Tổng quan luận án

Tình trạng lạm dụng và các tác dụng phụ của thuốc tổng hợp hóa dược đã thúc đẩy xu hướng nghiên cứu, ứng dụng các hợp chất tự nhiên có nguồn gốc thảo dược trong y học hiện đại. Việt Nam sở hữu hệ thực vật nhiệt đới phong phú với hơn 12.000 loài thực vật bậc cao, trong đó khoảng 4.000 loài được sử dụng trong y học cổ truyền. Tuy nhiên, phần lớn nguồn tài nguyên dược liệu này vẫn chưa được nghiên cứu toàn diện về thành phần hóa học cũng như cơ chế tác dụng dược lý thực nghiệm để cung cấp bằng chứng khoa học phục vụ phát triển thuốc.

Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge), loài thực vật thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae), được di thực từ Trung Quốc vào Việt Nam từ những năm 1960 và sinh trưởng tốt tại vùng Tây Bắc. Rễ Đan sâm là vị thuốc truyền thống chủ yếu được sử dụng để điều trị các bệnh lý tim mạch và tuần hoàn máu. Mặc dù các hợp chất tanshinon (Tan) trong Đan sâm đã được ghi nhận về khả năng chống ung thư trên thế giới, nhưng đặc điểm hóa học và hoạt tính sinh học của Đan sâm trồng trong điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu tại Việt Nam chưa được nghiên cứu đầy đủ.

Luận án tiến sĩ chuyên ngành Dược học được thực hiện với đề tài: "Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng kháng một số dòng tế bào ung thư của rễ cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge), họ Hoa môi (Lamiaceae)".

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm 02 nội dung cụ thể:

  1. Xác định được cấu trúc hóa học của một số hợp chất và hàm lượng các Tanshinon chính trong rễ Đan sâm.
  2. Đánh giá được tác dụng chống ung thư in vitro của cao chiết và các hợp chất phân lập từ rễ Đan sâm.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Toàn cây và rễ cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge, họ Lamiaceae); các phân đoạn dịch chiết, hợp chất tinh khiết và 12 dòng tế bào ung thư người (HL-60, U937, THP-1, Jurkat, DLD-1, COLO 205, Caco-2, HCT-15, PC-3, LNCaP FGC, MCF-7, HepG2).
  • Phạm vi không gian: Mẫu thực vật thu hái tại Trạm nghiên cứu trồng cây thuốc Sa Pa, tỉnh Lào Cai; các nội dung thực nghiệm được triển khai tại Viện Dược liệu, Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Viện Kiểm nghiệm, Nghiên cứu dược và Trang thiết bị Y tế Quân đội và Đại học Quốc tế Nagasaki (Nhật Bản).
  • Phạm vi thời gian: Mẫu nghiên cứu thực vật và dược liệu thu hái vào tháng 10 năm 2016 (ngày thu hái mẫu thực vật: 27/10/2016).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Về phân loại học, chi Salvia là một trong những chi lớn nhất của họ Lamiaceae với hơn 900 loài trên thế giới, thuộc phân họ Nepetoideae. Tại Việt Nam, họ Lamiaceae có trên 40 chi và khoảng 145 loài, riêng chi Salvia có 08 loài mang tên gọi Xôn. Đan sâm không phân bố tự nhiên ở Việt Nam mà được di thực và trồng trọt tại một số địa phương như Lào Cai, Vĩnh Phúc, Hà Nội, Phú Thọ, Thanh Hóa.

Các công trình nghiên cứu trên thế giới đã phân lập và xác định gần 200 hợp chất từ loài Salvia miltiorrhiza, tập trung vào 4 nhóm chính:

  • Nhóm diterpenoid: Gần 100 hợp chất (từ chất 1 đến chất 99), chia thành 3 phân nhóm: Phân nhóm 1 gồm 41 hợp chất tanshinon có nhóm mang màu ortho-naphthoquinon (Tanshinon IIA, Tanshinon I, Cryptotanshinon, Miltiron...); Phân nhóm 2 gồm 22 hợp chất abietan diterpenoid mang nhóm màu para-naphthoquinon (Danshenxinkun B, Isotanshinon IIA...); Phân nhóm 3 gồm 36 hợp chất diterpenoid khác không có khung naphthoquinon (Ferruginol, Sugiol, Tanshinlacton, Salvianan...).
  • Nhóm acid phenolic thân nước: Gồm 35 hợp chất (từ chất 100 đến chất 134), chia thành acid monophenolic (Acid caffeic, Danshensu...) và acid polyphenolic (Acid salvianolic A, B, C, Acid lithospermic B...).
  • Nhóm hợp chất khác: 12 hợp chất gồm triterpenoid (Acid ursolic, Acid oleanolic, α-amyrin), sterol (β-sitosterol, Daucosterol), flavonoid (Luteolin, Baicalin), dẫn xuất naphthalen, furan, acid succinic và lignan.
  • Nhóm tinh dầu hoa: 33 hợp chất bay hơi được xác định chủ yếu thuộc nhóm monoterpen, sesquiterpen và acid béo.

Về công dụng y học cổ truyền, Đan sâm có vị đắng, tính hơi mát; công năng hoạt huyết thông kinh, khư ứ chỉ thống, thanh tâm trừ phiền, tiêu sưng giảm đau; được ghi chép từ "Thần nông bản thảo kinh" (năm 25 TCN - 220 SCN), Dược điển Trung Quốc 2015, Dược điển Nhật Bản (YI Xin-Fang), Hàn Quốc (Dongyi Baojian) và các tài liệu dược học Việt Nam của Võ Văn Chi, Đỗ Tất Lợi, Viện Dược liệu.

Về hoạt tính sinh học chống ung thư, các công bố quốc tế tập trung vào các Tanshinon chính:

  • Tanshinon I (Tan I): Gây độc trên nhiều dòng tế bào ung thư (ruột kết, dạ dày, vú, gan, tuyến tiền liệt, phổi, máu) với IC50 từ vài μM đến vài chục μM; kích hoạt p53, p21, tăng tỷ lệ Bax/Bcl-2, hoạt hóa caspase-3, ức chế tín hiệu PI3K/Akt/survivin.
  • Tanshinon IIA (Tan IIA): Kích thích p53, p21, p27, Fas, TNF-α; giảm cyclin D1, CDK2, CDK4; hoạt hóa caspase-8, caspase-9, caspase-3; ức chế bám dính, xâm lấn, di căn thông qua giảm MMP-2, MMP-9 và NF-κB; ức chế tăng sinh mạch máu in vitro và in vivo.
  • Cryptotanshinon: Ức chế STAT3 (Tyr705), ức chế thụ thể androgen (AR), gây stress mạng lưới nội chất (ER stress) phụ thuộc ROS, kích hoạt p38 MAPK và ERK.
  • Dihydrotanshinon I: Ức chế topoisomerase I, ức chế HIF-1α và farnesyl transferase.
  • Acid salvianolic B: Ức chế con đường COX-2/PGE2, ức chế Ku86 trong cơ chế sửa chữa DNA.

Khoảng trống nghiên cứu: Dù Đan sâm đã di thực và trồng tại Sa Pa trong nhiều năm, các dữ liệu về đặc điểm thực vật đối chiếu, quy trình chiết xuất - phân lập các hợp chất tinh khiết, định lượng đồng thời các hoạt chất Tanshinon chính bằng HPLC và đánh giá tác dụng kháng ung thư gắn liền với cơ chế apoptosis ở cấp độ tế bào và phân tử của mẫu trồng tại Việt Nam vẫn chưa được thực hiện một cách đồng bộ.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

Luận án vận dụng lý thuyết hóa sinh thực vật về con đường sinh tổng hợp diterpenoid (qua mevalonat và methylerythritol phosphat) và acid phenolic (qua phenylpropanoid và tyrosine). Khung đánh giá dược lý dựa trên lý thuyết về sự chết tế bào theo chương trình (apoptosis) gồm con đường nội sinh (qua ty thể, giải phóng cytochrom c, hoạt hóa caspase-9 và caspase-3) và con đường ngoại sinh (qua thụ thể màng, hoạt hóa caspase-8 và caspase-3).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Luận án kết hợp các phương pháp thực vật học, hóa học phân tích, hóa học các hợp chất thiên nhiên và sinh học phân tử:

Nội dung nghiên cứu Kỹ thuật / Phương pháp áp dụng Trang thiết bị & Hóa chất chính
Thẩm định tên khoa học Quan sát, giải phẫu hình thái học thực địa và phòng thí nghiệm; đối chiếu khóa phân loại thực vật. Khóa phân loại chi Salvia; lưu trữ tiêu bản TB-10654.
Chiết xuất và phân lập Chiết siêu âm (dung môi EtOH 80%, 40°C), phân bố lỏng - lỏng với các dung môi tăng dần độ phân cực (Hex, EtOAc, BuOH); sắc ký cột pha thuận (Silica gel 60, cỡ hạt 63-200 µm) và pha đảo (ODS-A/RP-18, cỡ hạt 30-50 µm); kiểm tra bằng TLC (Silica gel F254, RP18 F254). Bể siêu âm ELMA S 180/H; tủ sấy chân không Shellab 1430 D-2E; đèn tử ngoại bước sóng 254 nm và 365 nm; thuốc thử H2SO4 10%/EtOH.
Xác định cấu trúc Đo nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực, quang phổ hấp thụ UV-Vis, phổ khối ESI-MS, HR-ESI-MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D-NMR (1H-NMR, 13C-NMR). Máy Stuart SMP3; JASCO P-1020; Carry 80; Agilent 1260 LC-MS/MS; Agilent 910 TQ-FTMS; JEOL ECX 400 (400/100 MHz); Bruker AM500 (500/125 MHz).
Định lượng Tanshinon Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) pha đảo, rửa giải gradient; đánh giá phương pháp theo hướng dẫn của ICH (khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, LOD, LOQ). Máy HPLC Shimadzu SPD-10AVP; HP 1100 DAD; Cột Phenomenex Luna C18 100A (150 × 4,6 mm, 5 µm); Cột bảo vệ Phenomenex C18 (4 × 30 mm).
Đánh giá hoạt tính in vitro Thử nghiệm gây độc tế bào MTT trên đĩa 96 giếng; đo mật độ quang ở bước sóng 595 nm; xác định tỷ lệ sống sót của tế bào. Tủ ấm 37°C, 5% CO2; máy đọc microplate reader; thuốc thử MTT; đối chứng dương Mitoxantrone (≥ 98% HPLC).
Đánh giá hình thái và phân mảnh DNA Nhuộm huỳnh quang nhân tế bào bằng Hoechst 33258; phân tích đứt gãy DNA bằng điện di trên gel agarose 2% nhuộm ethidium bromid. Dung dịch Hoechst 33258; kính hiển vi huỳnh quang; buồng điện di gel agarose; đèn soi UV.
Cơ chế phân tử & Ty thể Điện di protein SDS-PAGE và Western Blot màng PVDF (kháng thể caspase-3, -8, -9); đánh giá biến đổi điện thế màng ty thể bằng thuốc nhuộm JC-1. Màng PVDF; bộ kit Bio-Rad; dung dịch Chemi-Lumi One L; bộ kit JC-1; kính hiển vi quét laser FV10i (Olympus).

Điều kiện phân tích sắc ký HPLC định lượng

  • Cột phân tích: Phenomenex Luna C18 100A (150 mm × 4,6 mm, 5 µm).
  • Nhiệt độ cột: 25°C.
  • Detector UV-Vis: 270 nm.
  • Tốc độ dòng: 1,5 mL/phút.
  • Thể tích tiêm: 10 µL.
  • Pha động: Kênh A (nước chứa H3PO4 0,01%, pH ≈ 3,3); Kênh B (Acetonitril / Methanol = 2/1, v/v).
  • Chương trình dung môi rửa giải:
    • 0 – 7,5 phút: Gradient Kênh B từ 70% đến 95%.
    • 7,5 – 10 phút: Đẳng dòng Kênh B ở 95%.
    • 10 – 11 phút: Gradient Kênh B từ 95% về 70%.
    • 11 – 13 phút: Cân bằng cột ở 70% Kênh B.

Nguồn tư liệu, dữ liệu và xử lý thống kê

  • Nguồn mẫu: Dược liệu rễ Đan sâm (10 kg) thu hái tháng 10/2016 tại Sa Pa (ký hiệu mẫu ĐS-KYD-2016).
  • Nguồn tế bào: Ngân hàng tế bào của Viện nghiên cứu RIKEN, Nhật Bản.
  • Xử lý số liệu: Số liệu thực nghiệm sinh học lặp lại tối thiểu 3 lần độc lập, biểu thị dưới dạng giá trị trung bình $\pm$ độ lệch chuẩn (SD), độ lệch chuẩn tương đối (RSD%). Phân tích thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2016 và GraphPad Prism 6. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi $p < 0,05$.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các dữ liệu khoa học về Đan sâm gồm 5 phần chính:

  1. Vị trí, đặc điểm thực vật và phân bố: Mô tả đặc điểm hình thái thân thảo sống lâu năm (cao 30-80 cm, rễ nhỏ dài màu đỏ nâu, thân vuông, lá kép 3-5 lá chét, cụm hoa chùm tràng xanh tím nhạt) và sinh thái thích hợp tại vùng Sa Pa, Tam Đảo, Hà Nội, Phú Thọ.
  2. Thành phần hóa học: Tổng hợp 99 diterpenoid (trong đó có phân nhóm 1 gồm 41 chất ortho-naphthoquinon, phân nhóm 2 gồm 22 chất para-naphthoquinon, phân nhóm 3 gồm 36 chất diterpenoid khác), 35 acid phenolic (acid monophenolic và polyphenolic), 12 hợp chất thuộc các nhóm triterpenoid, sterol, flavonoid, lignan và 33 thành phần tinh dầu hoa.
  3. Công dụng trong y học cổ truyền: Trình bày tính vị, quy kinh, công năng khư ứ chỉ thống, hoạt huyết thông kinh; các bài thuốc cổ truyền chữa viêm gan mạn, suy tim, phong nhiệt, viêm khớp, suy nhược thần kinh tại Việt Nam và các chế phẩm Fufang Đan sâm, Guanxin Đan sâm tại Trung Quốc.
  4. Tác dụng chống ung thư trên các mô hình in vitro: Điểm lại cơ chế gây độc, chu kỳ tế bào và apoptosis của Tan I, Tan IIA, Cryptotanshinon, Dihydrotanshinon I, Acid salvianolic B, Acid salvianolic A, Salvinal.
  5. Tác dụng chống ung thư trên mô hình in vivo và lâm sàng: Tổng quan hiệu quả ức chế khối u thực nghiệm trên chuột (MCF-7, MDA-MB-231, LNCaP, J5, A549, H1299) và các thử nghiệm lâm sàng trong điều trị lơ xê mi cấp, ung thư đại trực tràng, gan, tụy, thực quản, phổi.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình chuẩn bị nguyên liệu, danh mục trang thiết bị, hóa chất và quy trình thực nghiệm:

  • Thẩm định thực vật: Mẫu tiêu bản mã số TB-10654 thu hái ngày 27/10/2016 tại Sa Pa.
  • Quy trình chiết xuất và phân đoạn: Mô tả quy trình chiết siêu âm với EtOH 80% và phân bố lần lượt với ba dung môi có độ phân cực tăng dần (n-hexan, EtOAc, BuOH).
  • Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc: Trình bày thông số kỹ thuật của các hệ thống máy đo nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực, UV-Vis, MS và NMR.
  • Quy trình HPLC: Xây dựng điều kiện sắc ký rửa giải gradient định lượng đồng thời Tan I, Tan IIA và Cryptotanshinon; quy chuẩn thẩm định phương pháp theo ICH.
  • Quy trình khảo sát tác dụng sinh học: Mô tả quy trình thử nghiệm MTT trên 12 dòng tế bào ung thư; phương pháp nhuộm Hoechst 33258; phương pháp phân tích phân mảnh DNA trên gel agarose 2%; kỹ thuật Western Blot phát hiện caspase-3, -8, -9; kỹ thuật nhuộm JC-1 đo điện thế màng ty thể trên kính hiển vi quét laser FV10i.

Chương 3: Thực nghiệm và kết quả

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được:

  • Thẩm định tên khoa học: Dựa trên đối chiếu đặc điểm hình thái và giải phẫu với các tài liệu phân loại thực vật, mẫu thu hái tại Sa Pa được PGS. TS. Phạm Thanh Huyền (Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu) giám định xác nhận chính xác là loài Salvia miltiorrhiza Bunge, thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae). Tiêu bản TB-10654 được lưu giữ tại Viện Dược liệu và Khoa Y Dược - ĐHQGHN.
  • Chiết xuất và phân đoạn:
    • Khối lượng mẫu rễ khô đem chiết: 500 g (độ ẩm 8,3%).
    • Chiết siêu âm với EtOH 80% ở 40°C (3 lần × 1500 mL) thu được 122,3 g cao chiết tổng.
    • Phân bố lỏng - lỏng từ 100 g cao tổng thu được 3 phân đoạn:
      • Phân đoạn n-hexan (Hex): 6,1 g.
      • Phân đoạn ethyl acetat (EtOAc): 26,4 g.
      • Phân đoạn n-butanol (BuOH): 21,2 g.
  • Phân lập hợp chất từ các phân đoạn:
    • Phân đoạn n-hexan (6,0 g): Tách trên cột silica gel (50 mm × 300 mm) với hệ dung môi Hex-EtOAc (5:1, v/v, 2500 mL), thu được 7 phân đoạn nhỏ ký hiệu H1 đến H7.
    • Phân đoạn ethyl acetat (25 g): Tách trên cột silica gel (Φ85 mm × 90 mm) với hệ dung môi Hex-EtOAc gradient (5:1 → 0:1, v/v, 400 mL/phân đoạn), thu được 7 phân đoạn E1 đến E7. Phân đoạn E5 (8,3 g) tiếp tục tách trên cột silica gel (Φ50 mm × 350 mm) với CHCl3-MeOH (15:1, v/v, 1200 mL) thu được 6 phân đoạn phụ (E5.1 đến E5.6). Phân đoạn E5.2 (230 mg) tinh chế qua cột pha đảo C18 (Φ20 mm × 400 mm) với hệ MeOH-H2O (7:2, v/v, 450 mL) thu được chất số 7.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học

  • Đã thẩm định và xác lập tiêu bản thực vật học chuẩn cho loài Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge, họ Lamiaceae) di thực và trồng tại Sa Pa, Lào Cai (mã số TB-10654).
  • Xây dựng quy trình chiết xuất siêu âm và phân bố phân đoạn hiệu quả từ rễ Đan sâm trồng tại Việt Nam, thu được các phân đoạn có độ phân cực khác nhau (n-hexan, EtOAc, BuOH).
  • Thiết lập quy trình phân lập chi tiết trên hệ thống sắc ký cột silica gel pha thuận kết hợp pha đảo C18, phân lập các hợp chất từ các phân đoạn dịch chiết.
  • Xây dựng và thẩm định hoàn chỉnh quy trình định lượng đồng thời các thành phần tanshinon chính (Tanshinon I, Tanshinon IIA, Cryptotanshinon) trong rễ Đan sâm bằng phương pháp HPLC-DAD trên cột Phenomenex Luna C18 với pha động chứa acid phosphoric và acetonitril/methanol.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn

  • Cung cấp cơ sở khoa học thực nghiệm về phương pháp kiểm tra chất lượng và định lượng hoạt chất chính cho nguồn dược liệu Đan sâm di thực tại Sa Pa.
  • Thiết lập hệ thống phương pháp đánh giá hoạt tính kháng ung thư in vitro và cơ chế apoptosis (từ thử nghiệm MTT, nhuộm nhân Hoechst 33258, phân mảnh DNA, Western Blot màng PVDF đến đo điện thế màng ty thể bằng JC-1) phục vụ định hướng nghiên cứu và phát triển sản phẩm thuốc từ Đan sâm trồng ở Việt Nam.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế: Các đánh giá hoạt tính sinh học trong nghiên cứu tập trung vào mô hình thực nghiệm in vitro trên các dòng tế bào ung thư nuôi cấy; chưa tiến hành khảo sát trên các mô hình động vật thực nghiệm (in vivo).
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Tiếp tục phân lập và xác định cấu trúc toàn bộ các hợp chất trong các phân đoạn dịch chiết còn lại (H1-H7, E1-E7, phân đoạn BuOH).
    • Khảo sát mở rộng tác dụng ức chế khối u trên mô hình động vật in vivo đối với các cao chiết và hoạt chất tinh khiết phân lập từ Đan sâm trồng tại Việt Nam.
    • Nghiên cứu so sánh hàm lượng Tanshinon và hoạt tính sinh học của Đan sâm trồng tại các vùng sinh thái khác nhau ở Việt Nam (đồng bằng và núi cao).

Giá trị tham khảo

  • Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Dược học, Dược liệu - Hóa thực vật: Luận án cung cấp hệ thống tài liệu tổng quan chi tiết về hóa học (gần 200 hợp chất) và dược lý học ung thư của loài Salvia miltiorrhiza; đồng thời là tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp phân lập sắc ký và kỹ thuật sinh học phân tử xác định cơ chế apoptosis.
  • Đối với các cơ sở kiểm nghiệm và nghiên cứu phát triển dược phẩm: Quy trình HPLC định lượng đồng thời ba Tanshinon chính (Tan I, Tan IIA, Cryptotanshinon) cùng các điều kiện sắc ký chi tiết có thể được ứng dụng trực tiếp trong công tác kiểm nghiệm, tiêu chuẩn hóa nguyên liệu rễ Đan sâm.

Câu hỏi thường gặp

1. Mẫu Đan sâm sử dụng trong luận án được thu hái ở đâu và ai là người giám định tên khoa học?

Mẫu thực vật và dược liệu Đan sâm được thu hái tại Trạm nghiên cứu trồng cây thuốc Sa Pa, thị trấn Sa Pa, tỉnh Lào Cai vào ngày 27/10/2016. Tên khoa học của mẫu được PGS. TS. Phạm Thanh Huyền (Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu) giám định xác nhận là Salvia miltiorrhiza Bunge, thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae). Tiêu bản được lưu trữ tại Viện Dược liệu và Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội với mã số TB-10654; mẫu dược liệu mang số hiệu ĐS-KYD-2016.

2. Các hợp chất diterpenoid trong rễ Đan sâm được phân loại cấu trúc như thế nào?

Theo tổng quan của luận án, gần 100 hợp chất diterpenoid phân lập từ Đan sâm được chia thành 3 phân nhóm chính:

  • Phân nhóm 1: 41 hợp chất tanshinon mang nhóm mang màu ortho-naphthoquinon (nhóm carbonyl ở vị trí 1,2), điển hình là Tanshinon IIA, Tanshinon I, Cryptotanshinon.
  • Phân nhóm 2: 22 hợp chất abietan diterpenoid mang nhóm mang màu para-naphthoquinon (nhóm carbonyl ở vị trí 1,4), ví dụ như Danshenxinkun B, Isotanshinon IIA.
  • Phân nhóm 3: 36 hợp chất diterpenoid khác không chứa khung naphthoquinon, cấu trúc 2, 3 hoặc 4 vòng, trong đó có một số hợp chất chứa nguyên tử nitơ (vòng oxazol hoặc pyrrol) như Salvianan, Salviamin G.

3. Quy trình chiết xuất và phân bố phân đoạn từ rễ Đan sâm thu được những kết quả cụ thể nào?

Từ 500 g rễ Đan sâm khô (độ ẩm 8,3%), sau khi chiết siêu âm với EtOH 80% ở 40°C (3 lần × 1500 mL) và thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được 122,3 g cao chiết tổng. Tiến hành chiết phân bố lỏng - lỏng 100 g cao tổng với các dung môi tăng dần độ phân cực thu được 3 phân đoạn:

  • Phân đoạn n-hexan: 6,1 g.
  • Phân đoạn ethyl acetat: 26,4 g.
  • Phân đoạn n-butanol: 21,2 g.

4. Quy trình định lượng HPLC đồng thời các Tanshinon chính sử dụng những điều kiện phân tích nào?

Quy trình HPLC sử dụng cột Phenomenex Luna C18 100A (150 × 4,6 mm, 5 µm), cột bảo vệ Phenomenex C18 (4 × 30 mm); nhiệt độ cột 25°C; detector bước sóng 270 nm; tốc độ dòng 1,5 mL/phút; thể tích tiêm 10 µL. Pha động gồm Kênh A (nước chứa H3PO4 0,01%, pH ≈ 3,3) và Kênh B (Acetonitril/Methanol 2:1, v/v) chạy theo chương trình gradient: 0–7,5 phút (70–95% B), 7,5–10 phút (95% B), 10–11 phút (95–70% B), 11–13 phút (70% B). Phương pháp được thẩm định theo chuẩn ICH.

5. Những phương pháp sinh học phân tử nào được thiết lập để đánh giá cơ chế gây chết tế bào của Đan sâm?

Luận án thiết lập 5 phương pháp sinh học phân tử in vitro:

  • Phương pháp MTT đo độ hấp thụ quang 595 nm để đánh giá tỷ lệ ức chế sinh trưởng tế bào.
  • Phương pháp nhuộm huỳnh quang Hoechst 33258 quan sát biến đổi hình thái nhân tế bào.
  • Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 2% nhuộm ethidium bromid phát hiện hiện tượng phân mảnh DNA.
  • Kỹ thuật Western Blot màng PVDF phát hiện sự biến đổi biểu hiện của các protein caspase-3, caspase-8 và caspase-9.
  • Phân tích chức năng và điện thế màng ty thể bằng thuốc nhuộm JC-1 trên hệ thống kính hiển vi quét laser FV10i.

Kết luận

Luận án tiến sĩ đã hoàn thành việc thẩm định phân loại thực vật học mẫu cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge, họ Lamiaceae) trồng tại Sa Pa, Lào Cai với mã số tiêu bản TB-10654. Đề tài đã xây dựng quy trình chiết xuất siêu âm, phân đoạn điều chế và phân lập các hợp chất từ rễ Đan sâm, đồng thời thiết lập phương pháp HPLC-DAD định lượng đồng thời các hoạt chất Tanshinon chính đạt tiêu chuẩn thẩm định ICH. Bên cạnh đó, luận án đã xây dựng hệ thống phương pháp thực nghiệm đồng bộ từ thử nghiệm gây độc tế bào MTT đến các kỹ thuật sinh học phân tử chuyên sâu nhằm đánh giá hoạt tính kháng ung thư và cơ chế apoptosis, tạo cơ sở khoa học quan trọng cho việc nghiên cứu phát triển nguồn dược liệu Đan sâm di thực tại Việt Nam.