Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng viêm của hợp chất thiên nhiên từ cây đại hoàng

• Tác giả: Hoàng Thị Ngọc Ánh
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Ngọc Khanh
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Hóa học
• Đề tài: Nghiên Cứu Cấu Trúc Và Hoạt Tính Kháng Viêm Của Hợp Chất Thiên Nhiên Từ Cây Đại Hoàng
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• MỤC LỤC
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHI ĐẠI HOÀNG – Rheum L.
• 1.2. Đặc điểm hình thái
• 1.3. Phân bố và thu hái
• 1.4. Thành phần hóa học
• 1.5. Các hợp chất khác
• 1.6. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học
• 1.6.1. Tác dụng nhuận tràng
• 1.6.2. Tác dụng kháng ung thư
• 1.6.3. Tác dụng kháng viêm và giảm đau
• 1.6.4. Tác dụng bảo vệ gan
• 1.6.5. Tác dụng kháng vi-rut
• 1.7. GIỚI THIỆU VỀ LOÀI RHEUM OFFICINALE BAILL.
• 1.8. Đặc điểm thực vật
• 1.9. Thành phần hóa học
• 1.10. Hoạt tính sinh học
• 1.11. GIỚI THIỆU VỀ LĨNH VỰC DOCKING PHÂN TỬ
• 1.11.1. Docking phân tử
• 1.11.2. Các đích nghiên cứu tác dụng kháng viêm
• 1.11.3. Các tiêu chí giống thuốc của các hợp chất
• 2. NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM
• 2.1. PHƯƠNG PHÁP
• 2.1.1. Thu thập mẫu thực vật
• 2.1.2. Nghiên cứu thành phần hóa học
• 2.1.3. Nghiên cứu về khả năng kháng viêm
• 2.1.4. Phương pháp docking phân tử
• 2.1.4.1. Mô tả tiến trình thí nghiệm docking
• 2.1.4.2. Xử lý cấu trúc phối tử
• 2.1.4.3. Xử lý cấu trúc protein
• 2.1.4.4. Xác định vùng họat động của protein
• 2.1.4.5. Mô phỏng tương tác phân tử bằng Autodock 4
• 2.2. Hóa chất và dụng cụ
• 2.3. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách
• 2.4. Tính chất vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT SẠCH TỪ CÂY ĐẠI HOÀNG
• 3.1.1. Cấu trúc hợp chất MC565
• 3.1.2. Cấu trúc của hợp chất MC566
• 3.1.3. Cấu trúc của hợp chất MC567
• 3.2. ĐÁNH GIÁ TIỀM NĂNG KHÁNG VIÊM CỦA CÁC HỢP CHẤT SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP DOCKING PHÂN TỬ
• 3.2.1. Tối ưu hóa cấu trúc hợp chất nghiên cứu
• 3.2.2. Đánh giá các tiêu chí giống thuốc của các hợp chất nghiên cứu
• 3.2.3. Xử lý tối ưu hóa cấu trúc protein nghiên cứu
• 3.2.4. Kết quả mô phỏng tương tác
• 3.3. HOẠT TÍNH ỨC CHẾ SỰ SẢN SINH NO CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐƯỢC PHÂN LẬP
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Giới thiệu về cây đại hoàng

Cây đại hoàng (Rheum officinale Baill.) là một trong những loài cây thuốc quý, được biết đến với nhiều tác dụng dược lý, đặc biệt là khả năng kháng viêm. Cấu trúc hợp chất thiên nhiên từ cây đại hoàng chủ yếu bao gồm các hợp chất anthraquinon, flavonoid và stilben. Các hợp chất này đã được nghiên cứu và chứng minh có tác dụng tích cực trong việc điều trị các bệnh viêm nhiễm. Theo tài liệu, cây đại hoàng có nguồn gốc từ Trung Quốc và đã được sử dụng trong y học cổ truyền từ hàng ngàn năm. Việc phân lập và xác định các hợp chất sinh học từ cây đại hoàng không chỉ giúp hiểu rõ hơn về thành phần hóa học mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc kháng viêm từ thiên nhiên.

1.1 Đặc điểm hình thái và phân bố

Cây đại hoàng là cây thân thảo lâu năm, có rễ phình to và thân rỗng. Cây thường mọc ở các vùng ôn đới và cận nhiệt đới, ưa khí hậu mát mẻ và ẩm ướt. Tại Việt Nam, cây đại hoàng được trồng ở nhiều tỉnh miền núi, nơi có điều kiện khí hậu phù hợp. Việc thu hái thân rễ của cây thường diễn ra vào mùa thu, khi cây đã trưởng thành từ 3-4 năm. Hoạt tính kháng viêm của cây đại hoàng đã được ghi nhận qua nhiều nghiên cứu, cho thấy tiềm năng lớn trong việc phát triển các sản phẩm dược phẩm từ cây này.

II. Nghiên cứu thành phần hóa học

Nghiên cứu thành phần hóa học của cây đại hoàng cho thấy sự hiện diện của nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học. Các hợp chất anthraquinon như rhein, emodin, và physcion là những thành phần chính, được biết đến với tác dụng kháng viêm mạnh mẽ. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hợp chất này có khả năng ức chế sự sản sinh của các cytokine gây viêm như IL-6 và TNF-α. Việc phân lập và xác định cấu trúc hợp chất thiên nhiên từ cây đại hoàng không chỉ giúp khẳng định giá trị dược lý của cây mà còn mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc phát triển thuốc kháng viêm từ thiên nhiên.

2.1 Phân lập và xác định cấu trúc

Quá trình phân lập các hợp chất từ cây đại hoàng thường sử dụng các phương pháp sắc ký như sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký cột. Các hợp chất sau khi phân lập sẽ được xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ như H-NMR và C-NMR. Kết quả cho thấy các hợp chất anthraquinon có cấu trúc hóa học đặc trưng, với nhiều nhóm chức có khả năng tương tác với các thụ thể trong cơ thể, từ đó phát huy tác dụng kháng viêm. Việc nghiên cứu này không chỉ có giá trị trong lĩnh vực dược lý mà còn góp phần vào việc bảo tồn và phát triển nguồn dược liệu quý từ thiên nhiên.

III. Đánh giá hoạt tính kháng viêm

Hoạt tính kháng viêm của các hợp chất từ cây đại hoàng được đánh giá thông qua các phương pháp in silico và in vitro. Các nghiên cứu cho thấy rằng các hợp chất anthraquinon có khả năng ức chế sản sinh NO, một trong những yếu tố gây viêm chính trong cơ thể. Kết quả từ các thử nghiệm cho thấy rằng các hợp chất này có thể làm giảm đáng kể nồng độ NO trong môi trường nuôi cấy tế bào. Điều này chứng tỏ rằng hợp chất kháng viêm tự nhiên từ cây đại hoàng có tiềm năng lớn trong việc phát triển các liệu pháp điều trị viêm nhiễm hiệu quả.

3.1 Phương pháp đánh giá

Để đánh giá hoạt tính kháng viêm, các hợp chất được thử nghiệm trên các dòng tế bào khác nhau. Phương pháp in vitro cho phép quan sát trực tiếp tác động của các hợp chất lên sự sản sinh NO. Kết quả cho thấy rằng các hợp chất anthraquinon không chỉ ức chế sản sinh NO mà còn có khả năng điều chỉnh các cytokine gây viêm. Điều này mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm dược phẩm từ cây đại hoàng, nhằm điều trị các bệnh lý liên quan đến viêm nhiễm, đặc biệt trong bối cảnh dịch bệnh hiện nay.

IV. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu về cấu trúc hợp chất thiên nhiên và hoạt tính kháng viêm của cây đại hoàng đã chỉ ra tiềm năng lớn trong việc phát triển các sản phẩm dược phẩm từ thiên nhiên. Các hợp chất anthraquinon không chỉ có tác dụng kháng viêm mà còn có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau của y học. Đề xuất cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của các hợp chất này, cũng như mở rộng nghiên cứu trên các mô hình động vật để khẳng định hiệu quả và độ an toàn của chúng trong điều trị bệnh. Việc phát triển các sản phẩm từ cây đại hoàng không chỉ góp phần vào việc bảo tồn nguồn dược liệu quý mà còn mang lại lợi ích cho sức khỏe cộng đồng.

4.1 Đề xuất nghiên cứu tiếp theo

Cần thực hiện các nghiên cứu lâm sàng để đánh giá hiệu quả của các hợp chất từ cây đại hoàng trong điều trị các bệnh lý viêm nhiễm. Bên cạnh đó, việc nghiên cứu các phương pháp chiết xuất và tinh chế hợp chất cũng cần được chú trọng để tối ưu hóa hoạt tính kháng viêm. Các nghiên cứu này sẽ không chỉ giúp khẳng định giá trị dược lý của cây đại hoàng mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc kháng viêm từ thiên nhiên.

Tổng quan nghiên cứu

Viêm là một phản ứng sinh học phức tạp của cơ thể nhằm chống lại các tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, virus hoặc các yếu tố kích thích vật lý, hóa học. Tuy nhiên, viêm kéo dài và mất kiểm soát có thể dẫn đến nhiều bệnh lý mạn tính như viêm khớp, bệnh tim mạch, ung thư, tiểu đường và các rối loạn thần kinh. Đại dịch COVID-19 do virus SARS-CoV-2 gây ra đã làm nổi bật vai trò của viêm trong tiến triển bệnh, đặc biệt là cơn bão viêm gây tổn thương phổi nghiêm trọng. Do đó, nghiên cứu các hợp chất kháng viêm từ thiên nhiên trở thành hướng đi quan trọng nhằm phát triển các biện pháp phòng và điều trị hiệu quả.

Cây Đại hoàng (Rheum officinale Baill.) là một dược liệu truyền thống có lịch sử sử dụng lâu đời trong y học cổ truyền Việt Nam và thế giới, nổi bật với thành phần hóa học đa dạng gồm các hợp chất anthraquinon, flavonoid, stilben và acylglucoside. Nhiều hợp chất trong Đại hoàng đã được chứng minh có hoạt tính sinh học như kháng viêm, kháng ung thư, bảo vệ gan và kháng virus. Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là phân lập, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất thiên nhiên từ cây Đại hoàng, nhằm tìm kiếm các ứng viên tiềm năng cho phát triển thuốc phòng bệnh COVID-19 và các bệnh viêm nhiễm khác.

Phạm vi nghiên cứu tập trung vào thân rễ cây Đại hoàng thu thập tại Hà Nội, với các phương pháp phân lập hóa học hiện đại kết hợp đánh giá hoạt tính kháng viêm bằng phương pháp in silico docking phân tử và thử nghiệm in vitro ức chế sản sinh nitric oxide (NO) trên tế bào đại thực bào RAW 264.7. Nghiên cứu góp phần làm rõ cơ chế tác dụng kháng viêm của các hợp chất từ Đại hoàng, đồng thời cung cấp dữ liệu khoa học cho việc phát triển dược liệu và thuốc mới.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu sau:

• Lý thuyết phản ứng viêm và các yếu tố trung gian: Viêm được điều hòa bởi các cytokine như IL-6, TNF-α, yếu tố phiên mã NF-kB và các enzym COX, NOS. Sự tăng sinh các yếu tố này dẫn đến phản ứng viêm cấp và mạn tính.
• Mô hình docking phân tử: Phương pháp tính toán dự đoán tương tác giữa các hợp chất (ligand) với protein mục tiêu (receptor) trong không gian ba chiều, đánh giá ái lực liên kết và vị trí gắn kết nhằm dự đoán hoạt tính sinh học.
• Quy tắc Lipinski về tính chất giống thuốc: Đánh giá khả năng hấp thu và sinh khả dụng của hợp chất dựa trên các tiêu chí về khối lượng phân tử, độ hòa tan trong lipid, số liên kết hydro cho và nhận, và chỉ số phân cực.
• Khái niệm về các hợp chất thiên nhiên chính: Anthraquinon, flavonoid, stilben và acylglucoside là các nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học đa dạng, đặc biệt là kháng viêm và kháng virus.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Mẫu thân rễ Đại hoàng (Rheum officinale Baill.) thu mua tại phố Lãn Ông, Hà Nội, được xác định và lưu giữ tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên.
• Phân lập và xác định cấu trúc: Sử dụng chiết xuất methanol, phân đoạn dung môi theo độ phân cực tăng dần, kết hợp sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột (CC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để phân lập các hợp chất tinh khiết. Cấu trúc xác định bằng phổ NMR (1D, 2D), phổ khối lượng (MS), phổ IR, UV.
• Phân tích docking phân tử: Sử dụng phần mềm AutoDock 4.6 để mô phỏng tương tác giữa các hợp chất phân lập với protein IL-6 (PDB ID: 1ALU) và TNF-α (PDB ID: 2AZ5). Cấu trúc protein được chuẩn bị loại bỏ nước, bổ sung hydro phân cực, xác định vùng hoạt động dựa trên các amino acid đặc trưng. Ligand được tối ưu hóa năng lượng bằng phương pháp DFT với bộ hàm B3LYP/6-311G(d,p).
• Thử nghiệm in vitro ức chế sản sinh NO: Tế bào đại thực bào RAW 264.7 được nuôi cấy trong môi trường DMEM, kích thích bằng LPS để tạo phản ứng viêm. Các hợp chất thử nghiệm được xử lý ở nhiều nồng độ khác nhau, đo lượng NO sản sinh bằng phản ứng Griess, tính giá trị IC50. Độ sống sót tế bào được đánh giá bằng phương pháp MTT.
• Timeline nghiên cứu: Thu thập mẫu và phân lập hợp chất trong 6 tháng đầu, xác định cấu trúc và tối ưu hóa ligand trong 3 tháng tiếp theo, thực hiện docking và thử nghiệm in vitro trong 6 tháng cuối năm 2021.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Phân lập và xác định cấu trúc thành công 3 hợp chất chính: MC565 (Chrysophanol), MC566 và MC567 với khối lượng phân tử lần lượt 254, 258 và 254. Các dữ liệu phổ NMR và MS cho thấy cấu trúc tương đồng với các hợp chất anthraquinon và dẫn xuất liên quan.

2. Hoạt tính kháng viêm in silico: Docking phân tử cho thấy MC565 có ái lực liên kết với IL-6 và TNF-α lần lượt là -7.5 và -8.2 kcal/mol, thấp hơn so với các hợp chất chuẩn, cho thấy khả năng ức chế tốt các cytokine viêm. MC566 và MC567 cũng thể hiện ái lực liên kết âm mạnh, hỗ trợ tiềm năng kháng viêm.

3. Ức chế sản sinh NO in vitro: MC565 đạt giá trị IC50 12.5 µM, MC566 là 15.8 µM và MC567 là 18.3 µM, so với chất chuẩn L-NMMA có IC50 khoảng 10 µM. Tất cả các hợp chất đều không gây độc tế bào ở nồng độ thử nghiệm, đảm bảo tính an toàn.

4. So sánh với nghiên cứu khác: Kết quả phù hợp với các báo cáo trước đây về tác dụng kháng viêm của chrysophanol và các anthraquinon từ Đại hoàng, đồng thời mở rộng thêm bằng chứng về hiệu quả của các hợp chất mới phân lập.

Thảo luận kết quả

Các hợp chất anthraquinon từ Đại hoàng, đặc biệt là chrysophanol (MC565), thể hiện khả năng ức chế các yếu tố viêm quan trọng như IL-6 và TNF-α, góp phần làm giảm phản ứng viêm. Ái lực liên kết âm mạnh trong mô phỏng docking phản ánh sự tương tác thuận lợi giữa ligand và protein mục tiêu, hỗ trợ cơ chế tác dụng kháng viêm. Thử nghiệm in vitro ức chế NO trên tế bào RAW 264.7 cũng chứng minh hiệu quả sinh học thực tế của các hợp chất này.

So với các nghiên cứu trước, kết quả này củng cố vai trò của Đại hoàng như một nguồn dược liệu quý giá trong điều trị viêm và các bệnh liên quan. Việc kết hợp phương pháp in silico và in vitro giúp tiết kiệm thời gian, chi phí và tăng độ chính xác trong đánh giá hoạt tính sinh học. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ ái lực liên kết docking và biểu đồ IC50 ức chế NO, giúp minh họa rõ ràng hiệu quả của từng hợp chất.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tiếp tục nghiên cứu mở rộng các hợp chất khác từ Đại hoàng: Phân lập thêm các hợp chất flavonoid, stilben để đánh giá hoạt tính kháng viêm và kháng virus, nhằm đa dạng hóa nguồn ứng viên thuốc mới. Thời gian 12 tháng, chủ thể Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên.

2. Phát triển thử nghiệm in vivo trên mô hình động vật: Đánh giá hiệu quả và độ an toàn của các hợp chất MC565, MC566, MC567 trong điều trị viêm cấp và mạn tính, đặc biệt trong mô hình viêm phổi do virus. Thời gian 18 tháng, chủ thể các trung tâm nghiên cứu dược lý.

3. Tối ưu hóa cấu trúc hóa học và tổng hợp dẫn xuất: Sử dụng phương pháp hóa học và tính toán để cải thiện hoạt tính và dược động học của các hợp chất, tăng khả năng hấp thu và giảm độc tính. Thời gian 24 tháng, chủ thể các phòng thí nghiệm hóa dược.

4. Ứng dụng trong phát triển sản phẩm dược liệu và thực phẩm chức năng: Nghiên cứu quy trình chiết xuất, bào chế và kiểm định chất lượng sản phẩm từ Đại hoàng có hoạt tính kháng viêm, phục vụ thị trường trong nước và xuất khẩu. Thời gian 12 tháng, chủ thể doanh nghiệp dược liệu.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu dược liệu và hóa học thiên nhiên: Tài liệu cung cấp dữ liệu chi tiết về thành phần hóa học và phương pháp phân lập các hợp chất từ Đại hoàng, hỗ trợ nghiên cứu phát triển thuốc mới.

2. Chuyên gia y sinh và dược lý học: Thông tin về hoạt tính kháng viêm in silico và in vitro giúp hiểu rõ cơ chế tác dụng và lựa chọn hợp chất ứng dụng trong điều trị viêm và các bệnh liên quan.

3. Doanh nghiệp sản xuất dược phẩm và thực phẩm chức năng: Cơ sở khoa học để phát triển sản phẩm từ Đại hoàng, đảm bảo hiệu quả và an toàn, đáp ứng nhu cầu thị trường.

4. Sinh viên và học viên cao học ngành Hóa học, Dược học, Sinh học: Tài liệu tham khảo về quy trình nghiên cứu khoa học, phương pháp phân tích cấu trúc và đánh giá hoạt tính sinh học, nâng cao kỹ năng nghiên cứu.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao chọn cây Đại hoàng để nghiên cứu hoạt tính kháng viêm?
   Cây Đại hoàng chứa nhiều hợp chất anthraquinon đã được chứng minh có tác dụng kháng viêm, kháng ung thư và kháng virus. Đây là dược liệu truyền thống có tiềm năng lớn trong phát triển thuốc mới, đặc biệt trong bối cảnh đại dịch COVID-19.

2. Phương pháp docking phân tử có độ chính xác như thế nào?
   Docking phân tử là phương pháp tính toán dự đoán tương tác ligand-protein dựa trên cấu trúc 3D, giúp đánh giá ái lực liên kết và vị trí gắn kết. Kết quả thường được xác thực bằng thử nghiệm in vitro và in vivo để đảm bảo độ tin cậy.

3. Các hợp chất phân lập có độc tính không?
   Thử nghiệm MTT trên tế bào RAW 264.7 cho thấy các hợp chất MC565, MC566, MC567 không gây độc tế bào ở nồng độ thử nghiệm, đảm bảo an toàn cho các bước nghiên cứu tiếp theo.

4. Giá trị IC50 ức chế NO có ý nghĩa gì?
   IC50 là nồng độ hợp chất cần thiết để ức chế 50% sản sinh nitric oxide, một chỉ số quan trọng đánh giá hoạt tính kháng viêm. Giá trị IC50 càng thấp chứng tỏ hiệu quả ức chế càng cao.

5. Luận văn có đề xuất ứng dụng thực tiễn nào không?
   Luận văn đề xuất phát triển các hợp chất từ Đại hoàng thành thuốc hoặc thực phẩm chức năng kháng viêm, đồng thời khuyến nghị nghiên cứu mở rộng và thử nghiệm in vivo để ứng dụng trong điều trị các bệnh viêm và phòng ngừa COVID-19.

Kết luận

• Phân lập thành công ba hợp chất chính từ cây Đại hoàng, xác định cấu trúc bằng phổ NMR và MS.
• Các hợp chất thể hiện ái lực liên kết mạnh với các protein viêm IL-6 và TNF-α qua mô phỏng docking phân tử.
• Thử nghiệm in vitro cho thấy khả năng ức chế sản sinh NO hiệu quả, không gây độc tế bào.
• Kết quả nghiên cứu góp phần làm rõ cơ chế kháng viêm của Đại hoàng, mở hướng phát triển thuốc mới phòng và điều trị viêm, đặc biệt trong bối cảnh COVID-19.
• Đề xuất nghiên cứu tiếp tục mở rộng, thử nghiệm in vivo và phát triển sản phẩm dược liệu ứng dụng thực tiễn.

Luận văn là tài liệu tham khảo quý giá cho các nhà khoa học, chuyên gia dược liệu và doanh nghiệp trong lĩnh vực phát triển thuốc và sản phẩm chăm sóc sức khỏe. Để tiếp tục khai thác tiềm năng của Đại hoàng, cần triển khai các nghiên cứu sâu hơn và ứng dụng công nghệ hiện đại trong phát triển dược phẩm.