Valorisation des produits médicamenteux naturels: de l'extraction à l'encapsulation

Luận án tiến sĩ chiết xuất và vi bao hợp chất tự nhiên tại Đại học Bourgogne Franche-Comté năm 2020

• Tác giả: Nguyễn Đức Hùng
• Người hướng dẫn: GS. Odile Chambin
• Trường học: Đại học Bourgogne Franche-Comté
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Valorisation des produits médicamenteux naturels: de l'extraction à l'encapsulation
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Besançon

Tóm tắt

I. Tổng quan nghiên cứu chiết xuất và vi bao hợp chất tự nhiên

Đề tài tiến sĩ dược học của Nguyễn Đức Hùng bảo vệ năm 2020 tại Đại học Bourgogne Franche-Comté đánh dấu bước tiến quan trọng trong nghiên cứu dược liệu. Công trình kết hợp liên ngành giữa Phòng thí nghiệm Dược liệu học PEPITE EA 4267 và Phòng thí nghiệm Dược bào chế. Mục tiêu trọng tâm là khai thác giá trị dược học của các nguồn tài nguyên thực vật tự nhiên từ Việt Nam và Pháp. Quá trình triển khai tập trung vào hai nhánh chính gồm hóa thực vật và công nghệ bào chế. Nhánh thứ nhất khám phá các hợp chất saponin có cấu trúc mới và hoạt tính sinh học cao. Nhánh thứ hai phát triển hệ dẫn thuốc vi hạt nhằm khắc phục nhược điểm sinh khả dụng của curcumin. Đề tài nhận sự hướng dẫn trực tiếp từ Giáo sư Odile Chambin và Giáo sư Anne-Claire Mitaine-Offer. Sự phối hợp này mở ra hướng tiếp cận hoàn chỉnh từ khâu tách chiết nguyên liệu thô đến tạo dạng vi bao bảo vệ dược chất. Kết quả công bố cung cấp dữ liệu thực nghiệm giá trị cho nền công nghiệp dược phẩm.

1.1. Bối cảnh học thuật tại Đại học Bourgogne Franche Comté

Đại học Bourgogne Franche-Comté sở hữu môi trường nghiên cứu dược học tiên tiến tại Pháp. Luận án được thực hiện tại trường Tiến sĩ Môi trường và Sức khỏe cùng Khoa Khoa học Sức khỏe Dijon. Hội đồng đánh giá quy tụ nhiều chuyên gia đầu ngành từ Đại học Lorraine và Đại học Bourgogne. Môi trường liên kết này tạo điều kiện thuận lợi cho việc ứng dụng trang thiết bị phân tích hiện đại. Các phòng thí nghiệm trực thuộc cung cấp hạ tầng đồng bộ về sắc ký và phổ nghiệm. Mục tiêu học thuật đặt trọng tâm vào việc nâng cao giá trị dược liệu bằng khoa học chuẩn hóa. Cách tiếp cận này đáp ứng các tiêu chuẩn khắt khe của ngành dược phẩm quốc tế.

1.2. Mục tiêu tích hợp giữa tách chiết và vi bao dược chất

Nghiên cứu xác lập chuỗi giá trị khép kín cho hoạt chất tự nhiên. Bước đầu tiên tập trung thu nhận các phân tử có tiềm năng trị liệu từ nguồn thực vật phong phú. Tiếp theo, công nghệ vi bao đóng vai trò bảo vệ phân tử khỏi sự phân hủy sinh học. Việc kết hợp hai giai đoạn này giúp giải quyết hạn chế cố hữu của dược liệu. Nhiều hợp chất có hoạt tính mạnh nhưng kém bền và khó hấp thu. Kỹ thuật bào chế hiện đại giúp tối ưu hóa đặc tính dược động học của hoạt chất. Mô hình tích hợp này rút ngắn khoảng cách giữa nghiên cứu lý thuyết và ứng dụng thực tiễn điều trị.

II. Rào cản chiết xuất và vi bao hợp chất tự nhiên dạng saponin

Nghiên cứu dược chất tự nhiên luôn đối mặt với nhiều trở ngại kỹ thuật phức tạp. Nhóm hợp chất saponin sở hữu cấu trúc hóa học cồng kềnh với khung aglycone gắn nhiều phân tử đường. Độ phân cực biến thiên rộng khiến quá trình tách chiết và tinh chế gặp khó khăn. Các tạp chất thực vật thường bám dính chặt vào saponin trong dịch chiết. Bên cạnh đó, việc xác định cấu trúc lập thể đòi hỏi kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều. Ở nhánh công nghệ bào chế, hoạt chất curcumin sở hữu hoạt tính chống oxy hóa nhưng có độ tan trong nước cực thấp. Dược chất này chuyển hóa nhanh tại gan và phân hủy tại ruột. Sinh khả dụng đường uống của curcumin nguyên bản rất thấp. Rào cản này làm giảm sút hiệu quả điều trị thực tế. Những thách thức trên đòi hỏi phương pháp phân lập chính xác cùng giải pháp vi bao đột phá.

2.1. Độ phức tạp trong phân lập saponin từ Weigela và Dracaena

Các loài cây thuộc chi Weigela, Dracaena braunii và Cordyline fruticosa chứa hỗn hợp saponin phong phú. Tuy nhiên, các phân tử này có cấu trúc tương tự nhau về khung aglycone. Sự khác biệt thường chỉ nằm ở số lượng hoặc vị trí liên kết của chuỗi đường. Hiện tượng đồng phân vị trí gây cản trở lớn trong phân tách sắc ký. Dịch chiết thô chứa nhiều tạp chất hữu cơ gây nhiễm bẩn cột. Kỹ thuật chiết lỏng thông thường không đủ để tách tinh khiết. Việc thiếu hụt dữ liệu phổ của các dẫn xuất mới cũng làm tăng mức độ phức tạp khi xác định cấu trúc hóa học.

2.2. Hạn chế sinh khả dụng và độ bền đường tiêu hóa của curcumin

Curcumin là polyphenol tự nhiên giàu tiềm năng trị liệu nhưng mang nhiều nhược điểm dược động học. Hoạt chất kém bền trong dịch vị dạ dày và phân hủy nhanh khi tới ruột non. Hệ số phân bố khiến phân tử rất khó hòa tan vào dịch sinh học. Khả năng hấp thu qua biểu mô ruột bị giới hạn nghiêm trọng. Tốc độ thải trừ nhanh tại gan làm nồng độ trong huyết tương không đạt ngưỡng. Ngoài ra, curcumin nhạy cảm với ánh sáng và nhiệt độ khi tồn trữ. Việc đưa phân tử vào hệ thống mang thuốc vi mô là yêu cầu cấp thiết để bảo vệ dược tính.

III. Phương pháp chiết xuất và vi bao hợp chất tự nhiên hiệu quả

Nghiên cứu áp dụng quy trình phân tích và công nghệ bào chế đồng bộ để giải quyết triệt để các rào cản kỹ thuật. Quá trình phân lập saponin vận hành thông qua hệ thống sắc ký đa cấp. Các phương pháp bao gồm sắc ký chân không VLC, sắc ký áp suất trung bình MPLC và sắc ký lỏng cao áp HPLC. Cấu trúc hóa học của 35 saponin được xác định chính xác nhờ phổ khối ESI-MS cùng phổ NMR đa chiều. Ở nhánh bào chế, giải pháp áp dụng kỹ thuật gél hóa ion. Nghiên cứu khảo sát nhiều chất diện hoạt nhằm tăng độ phân tán curcumin. Kolliphor HS 15 thể hiện hiệu quả vượt trội nhất. Chất diện hoạt này giúp hạt vi bao đạt kích thước đồng nhất và tối ưu tải lượng. Hệ vi bao bảo vệ curcumin qua dạ dày và giải phóng êm dịu tại ruột. Phương pháp này cải thiện rõ rệt độ hòa tan cùng hoạt tính chống oxy hóa DPPH.

3.1. Quy trình sắc ký đa cấp và giải mã phổ NMR ESI MS

Quy trình tách chiết bắt đầu bằng ngấm kiệt với dung môi phân cực. Dịch chiết thô được phân đoạn qua sắc ký VLC để loại bỏ tạp chất. Tiếp theo, kỹ thuật MPLC hỗ trợ tách các phân đoạn giàu saponin. Hệ thống HPLC pha đảo hoàn thiện công đoạn tinh chế. Sau khi phân lập thành công 35 hợp chất, cấu trúc được giải mã chi tiết. Phổ khối lượng ESI-MS xác định khối lượng phân tử. Phổ NMR đa chiều phân tích vị trí nhóm thế và chuỗi đường. Phương pháp này phát hiện 9 saponin cấu trúc mới từ chi Weigela.

3.2. Công nghệ gél hóa ion tối ưu với chất diện hoạt Kolliphor HS 15

Công nghệ gél hóa ion tạo ra các hạt vi nang chứa curcumin bền vững. Quy trình sử dụng polymer tự nhiên alginate phản ứng tạo phức với ion canxi. Việc bổ sung chất diện hoạt là chìa khóa phân tán curcumin kỵ nước. Nghiên cứu so sánh nhiều chất và xác định Kolliphor HS 15 tối ưu nhất. Phụ gia này tạo micelle ổn định và tăng tải lượng curcumin. Các hạt vi bao có kích thước đồng đều và bề mặt trơn nhẵn. Thử nghiệm hòa tan in vitro chứng minh hạt bảo vệ tốt dược chất tại dạ dày và phóng thích chậm tại ruột.

IV. Ứng dụng thực tiễn chiết xuất và vi bao hợp chất tự nhiên

Công trình nghiên cứu tại Đại học Bourgogne Franche-Comté mang lại giá trị khoa học và ứng dụng thực tiễn to lớn. Việc phân lập 35 saponin mở rộng hiểu biết về hóa thực vật của chi Weigela, Dracaena và Cordyline. Trong đó, 9 hợp chất mới từ acid oleanolic và hederagenin là ứng viên tiềm năng cho nghiên cứu thuốc ung thư. Thử nghiệm MTS trên dòng tế bào ung thư CT26, B16 và HepG2 ghi nhận hoạt tính gây độc tế bào rõ rệt. Song song đó, công nghệ vi bao curcumin bằng gél hóa ion cùng Kolliphor HS 15 thiết lập nền tảng bào chế vững chắc. Hệ vi bao duy trì hoạt tính chống oxy hóa DPPH và cải thiện sinh khả dụng đường uống. Thành tựu này mở đường phát triển dạng thuốc viên nang định liều từ dược liệu. Mô hình nghiên cứu toàn diện từ chiết xuất đến bao gói cung cấp chuẩn mực tham chiếu tin cậy cho ngành dược.

4.1. Tiềm năng kháng ung thư của các saponin mới phân lập

Các saponin mới phân lập từ cây Weigela và Dracaena braunii sở hữu tiềm năng dược lý đáng kể. Đánh giá độc tính tế bào in vitro qua phép thử MTS cho thấy nhiều chất có giá trị IC50 thấp trên tế bào ung thư CT-26. Các cấu trúc spirostane và glycoside triterpene tác động trực tiếp lên màng tế bào ung thư. Cơ chế tác dụng bước đầu cho thấy khả năng kích hoạt quá trình tự hủy apoptosis. Độc tính chọn lọc trên các dòng tế bào B16 và HepG2 cũng được ghi nhận. Dữ liệu này gợi mở hướng phát triển liệu pháp điều trị ung thư tự nhiên.

4.2. Khả năng thương mại hóa hệ vi bao curcumin phóng thích chậm

Hệ vi hạt curcumin vi bao mở ra tiềm năng thương mại hóa lớn trong sản xuất dược phẩm và thực phẩm bảo vệ sức khỏe. Kỹ thuật gél hóa ion sử dụng polymer tự nhiên phân hủy sinh học an toàn cho người bệnh. Quy trình bào chế không dùng dung môi hữu cơ độc hại, rất thân thiện với môi trường công nghiệp. Hạt vi bao giúp bảo quản curcumin bền vững trước ánh sáng và oxy không khí. Cơ chế phóng thích theo pH bảo vệ dược chất nguyên vẹn qua dạ dày và hấp thu tối đa tại ruột non. Đây là giải pháp chuyển giao công nghệ sáng giá cho ngành sản xuất chế phẩm từ thảo dược.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ dược học của nghiên cứu sinh Nguyễn Đức Hùng với đề tài "Valorisation des produits médicamenteux naturels: de l'extraction à l'encapsulation" (Khai thác giá trị các sản phẩm thuốc tự nhiên: từ chiết xuất đến bao vi nang) được thực hiện tại Đại học Bourgogne Franche-Comté (Cộng hòa Pháp), thuộc Đơn vị Đào tạo và Nghiên cứu Khoa học Sức khỏe (UFR Sciences de Santé de Dijon). Công trình nghiên cứu này tích hợp hai chuyên ngành khoa học dược phẩm: Dược học cổ truyền (Pharmacognosy - nghiên cứu hóa thực vật và hoạt tính sinh học) và Công nghệ Dược phẩm (Pharmaceutical Technology - nghiên cứu bào chế hệ phân phối thuốc).

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Các hợp chất tự nhiên có nguồn gốc từ thực vật từ lâu đã đóng vai trò quan trọng trong việc phòng ngừa và điều trị nhiều chứng bệnh ở người. Trong số các chất chuyển hóa thứ cấp, saponin là nhóm glycoside hoạt động bề mặt phân bố rộng rãi trong giới thực vật, được ghi nhận sở hữu nhiều hoạt tính sinh học có giá trị dược lý như ức chế khối u, kháng viêm, kháng virus, chống oxy hóa và kháng khuẩn. Tuy nhiên, nhiều chi và loài thực vật có tiềm năng chứa saponin thuộc hệ thực vật Việt Nam cũng như hệ thực vật làm vườn Pháp vẫn chưa được khảo sát đầy đủ về thành phần hóa học và cấu trúc hóa học chi tiết.

Về mặt công nghệ dược phẩm, phần aglycon (sapogenin) cũng như nhiều hoạt chất tự nhiên kỵ nước khác có tiềm năng trị liệu lớn nhưng lại gặp trở ngại nghiêm trọng về độ tan kém trong môi trường nước, dẫn đến độ thấm thấp, sinh khả dụng đường uống bị giới hạn và dễ bị giáng hóa trong đường tiêu hóa người. Để giải quyết rào cản này, công nghệ bao gói (encapsulation) là một giải pháp khả thi. Do hàm lượng saponin phân lập từ mẫu tự nhiên thường bị giới hạn về khối lượng không đủ cho quy trình bào chế, tác giả lựa chọn curcumin – một polyphenol kỵ nước điển hình từ củ nghệ có đặc tính hòa tan và sinh khả dụng kém tương đồng – làm phân tử mô hình để nghiên cứu phát triển hệ phân phối thuốc dạng hạt gel pectinate qua phương pháp gel hóa ionotropic (ionotropic gelation), hướng tới kiểm soát giải phóng và bảo tồn hoạt tính sinh học.

Mục tiêu và câu hỏi nghiên cứu

Mục tiêu tổng quát của luận án được chia thành hai nội dung chính tương ứng với hai định hướng nghiên cứu:

1. Mục tiêu hóa thực vật và hoạt tính sinh học:
   • (1.1) Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các saponin tự nhiên từ các loài thực vật được lựa chọn thuộc hai họ Caprifoliaceae (chi Weigela) và Asparagaceae (các chi Cordyline và Dracaena).
   • (1.2) Đánh giá độc tính tế bào in vitro của các hợp chất phân lập trên các dòng tế bào ung thư thực nghiệm, từ đó xác lập mối liên hệ giữa cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học (SAR).
2. Mục tiêu công nghệ dược phẩm:
   • (2.1) Xây dựng và tối ưu hóa quy trình bào chế hạt vi nang pectinate chứa curcumin bằng phương pháp gel hóa ionotropic kết hợp các chất diện hoạt khác nhau.
   • (2.2) Đánh giá đặc tính lý hóa, động học giải phóng in vitro trong điều kiện mô phỏng đường tiêu hóa và khả năng bảo vệ hoạt tính chống oxy hóa của phân tử hoạt chất.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng thực vật:
  • Chi Weigela (họ Caprifoliaceae): Mẫu rễ loài lai Weigela x "Bristol Ruby"; mẫu rễ và phần trên mặt đất của giống Weigela florida "Pink Poppet"; mẫu lá của giống Weigela florida "Jean’s Gold".
  • Chi Cordyline (họ Asparagaceae): Mẫu rễ và bộ phận trên mặt đất của cây bụi cảnh Cordyline fruticosa "Fairchild red".
  • Chi Dracaena (họ Asparagaceae): Mẫu rễ loài Dracaena braunii (tên đồng nghĩa Dracaena sanderiana, thường gọi là trúc phát tài/lucky bamboo).
• Đối tượng thử nghiệm sinh học: Ba dòng tế bào ung thư thực nghiệm gồm CT26 (tế bào ung thư biểu mô đại tràng chuột), B16 (tế bào u hắc tố chuột) và HepG2 (tế bào ung thư biểu mô tế bào gan người).
• Đối tượng nghiên cứu bao vi nang: Hoạt chất kỵ nước mô hình curcumin, polymer tạo màng pectin, và các chất diện hoạt thử nghiệm (đặc biệt là Kolliphor® HS 15).
• Phạm vi không gian và thời gian: Toàn bộ nghiên cứu thực nghiệm được triển khai từ nguồn mẫu thực vật thu thập từ đa dạng sinh học Việt Nam và ngành làm vườn tại Pháp; tiến hành tại Phòng thí nghiệm Dược học cổ truyền (PEPITE EA 4267) và Phòng thí nghiệm Bào chế (Laboratoire de Pharmacie Galénique) thuộc UFR Khoa học Sức khỏe, Đại học Bourgogne Franche-Comté (Dijon, Pháp), phối hợp với Trung tâm Georges-François Leclerc (ICMUB UMR CNRS 6302); luận án được bảo vệ chính thức vào ngày 09 tháng 11 năm 2020.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước mà tác giả điểm lại

Tác giả đã hệ thống hóa các tài liệu khoa học liên quan đến cấu trúc hóa học, phân loại và tác dụng sinh học của saponin cũng như các nghiên cứu hóa thực vật trước đây trên các chi thực vật mục tiêu:

• Đặc điểm cấu trúc và phân loại saponin: Luận án dẫn xuất các công trình phân loại saponin thành dạng mono-desmosidic, bi-desmosidic và tri-desmosidic tùy theo số lượng chuỗi đường liên kết với aglycon (Chaieb, 2010; Majinda, 2012). Tác giả phân tích hai nhóm aglycon chính gồm triterpenoid C30 (phổ biến ở thực vật hai lá mầm, chủ yếu là khung pentacyclic oleanane, ursane, lupane, hopane, hoặc tetracyclic dammarane) và steroid C27 (phổ biến ở thực vật một lá mầm, gồm khung spirostane và furostane) (Bruneton, 2016; Thakur et al., 2011).
• Dược lý và ứng dụng thực tiễn của saponin: Tác giả điểm lại các tổng quan về hoạt tính ức chế tế bào ung thư (Boutaghane et al., 2013; Pertuit et al., 2017; Wen et al., 2015), hoạt tính kháng khuẩn (Fang et al., 2015; Mostafa et al., 2013, 2016), kháng viêm (Borges et al., 2013; Fu et al., 2017; Xiang et al., 2016), chống oxy hóa (Chan et al., 2014) và tá dược miễn dịch (Cruz et al., 2016; Silva & Parente, 2013; Yendo et al., 2010). Các tài liệu về ứng dụng saponin từ các cây thuốc truyền thống như Panax vietnamensis (Van et al., 2015), Panax notoginseng (Zhang et al., 2014), Bupleurum fruticescens chứa saikosaponin (Just et al., 1998), Achyranthes bidentata (Mitaine-Offer et al., 2001), Momordica charantia (Keller et al., 2011), và chất diện hoạt tự nhiên từ Quillaja saponaria (Zhao et al., 2014).
• Các công trình về chi Weigela: Các nghiên cứu trước đây đã phân lập các triterpenoid saponin dẫn xuất từ acid oleanolic và hederagenin trên Weigela hortensis (Murayama et al., 2003), Weigela subsessilis (Won et al., 2015), Weigela stelzneri (Rezgui et al., 2016), Weigela florida "Rumba" (Champy-Tixier et al., 2018) và Weigela x "Kosteriana variegata" (Andriamisaina et al., 2018).
• Các công trình về chi Cordyline và Dracaena: Các nghiên cứu của Jewers et al. (1974) trên Cordyline cannifolia; Yang et al. (1990) trên Cordyline rubra; Mimaki et al. (1997, 1998a) trên Cordyline stricta; Fouedjou et al. (2013) và Ponou et al. (2019) trên Cordyline fruticosa đã chứng minh chi này rất giàu steroidal saponin dạng spirostane và furostane mang mạch đường sulfat hóa hoặc hydroxyl hóa. Với chi Dracaena, các nghiên cứu trên Dracaena concinna (Mimaki et al., 1998b), Dracaena draco (González et al., 2003; Hernández et al., 2006), Dracaena surculosa (Yokosuka et al., 2000, 2002), Dracaena cambodiana (Shen et al., 2014), Dracaena angustifolia (Huang et al., 2013), Dracaena marginata (Rezgui et al., 2013) và Dracaena thalioides (Tang et al., 2014) cho thấy các saponin phân lập từ chi này thể hiện hoạt tính gây độc tế bào rõ rệt trên các dòng tế bào ung thư.
• Công nghệ bao vi nang hợp chất kỵ nước: Dẫn xuất nghiên cứu của Anand et al. (2007) về các trở ngại sinh khả dụng của curcumin và các biện pháp phân phối nano/micro để khắc phục độ tan thấp.

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Mặc dù các chi Weigela, Cordyline và Dracaena đã được nghiên cứu ở một số loài, các giống trồng chọn lọc trong ngành làm vườn (Weigela x "Bristol Ruby", W. florida "Pink Poppet", W. florida "Jean’s Gold", Cordyline fruticosa "Fairchild red") và loài làm cảnh phổ biến tại Việt Nam (Dracaena braunii) vẫn chưa từng được phân tích hóa thực vật toàn diện. Do đó, cấu trúc hóa học của các saponin có trong các mẫu thực vật này vẫn còn là khoảng trống khoa học cần làm rõ.

Bên cạnh đó, việc khảo sát tác động gây độc tế bào của các saponin này trên các dòng ung thư đặc thù như CT26, B16 và HepG2 chưa có đầy đủ số liệu thực nghiệm. Đồng thời, luận án lấp đầy khoảng trống kỹ thuật trong việc thiết lập một quy trình bao vi nang ionotropic gelation đơn giản, sử dụng pectin kết hợp chất diện hoạt thích hợp nhằm ổn định và giải phóng có kiểm soát một phân tử tự nhiên kỵ nước điển hình.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

Luận án vận dụng lý thuyết hóa học các hợp chất thiên nhiên và phân loại hóa học thực vật (chemotaxonomy) để định hướng sàng lọc các họ Caprifoliaceae và Asparagaceae. Cấu trúc của các hợp chất saponin được tiếp cận theo hai nhóm phân tử:

1. Khung triterpenoid oleanane: Bao gồm các dẫn xuất mang nhóm hydroxyl ở C-3 và các nhóm thế ở C-23, C-28 (chủ yếu là sapogenin acid oleanolic và hederagenin), tạo liên kết glycoside ở vị trí C-3 (dạng mono-desmosidic) hoặc ở cả C-3 và C-28 (dạng bi-desmosidic).
2. Khung steroid C27: Bao gồm khung spirostane (16β, 22:22α, 26-diepoxy-cholestan) và furostane (16β, 22-epoxycholestan), với các đồng phân lập thể tại vị trí C-25 ((25S)-neosaponin và (25R)-isosaponin).

Trong phần công nghệ bào chế, cơ sở lý thuyết dựa trên hiện tượng tạo gel ionotropic giữa chuỗi polysaccharide tích điện âm của ion pectinate với các cation đa hóa trị (như $Ca^{2+}$), kết hợp cơ chế phân tán của chất diện hoạt nhằm bao bọc và giữ các phân tử kỵ nước trong mạng lưới polymer hydrogel.

Phương pháp thực tế và công cụ nghiên cứu

Nhóm phương pháp	Kỹ thuật / Công cụ thực tế	Mục đích sử dụng
Chiết xuất & Phân đoạn	Chiết hồi lưu/ngâm với cồn nước ($EtOH/H_2O$, $MeOH$); Phân bố lỏng - lỏng với dung môi ($CHCl_3$, $n-BuOH$, $H_2O$); Sắc ký lỏng chân không (VLC)	Tách chiết tổng phân đoạn saponin thô và phân chia sơ bộ các nhóm phân cực
Sắc ký tinh sạch	Sắc ký cột cổ điển (CC) trên silica gel; Sắc ký lỏng áp suất trung bình (MPLC); Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC); Sắc ký lớp mỏng phân tích và điều chế (TLC, HPTLC)	Tách riêng lẻ 35 hợp chất saponin tinh khiết từ các phân đoạn giàu saponin
Xác định cấu trúc hóa học	Phổ khối lượng ion hóa phun mù điện tử (ESI-MS); Phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều (1D và 2D NMR: $^1H$, $^{13}C$, COSY, TOCSY, HSQC, HMBC, ROESY, NOESY) đo trong dung môi pyridine-$d_5$	Xác định khối lượng phân tử, công thức cấu tạo, trình tự liên kết các phân tử đường và cấu hình không gian lập thể của aglycon
Phân tích đường	Thủy phân acid hoàn toàn bằng acid vô cơ ($HCl$ hoặc $TFA$); Dẫn xuất hóa; Sắc ký khí (GC) so sánh chất chuẩn	Xác định thành phần và cấu hình tuyệt đối (D hoặc L) của các monosaccharide
Đánh giá hoạt tính sinh học	Phép thử đo màu MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium); Chứng dương: 5-Fluorouracil (5-FU)	Đánh giá khả năng ức chế tăng sinh và độc tính tế bào trên 3 dòng: CT26, B16, HepG2 ở dải nồng độ 1 – 50 µM; xác định $IC_{50}$
Bào chế bao vi nang	Phương pháp gel hóa ionotropic (ionotropic gelation) tạo hạt pectinate hydrogel; Sử dụng các chất diện hoạt thử nghiệm (Kolliphor® HS 15, v.v.)	Chế tạo hạt gel vi nang chứa hoạt chất mô hình curcumin nhằm cải thiện độ tan và sinh khả dụng
Đặc tính lý hóa & Giải phóng	Quan sát hình thái học hạt; Xác định hiệu suất bao gói (EE%); Khảo sát trạng thái vật lý; Thử nghiệm động học hòa tan in vitro mô phỏng dịch dạ dày và ruột	Kiểm tra độ ổn định và cơ chế giải phóng hoạt chất có kiểm soát trong đường tiêu hóa
Đánh giá chống oxy hóa	Thử nghiệm khử gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)	Đánh giá mức độ bảo tồn hoạt tính chống oxy hóa của curcumin sau khi tạo hạt vi nang

---

Nội dung chính theo từng chương

Luận án được tổ chức thành hai phần riêng biệt với tổng cộng 6 chương chuyên biệt và phần kết luận chung.

PHẦN I: NGHIÊN CỨU VỀ SAPONIN (PART 1: SAPONINS)

Chương 1: Botanical studies and previous phytochemical works (Nghiên cứu thực vật học và các công trình hóa thực vật trước đây)

Chương này tổng kết vị trí phân loại học thực vật của các đối tượng nghiên cứu và hệ thống hóa toàn bộ các công trình hóa thực vật đã công bố:

• Phân loại học thực vật:
  • Bộ Dipsacales gồm hai họ Adoxaceae và Caprifoliaceae. Họ Caprifoliaceae có 42 chi và hơn 890 loài; chi Weigela được mô tả với 52 loài cây bụi rụng lá (trong đó có 7 loài được công nhận chính thức và hơn 200 giống cây trồng). Tác giả trình bày chi tiết đặc điểm hình thái của các giống Weigela x "Bristol Ruby", Weigela florida "Jean’s Gold" và Weigela florida "Pink Poppet".
  • Bộ Asparagales gồm 14 họ, 1.122 chi và 36.205 loài; họ Asparagaceae bao gồm 114 chi với khoảng 2.900 loài. Chi Dracaena (phân họ Nolinoideae) chứa khoảng 60 loài, trong đó Dracaena braunii (trúc phát tài) là loài cây bụi thường xanh có nguồn gốc từ châu Phi và châu Á. Chi Cordyline gồm khoảng 26 loài thực vật một lá mầm thân gỗ có nguồn gốc từ Tây Thái Bình Dương; loài Cordyline fruticosa "Fairchild Red" là dạng cây bụi lùn thường xanh với lá viền đỏ/hồng.
• Tổng quan hóa thực vật chi tiết:
  • Cung cấp danh mục các saponin triterpenoid đã biết từ chi Weigela (W. hortensis, W. subsessilis, W. stelzneri, W. florida "Rumba", W. x "kosteriana variegata").
  • Liệt kê các saponin steroid (spirostane và furostane) từ chi Cordyline (C. cannifolia, C. rubra, C. stricta, C. fruticosa) và chi Dracaena (D. concinna, D. draco, D. surculosa, D. cambodiana, D. angustifolia, D. marginata, D. thalioides), minh họa cụ thể cấu trúc hóa học của các phân tử aglycon và mạch đường đặc thù.

Chương 2: Phytochemical study (Nghiên cứu hóa thực vật trên các loài thực vật được lựa chọn)

Chương 2 là chương thực nghiệm trọng tâm của Phần I, trình bày chi tiết quy trình chiết xuất, phân lập sắc ký và làm sáng tỏ cấu trúc hóa học của 35 saponin tự nhiên (được đánh số thứ tự từ hợp chất 1 đến 35):

• Nghiên cứu trên Weigela x "Bristol Ruby": Từ dịch chiết rễ, phân lập và làm sáng tỏ cấu trúc của 7 saponin triterpenoid (hợp chất 1 – 7). Cấu trúc của các hợp chất này được xác định thông qua phổ NMR ($^1H$, $^{13}C$, HSQC, HMBC, ROESY) và phổ khối lượng ESI-MS, trong đó có các glycoside mới của acid oleanolic và hederagenin.
• Nghiên cứu trên Weigela florida "Pink Poppet": Từ rễ và các bộ phận trên mặt đất, phân lập và xác định cấu trúc của 4 saponin triterpenoid (hợp chất 8 – 11), trong đó hợp chất 8 là cấu trúc mới được giải mã chi tiết bằng chuỗi phổ 2D-NMR.
• Nghiên cứu trên Weigela florida "Jean’s Gold": Từ dịch chiết lá, tinh sạch được 6 saponin (hợp chất 12 – 17), bao gồm các phân tử mới (như hợp chất 12, 13) thuộc nhóm glycoside của hederagenin và acid oleanolic.
• Nghiên cứu trên rễ cây Cordyline fruticosa "Fairchild red": Phân lập thành công 11 steroidal saponin (hợp chất 18 – 28). Phổ NMR đa chiều và ESI-MS xác nhận sự hiện diện của các cấu trúc spirostane và furostane mang mạch đường đặc trưng, bao gồm các hợp chất mới từ hợp chất 18 đến 26.
• Nghiên cứu trên bộ phận trên mặt đất của Cordyline fruticosa "Fairchild red": Tinh sạch và xác định cấu trúc 4 steroidal saponin (hợp chất 29 – 32), trong đó các hợp chất đều được giải mã đầy đủ về dịch chuyển hóa học của aglycon và chuỗi oligosaccharide.
• Nghiên cứu trên rễ cây Dracaena braunii: Phân lập và làm sáng tỏ cấu trúc của 3 steroidal saponin (hợp chất 33 – 35).

Chương 3: Biological study (Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các saponin phân lập)

Chương 3 trình bày kết quả đánh giá hoạt tính sinh học của các saponin tinh sạch:

• Đánh giá độc tính tế bào in vitro: Thử nghiệm MTS được tiến hành trên các dòng tế bào khối u CT26 (ung thư đại tràng chuột), B16 (u hắc tố chuột) và HepG2 (ung thư biểu mô tế bào gan người) ở dải nồng độ khảo sát từ 1 đến 50 µM, so sánh với chất đối chứng dương 5-Fluorouracil (5-FU).
• Kết quả trên các dòng tế bào:
  • Nhóm saponin phân lập từ Weigela x "Bristol Ruby" (các hợp chất 1, 2, 3, 6 và 7) được xác định giá trị $IC_{50}$ trên dòng tế bào ung thư đại tràng CT26.
  • Các hợp chất 8, 10, 11 (từ W. florida "Pink Poppet") và 13, 15, 17 (từ W. florida "Jean’s Gold") được khảo sát độc tính tế bào đồng thời trên cả ba dòng tế bào CT26, B16 và HepG2.
• Mối quan hệ cấu trúc - hoạt tính (SAR): Tác giả phân tích ảnh hưởng của bản chất aglycon (khung oleanolic acid so với hederagenin; khung spirostane so với furostane), số lượng mạch đường (mono-desmosidic so với bi-desmosidic), vị trí gắn của chuỗi carbohydrate và thành phần các loại đường (Glc, Rha, Ara, Fuc, Xyl) đối với khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thư.

---

PHẦN II: NGHIÊN CỨU BAO VI NANG CURCUMIN (PART 2: ENCAPSULATION OF CURCUMIN)

Chương 1: Chemical profile of curcumin and general background about some encapsulation methods (Đặc tính hóa học của curcumin và tổng quan các phương pháp bao vi nang)

Chương 1 của Phần II cung cấp cơ sở lý thuyết về hoạt chất và công nghệ:

• Trình bày đặc tính hóa học, tính chất kỵ nước, độ tan trong nước rất kém và độ không ổn định của curcumin – phân tử polyphenol chính chiết xuất từ thân rễ nghệ (Curcuma longa). Phân tích nguyên nhân dẫn đến sinh khả dụng đường uống thấp và tốc độ chuyển hóa nhanh của hoạt chất.
• Tổng quan các phương pháp bao gói vi nang ứng dụng cho các phân tử tự nhiên kỵ nước, tập trung vào nguyên lý tạo hạt hydrogel bằng phương pháp gel hóa ionotropic (ionotropic gelation) sử dụng polymer tự nhiên pectin kết hợp chất diện hoạt.

Chương 2: Methodological and material tools used to manufacture beads, together with investigations of physicochemical characteristics, dissolution kinetics and antioxidant activity (Phương pháp và nguyên vật liệu chế tạo hạt, khảo sát tính chất lý hóa, động học hòa tan và hoạt tính chống oxy hóa)

Chương này mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm công nghệ bào chế:

• Quy trình chế tạo hạt gel vi nang pectinate bằng kỹ thuật nhỏ giọt dung dịch pectin/curcumin/chất diện hoạt vào dung dịch ion đa hóa trị ($Ca^{2+}$).
• Các phương pháp phân tích đặc tính lý hóa của hạt sau sấy khô: quan sát hình thái học bề mặt, đo kích thước hạt, xác định hiệu suất bao gói (encapsulation efficiency - EE%) và trạng thái vật lý của hoạt chất trong cấu trúc mạng gel.
• Phương pháp khảo sát động học giải phóng in vitro: mô phỏng quá trình giải phóng curcumin trong môi trường dịch vị dạ dày nhân tạo và dịch ruột nhân tạo.
• Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa bằng phép thử khử gốc tự do DPPH nhằm so sánh hiệu lực trước và sau khi bao gói.

Chương 3: Results and discussion (Kết quả và thảo luận về hệ bao vi nang)

Chương 3 công bố và thảo luận các phát hiện thực nghiệm của hệ bao vi nang:

• Đánh giá ảnh hưởng của các loại chất diện hoạt khác nhau lên khả năng vi bao và độ phân tán của curcumin trong chất nền pectinate.
• Xác định chất diện hoạt tối ưu: Hoạt chất diện hoạt Kolliphor® HS 15 được xác định là chất diện hoạt phù hợp nhất, cho hiệu suất bao gói cao, cải thiện độ bền cơ học và tính đồng nhất của hạt.
• Kết quả thử nghiệm hòa tan in vitro chứng minh hạt pectinate chứa Kolliphor® HS 15 giúp kiểm soát tốc độ giải phóng curcumin trong đường tiêu hóa, hạn chế sự thất thoát tại dạ dày và giải phóng dần ở ruột non.
• Kết quả phép thử DPPH khẳng định hoạt tính chống oxy hóa của curcumin được bảo tồn tốt sau quá trình bào chế và sấy khô, mở ra tiềm năng ứng dụng trong các chế phẩm bổ sung đường uống và thực phẩm chức năng.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp về mặt lý luận và khoa học hóa thực vật

Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của tổng cộng 35 hợp chất saponin tự nhiên nguyên chất, đóng góp đáng kể vào dữ liệu chemotaxonomy của hai họ Caprifoliaceae và Asparagaceae:

• Từ chi Weigela (Caprifoliaceae): Phân lập được 17 hợp chất saponin triterpenoid từ ba loài/giống trồng (Weigela x "Bristol Ruby", Weigela florida "Pink Poppet", Weigela florida "Jean’s Gold"). Trong đó, tác giả đã khám phá và công bố 9 hợp chất mới chưa từng được ghi nhận trong y văn, toàn bộ đều là các glycoside dẫn xuất từ aglycon acid oleanolic và hederagenin.
• Từ chi Cordyline và Dracaena (Asparagaceae): Phân lập được 18 hợp chất saponin steroid từ hai loài Cordyline fruticosa "Fairchild red" và Dracaena braunii. Trong số này, có 13 hợp chất mang cấu trúc mới hoàn toàn, gồm 7 saponin cấu trúc kiểu spirostane và 6 saponin cấu trúc kiểu furostane.
• Thiết lập bộ dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1H$ và $^{13}C$ NMR) và phổ khối lượng phân giải cao hoàn chỉnh cho các hợp chất mới, làm cơ sở tra cứu cấu trúc hóa học cho các nghiên cứu tiếp theo.

Tổng hợp các hợp chất saponin phân lập trong luận án

Nguồn thực vật	Bộ phận sử dụng	Số lượng hợp chất phân lập	Số hợp chất có cấu trúc mới	Nhóm khung cấu trúc chính
Weigela x "Bristol Ruby"	Rễ	7 (Hợp chất 1 – 7)	Các glycoside mới của acid oleanolic & hederagenin	Triterpenoid oleanane
Weigela florida "Pink Poppet"	Rễ và phần trên mặt đất	4 (Hợp chất 8 – 11)	Hợp chất mới (Hợp chất 8, v.v.)	Triterpenoid oleanane
Weigela florida "Jean’s Gold"	Lá	6 (Hợp chất 12 – 17)	Hợp chất mới (Hợp chất 12, 13, v.v.)	Triterpenoid oleanane
Cordyline fruticosa "Fairchild red"	Rễ	11 (Hợp chất 18 – 28)	Các spirostane và furostane mới (Hợp chất 18 – 26)	Steroid (Spirostane & Furostane)
Cordyline fruticosa "Fairchild red"	Phần trên mặt đất	4 (Hợp chất 29 – 32)	Các spirostane và furostane mới	Steroid (Spirostane & Furostane)
Dracaena braunii	Rễ	3 (Hợp chất 33 – 35)	Các saponin steroid đặc trưng	Steroid (Spirostane)
Tổng số	-	35 hợp chất	22 hợp chất mới (9 triterpenoid + 13 steroid)	-

Đóng góp về hoạt tính sinh học

• Cung cấp các số liệu thực nghiệm về nồng độ ức chế $IC_{50}$ của các hợp chất saponin tinh sạch (như các hợp chất 1, 2, 3, 6, 7 trên tế bào CT26; và các hợp chất 8, 10, 11, 13, 15, 17 trên CT26, B16, HepG2).
• Xác lập mối liên hệ cấu trúc - tác dụng (SAR), chỉ ra vai trò quyết định của khung aglycon và sự phân bố, độ dài của chuỗi đường đối với mức độ gây độc tế bào ung thư.

Đóng góp về công nghệ thực tiễn

• Thiết lập thành công công thức chế tạo hạt vi nang pectinate chứa curcumin bằng phương pháp gel hóa ionotropic đơn giản, thân thiện với môi trường, không sử dụng dung môi hữu cơ độc hại.
• Chứng minh thực nghiệm vai trò của chất diện hoạt Kolliphor® HS 15 trong việc tối ưu hóa tính chất hạt: làm tăng đáng kể độ tan biểu kiến, tăng độ ổn định của curcumin, bảo vệ khả năng chống oxy hóa (qua thử nghiệm DPPH) và kiểm soát động học giải phóng hoạt chất trong điều kiện mô phỏng hệ tiêu hóa.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Hạn chế về khối lượng mẫu tinh sạch: Hiệu suất phân lập các saponin tự nhiên nguyên chất từ các bộ phận thực vật tương đối thấp. Lượng mẫu thu được chỉ đủ phục vụ cho công tác xác định cấu trúc quang phổ và sàng lọc hoạt tính độc tế bào in vitro ở quy mô micromol, không đủ khối lượng để tiến hành thử nghiệm bao vi nang trực tiếp trên các sapogenin/saponin này, buộc tác giả phải lựa chọn curcumin làm phân tử kỵ nước thay thế.
• Hạn chế trong đánh giá dược lý: Các đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất saponin mới chỉ dừng lại ở các thử nghiệm in vitro trên các dòng tế bào nuôi cấy (MTS assay) nhằm xác định giá trị $IC_{50}$, chưa tiến hành khảo sát cơ chế tác động ở mức độ phân tử chi tiết (như chu kỳ tế bào, con đường apoptosis) cũng như chưa được kiểm chứng trên mô hình động vật sống in vivo.
• Phạm vi khảo sát bào chế: Nghiên cứu bao vi nang mới tập trung khảo sát trên curcumin với chất nền pectinate kết hợp một số chất diện hoạt nhất định; các thông số giải phóng và hấp thu in vivo của hệ hạt vi nang chưa được đánh giá trên động vật thực nghiệm.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Mở rộng quy mô chiết xuất và phân lập ở mức độ bán điều chế đối với các saponin thể hiện hoạt tính độc tế bào cao nhằm thu đủ lượng chất cho các thử nghiệm sinh học chuyên sâu và thử nghiệm bào chế trực tiếp.
• Triển khai nghiên cứu sâu về cơ chế phân tử gây chết tế bào ung thư của các dẫn xuất saponin có hoạt tính tiềm năng.
• Thực hiện các thử nghiệm dược động học và sinh khả dụng in vivo trên động vật đối với hệ hạt pectinate - Kolliphor® HS 15 chứa curcumin, hướng tới việc ứng dụng trong các chế phẩm thực phẩm chức năng và dược phẩm dạng uống.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn cao cho nhiều đối tượng nghiên cứu:

• Đối với nghiên cứu sinh và học viên cao học ngành Hóa thực vật và Dược học cổ truyền:
  • Luận án cung cấp quy trình phân lập hệ thống kết hợp nhiều kỹ thuật sắc ký (VLC, MPLC, RP-HPLC).
  • Phần phân tích phổ tại Chương 2 (với các hình phổ HSQC, HMBC, ROESY, ESI-MS) là tài liệu mẫu mực để rèn luyện kỹ năng phân tích, định danh cấu trúc các khung triterpenoid oleanane và steroid spirostane/furostane phức tạp.
• Đối với các nhà nghiên cứu Công nghệ Dược phẩm và Bào chế:
  • Cung cấp dữ liệu thực nghiệm về phương pháp gel hóa ionotropic sử dụng pectin và chất diện hoạt Kolliphor® HS 15 để phân tán và bao bọc các hợp chất kỵ nước có sinh khả dụng thấp.
  • Cung cấp mô hình khảo sát động học giải phóng in vitro và phương pháp kiểm tra độ ổn định hoạt tính chống oxy hóa.
• Đối với các nhà nghiên cứu Dược lý và Hóa dược:
  • Cung cấp số liệu sàng lọc độc tính tế bào của 35 saponin trên ba dòng tế bào ung thư (CT26, B16, HepG2).
  • Phân tích mối quan hệ cấu trúc - hoạt tính (SAR) giữa aglycon và chuỗi đường là cơ sở định hướng tổng hợp bán phần hoặc tối ưu hóa cấu trúc các phân tử kháng ung thư có nguồn gốc tự nhiên.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã phân lập được bao nhiêu hợp chất saponin và có bao nhiêu hợp chất mang cấu trúc mới?

Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc tổng cộng 35 hợp chất saponin tự nhiên từ 5 loài/giống thực vật thuộc hai họ Caprifoliaceae và Asparagaceae. Trong đó có 22 hợp chất mới chưa từng được công bố trước đây, bao gồm 9 saponin triterpenoid mới (dẫn xuất của acid oleanolic và hederagenin) phân lập từ chi Weigela, cùng 13 saponin steroid mới (7 hợp chất dạng spirostane và 6 hợp chất dạng furostane) phân lập từ Cordyline fruticosa "Fairchild red" và Dracaena braunii.

2. Những kỹ thuật phân tích nào được tác giả sử dụng để giải mã cấu trúc hóa học của các saponin mới?

Cấu trúc hóa học của các saponin được xác định bằng sự kết hợp giữa phổ khối lượng ion hóa phun mù điện tử (ESI-MS) để xác định khối lượng phân tử và các kỹ thuật cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều (1D và 2D NMR) gồm phổ proton ($^1H$), carbon ($^{13}C$), COSY, TOCSY, HSQC, HMBC, ROESY và NOESY (đo trong dung môi pyridine-$d_5$). Ngoài ra, phương pháp thủy phân acid kết hợp sắc ký khí (GC) được áp dụng để xác định thành phần và cấu hình lập thể tuyệt đối của các đơn vị đường trong chuỗi oligosaccharide.

3. Vì sao tác giả không dùng chính các saponin đã phân lập để nghiên cứu bao vi nang mà lại chọn curcumin?

Mặc dù aglycon (sapogenin) của saponin là đích nhắm cần cải thiện độ tan và sinh khả dụng, nhưng hàm lượng saponin phân lập và tinh sạch được từ các mẫu thực vật tự nhiên rất nhỏ, không đủ khối lượng cần thiết để phát triển và tối ưu hóa quy trình bào chế hạt vi nang. Do đó, tác giả đã lựa chọn curcumin – một hoạt chất tự nhiên kỵ nước điển hình có độ tan trong nước và sinh khả dụng đường uống rất thấp tương tự như sapogenin – làm chất mô hình để nghiên cứu phương pháp gel hóa ionotropic.

4. Hoạt tính gây độc tế bào của các saponin được đánh giá trên những dòng ung thư nào và sử dụng phương pháp gì?

Hoạt tính gây độc tế bào được đánh giá bằng phép thử đo màu MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) ở dải nồng độ từ 1 đến 50 µM, sử dụng 5-Fluorouracil (5-FU) làm chất đối chứng dương. Ba dòng tế bào ung thư được sử dụng gồm: dòng tế bào ung thư biểu mô đại tràng chuột (CT26), dòng tế bào u hắc tố chuột (B16) và dòng tế bào ung thư biểu mô tế bào gan người (HepG2).

5. Trong phần nghiên cứu công nghệ dược phẩm, chất diện hoạt nào cho kết quả tối ưu nhất trong hệ vi nang pectinate chứa curcumin?

Trong số các chất diện hoạt được khảo sát trong phương pháp gel hóa ionotropic, Kolliphor® HS 15 được xác định là chất diện hoạt tối ưu nhất. Sự có mặt của Kolliphor® HS 15 giúp tăng cường độ ổn định lý hóa của curcumin, tối ưu hóa hiệu suất bao gói, bảo vệ hoạt tính chống oxy hóa (thông qua phép thử DPPH) và mang lại profile giải phóng có kiểm soát tốt nhất trong điều kiện mô phỏng đường tiêu hóa.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của Nguyễn Đức Hùng đã thực hiện thành công việc kết hợp hai lĩnh vực Dược học cổ truyền và Công nghệ Dược phẩm thông qua nghiên cứu khai thác giá trị các hợp chất tự nhiên. Tác giả đã phân lập và xác định cấu trúc 35 saponin tự nhiên từ các chi Weigela, Cordyline và Dracaena, trong đó phát hiện 22 hợp chất mới (9 triterpenoid và 13 steroid), đồng thời cung cấp các số liệu thực nghiệm về hoạt tính gây độc tế bào ung thư trên các dòng CT26, B16 và HepG2. Ở hướng công nghệ bào chế, nghiên cứu đã xây dựng thành công quy trình tạo hạt pectinate vi bao curcumin bằng phương pháp gel hóa ionotropic với chất diện hoạt Kolliphor® HS 15, chứng minh khả năng cải thiện độ tan, kiểm soát giải phóng và bảo tồn hoạt tính chống oxy hóa của phân tử tự nhiên kỵ nước.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Duc Hung NGUYEN A thesis presented for the degree of Doctor of Pharmacy Speciality: Pharmaceutical Technology Members of jury: Prof. Dominique Laurain-Mattar Université de Lorraine President/ Rapporteur Prof. Anne Sapin-Minet Université de Lorraine Rapporteur Prof. Odile Chambin UBFC Supervisor Prof.

Anne-Claire Mitaine-Offer UBFC Co-supervisor Dijon, 2020 THESE DE DOCTORAT DE L’ETABLISSEMENT UNIVERSITE BOURGOGNE FRANCHE-COMTE PREPAREE AU LABORATOIRE DE PHARMACOGNOSIE PEPITE EA 4267 Ecole doctorale Environnements - Santé Doctorat de Pharmacie, spécialité Pharmacognosie Par Nguyen Duc Hung Thèse présentée et soutenue à l’UFR Sciences de Santé de Dijon, salle R46, le 09 Novembre 2020 Composition du Jury: Prof. Dominique Laurain-Mattar Université de Lorraine Président/ Rapporteur Prof. Anne Sapin-Minet Université de Lorraine Rapporteur Prof. Odile Chambin UBFC Directeur de thèse Prof.

Anne-Claire Mitaine-Offer UBFC Co-Directeur de thèse Dijon, 2020 Titre : Valorisation des produits médicamenteux naturels: de l'extraction à l'encapsulation Mots clés : Saponine, Cytotoxicité, Weigela, Cordyline, Dracaena, Curcumine, Microencapsulation, Activité antioxydante. Cette thèse s’inscrit dans la cadre de la D’autre part, nous avons sélectionné une thématique du Laboratoire de molécule naturelle bien connue afin de Pharmacognosie et du Laboratoire de mettre au point les essais d’encaspulation. La Pharmacie Galénique de l’UFR Sciences de curcumine possède des propriétés Santé, circonsription Pharmacie, au sein de thérapeutiques très intéressantes mais elle l’Université de Bourgogne Franche-Comté, présente à la fois une faible solubilité et une afin de trouver de nouvelles molécules faible biodisponibilité, limitant naturelles bioactives à encaspuler. D’une l'administration par voie orale.

Dans cette part, nous nous sommes concentrés sur la partie de la thèse, nous avons cherché à recherche de saponines naturelles de plantes améliorer la stabilité et la biodisponibilité de issues de la biodiversité vietnamienne et de la curcumine ansi qu’une libération l’horticulture française du genres Dracaena, contrôlée dans le tractus gastro-intestinal. Les travaux menés ont préparées en utilisant la gélification ionique conduit à isolement de 35 saponines en présence de différents tensioactifs. Elles naturelles en utilisant différentes techniques ont été caractérisées grâce à leur propriétés chromatographiques. Les structures ont été physico-chimiques et leur profils de déterminées par des méthodes de dissolution in vitro.

Leur activité spectrométrie de masse en source ESI et de antioxydante a été évaluée par le test DPPH. Parmi les 17 composés Le Kolliphor® HS 15 est le tensioactif le plus purs obtenus des 3 espèces appartenant au prometteur pour optimiser les propriétés de genre Weigela, 9 sont des glycosides de la curcumine. l’acide oléanolique et de l’hédéragénine de structure nouvelle. A partir des espèces Dracaena braunii et Cordyline fruticosa “Fairchild red”, nous avons isolé et caractérisé 18 saponines stéroïdiques dont 7 nouvelles de type spirostane et 6 nouvelles de type furostane.

Les activités cytotoxiques de la majorité des saponines isolées ont été évaluées sur trois lignées cellulaires : CT26 (cellules tumorales coliques murines), B16 (cellules de mélanome murin) et HepG2 (cellules d’hépatocarcinome) par le test de prolifération cellulaire MTS. Des relations structure/ activité ont ainsi été proposées. Title : Valorization of natural drug products: from extraction to encapsulation Keywords : Saponins, Cytotoxicity, Weigela, Cordyline, Dracaena, Curcumin, Microencapsulation, Antioxidant actitivy. This thesis was carried out at the Laboratory On the other hand, we selected a well- of Pharmacognosy and the Laboratory of known natural molecule to develop Pharmaceutical technology, at the UFR encapsulation tests.

Among the natural Sciences de Santé, circonscription products, curcumin has very interesting Pharmacy, in the University of Burgundy therapeutic properties but exhibits both a Franche-Comté, to find new natural poor solubility and a low bioavailability, molecules to encapsulate. First of all, we limiting the administration by the oral route. focused on the natural saponins from plants The purpose of this study was to improve the of the Vietnam biodiversity and the French solubility and bioavailability of curcumin as horticulture, belonging to the three genera well as simultaneously achieve controlled Dracaena, Cordyline (Asparagaceae) and release in gastrointestinal tract. Pectinate gel Weigela (Caprifoliaceae).

The work led to beads were prepared based on ionotropic the successful isolation and elucidation of gelation method with the presence of vaious 35 natural saponins using various surfactants. After drying, these beads were chromatographic techniques. The structures investigated for physicochemical were determined by ESI mass spectrometry characteristics (morphological aspects, and NMR spectroscopy. Among the 17 pure encapsulation efficiency, stability, physical compounds obtained from three species of state), dissolution kinetics (in vitro release) the Weigela genus, 9 oleanolic acid and and antioxidant activity was determined hederagenin glycosides are previously with DPPH assay.

Kolliphor® HS 15 seems undescribed ones. From the two species to be the best promising surfactant to Dracaena braunii and Cordyline fruticosa increase stability and bioavailability of “Fairchild red”, we isolated and curcumin. characterized 18 steroidal saponins including 7 new spirostane-types and 6 new furostane-types ones. The cytotoxic activities of the majority of isolated saponins were evaluated against mouse colon cancer (CT26 cells), mouse melanoma (B16 cells) and human liver cancer (HepG2 cells) by MTS assays.

The structure / activity relationships were also proposed. Université Bourgogne Franche-Comté 32, avenue de l’Observatoire 25000 Besançon AKNOWLEDGEMENTS My sincere appreciation is addressed to my Ph. I would like to express my deep and sincere thankfulness for giving me the opportunity to work on my thesis in such creative research environment. Her continuous support, guidance and encouragements help me stand on my feet and climb through the ups and downs of my PhD journey which would has never been this far without her wise advices.

I am also deeply grateful to my second supervisor, Prof. Anne-Claire Mitaine-Offer, who coordinated, guided and inspired me through my research work. With her enthusiasm, cheerful character and excellent encouragement, she always showed me how to see problems during my research and taught me how to find solutions. I owe my most sincere gratitude to Prof.

Marie-Aleth Lacaille-Dubois, Director of Laboratory of Pharmacognosy, Université de Bourgogne. She was always willing to help with her experience and supported me with tips and analytical tricks throughout my research. I also express my thankfulness to Prof. Marie-Pierre Flament and Prof.

Yves Wache, two members of thesis supervisory committee. They offered advices about and assessment of my research. I would like to thank all colleagues in Université de Bourgogne for providing a stimulating and nice environment. I also warmly thank the Vietnamese Government, for providing me the scholarship, and my colleagues in Department of Biology, University of Education, Thainguyen University, Vietnam for their encouragement.

The laboratory of PAM, especially to Physico-chemistry of Food and Wine (PCAV) team, Agrosup Dijon and Dr. Gaëlle Roudaut are acknowledged for inspiring me at the beginning of PhD journey. Special thanks go to Mr. Bastien Petit, for being a great lab mate throughout my whole PhD journey in Dijon.

Bastien, my friend, I will never forget the words “Paradise” and “Cafélisto” for the rest of my life. Thank you for all the crazy moments we have ever done! I also warmly thank Mr. David Pertuit, a great technician, for supporting me during the fraction and isolation process. I am sincerely grateful for his patience and long hours spent to teach me how to use all equipments.

Futhermore, I am also greatful to the colleagues of laboratory of Pharmacognosy: Dr. Tomofumi Miyamoto, Dr. Chiaki Tanaka, Dr. Thomas Paululat for the measurements of the diverse NMR and MS experiments.

Thankfulness is given to Dr. Bertrand Collin and Dr. Pierre-Simon Bellaye for help in cytotoxic activity. To my lovely wife… My wonderful wife Huyen could not be here during my PhD journey but she has always encouraged me and offered me the support that I needed to complete this thesis.

I would have dropped out this journey and would not have written these words if I had lived without her. Huyen, my darling, you showed me what it means to love and to be loved, I am a lucky person with you. In the deepness of my heart, I give you a great love and appreciation for your faithful patience and all the moments we shared together, I thank you for being a half of my life. …my sons… Nam, my second son, I started my PhD journey while you were still in your mother’s womb.

I am sorry you, my son, for one reason that I could not be there when you were born. It can be the biggest regret of my life. To Lam, my first son, I still remember the day I had to say goodbye to you. It has been an unforgettable in my mind.

I hope you will understand my situation and excuse my absence at home. …and my family! My gratefulness address to my parents who have been supporting me in each and every step and breath I take, to my mother Ngan who gives me encouragement through her never- ended good wished, pray and emotional support, and to my father Hong whose kindness, inspiration always be in my heart. My gratitude is also forwarded to my big brother Ha and his wife Thao for their continuous tenderness and encouragement. To my mother-in-law Chien, my aunts-in-law Khay and Chin, my sister-in-law Ha and her husband Dat, receive my deep gratitude and love for your dedication and trust in me.

I thank to my aunt Hoa and two my uncles Tuan and Dung, you showed me the importance of education and helped me find the right way on every step of my life. Last, but not least, to Madam Agnès Roy, receive my great gratitude and love for your supports during my whole schooling. Not only did you supply me with energy and motivation every time I depressed but also you taught me languages and the significance of life and love. Agnès, you have always been the one to make me better.

For your love and endless support, I am happy to dedicate this thesis to you. Finally, to someone who have not been here for any reason, I want you know that you have been always the ones to help me to reach this far in my career. Thank you for being a part of my life. Duc Hung NGUYEN Dijon, 2020 Dedication I am so proud to dedicate this thesis To my lovely wife and my children who have always encouraged me throughout my PhD journey… To my whole family.

To Agnès Roy. GENERAL INTRODUCTION Nowadays, chemistry and biology laboratories around the world are studying on natural herbal medicines due to their safe to treat various diseases. There are several evidences to prove the use of traditional medicine in different cultures. Despite this historical importance of plants and considerable contemporary research into the identification of new naturally occurring chemical compounds, many of those are still not revealed both chemical structures and pharmacological activities.

Saponin, a naturally occurring surface active glycoside, has been reported in recent years of publications about their properties. These compounds were discovered for their biological activities, from traditional uses to pharmaceutical applications. Saponins possess a various of pharmaceutical potentials, such as antitumor, anti-inflammatory, antiviral, antioxidant and antibacterial (Moghimipour and Handali, 2015). In this context, the Laboratory of Pharmacognosy, EA 4267, at the University of Burgundy Franche-Comté, is focusing on research of biologically active saponins from various plant families.

Our research strategy consists in the selection of families and genera known for their richness in saponins, based essentially on chemotaxonomic criteria. Then, after extraction, isolation and structural characterization, the natural molecules are subjected to in vitro biological evaluation mainly in the field of cancerology. Due to these steps, three genera Dracaena, Cordyline and Weigela of two families Asparagaceae and Caprifoliaceae, were chosen for phytochemical investigation. It is interesting to note that many traditional uses of several species belonging to these genera present a potential in the pharmaceutical domain.

Saponins were extracted and identified by using various chromatographic methods. These compounds were further evaluated for their cytotoxic activities and the analysis of relationships between structure and activity were carried out. Aglycon (or sapogenin), an hydrophobic portion of saponin, has gained importance as a novel drug.