinin, ure) và mô bệnh học cấu trúc vi thể gan, thận không có sự khác biệt so với lô đối chứng sinh lý.
• Tác dụng bảo vệ tế bào gan: Trên mô hình chuột cống bị gây tổn thương gan cấp tính bằng paracetamol, lô dùng phytosome silybin có hoạt độ men gan AST và ALT trong huyết thanh giảm có ý nghĩa thống kê ($p < 0,05$) so với lô mô hình đối chứng bệnh lý không điều trị; hiệu quả hạ men gan và giảm tỷ lệ hoại tử tế bào gan trung tâm tiểu thùy của phytosome silybin cao hơn rõ rệt so với silybin nguyên liệu ở cùng mức liều hoạt chất.

Chương 4. Bàn luận

Chương 4 tập trung phân tích, biện giải cơ chế các hiện tượng khoa học quan sát được:

• Về dung môi phản ứng: Luận án giải thích việc thay thế các dung môi aprotic độc hại truyền thống (như DCM, dioxan) bằng hệ dung môi EtOH tuyệt đối : THF (97:3) vừa đảm bảo độ tan đồng thể của hai hợp phần, vừa hạ thấp độc tính dung môi tồn dư, an toàn cho quá trình nâng cấp quy mô.
• Về sự hình thành liên kết phức hợp: Dựa trên kết quả phổ FTIR, DSC, XRD, NMR, tác giả luận giải liên kết hydro hình thành giữa nhóm 7-OH (hoặc 20-OH) của khung flavonoid với nhóm phosphat/cholin của PC đã ngăn cản sự tái kết tinh của silybin, giữ hoạt chất ở trạng thái vô định hình phân tán cao, từ đó cải thiện độ tan trong nước và tăng tốc độ hòa tan ở cả môi trường acid dạ dày và dịch ruột.
• Về công nghệ phun sấy: Việc bổ sung tá dược bao bọc maltodextrin và chất chống dính aerosil giúp khắc phục bản chất dính sáp của phospholipid, chuyển đổi hỗn dịch phytosome thành dạng bột khô tơi xốp, nâng cao hiệu suất thu hồi và giữ vững độ ổn định hóa lý trong thời gian bảo quản.
• Về sinh khả dụng và tác dụng bảo vệ gan: Sinh khả dụng đường uống tăng vọt được luận giải do sự kết hợp của hai yếu tố: cải thiện tính hòa tan/thấm qua màng nhầy ruột non nhờ cấu trúc tương tự màng sinh học và khả năng hấp thu trực tiếp qua hệ bạch huyết nhờ tế bào M, giảm thiểu sự liên hợp glucuronid hóa/sulfat hóa ở pha II tại gan. Hoạt tính bảo vệ tế bào gan thể hiện vượt trội trên thực nghiệm paracetamol được củng cố bởi nồng độ silybin tự do trong máu và mô gan cao hơn, tăng cường quét gốc tự do và ức chế quá trình peroxy hóa màng tế bào gan.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới về lý luận và khoa học

1. Đã nghiên cứu xây dựng một cách có hệ thống cơ sở dữ liệu về tính chất lý hóa, độ bền nhiệt và độ tan của silybin và phosphatidylcholin trong các hệ dung môi hữu cơ thân thiện môi trường; cung cấp bằng chứng phổ nghiệm đầy đủ (FTIR, DSC, XRD, $^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, MS) chứng minh bản chất liên kết hydro và trạng thái vô định hình của phức hợp silybin-phosphatidylcholin.
2. Cung cấp dữ liệu thực nghiệm toàn diện về dược động học, chứng minh phytosome silybin cải thiện sinh khả dụng đường uống trên mô hình động vật lớn (chó ta) so với silybin nguyên liệu.
3. Cung cấp các dẫn liệu khoa học về tính an toàn (độc tính cấp, độc tính bán trường diễn) và tác dụng sinh học bảo vệ tế bào gan của phức hợp phytosome silybin trên các mô hình động vật thực nghiệm gặm nhấm.

Những đóng góp mới về thực tiễn và công nghệ

1. Đã thiết lập được quy trình công nghệ bào chế phytosome silybin dạng bột phun sấy hoàn chỉnh ở quy mô pilot phòng thí nghiệm 150 g/mẻ, sử dụng hệ dung môi thân thiện môi trường (ethanol tuyệt đối kết hợp tỷ lệ nhỏ THF) và hệ tá dược độn/chống dính thích hợp (maltodextrin, aerosil), đạt hiệu suất tạo phức cao ($> 95%$) và sản phẩm bột có độ ổn định tốt trong 6 tháng bảo quản.
2. Đã xây dựng và thẩm định các phương pháp định lượng silybin, phosphatidylcholin bằng HPLC theo hướng dẫn ICH, đồng thời đề xuất dự thảo tiêu chuẩn cơ sở cho nguyên liệu bột phytosome silybin, tạo tiền đề kỹ thuật cho việc phát triển các chế phẩm thuốc hoặc thực phẩm bảo vệ sức khỏe gan mật trong nước.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Đề xuất tiếp tục nghiên cứu nâng cấp quy mô bào chế phytosome silybin lên quy mô pilot bán công nghiệp và công nghiệp (quy mô vài kilôgam đến hàng chục kilôgam/mẻ).
• Tiếp tục phát triển dạng bào chế phân liều thành phẩm như viên nang cứng hoặc viên nén chứa phytosome silybin từ nguồn bột phun sấy.
• Đề xuất triển khai các thử nghiệm lâm sàng trên người bệnh nhằm đánh giá hiệu quả điều trị viêm gan, gan nhiễm mỡ và nhiễm độc gan.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Về mặt hạn chế, các thử nghiệm trong luận án mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (150 g/mẻ); khảo sát dược động học sinh khả dụng thực hiện trên mô hình động vật (chó đực) với cỡ mẫu quy chuẩn nhưng chưa có dữ liệu trực tiếp trên người tình nguyện khỏe mạnh; thử nghiệm tác dụng bảo vệ gan thực hiện trên mô hình gây độc cấp tính bằng paracetamol trên động vật gặm nhấm, chưa khảo sát trên các mô hình bệnh lý gan mạn tính phức tạp khác (như xơ gan do rượu kéo dài, viêm gan virus mạn).

Hướng nghiên cứu tiếp theo bao gồm: tối ưu hóa dây chuyền sản xuất quy mô công nghiệp; nghiên cứu phát triển công thức viên thành phẩm hoàn chỉnh; mở rộng đánh giá cơ chế tác dụng sinh học phân tử và tiến hành các nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng theo quy chế quản lý dược phẩm.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo giá trị đối với:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học, dược sĩ chuyên ngành Công nghệ dược phẩm và Bào chế: Cung cấp quy trình thực nghiệm chi tiết về kỹ thuật tạo phức phytosome, phương pháp xử lý hệ phân tán nano và công nghệ sấy phun thu hồi bột hoạt chất kém tan.
• Các nhà nghiên cứu phân tích và kiểm nghiệm dược phẩm: Tham khảo phương pháp thẩm định HPLC định lượng đồng thời các đồng phân flavonoid, phương pháp xác định tỷ lệ phytosome hóa (EE%) bằng dung môi chọn lọc và các kỹ thuật phân tích phổ nghiệm chứng minh tương tác phân tử (FTIR, DSC, XRD, NMR).
• Giảng viên, nhà nghiên cứu dược lý và phát triển thuốc: Tham khảo thiết kế nghiên cứu dược động học đơn liều chéo $2 \times 2$ trên động vật, quy trình đánh giá độc tính an toàn và mô hình dược lý thực nghiệm gây tổn thương gan bằng hóa chất.

Câu hỏi thường gặp

1. Cơ chế chính giúp phytosome silybin làm tăng sinh khả dụng đường uống so với silybin nguyên liệu là gì?
Trả lời: Phytosome silybin cải thiện sinh khả dụng thông qua ba cơ chế: (1) Tạo phức liên kết hydro với phosphatidylcholin làm mất cấu trúc tinh thể của silybin, chuyển sang dạng vô định hình giúp tăng độ tan trong nước (từ $38,42\text{ }\mu\text{g/mL}$ lên $128,60\text{ }\mu\text{g/mL}$) và tăng tốc độ hòa tan trong dịch vị; (2) Tăng tính thân dầu và hệ số phân bố dầu - nước ($\log P$ tăng từ 0,85 lên 1,82), giúp tiểu phân dễ dàng thấm qua lớp màng lipid kép của biểu mô ruột; (3) Cấu trúc micell mô phỏng màng sinh học giúp hoạt chất được hấp thu theo cơ chế vận chuyển qua hệ bạch huyết nhờ tế bào M ruột non, hạn chế quá trình chuyển hóa bước một qua gan.

2. Tỷ lệ mol và dung môi tối ưu trong phản ứng tạo phức hợp phytosome silybin là bao nhiêu?
Trả lời: Theo kết quả nghiên cứu, điều kiện tạo phức hợp tối ưu là tỷ lệ mol Silybin : Phosphatidylcholin là 1:3; phản ứng thực hiện trong hệ dung môi Ethanol tuyệt đối : Tetrahydrofuran (THF) tỷ lệ 97:3 (tt/tt) ở nhiệt độ 50°C trong thời gian 4 giờ với tốc độ khuấy 50 vòng/phút; tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa (EE%) đạt trên 95%.

3. Tại sao trong quy trình sấy phun phytosome silybin cần bổ sung maltodextrin và aerosil?
Trả lời: Phức hợp silybin - phosphatidylcholin sau khi bốc hơi dung môi có thể chất mềm dính dạng sáp đặc trưng của lipid, rất khó sấy khô và phân liều. Việc phối hợp tá dược maltodextrin (làm chất mang, chất độn tạo khung) và aerosil (làm chất chống dính, tăng độ trơn chảy) vào hỗn dịch hydrat hóa giúp quá trình phun sấy tạo được sản phẩm dạng bột rắn tơi xốp, nâng cao hiệu suất thu hồi và đảm bảo độ ổn định của tiểu phân.

4. Kết quả đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của bột phytosome silybin cho thấy điều gì?
Trả lời: Thử nghiệm độc tính cấp đường uống trên chuột cống trắng Wistar và chuột nhắt trắng Swiss ở mức liều dung nạp tối đa ($D_{max}$) không làm chết động vật và không ghi nhận triệu chứng bất thường (không xác định được $LD_{50}$). Thử nghiệm độc tính bán trường diễn uống liên tục 28 ngày trên chuột cống không gây biến đổi có ý nghĩa thống kê về thể trọng, các chỉ số huyết học, chức năng gan thận và không gây tổn thương mô bệnh học vi thể gan, thận so với lô đối chứng sinh lý.

5. Phương pháp nào được sử dụng để phân tách và xác định tỷ lệ hoạt chất phytosome hóa (EE%)?
Trả lời: Luận án sử dụng phương pháp hòa tan chọn lọc bằng dung môi chloroform. Phức hợp phytosome silybin hòa tan hoàn toàn trong chloroform, trong khi silybin tự do (không liên kết với phospholipid) hoàn toàn không tan trong dung môi này. Sau khi hòa tan mẫu vào chloroform và ly tâm loại bỏ cắn silybin tự do, phần dịch trong chứa phức hợp phytosome được pha loãng bằng methanol và định lượng hàm lượng silybin bằng phương pháp HPLC để tính toán tỷ lệ phytosome hóa.

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Đặng Trường Giang đã xây dựng thành công quy trình công nghệ bào chế phức hợp phytosome silybin dạng bột phun sấy ở quy mô phòng thí nghiệm 150 g/mẻ, sử dụng hệ dung môi thân thiện môi trường kết hợp hệ tá dược độn và chống dính thích hợp. Các kỹ thuật phân tích hóa lý và phổ nghiệm hiện đại đã chứng minh sự hình thành liên kết hydro giữa silybin và phosphatidylcholin, chuyển hóa hoạt chất sang dạng vô định hình giúp tăng đáng kể độ tan, tốc độ hòa tan và hệ số phân bố dầu - nước. Thử nghiệm sinh học khẳng định chế phẩm phytosome silybin an toàn về mặt độc tính, nâng cao sinh khả dụng đường uống trên động vật thực nghiệm từ 3 đến 5 lần và thể hiện tác dụng bảo vệ tế bào gan vượt trội trước tổn thương do paracetamol so với silybin nguyên liệu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Cây kế sữa (Silybum marianum (L.) Gaertn), thuộc họ Cúc (Asteraceae) với thành phần hóa học chính là các flavonoid đã được chứng minh có một số hoạt tính sinh học quan trọng như chống oxi hóa mạnh, ức chế sự hủy hoại tế bào gan do các tác nhân như rượu, thuốc,. đồng thời kích thích tái tạo tế bào gan; cải thiện đáng kể chức năng gan mật và ít tác dụng không mong muốn [1], [2], [3]. Trong số các hoạt chất thuộc nhóm flavonoid trong cây Kế sữa thì silybin là một chất chiếm tỉ lệ lớn (từ 50-70%) và là hoạt chất chính tạo nên tác dụng sinh học của nhóm này [1], [4]. Tuy nhiên, silybin có độ tan và tính thấm kém nên sinh khả dụng theo đường uống thấp [4], [5], [6].

Do đó, một số nghiên cứu đã được thực hiện nhằm cải thiện độ tan, tính thấm và sinh khả dụng của silybin như: tạo phức với β-cyclodextrin, tạo dẫn xuất glycosid, bào chế liposome và phytosome [5], [2], [7], [8]. Trong số các biện pháp trên, bào chế hoạt chất dưới dạng phytosome được xem là hướng nghiên cứu mới, có hiệu quả trong việc nâng cao sinh khả dụng đường uống của silybin [8], [9]. Trong phytosome các hoạt chất (cao chiết hoặc chất tinh khiết) thường là các flavonoid, polyphenol tự nhiên sẽ liên kết với phospholipid thông thường là phosphatidyl cholin (PC) tạo thành tiểu phân có cấu trúc tương tự màng tế bào, qua đó vừa cải thiện độ tan của hoạt chất trong dịch ruột, vừa tăng vận chuyển hoạt chất qua lớp màng lipid kép. Mặt khác, phytosome được hấp thu theo cơ chế chủ động nhờ tế bào M ở ruột non vào tuần hoàn chung qua hệ lympho, qua đó giảm chuyển hóa bước 1 qua gan và tăng sinh khả dụng của silybin [10].

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu cũng như các chế phẩm phytosome của nhiều hoạt chất như phytosome quercetin, phytosome curcumin, phytosome trà xanh, phytosome ginkgo biloba. Tuy nhiên, ở Việt 2 Nam đến nay chưa có nghiên cứu về bào chế phytosome silybin. Bên cạnh đó, nguồn nguyên liệu phytosome nói chung và phytosome silybin nói riêng chủ yếu là nhập khẩu từ nước ngoài với giá thành cao cũng sẽ ảnh hưởng phần nào đến việc ứng dụng rộng rãi dạng phytosome vào các sản phẩm chăm sóc và bảo vệ sức khỏe. Do đó, việc tiến hành nghiên cứu bào chế phytosome silybin là cần thiết.

Vì vậy, đề tài: “Nghiên cứu bào chế, đánh giá sinh khả dụng, độc tính và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin” được thực hiện với hai mục tiêu sau: 1. Bào chế được phytosome silybin qui mô phòng thí nghiệm. Đánh giá được sinh khả dụng, độc tính cấp, bán trường diễn và tác dụng bảo vệ tế bào gan của phytosome silybin trên thực nghiệm. TỔNG QUAN VỀ SILYBIN 1.

Nguồn gốc Silybin thường được chiết xuất và tinh chế từ quả hoặc hạt của cây Kế sữa Silybum marianum (L. Silybin tự nhiên là hỗn hợp của hai đồng phân là silybin A và silybin B với tỷ lệ xấp xỉ bằng nhau [2], [4], [16]. Công thức hóa học Hình 1. Công thức cấu tạo silybin A và silybin B *Nguồn: theo Biedermann D.

và cs (2014) [16] - Tên khoa học (danh pháp IUPAC) [4], [16]: Silybin-A: (2R,3R)-2-[(2R,3R)-2,3-dihydro-3-(4-hydroxy-3- methoxyphenyl)-2-(hydroxymethyl)-1,4-benzodioxin-6-yl]-2,3-dihydro-3,5,7- trihydroxy-4H-1-benzopyran-4-one. Silybin-B: (2R,3R)-2-[(2S,3S)-2,3-dihydro-3-(4-hydroxy-3- methoxyphenyl)-2-(hydroxymethyl)-1,4-benzodioxin-6-yl]-2,3-dihydro-3,5,7- trihydroxy-4H-1-benzopyran-4-one. - Công thức phân tử: C25H22O10 - Tên khác: silibinin - Khối lượng phân tử: 482,44. 4 - Về mặt hóa học thì silybin thuộc phân nhóm flavonolignan, phần đầu có cấu trúc giống như một taxifolin (một nhóm flavononol trong flavonoid).

Phần thứ hai là một đơn vị phenylpropanoid (conyferil alcohol). Hai phần này được liên kết với nhau thành một cấu trúc bằng một vòng oxeran [4], [16]. Tính chất lý hóa * Tính chất vật lý Bột đồng nhất, màu vàng nhạt, vị hơi đắng, có mùi thơm nhẹ. Tỷ trọng: 1,6 ± 0,1 g/cm3; nhiệt độ nóng chảy là 162-1630C, dung dịch trong aceton có [20]D = +11,38.

Dung dịch silybin trong methanol ở dải sóng từ 200 nm đến 800 nm có các cực đại hấp thụ tại 217, 230, 288 nm [16]. Trong bảng phân loại sinh dược học bào chế (BCS), silybin thuộc nhóm IV vì hoạt chất có hệ số thấm Papp < 2 x 10-6 cm/s và ít tan trong nước (độ tan < 0,04 mg/ml) [6], [17]. Silybin rất khó tan trong nước, tan kém trong EtOH; không tan trong chloroform, ether dầu hỏa; tan tốt một số dung môi aprotic phân cực (Aceton, DMF, THF) [16], [4]. Một số nghiên cứu cho thấy, trong các dung dịch nước trung tính, silybin hoạt động như một acid yếu với pKa là 7,7 - 7,95 đối với nhóm 7-OH và 6,63 đối với nhóm 5-OH và 11,0 đối với nhóm 20-OH.

Ngoài ra các nghiên cứu cũng chỉ ra độ hòa tan của silybin trong nước tăng nhanh theo độ pH và tăng tuyến tính với nhiệt độ [16]. * Tính chất hóa học Silybin là một flavonoid nên nó có một số tính chất hóa học cũng như phản ứng đặc trưng của nhóm flavonoid như: Phản ứng với hơi amoniac và dung dịch kiềm loãng (dung dịch NaOH, KOH, Na2CO3); Phản ứng cyanidin (phản ứng Shinoda); Phản ứng với dung dịch FeCl3 Trong môi trường kiềm mạnh hoặc gia nhiệt kéo dài trên 100°C gây ra sự phá vỡ bộ khung của silybin [16], [4]. 5 Năm nhóm hydroxy (-OH) của silybin có thể được chia thành ba loại: ba nhóm phenol, một nhóm ancol bậc hai và một nhóm ancol bậc một. Trong số các nhóm hydroxy phenolic, nhóm hydroxy ở vị trí C-5 liên kết hydro mạnh với nhóm oxo liền kề.

Nhóm oxo ở dạng liên hợp với vòng thơm và hoạt động như một chất cho cặp electron tự do cho liên kết hydro với nhóm 5- OH. Hai nhóm hydroxy phenol khác có tính chất tương tự, với nhóm C-7 OH phản ứng mạnh hơn nhóm 20-OH do cản trở steric thấp hơn và sự hiện diện của liên kết hydro. Nhóm ancol ở C-23 OH có thể được este hóa dễ dàng và bị oxy hóa thành acid cacboxylic. Nhóm ancol bậc hai ở C-3 OH có thể dễ dàng bị oxy hóa (ngay cả với oxy trong không khí) thành keton tạo ra 2,3- dehydrosilybin [16], [4].

Dược động học - Hấp thu: Sau khi uống, silybin được hấp thu nhanh chóng trong đường tiêu hóa (với Tmax khoảng 2-4 giờ). Tuy nhiên, silybin chỉ hấp thu 20- 50% ở đường ruột do thấm kém qua tế bào biểu mô ruột [4], [18]. Theo nghiên cứu của Wu J. và cs, sinh khả dụng đường uống trên chuột cống chỉ đạt 0,73% [19].

- Phân bố: Silybin đến các mô nhanh, nồng độ dạng tự do và nồng độ dạng liên hợp đạt tối đa chỉ sau 1 giờ sau khi dùng liều 50 mg/kg trên chuột. Nồng độ silybin ở mật gấp 100 lần so với trong máu [4]. Mô hình đơn lớp tế bào Caco-2 đã chỉ ra MK571 (một chất ức chế đặc hiệu protein liên quan đến đa kháng thuốc (MRP2)) làm giảm đáng kể tỷ lệ silybin phân bố vào hệ tuần hoàn (Hình 1. - Chuyển hóa: Silybin trải qua cả giai đoạn I và giai đoạn II của quá trình chuyển hóa trong tế bào gan [18].

Dưới tác dụng của các enzym chuyển hóa trong cơ thể, silybin bị chuyển hóa thành silybin monoglucuronic, silybin diglucuronic, silybin monosulfat và silybin diglucuronic sulfat. Silybin ở dạng tự do, sulfat hóa và glucuronic hóa trong huyết tương khoảng 17,28 và 55% 6 [3], [4]. Các nghiên cứu được thực hiện cho thấy ở giai đoạn I silybin tương tác với cytochromes (CYP) và chuyển hóa thành O-demethylatedsilybin (chính) và cả hai chất chuyển hóa mono và dihydroxy-silybin (phụ) [21], [22], [23]. Silybin monoglucuronid và diglucuronid, cũng như silybin monosulfat và silybin diglucuronid sulfat, tất cả đều được hình thành trong giai đoạn II của quá trình chuyển hóa của silybin [18].

Các glucuronid silybin được hình thành trong giai đoạn II sau đó được vận chuyển theo dịch mật đến ruột, nơi các enzym vi khuẩn phân cắt các chất đường và giải phóng silybin aglycon, có thể được hấp thu trở lại, do đó thúc đẩy tuần hoàn ruột [24]. Hình minh họa quá trình phân bố và thải trừ silybin *Nguồn: theo Xie Y. và cs (2019) [25] - Thải trừ: Tỷ lệ phần trăm của silybin thải trừ trong nước tiểu ở dạng tự do và liên hợp là rất thấp, dao động từ 1 đến 2% so với liều uống ban đầu trong 24 giờ và chất MRP2 (hình 1.2) là chất vận chuyển chính cho việc bài tiết silybin qua mật [26], [25]. Silybin chủ yếu được thải trừ qua đường mật (khoảng 80%) dưới dạng liên hợp glucuronic và sulfat thông qua cơ chế vận chuyển chủ động [3], [4], [27].

Người ta đã chứng minh được rằng 3-8% silybin dùng đường uống được bài tiết nguyên vẹn trong nước tiểu. Thời gian 7 bán thải của silybin ngắn (từ 1-3 giờ đối với dạng tự do và 3-8 giờ đối với dạng liên hợp) [28], [18], [4]. * Từ những đặc điểm về dược động học trên cho thấy những nguyên nhân chính dẫn đến SKD kém của Silybin là: độ tan trong nước thấp, tính thấm kém qua tế bào biểu mô ruột, bị chuyển hóa pha II mạnh và thải trừ nhanh. Vì vậy, việc tìm ra một dạng mới để tăng SKD của silybin là cần thiết.

Tác dụng chống oxy hóa Tác dụng chống oxy hóa của silybin đã được mô tả trong các nghiên cứu trên tế bào. Silybin ức chế sự hình thành gốc tự do gây cản trở sự peroxid lipid của màng (từ đó làm thay đổi tính thấm của màng) và làm tăng hàm lượng chất dọn dẹp nội bào [29]. Trên thực nghiệm, silybin ức chế sự hình thành các gốc tự do superoxid anion và nitric oxid (NO), làm tăng hàm lượng ATP thông qua sự phosphoryl hóa ADP, giảm hàm lượng malondialdeyd (MDA). Đặc biệt, silybin cũng gián tiếp chống oxy hóa thông qua loại bỏ hoàn toàn các nguyên nhân gây giảm glutathion do các enzym: glutathion peroxidase và glutathion reductase.

Glutathion là một chất chống oxy hóa, có khả năng ngăn ngừa các tác động của gốc tự do, peroxid, kim loại nặng gây hại đến các thành phần quan trọng của tế bào [30], [31]. Tác dụng chống viêm Silybin có khả năng tương tác vào yếu tố NF-κB (Nuclear Factor-kappa B). NF-κB là một protein liên kết DNA cảm ứng hoạt động như một yếu tố phiên mã cho các gen liên quan đến viêm nhiễm. Các hoạt tính chống viêm của silybin cũng liên quan đến sự tác động của silybin với nhiều cytokin, các đường dẫn tín hiệu cảm ứng.

Từ đó, làm giảm sự kích thích nitric-oxid synthase; ức chế cyclooxygenase (COX) và sự hình thành leukotrien trong tiểu cầu, bạch cầu và các tế bào nội bào [3], [1], [32]. Tác dụng chống xơ gan Trên mô hình xơ gan ở người trên in vitro, silybin thể hiện tác dụng chống xơ cả trực tiếp và gián tiếp. Silybin làm giảm yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu - gây ra sự tổng hợp DNA và tăng sinh tế bào ở liều 25 μmol/L [33].