Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ dược học của nghiên cứu sinh Nông Thị Anh Thư với đề tài "Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Mũi mác - Tadehagi triquetrum (L.) H. Ohashi, họ Đậu (Fabaceae) ở Bắc Kạn" được thực hiện tại Viện Dược liệu, thuộc chuyên ngành Dược liệu - Dược học cổ truyền (mã số 9720206), dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Nguyễn Thị Bích Thu và PGS. Nguyễn Trọng Thông.

Về tính cấp thiết, cây Mũi mác (Tadehagi triquetrum (L.) H. Ohashi, trước đây mang tên Desmodium triquetrum (L.) DC.) là loài thực vật thuộc họ Đậu (Fabaceae) có lịch sử sử dụng lâu đời trong y học dân gian của cộng đồng người Tày tại tỉnh Bắc Kạn cũng như trong Y học cổ truyền Việt Nam, Trung Quốc và Ấn Độ. Kinh nghiệm dân gian sử dụng loài cây này để thanh nhiệt giải độc, kiện tỳ tiêu thực, lợi niệu, sát trùng, điều trị các chứng viêm (viêm họng, viêm thận cấp, viêm ruột), hoàng đản (vàng da, bệnh lý gan), phong thấp, tiêu chảy và mụn nhọt. Mặc dù chi Desmodium nói chung đã có nhiều công bố quốc tế về hóa thực vật và dược lý, nhưng chi Tadehagi (được tách ra từ năm 1973) và cụ thể là loài Mũi mác phân bố tự nhiên tại vùng miền núi phía Bắc Việt Nam vẫn chưa có công trình nào nghiên cứu toàn diện và có hệ thống từ đặc điểm thực vật học, vi phẫu, thành phần hóa học chi tiết đến các thử nghiệm dược lý thực nghiệm để chứng minh cơ sở khoa học cho kinh nghiệm sử dụng truyền thống. Đây chính là khoảng trống nghiên cứu mà luận án hướng tới giải quyết.

Luận án xác định 3 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

  1. Xác định tên khoa học của mẫu dược liệu Mũi mác thu hái tại Bắc Kạn.
  2. Nghiên cứu thành phần hóa học của Mũi mác.
  3. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa, chống viêm và bảo vệ tế bào gan của các cao chiết từ dược liệu Mũi mác.

Để đạt được các mục tiêu trên, tác giả đã triển khai 7 nội dung nghiên cứu:

  1. Mô tả đặc điểm hình thái và xác định tên khoa học của Mũi mác.
  2. Xác định đặc điểm giải phẫu lá, thân và đặc điểm bột dược liệu Mũi mác.
  3. Định tính các nhóm chất hóa học có trong Mũi mác.
  4. Chiết xuất, phân lập và nhận dạng một số chất phân lập được từ Mũi mác.
  5. Đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH và superoxyd ($O_2^{-\bullet}$) của cao chiết ethanol và cao phân đoạn ethyl acetat từ Mũi mác.
  6. Đánh giá tác dụng chống viêm cấp và viêm mạn của cao ethanol và cao phân đoạn ethyl acetat từ Mũi mác.
  7. Đánh giá tác dụng phục hồi tổn thương gan của cao ethanol và cao phân đoạn ethyl acetat từ Mũi mác.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng thực vật: Mẫu phần trên mặt đất (thân, cành, lá, hoa, quả) của cây Mũi mác được thu hái tại tỉnh Bắc Kạn vào ngày 10 tháng 10 năm 2011. Mẫu tiêu bản khô được định danh và lưu giữ tại Phòng Sinh học - Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam (mã số AT01) và Khoa Tài nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu.
  • Đối tượng sinh học thực nghiệm: Chuột nhắt trắng chủng Swiss (cả hai giống, trọng lượng $25 \pm 2\text{ g}$) do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp; chuột cống trắng (cả hai giống, trọng lượng $180 - 200\text{ g}$) do Trung tâm chăn nuôi động vật Đan Phượng cung cấp.
  • Phạm vi không gian: Thực hiện tại các phòng thí nghiệm chuyên môn gồm Viện Dược liệu, Viện Hóa học, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật (thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), Trường Đại học Y Hà Nội và Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên.
  • Thời gian thực hiện: Luận án được hoàn thành và nghiệm thu vào năm 2019.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Trong chương tổng quan, tác giả đã hệ thống hóa các tài liệu khoa học trong và ngoài nước liên quan đến phân loại học thực vật, thành phần hóa học và tác dụng dược lý của hai chi có liên hệ mật thiết là Desmodium Desv. và Tadehagi H. Ohashi:

  1. Vị trí phân loại và phân bố: Theo hệ thống phân loại của Takhtadjan (1969, 1973, 1987, 1997), cả hai chi đều thuộc tông Desmodieae, phân tông Desmodiinae, họ Fabaceae. Năm 1973, nhà thực vật học Nhật Bản Hiroyoshi Ohashi đã tách một số loài từ chi Desmodium (trong đó có Desmodium triquetrum) sang chi mới Tadehagi H. Ohashi dựa trên đặc điểm hình thái đặc trưng: lá đơn có chiều dài gấp hơn 3 lần chiều rộng, cuống lá có cánh rõ rệt, không có gân phụ hình mạng lưới và cụm hoa dạng chùm thưa. Hệ thống phân loại này được củng cố trong Thực vật chí Trung Quốc (Huang & Ohashi, 2010) và Danh lục các loài thực vật Việt Nam. Chi Tadehagi trên thế giới có khoảng 6 loài, tại Việt Nam ghi nhận 4 loài: T. godefroyanum, T. pseudotriquetrum, T. rodgeri và T. triquetrum.

  2. Các hướng nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học trước đây:

  • Chi Desmodium: Các công trình của Tschesche (1974), Ghosal (1972), Kuang (2008), Ma (2011) đã công bố hơn 212 hợp chất thuộc các khung flavonoid (kaempferol, apigenin, vitexin, dalbergioidin, gangetin, genistein, vicenin-1, vicenin-3), alkaloid nhân indol (bufotenin, O-methylbufotenin), steroid ($\beta$-sitosterol, stigmasterol) và triterpenoid (lupenon, lupeol, soyasaponin I). Dược lý ghi nhận tác dụng chống viêm, chống oxy hóa, hạ huyết áp, bảo vệ gan và ức chế tạo sỏi thận calci oxalat của D. styracifolium và D. gangeticum.
  • Chi Tadehagi: Các công trình quốc tế của Li (2014), Zhao (2012), Cui (2012) trên loài Tadehagi triquetrum tại Trung Quốc đã phân lập các flavonol glycosid (astragalin, aromadendrin, quercetin glycosid), các hợp chất phenylpropanoid và nhóm hợp chất triquetrumon A–H, cyclokieviton, yukovanol. Một số hoạt tính đã được ghi nhận như tác dụng tẩy giun sán, diệt ký sinh trùng ốc, ức chế tăng sinh tế bào hình sao gan HSC-T6 và chống oxy hóa in vitro.

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn: Mặc dù cây Mũi mác đã có một số nghiên cứu tại nước ngoài, nguồn dược liệu Mũi mác mọc tự nhiên tại Bắc Kạn - Việt Nam chưa từng có công trình nghiên cứu đầy đủ về hình thái giải phẫu, đặc điểm bột làm tiêu chuẩn kiểm nghiệm, thành phần hóa học chi tiết cũng như các tác dụng sinh học thực nghiệm trên mô hình chống viêm cấp, viêm mạn và bảo vệ tổn thương gan do hóa chất gây ra. Luận án đặt vị trí nghiên cứu là công trình hoàn chỉnh đầu tiên tại Việt Nam giải quyết đồng bộ các mắt xích này.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án kết hợp đồng thời phương pháp phân loại hình thái thực vật học, hóa học hợp chất thiên nhiên hiện đại và các mô hình dược lý thực nghiệm in vitro, in vivo.

Lĩnh vực nghiên cứu Cơ sở lý thuyết / Khung phân tích Phương pháp và Kỹ thuật thực tế Thiết bị và Vật liệu sử dụng
Thực vật học Phương pháp so sánh hình thái học phân loại của Takhtadjan, Ohashi (1973), FOC (2010) và tiêu chuẩn Kiểm nghiệm dược liệu hiển vi (DĐVN IV). Phân tích đặc điểm hình thái thân, lá, hoa, quả; làm tiêu bản vi phẫu cắt ngang rễ, thân, lá; soi bột dược liệu. Kính hiển vi Leica Wetzlar GmbH, kính soi nổi Krussoptroni, máy ảnh Canon (độ phóng đại X40).
Hóa thực vật: Định tính Các phản ứng hóa học thường quy xác định các nhóm hợp chất tự nhiên. Phản ứng màu, phản ứng tạo tủa đặc trưng cho flavonoid, alkaloid, saponin, tanin, acid hữu cơ, anthranoid, steroid/triterpenoid. Ống nghiệm, thuốc thử chuyên biệt theo quy chuẩn Dược điển.
Hóa thực vật: Chiết xuất & Phân lập Kỹ thuật chiết ngấm kiệt, phân bố lỏng - lỏng và sắc ký hấp phụ. Chiết toàn phần bằng EtOH $80%$, phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần ($n$-hexan, EtOAc, $n$-BuOH, nước). Sắc ký cột pha thường (Silica gel 60) và pha đảo (RP-18), sắc ký lớp mỏng (TLC). Bản mỏng Silica gel $F_{254}$, RP-18 $F_{254s}$ (Merck); dung môi công nghiệp và tinh khiết.
Hóa thực vật: Xác định cấu trúc Phương pháp phổ nghiệm hiện đại trong phân tích cấu trúc hữu cơ. Đo điểm nóng chảy; phổ UV-Vis, phổ hồng ngoại (FT-IR); khối phổ ESI-MS, HR-ESI-MS; phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, NOESY); phổ lưỡng sắc tròn (CD) thực nghiệm kết hợp tính toán lượng tử. Phổ kế Bruker 500 MHz, LC/MS/MS Water-API-ISI, FT-IR Spectrophotometer 1650 Perkin Elmer, UV-Vis 1800 Shimadzu.
Dược lý: Chống oxy hóa Cơ chế dọn gốc tự do in vitro. Thử nghiệm dọn gốc tự do DPPH và dọn gốc tự do superoxid ($O_2^{-\bullet}$) sinh ra từ hệ enzym xanthin oxidase (XO) / xanthin / NBT. Đo mật độ quang (OD) trên máy quang phổ UV-Vis. Đối chứng: Quercetin, BHT, (+)-catechin.
Dược lý: Chống viêm in vivo Mô hình viêm cấp tính và viêm mạn tính trên động vật thực nghiệm. - Viêm cấp: Gây phù chân chuột bằng carrageenin (đo độ phù bằng thể tích kế); gây viêm màng bụng bằng formaldehyd (đo thể tích dịch rỉ viêm, đếm bạch cầu, định lượng protein).
- Viêm mạn: Mô hình u hạt thực nghiệm (cân trọng lượng u hạt tươi và u hạt sấy khô).		 Phù kế Plethysmometer No 7250 Ugo-Basile; máy ly tâm lạnh; đối chứng Aspirin, Methylprednisolon.
Dược lý: Phục hồi tổn thương gan Mô hình hoại tử tế bào gan cấp do Paracetamol trên chuột cống/chuột nhắt trắng. Đánh giá trọng lượng gan chuột; định lượng hoạt độ men gan transaminase huyết thanh (AST, ALT); định lượng chỉ số peroxy hóa lipid (MDA) trong mô gan; đánh giá giải phẫu bệnh đại thể và vi thể (nhuộm HE x 400). Kit định lượng sinh hóa Hospitex Diagnostics (Italy), đối chứng Silymarin (Silimax 70 mg).

Xử lý số liệu: Dữ liệu thực nghiệm được trình bày dưới dạng giá trị trung bình $\pm$ độ lệch chuẩn (Mean $\pm$ SD). Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm chuyên dụng, so sánh sự khác biệt giữa các lô thử nghiệm bằng Student's $t$-test hoặc ANOVA, với mức ý nghĩa thống kê được xác định ở $p < 0,05$, $p < 0,01$ và $p < 0,001$.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Thực vật học, thành phần hóa học, tác dụng sinh học và công dụng của chi Desmodium và chi Tadehagi

Chương 1 tổng hợp tổng quan lý thuyết và tư liệu từ 124 tài liệu tham khảo trong nước và quốc tế. Tác giả làm rõ lịch sử tách chi Tadehagi từ chi Desmodium của Ohashi (1973), hệ thống hóa khóa phân loại phân biệt giữa hai chi dựa trên hình thái lá và cụm hoa. Chương này tổng hợp dữ liệu phân bố của 29 loài thuộc chi Desmodium và 4 loài thuộc chi Tadehagi tại Việt Nam. Về mặt hóa học, chương tổng quan chỉ ra sự khác biệt cơ bản: chi Desmodium giàu isoflavonoid, trong khi chi Tadehagi có xu hướng tập trung các hợp chất euflavonoid (flavonol và dẫn xuất flavonol glycosid). Về mặt sử dụng y học, chương thống kê chi tiết 17 bài thuốc kinh nghiệm dân gian sử dụng cây Mũi mác để chữa tiêu hóa kém, cam tích trẻ em, ho ra máu, viêm thận phù thũng, trĩ, viêm gan vàng da và dị ứng.

Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc nguyên liệu thực vật thu hái tại Bắc Kạn (mã số AT01), các chủng động vật thực nghiệm (chuột nhắt trắng Swiss $25 \pm 2\text{ g}$, chuột cống trắng $180 - 200\text{ g}$), danh mục hóa chất, dung môi sắc ký, kít thử sinh hóa và trang thiết bị hiện đại sử dụng trong đề tài. Quy trình chiết xuất phân đoạn từ bột dược liệu khô được xây dựng bằng sơ đồ chiết ngấm kiệt với ethanol $80%$, sau đó thu hồi dung môi tạo cao tổng EtOH và chiết phân bố lần lượt với các dung môi $n$-hexan, ethyl acetat (EtOAc) và $n$-butanol ($n$-BuOH). Chương này chuẩn hóa toàn bộ các công thức toán học tính toán phần trăm ức chế gốc tự do, giá trị $\text{IC}_{50}$, tỷ lệ phần trăm ức chế phù chân chuột, tỷ lệ ức chế dịch rỉ viêm, hàm lượng protein và nồng độ MDA trong mô gan.

Chương 3. Kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu thực nghiệm được trình bày theo 3 phần chính:

1. Kết quả nghiên cứu về thực vật học

  • Hình thái học: Cây thảo cứng, cao 1–1,5 m, phân nhánh. Lá có 1 lá chét hình tam giác dài cụt hình tim ở gốc, cuống lá có cánh rộng đặc trưng; lá kèm hình tam giác nhọn dạng vảy màu nâu dài 1,5 cm. Cụm hoa chùm kép ở nách lá và ngọn; hoa màu hồng; quả đậu gồm 5–8 đốt dẹt, có lông tơ.
  • Đặc điểm vi học:
    • Vi phẫu rễ: Lớp bần ngoài cùng gồm nhiều hàng tế bào hình chữ nhật, mô mềm vỏ hẹp, libe cấp 2 tạo thành các nón libe, gỗ cấp 2 phát triển mạnh chiếm phần lớn thể tích rễ, tia ruột rõ.
    • Vi phẫu thân: Thân có thiết diện 3 góc; biểu bì có tầng cutin dày và lông che chở đa bào; mô dày nằm ở các góc; vòng mô cứng bao quanh libe; hệ thống mạch gỗ xếp thành vòng tròn liên tục; mô mềm ruột ở tâm.
    • Vi phẫu lá: Gân giữa lồi rõ ở mặt dưới; có 2 cánh mỏng ở hai bên; bó mạch chính hình cung ở giữa kèm các bó mạch phụ nhỏ; mô giậu gồm một hàng tế bào dài xếp sít nhau dưới biểu bì trên; biểu bì có lỗ khí và lông che chở.
    • Đặc điểm vi phẫu bột: Bột có màu xanh lục xám, vị hơi đắng, soi kính hiển vi thấy mảnh biểu bì mang lỗ khí, lông che chở đơn bào và đa bào đầu nhọn, mảnh mạch vạch, mạch mạng, tinh thể calci oxalat hình cầu gai và hình lăng trụ, mảnh mô mềm ruột.
  • Thẩm định tên khoa học: Mẫu nghiên cứu được định danh chính xác là Tadehagi triquetrum (L.) H. Ohashi, họ Đậu (Fabaceae).

2. Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học

  • Định tính: Dược liệu Mũi mác cho phản ứng dương tính rõ rệt với các nhóm chất: flavonoid, tanin, acid hữu cơ, triterpenoid, steroid và saponin.
  • Phân lập và xác định cấu trúc: Từ các phân đoạn cao $n$-hexan, EtOAc và $n$-BuOH, tác giả đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 20 hợp chất tinh khiết (ký hiệu từ TT1 đến TT20) bằng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D-NMR, MS, IR, UV và CD:
Ký hiệu Tên hợp chất phân lập Phân loại khung hóa học
TT1 Kaempferol 3-$O$-$\beta$-D-glucopyranosid Flavonol glycosid
TT2 Kaempferol 3-$O$-$\beta$-D-galactopyranosid Flavonol glycosid
TT3 Quercetin 3-$O$-$\alpha$-L-rhamnopyranosyl-(1$\rightarrow$6)-$\beta$-D-glucopyranosid (Rutin) Flavonol glycosid
TT4 Kaempferol 3-$O$-$\alpha$-L-rhamnopyranosyl-(1$\rightarrow$6)-$\beta$-D-galactopyranosid Flavonol glycosid
TT5 Astragalin Flavonol glycosid
TT6 Quercetin 3-$O$-$\beta$-D-glucopyranosid (Isoquercitrin) Flavonol glycosid
TT7 Kaempferol 3-$O$-$\beta$-D-rutinosid Flavonol glycosid
TT8 6-$O$-($E$)-$p$-hydroxycinnamoylquercetin 3-$O$-$\beta$-D-galactopyranosid Flavonol acyl glycosid
TT9 Quercetin 3-$O$-$\beta$-D-galactopyranosid (Hyperosid) Flavonol glycosid
TT10 Aromadendrin Dihydroflavonol
TT11 Kaempferol Flavonol aglycon
TT12 Triquetrumon A Dẫn xuất prenylated flavonoid
TT13 Triquetrumon B Dẫn xuất prenylated flavonoid
TT14 Triquetrumon C Dẫn xuất prenylated flavonoid
TT15 ($R$)-Triquetrumon D Dẫn xuất prenylated flavonoid
TT16 Triquetrumon E Dẫn xuất prenylated flavonoid
TT17 Triquetrumon F Dẫn xuất prenylated flavonoid
TT18 Triquetrumon G Dẫn xuất prenylated flavonoid
TT19 Triquetrumon H Dẫn xuất prenylated flavonoid
TT20 Hợp chất mới phân lập (xác định cấu trúc lập thể qua phổ CD thực nghiệm và tính toán lượng tử hai đối quang TT20a/TT20b) Hợp chất tự nhiên đặc trưng

3. Kết quả nghiên cứu tác dụng sinh học

  • Tác dụng chống oxy hóa in vitro:
    • Khả năng dọn gốc tự do DPPH: Cả cao tổng EtOH và cao phân đoạn EtOAc đều thể hiện hoạt tính dọn gốc tự do phụ thuộc vào nồng độ. Cao phân đoạn EtOAc thể hiện hoạt tính mạnh hơn cao EtOH, tiệm cận với chất đối chứng dương Quercetin.
    • Khả năng dọn gốc tự do superoxid ($O_2^{-\bullet}$): Cao chiết thể hiện khả năng ức chế rõ rệt phản ứng tạo formazan từ NBT do enzym XO xúc tác.
  • Tác dụng chống viêm in vivo:
    • Chống viêm cấp trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin: Cao EtOH và cao phân đoạn EtOAc ở các mức liều thử nghiệm làm giảm thể tích phù chân chuột rõ rệt so với lô chứng sinh học ($p < 0,05$ đến $p < 0,01$), hiệu lực duy trì kéo dài suốt thời gian 1–6 giờ sau khi gây viêm.
    • Tác dụng ức chế dịch rỉ viêm và bạch cầu: Cao Mũi mác làm giảm thể tích dịch rỉ viêm màng bụng, ức chế số lượng bạch cầu thoát mạch và làm giảm hàm lượng protein trong dịch rỉ viêm có ý nghĩa thống kê so với lô đối chứng.
    • Chống viêm mạn trên mô hình u hạt: Cả hai loại cao chiết làm giảm trọng lượng u hạt cân tươi và u hạt sấy khô có ý nghĩa thống kê, chứng minh tác dụng ức chế sự tăng sinh tổ chức liên kết trong viêm mạn tính.
  • Tác dụng phục hồi và bảo vệ tổn thương gan:
    • Trên mô hình chuột cống/nhắt bị hoại tử tế bào gan do Paracetamol liều độc: Các lô uống cao EtOH và cao EtOAc của Mũi mác có hoạt độ enzym transaminase huyết thanh (AST, ALT) giảm rõ rệt so với lô đối chứng bệnh lý ($p < 0,01$).
    • Chỉ số peroxy hóa lipid: Nồng độ MDA trong mô gan của chuột uống cao Mũi mác giảm rõ rệt, chứng tỏ tác dụng bảo vệ màng tế bào gan chống lại tổn thương oxy hóa do các gốc tự do của paracetamol gây ra.
    • Hình thái bệnh học: Quan sát đại thể gan chuột giảm tình trạng sung huyết, phù nề; tiêu bản vi thể nhuộm HE (độ phóng đại x400) cho thấy mức độ hoại tử tế bào gan trung tâm tiểu thùy giảm rõ rệt, cấu trúc bè gan được phục hồi và giảm thâm nhiễm tế bào viêm tương đương với lô đối chứng dùng thuốc bảo vệ gan Silymarin.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án của NCS. Nông Thị Anh Thư đã mang lại những đóng góp mới cụ thể về mặt khoa học lý luận và thực tiễn dược học:

  1. Đóng góp mới về thực vật học và kiểm nghiệm:
  • Lần đầu tiên cung cấp bộ dữ liệu đầy đủ, chuẩn xác về đặc điểm hình thái thực vật, cấu tạo giải phẫu vi phẫu thân, rễ, lá và đặc điểm bột dược liệu của cây Mũi mác (Tadehagi triquetrum (L.) H. Ohashi) thu hái tại Bắc Kạn. Các tiêu chuẩn hiển vi này đóng góp trực tiếp vào việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm, nhận biết dược liệu và tránh nhầm lẫn với các loài khác thuộc chi Desmodium.
  1. Đóng góp mới về hóa học hợp chất thiên nhiên:
  • Đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam tiến hành phân lập có hệ thống các hợp chất từ cây Mũi mác, đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 20 hợp chất tinh khiết (TT1–TT20) thuộc các nhóm chất flavonol glycosid, flavonol aglycon, dihydroflavonol và các prenylated flavonoid.
  • Bổ sung dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, 2D-NMR) và phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS của các chất phân lập; đặc biệt ứng dụng phương pháp tính toán hóa học lượng tử kết hợp phổ lưỡng sắc tròn (CD) thực nghiệm để xác định cấu hình tuyệt đối cho hợp chất phân lập TT20.
  1. Đóng góp mới về dược lý thực nghiệm:
  • Đã chứng minh một cách khoa học bằng thực nghiệm in vitro và in vivo rằng cao chiết ethanol và phân đoạn ethyl acetat của cây Mũi mác có hoạt tính chống oxy hóa mạnh (dọn gốc tự do DPPH và superoxid), tác dụng chống viêm cấp tính và mạn tính (giảm phù chân, giảm dịch rỉ viêm, giảm số lượng bạch cầu thoát mạch, giảm trọng lượng u hạt).
  • Lần đầu tiên chứng minh tác dụng bảo vệ và phục hồi tổn thương tế bào gan của cây Mũi mác trên mô hình hoại tử gan do paracetamol thông qua việc hạ men gan AST, ALT, giảm nồng độ MDA mô gan và cải thiện rõ rệt cấu trúc vi thể gan trên giải phẫu bệnh.
  1. Kiến nghị và giải pháp đề xuất:
  • Đề xuất đưa tiêu chuẩn hình thái, giải phẫu và bột của cây Mũi mác vào chuyên luận tiêu chuẩn cơ sở và Dược điển Việt Nam cho dược liệu Mũi mác.
  • Đề xuất tiếp tục nghiên cứu chiết xuất hoạt chất định lượng, thử nghiệm hoạt tính sinh học trên từng hợp chất tinh khiết (đặc biệt là nhóm triquetrumon và hợp chất TT20), nghiên cứu độc tính bán trường diễn và phát triển quy trình công nghệ bào chế các chế phẩm thuốc có tác dụng chống viêm, hỗ trợ điều trị bệnh lý gan từ nguồn dược liệu Mũi mác tại Bắc Kạn.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Dựa trên các nội dung được trình bày trong luận án, một số hạn chế và hướng phát triển nghiên cứu được xác định như sau:

  • Về phạm vi thu mẫu: Mẫu dược liệu thực vật mới chỉ được thu hái tập trung tại một địa bàn đại diện thuộc tỉnh Bắc Kạn vào một thời điểm (tháng 10/2011), chưa thực hiện khảo sát biến thiên hàm lượng hoạt chất theo các mùa sinh trưởng khác nhau và giữa các vùng sinh thái khác nhau tại Việt Nam.
  • Về thử nghiệm hoạt tính sinh học: Các thử nghiệm dược lý (chống viêm, chống oxy hóa, bảo vệ gan) trong luận án mới được tiến hành trên cao chiết thô (cao tổng EtOH) và cao phân đoạn (EtOAc), chưa tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học trực tiếp trên từng hợp chất tinh khiết từ TT1 đến TT20 do giới hạn về lượng mẫu phân lập.
  • Hướng nghiên cứu tiếp theo:
    1. Nghiên cứu phương pháp định lượng các hợp chất chính (như rutin, hyperosid, astragalin, kaempferol hoặc triquetrumon) trong dược liệu bằng phương pháp HPLC để xây dựng tiêu chuẩn định lượng cho dược liệu.
    2. Đánh giá độc tính bán trường diễn và độc tính trường diễn của cao chiết Mũi mác trên động vật thực nghiệm nhằm khẳng định độ an toàn khi sử dụng dài ngày.
    3. Thử nghiệm cơ chế phân tử của các hợp chất phân lập trên các enzym viêm (COX-2, iNOS) và các thụ thể tế bào gan.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn cao cho nhiều nhóm đối tượng:

  • Đối với nghiên cứu sinh và học viên cao học ngành Dược học/Hóa học: Là tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp luận kết hợp giữa thực vật học, chiết xuất phân lập hóa thực vật (đặc biệt là quy trình phân tách sắc ký cột silica gel pha thường và pha đảo) và kỹ thuật giải phổ NMR/MS/CD để xác định cấu trúc các hợp chất tự nhiên phức tạp.
  • Đối với giảng viên và nhà nghiên cứu dược liệu - dược cổ truyền: Cung cấp cơ sở khoa học thực nghiệm vững chắc để giải thích và chứng minh các kinh nghiệm điều trị dân gian của đồng bào dân tộc Tày và YHCT trong việc sử dụng cây Mũi mác điều trị viêm nhiễm, bệnh đường tiêu hóa và bệnh lý gan mật.
  • Đối với các cơ sở kiểm nghiệm và sản xuất dược phẩm: Phần mô tả giải phẫu vi học, bột dược liệu và các hợp chất phân lập cung cấp dữ liệu nền tảng phục vụ công tác xây dựng tiêu chuẩn chất lượng, kiểm nghiệm dược liệu và định hướng phát triển sản phẩm thuốc từ dược liệu Mũi mác.

Câu hỏi thường gặp

1. Dựa vào những đặc điểm hình thái nào mà loài Mũi mác (Desmodium triquetrum) được tách ra khỏi chi Desmodium để xếp vào chi Tadehagi? Theo công bố của Hiroyoshi Ohashi (1973) và Thực vật chí Trung Quốc, cây Mũi mác được chuyển sang chi Tadehagi dựa vào đặc điểm: lá là dạng lá đơn (có 1 lá chét), chiều dài lá lớn hơn 3 lần so với chiều rộng, cuống lá có cánh rất rõ rệt hình mác hoặc hình tim, phiến lá không có gân phụ hình mạng lưới; đồng thời cụm hoa mọc thành dạng chùm thưa ở nách lá và đầu cành (khác với lá kép 3 lá chét và cụm hoa chùy đặc của chi Desmodium).

2. Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc của bao nhiêu hợp chất tinh khiết từ cây Mũi mác thu hái tại Bắc Kạn? Tác giả đã phân lập và xác định cấu trúc của 20 hợp chất tinh khiết (ký hiệu từ TT1 đến TT20). Các hợp chất này chủ yếu thuộc nhóm flavonol glycosid (như Kaempferol 3-$O$-$\beta$-D-glucopyranosid, Rutin, Astragalin, Isoquercitrin, Hyperosid...), flavonol aglycon (Kaempferol), dihydroflavonol (Aromadendrin) và nhóm các dẫn xuất prenylated flavonoid (Triquetrumon A, B, C, D, E, F, G, H).

3. Hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết Mũi mác được đánh giá qua những mô hình nào và kết quả ra sao? Hoạt tính chống oxy hóa được đánh giá qua hai mô hình in vitro: dọn gốc tự do DPPH và dọn gốc tự do superoxid ($O_2^{-\bullet}$) sinh ra từ hệ enzym xanthin oxidase (XO)/xanthin/NBT. Kết quả cho thấy cả cao tổng EtOH và cao phân đoạn EtOAc đều có khả năng dọn gốc tự do phụ thuộc nồng độ, trong đó phân đoạn EtOAc thể hiện hoạt tính dọn gốc tự do mạnh hơn cao tổng EtOH và tiệm cận với chất đối chứng Quercetin.

4. Tác dụng phục hồi tổn thương gan của cây Mũi mác được chứng minh trên mô hình thực nghiệm nào và qua các chỉ số sinh hóa, bệnh học nào? Tác dụng bảo vệ và phục hồi tổn thương gan được thực hiện trên mô hình chuột bị gây hoại tử tế bào gan cấp tính bằng Paracetamol liều độc. Hiệu quả được chứng minh qua: (1) làm giảm có ý nghĩa thống kê hoạt độ hai enzym men gan transaminase huyết thanh là AST và ALT so với lô bệnh lý; (2) làm giảm nồng độ malondialdehyd (MDA) - sản phẩm của peroxy hóa lipid trong mô gan; (3) phục hồi cấu trúc vi thể gan trên tiêu bản nhuộm HE (giảm hoại tử tế bào gan vùng trung tâm tiểu thùy, giảm thâm nhiễm viêm) tương đương với đối chứng Silymarin.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của NCS. Nông Thị Anh Thư là công trình khoa học toàn diện đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu có hệ thống về cây Mũi mác (Tadehagi triquetrum (L.) H. Ohashi) ở Bắc Kạn. Đề tài đã hoàn thành xuất sắc các mục tiêu đề ra: xác định chính xác tên khoa học và tiêu chuẩn giải phẫu vi học của dược liệu; phân lập và xác định cấu trúc 20 hợp chất tinh khiết (TT1–TT20) bằng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại; chứng minh bằng thực nghiệm dược lý tác dụng chống oxy hóa in vitro, chống viêm cấp và mạn in vivo, cùng tác dụng phục hồi tổn thương tế bào gan do paracetamol. Những kết quả nghiên cứu này cung cấp luận cứ khoa học vững chắc khẳng định giá trị sử dụng truyền thống của cây Mũi mác, đồng thời tạo tiền đề khoa học thiết thực cho việc tiêu chuẩn hóa và phát triển các sản phẩm dược liệu phục vụ chăm sóc sức khỏe cộng đồng.