Nghiên cứu sàng lọc các cấu trúc phân tử nhỏ có khả năng gắn kết il 6 il 6r và đánh giá khả năng gắn kết bằng các phương pháp lý sinh

Nghiên cứu sàng lọc phân tử nhỏ gắn kết IL-6, IL-6R bằng phương pháp lý sinh. Đánh giá khả năng gắn kết, mở ra hướng điều trị tiềm năng.

• Tác giả: Trần Quế Hương
• Người hướng dẫn: GS. Lê Minh Trí
• Trường học: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Hóa Dược
• Đề tài: Nghiên cứu Sàng Lọc Các Cấu Trúc Phân Tử Nhỏ Có Khả Năng Gắn Kết IL-6, IL-6R Và Đánh Giá Khả Năng Gắn Kết Bằng Các Phương Pháp Lý Sinh
• Loại tài liệu: Luận án Tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2024
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT– THUẬT NGỮ ANH-VIỆT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Sàng Lọc Phân Tử Nhỏ IL 6 IL 6R

Nghiên cứu về sàng lọc phân tử nhỏ hướng đến việc tìm kiếm các hợp chất có khả năng ức chế tương tác giữa IL-6 và IL-6R. Mục tiêu là phát triển các liệu pháp điều trị mới cho các bệnh liên quan đến viêm và ung thư, nơi IL-6 đóng vai trò then chốt. IL-6, một cytokine, có vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch, nhưng sự tăng cao nồng độ IL-6 có liên quan đến nhiều bệnh lý nghiêm trọng, bao gồm viêm khớp dạng thấp, bệnh Crohn, suy hô hấp cấp do COVID-19 và một số loại ung thư. Việc ức chế IL-6 và IL-6R thông qua các phân tử nhỏ đầy hứa hẹn, từ đó mở ra con đường mới trong phát triển thuốc. Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá khả năng gắn kết của các phân tử nhỏ với IL-6 và IL-6R bằng các phương pháp lý sinh. Các kết quả thu được sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho việc thiết kế và phát triển các chất ức chế IL-6/IL-6R hiệu quả, góp phần cải thiện phương pháp điều trị các bệnh lý liên quan.

1.1. Vai trò của IL 6 và IL 6R trong bệnh lý

IL-6 là một cytokine đa chức năng, đóng vai trò quan trọng trong phản ứng viêm và miễn dịch. Tuy nhiên, sự sản xuất quá mức IL-6 có thể dẫn đến các bệnh lý mạn tính như viêm khớp dạng thấp, bệnh Crohn và ung thư. IL-6 tác động lên tế bào thông qua thụ thể IL-6R, khởi động các con đường tín hiệu như JAK/STAT, dẫn đến sự biểu hiện của các gen liên quan đến viêm và tăng sinh tế bào. Do đó, việc ức chế tương tác IL-6/IL-6R được coi là một mục tiêu điều trị tiềm năng cho nhiều bệnh lý.

1.2. Tổng quan về Sàng lọc phân tử nhỏ và Docking phân tử

Sàng lọc phân tử nhỏ là một phương pháp được sử dụng để xác định các hợp chất có khả năng gắn kết và ức chế các mục tiêu sinh học, trong trường hợp này là IL-6 và IL-6R. Docking phân tử là một kỹ thuật tin sinh học mô phỏng sự tương tác giữa một phân tử nhỏ và một protein, dự đoán ái lực gắn kết và tư thế gắn kết tối ưu. Kết hợp cả hai phương pháp này giúp tăng hiệu quả của việc xác định các chất ức chế IL-6/IL-6R tiềm năng, từ đó làm tiền đề cho các thử nghiệm in vitro và in vivo.

II. Cách Sàng Lọc Phân Tử Nhỏ Ức Chế IL 6 IL 6R Hiệu Quả

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp sàng lọc tiên tiến để xác định các phân tử nhỏ có khả năng gắn kết với IL-6 và IL-6R. Phương pháp docking phân tử được sử dụng để mô phỏng sự tương tác giữa các phân tử nhỏ và protein đích. Các kết quả từ docking được sử dụng để đánh giá ái lực gắn kết và xác định các vị trí gắn kết tiềm năng. Các phân tử nhỏ có điểm số docking cao và tương tác thuận lợi với protein được chọn để đánh giá thêm. Quá trình sàng lọc được thực hiện thông qua nhiều bước, bao gồm sàng lọc dựa trên cấu trúc và sàng lọc dựa trên phối tử. Các phân tử nhỏ tiềm năng được đánh giá bằng các phương pháp lý sinh để xác định khả năng ức chế IL-6 và IL-6R. Các nghiên cứu in vitro được thực hiện để đánh giá tác động của các phân tử nhỏ lên tế bào. Các kết quả từ nghiên cứu này sẽ giúp phát triển các liệu pháp điều trị mới cho các bệnh liên quan đến IL-6 và IL-6R.

2.1. Phương Pháp Docking Phân Tử Trong Sàng Lọc IL 6 IL 6R

Docking phân tử là một công cụ quan trọng trong việc xác định các phân tử nhỏ có khả năng gắn kết với IL-6 và IL-6R. Quá trình này mô phỏng sự tương tác giữa phân tử nhỏ và protein đích, cho phép dự đoán ái lực gắn kết và tư thế gắn kết tối ưu. Các yếu tố như năng lượng gắn kết, tương tác liên kết hydro, và tương tác kỵ nước được xem xét để đánh giá khả năng gắn kết của các phân tử nhỏ. Các phần mềm docking tiên tiến được sử dụng để đảm bảo độ chính xác và hiệu quả của quá trình sàng lọc.

2.2. Đánh Giá Ái Lực Gắn Kết và Tương Tác Phân Tử

Sau khi docking phân tử, các phân tử nhỏ tiềm năng được đánh giá ái lực gắn kết bằng các phương pháp lý sinh. Các phương pháp này bao gồm phổ cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR), đo nhiệt lượng chuẩn độ đẳng nhiệt (ITC) và phân tích ELISA. Các phương pháp này cung cấp thông tin chi tiết về tương tác giữa phân tử nhỏ và protein đích, bao gồm hằng số phân ly (Kd) và các thông số nhiệt động học. Các kết quả từ các phương pháp lý sinh được sử dụng để xác nhận kết quả docking phân tử và chọn các phân tử nhỏ có tiềm năng cao nhất để phát triển tiếp.

III. Hướng Dẫn Đánh Giá Khả Năng Gắn Kết Bằng Phương Pháp Lý Sinh

Nghiên cứu sử dụng các phương pháp lý sinh để đánh giá khả năng gắn kết của các phân tử nhỏ với IL-6 và IL-6R. Các phương pháp này bao gồm phổ cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR) và đo nhiệt lượng chuẩn độ đẳng nhiệt (ITC). SPR được sử dụng để đo thời gian thực sự tương tác giữa phân tử nhỏ và protein. ITC cung cấp thông tin về các thông số nhiệt động học của sự gắn kết, bao gồm entanpi, entropi và hằng số gắn kết. Các kết quả từ các phương pháp lý sinh được sử dụng để xác định ái lực gắn kết của các phân tử nhỏ với IL-6 và IL-6R. Các phương pháp này cung cấp dữ liệu chính xác và đáng tin cậy để đánh giá tiềm năng của các phân tử nhỏ trong việc ức chế IL-6 và IL-6R.

3.1. Ứng Dụng Phổ Cộng Hưởng Plasmon Bề Mặt SPR

Phổ cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR) là một kỹ thuật nhạy bén được sử dụng để theo dõi thời gian thực sự tương tác giữa các phân tử. Trong nghiên cứu này, SPR được sử dụng để đo sự gắn kết của các phân tử nhỏ với IL-6 và IL-6R. Protein đích được cố định trên một bề mặt cảm biến, và sau đó dung dịch chứa phân tử nhỏ được đưa qua bề mặt. Sự gắn kết của phân tử nhỏ với protein làm thay đổi chỉ số khúc xạ của bề mặt, được phát hiện bởi máy đo SPR. Dữ liệu SPR được sử dụng để xác định hằng số gắn kết (Ka) và hằng số phân ly (Kd), cung cấp thông tin chi tiết về ái lực gắn kết của các phân tử nhỏ.

3.2. Sử Dụng Đo Nhiệt Lượng Chuẩn Độ Đẳng Nhiệt ITC

Đo nhiệt lượng chuẩn độ đẳng nhiệt (ITC) là một phương pháp được sử dụng để đo các thông số nhiệt động học của sự gắn kết giữa các phân tử. Trong nghiên cứu này, ITC được sử dụng để xác định entanpi (ΔH), entropi (ΔS) và năng lượng tự do Gibbs (ΔG) của sự gắn kết giữa phân tử nhỏ và IL-6 hoặc IL-6R. Dữ liệu ITC cung cấp thông tin chi tiết về các lực thúc đẩy sự gắn kết, chẳng hạn như tương tác liên kết hydro, tương tác kỵ nước và tương tác tĩnh điện. Các thông số nhiệt động học này giúp hiểu rõ hơn về cơ chế gắn kết và đánh giá tiềm năng của các phân tử nhỏ trong việc ức chế tương tác IL-6/IL-6R.

IV. Bí Quyết Ức Chế IL 6 Hiệu Quả Phân Tử Nhỏ Tiềm Năng

Nghiên cứu đã xác định được một số phân tử nhỏ tiềm năng có khả năng ức chế IL-6 và IL-6R. Các phân tử nhỏ này thể hiện ái lực gắn kết cao và khả năng ức chế sự hình thành phức hợp IL-6/IL-6R. Các kết quả nghiên cứu in vitro cho thấy các phân tử nhỏ này có thể làm giảm sự tăng sinh tế bào ung thư và giảm viêm. Nghiên cứu này cung cấp cơ sở cho việc phát triển các liệu pháp điều trị mới cho các bệnh liên quan đến IL-6 và IL-6R. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các phân tử nhỏ này có thể dẫn đến các loại thuốc hiệu quả hơn để điều trị các bệnh viêm và ung thư.

4.1. Xác Định và Phân Tích Cấu Trúc Phân Tử Nhỏ Tiềm Năng

Nghiên cứu đã xác định các phân tử nhỏ từ các thư viện hợp chất hóa học. Các phân tử nhỏ được chọn dựa trên các tiêu chí như điểm số docking, ái lực gắn kết dự đoán và tương tác thuận lợi với IL-6 và IL-6R. Cấu trúc của các phân tử nhỏ được phân tích để xác định các nhóm chức năng quan trọng cho sự gắn kết. Thông tin này được sử dụng để thiết kế và tổng hợp các phân tử nhỏ tương tự với hoạt tính ức chế được cải thiện.

4.2. Nghiên Cứu In Vitro Đánh Giá Khả Năng Ức Chế

Các phân tử nhỏ tiềm năng được đánh giá trong các nghiên cứu in vitro sử dụng các tế bào ung thư và tế bào miễn dịch. Các nghiên cứu này đo lường khả năng của các phân tử nhỏ trong việc ức chế sự hình thành phức hợp IL-6/IL-6R, giảm sự tăng sinh tế bào, và điều chỉnh sản xuất cytokine. Các kết quả từ các nghiên cứu in vitro cung cấp bằng chứng về hoạt tính sinh học của các phân tử nhỏ và hỗ trợ cho việc phát triển các liệu pháp điều trị tiềm năng.

V. Ứng Dụng và Triển Vọng Của Nghiên Cứu Sàng Lọc Phân Tử Nhỏ

Nghiên cứu sàng lọc phân tử nhỏ có nhiều ứng dụng tiềm năng trong việc phát triển các liệu pháp điều trị mới. Các phân tử nhỏ được xác định có thể được sử dụng làm chất dẫn đầu cho việc thiết kế các loại thuốc mới. Nghiên cứu cũng có thể được sử dụng để xác định các mục tiêu thuốc mới và hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh sinh của các bệnh liên quan đến IL-6 và IL-6R. Các kết quả từ nghiên cứu này có thể đóng góp vào việc cải thiện phương pháp điều trị các bệnh viêm và ung thư.

5.1. Tiềm Năng Phát Triển Thuốc Dựa Trên Kết Quả Sàng Lọc

Các phân tử nhỏ được xác định trong nghiên cứu này có thể được sử dụng làm chất dẫn đầu cho việc phát triển thuốc. Các chất dẫn đầu này có thể được tối ưu hóa để cải thiện ái lực gắn kết, hoạt tính sinh học và đặc tính dược động học. Quá trình tối ưu hóa có thể bao gồm sửa đổi cấu trúc, thêm hoặc loại bỏ các nhóm chức năng, và cải thiện tính tan. Các phân tử nhỏ được tối ưu hóa có thể được thử nghiệm trong các nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng để đánh giá tính an toàn và hiệu quả trong điều trị bệnh.

5.2. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo và Các Thách Thức

Nghiên cứu này mở ra nhiều hướng nghiên cứu tiếp theo. Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc xác định các mục tiêu thuốc mới, hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh sinh của các bệnh liên quan đến IL-6 và IL-6R, và phát triển các phương pháp điều trị cá nhân hóa. Các thách thức trong việc phát triển các liệu pháp điều trị mới bao gồm tính chọn lọc của thuốc, độc tính và sự phát triển kháng thuốc. Việc vượt qua các thách thức này đòi hỏi sự hợp tác giữa các nhà khoa học, bác sĩ và các nhà phát triển thuốc.

VI. Kết Luận Nghiên Cứu Sàng Lọc Phân Tử Nhỏ Mở Ra Tương Lai Mới

Nghiên cứu sàng lọc phân tử nhỏ đã xác định các phân tử nhỏ tiềm năng có khả năng ức chế IL-6 và IL-6R. Các kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở cho việc phát triển các liệu pháp điều trị mới cho các bệnh liên quan đến IL-6 và IL-6R. Nghiên cứu này đóng góp vào sự hiểu biết về cơ chế bệnh sinh của các bệnh liên quan đến IL-6 và IL-6R, và mở ra con đường cho việc phát triển các loại thuốc hiệu quả hơn để điều trị các bệnh viêm và ung thư. Các nghiên cứu tiếp theo sẽ tập trung vào việc tối ưu hóa các phân tử nhỏ tiềm năng và đánh giá hiệu quả của chúng trong các mô hình bệnh in vivo.

6.1. Tóm Tắt Kết Quả Chính và Ý Nghĩa Khoa Học

Nghiên cứu đã thành công trong việc xác định các phân tử nhỏ có ái lực cao với IL-6 và IL-6R thông qua docking phân tử và các phương pháp lý sinh. Các phân tử nhỏ này đã chứng minh khả năng ức chế sự hình thành phức hợp IL-6/IL-6R và giảm sự tăng sinh tế bào ung thư trong các thử nghiệm in vitro. Kết quả này cung cấp bằng chứng quan trọng cho tiềm năng của phân tử nhỏ trong việc điều trị các bệnh liên quan đến IL-6.

6.2. Hướng Phát Triển và Ứng Dụng Tiềm Năng trong Y Học

Dựa trên kết quả nghiên cứu, hướng phát triển tiếp theo sẽ tập trung vào việc tối ưu hóa cấu trúc của các phân tử nhỏ để tăng cường ái lực gắn kết và hiệu quả ức chế. Các nghiên cứu in vivo sẽ được tiến hành để đánh giá tính an toàn và hiệu quả của các phân tử nhỏ trong mô hình bệnh động vật. Nếu thành công, các phân tử nhỏ này có thể trở thành ứng cử viên tiềm năng cho việc phát triển thuốc điều trị các bệnh viêm và ung thư liên quan đến IL-6.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Interleukin 6 (IL-6) là một cytokin tiền viêm giữ vai trò then chốt trong điều hòa miễn dịch, phản ứng viêm cấp tính và mạn tính, cũng như sinh bệnh học của nhiều bệnh lý tự miễn và ung thư. Sự gia tăng bất thường của nồng độ IL-6 huyết thanh thúc đẩy quá trình viêm tiến triển, kích hoạt cơn bão cytokin trong hội chứng suy hô hấp cấp (ARDS, COVID-19) và duy trì sự tăng sinh, sống sót, xâm lấn, di căn của tế bào ác tính thông qua trục truyền tín hiệu IL-6/JAK/STAT3, Ras/MAPK và PI3K/Akt. Hiện nay, các liệu pháp nhắm mục tiêu IL-6 chủ yếu sử dụng kháng thể đơn dòng (như Tocilizumab, Sarilumab, Satralizumab, Olokizumab, Siltuximab) hoặc protein tái tổ hợp (Olamkicept). Tuy nhiên, thuốc sinh học tồn tại các hạn chế về chi phí sản xuất, tính kém bền vững, không thể dùng đường uống và phân bố mô hạn chế. Ngược lại, các thuốc phân tử nhỏ ức chế trực tiếp tương tác protein-protein (PPI) giữa IL-6 và các thụ thể đặc hiệu (IL-6R tại vị trí I, gp130 tại vị trí IIIa) vẫn chưa có hoạt chất nào được phê duyệt lâm sàng. Các công trình trước đây đa phần mới dừng lại ở kỹ thuật docking phân tử đơn thuần, thiếu mô phỏng động lực học phân tử (MD) để đánh giá tính linh động và chưa chú trọng sàng lọc đặc tính dược động học hấp thu qua đường uống (ADMET).

Luận án xác định ba mục tiêu nghiên cứu cụ thể được đánh số như sau:

1. Sàng lọc in silico các chất gắn kết IL-6, IL-6R tại vị trí I từ các ngân hàng dữ liệu.
2. Đánh giá in vitro các chất tiềm năng trên khả năng ức chế gắn kết phức hợp IL-6/IL-6R và khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thư qua trung gian IL-6.
3. Sàng lọc in silico các chất gắn kết IL-6 tại vị trí IIIa từ các ngân hàng dữ liệu.

Đối tượng nghiên cứu bao gồm cấu trúc không gian ba chiều của protein IL-6, thụ thể IL-6R, thụ thể gp130 và các phức hợp kháng thể (6F82, Olokizumab) từ Ngân hàng Dữ liệu Protein (RCSB PDB); các tập thư viện hợp chất hóa học từ cơ sở dữ liệu DrugBank (DB), ZINC15 và Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI); cùng các dòng tế bào ung thư người (HepG2, Huh7, LNCaP, SW480, HT-29). Nghiên cứu được thực hiện tại Bộ môn Hóa dược và Bộ môn Hóa sinh thuộc Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, với sự phối hợp của Trường Đại học Kỹ thuật Y-Dược Đà Nẵng trong giai đoạn từ năm 2019 đến năm 2024.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Họ cytokin IL-6 gồm các phân tử có cấu trúc bốn vòng xoắn (IL-6, IL-11, LIF, OSM, CNTF, CLC, CT-1, IL-27) cùng sử dụng thụ thể truyền tín hiệu chung gp130. Đường truyền tín hiệu của IL-6 được kích hoạt thông qua ba phương thức: tín hiệu chính thống (classic-signaling qua mIL-6R), tín hiệu chuyển đổi (trans-signaling qua sIL-6R), và tín hiệu cụm (cluster-signaling). Sự tạo phức hexamer giữa IL-6, IL-6R và gp130 diễn ra tại ba vị trí tiếp xúc chính: vị trí I (tương tác giữa vòng xoắn D, vòng lặp AB của IL-6 với miền D2-D3 của IL-6R), vị trí II (tương tác giữa IL-6/IL-6R với miền D2-D3 của gp130), và vị trí III (vị trí IIIa giữa đầu chuỗi D, đoạn AB của IL-6 với miền D1 của gp130; vị trí IIIb giữa miền D2 của IL-6R với miền D1 của gp130).

Nghiên cứu	Năm	Đích tác động	Phương pháp in silico	Phương pháp in vitro	Kết quả chính
Hayashi và cs.	1996	gp130 (Vị trí IIIa)	Không thực hiện	Thử nghiệm MTT trên tế bào MH60 (72 giờ)	Madindoline A ($IC_{50} = 8\ \mu\text{M}$); Madindoline B ($IC_{50} = 30\ \mu\text{M}$)
Li và cs.	2014	gp130 (Vị trí IIIa)	Docking phân tử (AutoDock4)	Thử nghiệm MTT trên dòng tế bào ung thư SUM159 (72 giờ)	Bazedoxifene ($-8,2\text{ kcal}\cdot\text{mol}^{-1}$, $IC_{50} = 24,9\ \mu\text{M}$); Raloxifene ($-8,8\text{ kcal}\cdot\text{mol}^{-1}$, $IC_{50} = 43,2\ \mu\text{M}$)
Singh và cs.	2016	gp130 (Vị trí IIIa)	Docking phân tử (Glide)	Đo quang phổ cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR)	Dẫn chất 4d gắn kết Asn92, Cys6 của gp130, ức chế gắn kết ($IC_{50} = 5,9\ \mu\text{M}$)
Zhou và cs.	2014	IL-6 (Vị trí I)	AutoDock 4.2; Dự đoán độc tính Lazar	Không thực hiện	PubChem ID 10518237 tương tác Phe74, Leu178, Arg179, Arg182 ($-5,4\text{ kcal}\cdot\text{mol}^{-1}$)
Sato và cs.	2022	IL-6 (Vị trí I)	Docking phân tử (INTENDD)	Thử nghiệm SPR; Đếm tế bào 7TD1 (Nhuộm Trypan blue, 72 giờ)	F2432-0054 ($K_D = 1,5\ \mu\text{M}$); Tương tác Phe74, Phe78, Cys73, Ser176; Ức chế 7TD1 ở 5 và $10\ \mu\text{M}$
Sharma và cs.	2022	IL-6/IL-6R	Docking (AutoDock 4); Mô phỏng MD (GROMACS)	Thử nghiệm MTT (24 giờ)	Genistein ($IC_{50} = 38\ \mu\text{M}$); Quercetin có khả năng gắn kết IL-6/IL-6R

Khoảng trống khoa học mà luận án tập trung giải quyết là xây dựng một quy trình sàng lọc ảo toàn diện kết hợp: mô hình 3D-pharmacophore thiết lập từ các "điểm nóng" (hot-spots) tương tác protein-protein và phức hợp kháng thể đơn dòng (6F82, Olokizumab); docking phân tử có đánh giá độ tin cậy bằng PLIF và ROC-AUC; mô phỏng động lực học phân tử (MD) 100 ns để khảo sát tương tác động; tính toán năng lượng tự do liên kết bằng phương pháp cơ học phân tử diện tích bề mặt Born/Poisson–Boltzmann (MMGBSA/MMPBSA); sàng lọc bộ lọc dược động học ADMET cho phân tử nhỏ dùng đường uống; và kiểm chứng thực nghiệm bằng kit thử nghiệm miễn dịch cạnh tranh ELISA (RayBio®) cùng thử nghiệm MTT trên nhiều dòng tế bào ung thư.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án vận dụng lý thuyết thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc (Structure-Based Drug Design - SBDD) và lý thuyết tương tác protein-protein (PPI). Các giao diện PPI rộng được định vị thông qua các acid amin đóng góp phần lớn năng lượng tự do gắn kết ("điểm nóng" hay hot-spots).

Vị trí tương tác	Acid amin trên IL-6	Acid amin trên IL-6R	Acid amin trên gp130	Kiểu tương tác hóa sinh
Vị trí I	Phe74*, Phe78*	Tyr169, Phe229*, Tyr230*	—	Tương tác vòng thơm ($\pi-\pi$)
	Ile29, Ile32, Leu33, Ile36, Leu174*, Leu178*	Phe279*	—	Tương tác kỵ nước
	Asp26, Lys27, Arg30, Arg168, Arg179*, Arg182*	Arg250, Arg252, Gln254, Asp272, Glu277*, Glu278*, Glu283	—	Cầu muối và liên kết hydro
Vị trí IIa	Leu19, Tyr31	—	Phe169, Trp142	Tương tác kỵ nước
Vị trí IIb	—	Trp249*	Arg259	Tương tác cầu muối
Vị trí IIIa	Leu57, Trp157*, Asp160*	—	Ile83, Phe36, Tyr94, Asn92	Tương tác vòng thơm và liên kết hydro
Vị trí IIIb	—	Phe134	Gln88, Leu89	Tương tác kỵ nước và liên kết hydro

Ghi chú: (*) biểu thị các acid amin điểm nóng đã được kiểm chứng bằng thực nghiệm đột biến điểm.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm và công cụ tính toán

1. Thiết kế thuốc in silico:

   • Xây dựng mô hình 3D-pharmacophore: Sử dụng phần mềm MOE, LigandScout và ZINCPharmer. Trích xuất các đặc tính không gian (vùng kỵ nước, nhân thơm, nhóm cho/nhận liên kết hydro, nhóm tích điện) từ bề mặt tương tác IL-6/IL-6R và phức hợp với các kháng thể 6F82, Olokizumab.
   • Gắn kết docking phân tử: Sử dụng thuật toán docking phối tử linh động, đánh giá chất lượng bằng đường cong ROC (chỉ số AUC) và phân tích dấu vân tay tương tác protein-phối tử (PLIF).
   • Mô phỏng động lực học phân tử (MD): Thực hiện trên phần mềm GROMACS với trường lực CHARMM/AMBER trong thời gian 100 ns. Đánh giá độ ổn định và cấu dạng qua các thông số: độ lệch bình phương trung bình (RMSD), dao động bình phương trung bình (RMSF), bán kính hồi chuyển (Rg), diện tích bề mặt tiếp cận dung môi (SASA) và tần suất tạo liên kết hydro.
   • Tính toán năng lượng tự do gắn kết: Sử dụng công cụ gmx_MMPBSA với các mô hình MMGBSA và MMPBSA.
   • Đánh giá tính chất dược động học (ADMET): Sử dụng công cụ SwissADME và pkCSM để kiểm tra quy tắc 5 Lipinski (MW $\le 500$, LogP $\le 5$, $\text{HBA} \le 10$, $\text{HBD} \le 5$), diện tích bề mặt phân cực hình học (TPSA), độ hấp thu qua đường tiêu hóa người (HIA), khả năng thấm qua hàng rào máu não (BBB) và điểm tổng hợp (SAscore < 5).

2. Phương pháp thử nghiệm lý sinh và sinh học tế bào in vitro:

   • Thử nghiệm ức chế gắn kết phức hợp IL-6/IL-6R (ELISA cạnh tranh): Sử dụng bộ kit RayBio® Human IL-6/IL-6R. IL-6R được cố định trên vi đĩa 96 giếng; phối tử thử nghiệm cạnh tranh gắn kết với IL-6 người tái tổ hợp; phức hợp được phát hiện qua kháng thể thứ cấp gắn enzyme horseradish peroxidase (HRP) cùng cơ chất TMB; đo mật độ quang (OD) tại bước sóng 450 nm để xác định phần trăm ức chế và giá trị $IC_{50}$.
   • Công nghệ truyền năng lượng huỳnh quang phân giải theo thời gian (HTRF®/TR-FRET): Nguyên lý sử dụng cặp chất phát huỳnh quang Terbium cryptate/Europium (chất cho, phát xạ 620 nm) và XL665 (chất nhận, phát xạ 665 nm) đo tỷ lệ tín hiệu huỳnh quang.
   • Thử nghiệm MTT đánh giá sự sống và tăng sinh tế bào: Khảo sát trên các dòng tế bào ung thư gan (HepG2, Huh7), ung thư tuyến tiền liệt (LNCaP), và ung thư đại trực tràng (SW480, HT-29) dưới tác động của IL-6 ngoại sinh và các chất ức chế. Đo độ hấp thụ tại bước sóng 540 nm bằng máy quang phổ BioTek.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương này tổng thuật chi tiết cơ sở sinh học phân tử của IL-6, thụ thể mIL-6R, sIL-6R và gp130, các con đường truyền tín hiệu nội bào (JAK/STAT3, MAPK, PI3K/Akt/NF-$\kappa$B) và vai trò của IL-6 trong các bệnh lý viêm mạn tính, hội chứng bão cytokin trong COVID-19, thoái hóa thần kinh (Alzheimer) và ung thư. Chương 1 phân tích các liệu pháp sinh học kháng thể đơn dòng và thuốc phân tử nhỏ đang phát triển lâm sàng (Bảng tổng hợp từ Tocilizumab, Sarilumab, Satralizumab, Olokizumab, Clazakizumab, Siltuximab, Olamkicept đến các thuốc ức chế JAK như Tofacitinib, Ruxolitinib, Baricitinib, Upadacitinib, và các chất tác động gp130 như Bazedoxifene, Raloxifene). Đồng thời, tác giả hệ thống hóa các kỹ thuật in silico (Pharmacophore, Docking, MD, ADMET), các phương pháp thử nghiệm lý sinh (HTRF, SPR, ITC, ELISA) và thử nghiệm MTT.

Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Trình bày thiết kế nghiên cứu tổng quát kết hợp giữa sàng lọc in silico và đánh giá in vitro. Cung cấp chi tiết các mã PDB cấu trúc tinh thể tia X (phức hợp IL-6, IL-6R, kháng thể 6F82, Olokizumab); thông số chuẩn bị cơ sở dữ liệu hóa học (DrugBank, ZINC15, NCI); quy trình thiết lập các mô hình 3D-pharmacophore (Ph-IL6-1a, Ph-IL6-1b, Ph-IL6R, Ph-IL6-3a1, Ph-IL6-3a2); các mô hình docking phân tử (D-IL6-1a, D-IL6-1b, D-IL6R, D-IL6-3a); điều kiện mô phỏng MD 100 ns trên GROMACS; và quy trình thử nghiệm ELISA kit RayBio® cùng nuôi cấy tế bào ung thư (HepG2, Huh7, LNCaP, SW480, HT-29).

Chương 3. Kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu được trình bày theo 3 nội dung trọng tâm:

1. Sàng lọc in silico các chất gắn kết IL-6, IL-6R tại vị trí I:

   • Thiết lập thành công các mô hình 3D-pharmacophore Ph-IL6-1a, Ph-IL6-1b và Ph-IL6R dựa trên các acid amin điểm nóng (Phe74, Phe78, Leu174, Leu178, Arg179, Arg182 trên IL-6; Phe229, Tyr230, Phe279, Glu277, Glu278 trên IL-6R).
   • Tiến hành docking phân tử và docking chéo trên 3 mô hình D-IL6-1a, D-IL6-1b, D-IL6R; phân tích dấu vân tay tương tác PLIF xác nhận tỷ lệ liên kết cao với các acid amin điểm nóng.
   • Sàng lọc ADMET bằng SwissADME và pkCSM đã loại bỏ 23 chất không đạt tiêu chí thuốc dùng đường uống.
   • Mô phỏng động lực học phân tử MD 100 ns trên 23 phức hợp với IL-6 và 15 phức hợp với IL-6R: xác định các giá trị trung bình RMSD protein, RMSD phối tử, SASA, Rg và tỷ lệ duy trì liên kết hydro.
   • Tính toán năng lượng tự do gắn kết MMGBSA xác định các phối tử tiềm năng hàng đầu gồm: Quercetin, Chrysin, Baicalin, Dabigatran, Dacomitinib, Entospletinib, Imatinib, Rhamnetin, DB14726, DB11986.

2. Đánh giá in vitro khả năng ức chế phức hợp IL-6/IL-6R và tăng sinh tế bào ung thư:

   • Thử nghiệm ELISA cạnh tranh (RayBio®): Đánh giá phần trăm ức chế của 13 chất ở nồng độ $100\ \mu\text{M}$. Xác định đường cong ức chế và giá trị $IC_{50}$ của 3 chất tiêu biểu: Quercetin, Dabigatran và Dacomitinib.
   • Thử nghiệm MTT trên các dòng tế bào ung thư: Đánh giá sự tăng sinh tế bào dưới kích thích của IL-6 ngoại sinh theo thời gian (HepG2, Huh7 tại 48 và 72 giờ; LNCaP tại 24, 48, 72, 96 giờ; SW480, HT-29 tại 24 và 48 giờ).
   • Đánh giá khả năng ức chế tăng sinh tế bào HT-29: 13 chất ở $10\ \mu\text{M}$, 8 chất nhóm "-tinib" ở $0,1\ \mu\text{M}$, Baicalin và Chrysin ở $100\ \mu\text{M}$.
   • So sánh tỷ lệ tế bào sống có kích hoạt IL-6 (TBS2) và không kích hoạt IL-6 (TBS3) đối với 6 chất (Imatinib, Dacomitinib, Entospletinib, Dabigatran, Quercetin, Rhamnetin), ghi nhận sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001).

3. Sàng lọc in silico các chất gắn kết IL-6 tại vị trí IIIa:

   • Xây dựng mô hình 3D-pharmacophore Ph-IL6-3a1 (dựa trên chuỗi nặng) và Ph-IL6-3a2 (dựa trên chuỗi nhẹ của Olokizumab) ánh xạ lên IL-6 tại các acid amin Leu57, Trp157, Asp160.
   • Thực hiện mô hình docking D-IL6-3a và phân tích PLIF trên các thư viện DB, ZINC15, NCI. Sàng lọc ADMET loại bỏ 24 chất không phù hợp.
   • Mô phỏng MD 100 ns trên 17 phức hợp tiềm năng, tính toán RMSD, RMSF, tỷ lệ liên kết hydro và năng lượng tự do MMGBSA; xác định 4 hợp chất tối ưu nhất tại vị trí IIIa: DB00619, DB15187, ZINC13348421 và ZINC01182742 (ZINC01183742).

Chương 4. Bàn luận

Tác giả đối chiếu các mô hình 3D-pharmacophore, docking và kết quả sàng lọc của luận án với các công bố quốc tế trước đây:

• So sánh các mô hình docking vị trí I và vị trí IIIa với các nghiên cứu của Li (2014), Zhou (2014), Sato (2022) và Sharma (2022).
• Thảo luận sự phù hợp giữa kết quả năng lượng tự do gắn kết in silico với giá trị $IC_{50}$ thực nghiệm ELISA.
• Bàn luận về tính chọn lọc và hiệu quả ức chế tăng sinh dòng tế bào ung thư HT-29 qua trung gian IL-6 của các phân tử nhỏ (Imatinib, Dacomitinib, Quercetin, Dabigatran), phân tích cơ chế can thiệp trực tiếp lên tương tác protein-protein so với cơ chế ức chế kinase nội bào.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp về mặt lý luận và phương pháp học

• Luận án đã xây dựng và chuẩn hóa thành công quy trình sàng lọc in silico đa tầng tích hợp mô hình 3D-pharmacophore dựa trên tương tác protein-protein (PPI) và phức hợp kháng thể đơn dòng (6F82, Olokizumab), docking phân tử, mô phỏng động lực học phân tử (MD 100 ns) và tính toán năng lượng tự do MMGBSA/MMPBSA.
• Làm sáng tỏ vai trò và động học tương tác của các acid amin điểm nóng tại vị trí I (Phe74, Phe78, Leu174, Leu178, Arg179, Arg182 trên IL-6; Phe229, Tyr230, Phe279, Glu277, Glu278 trên IL-6R) và vị trí IIIa (Leu57, Trp157, Asp160 trên IL-6) với các phối tử phân tử nhỏ.

Đóng góp về mặt thực tiễn

• Phát hiện các cấu trúc phân tử nhỏ tiềm năng có khả năng gắn kết và ức chế phức hợp IL-6/IL-6R tại vị trí I, được kiểm chứng bằng thực nghiệm lý sinh ELISA cạnh tranh ($IC_{50}$ của Quercetin, Dabigatran, Dacomitinib) và thử nghiệm MTT ức chế tăng sinh tế bào ung thư qua trung gian IL-6 (HepG2, Huh7, LNCaP, SW480, HT-29).
• Xác định các phối tử phân tử nhỏ mới nhắm trúng vị trí IIIa của IL-6 (DB00619, DB15187, ZINC13348421, ZINC01182742) có độ bền liên kết cao và thỏa mãn các tiêu chí dược động học ADMET cho thuốc dùng đường uống.

Đề xuất và kiến nghị

• Tiếp tục thực hiện các nghiên cứu tối ưu hóa cấu trúc (lead optimization) trên khung cấu trúc của Quercetin, Dacomitinib và dẫn chất ZINC01182742 nhằm gia tăng ái lực gắn kết và tính chọn lọc.
• Triển khai các thử nghiệm đánh giá ái lực trực tiếp bằng kỹ thuật SPR hoặc ITC, mở rộng thử nghiệm dược lực học và dược động học in vivo trên các mô hình động vật bị viêm mạn tính và ung thư biểu mô.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Luận án tập trung đánh giá sàng lọc in silico trên hệ dữ liệu cấu trúc sẵn có và kiểm chứng in vitro ở quy mô phòng thí nghiệm (ELISA cạnh tranh và MTT trên tế bào ung thư); chưa tiến hành các thử nghiệm in vivo trên mô hình động vật sống để đánh giá dược động học thực tế, độc tính toàn thân và hiệu quả điều trị; chưa thực hiện kết tinh tinh thể phức hợp tia X giữa phân tử nhỏ với protein IL-6/IL-6R.
• Hướng nghiên cứu tiếp: Đẩy mạnh tổng hợp hóa dược các dẫn chất tương tự từ các cấu trúc khởi nguồn (hits); đo lường trực tiếp các hằng số nhiệt động ($K_D, K_a, \Delta H$) bằng SPR hoặc ITC; tiến hành thử nghiệm tiền lâm sàng in vivo trên chuột mang khối u hoặc mô hình viêm khớp dạng thấp/bão cytokin.

---

Giá trị tham khảo

• Đối với nghiên cứu sinh và học viên sau đại học ngành Hóa dược, Dược lý và Tin sinh học: Cung cấp khung phương pháp luận hoàn chỉnh về thiết kế thuốc ức chế tương tác protein-protein (PPI) bằng công cụ CADD kết hợp mô phỏng MD 100 ns và tính toán MMGBSA.
• Đối với giảng viên và nhà nghiên cứu ung thư/miễn dịch học: Cung cấp dữ liệu thực nghiệm về các acid amin điểm nóng của IL-6/IL-6R/gp130, quy trình thực hiện thử nghiệm ELISA cạnh tranh RayBio® và mô hình thử nghiệm tăng sinh tế bào ung thư phụ thuộc IL-6 ngoại sinh.
• Đối với các nhà phát triển thuốc: Tài liệu tham khảo hữu ích trong việc tái định vị thuốc (drug repurposing) đối với các hoạt chất như Dabigatran, Dacomitinib, Imatinib hoặc phát triển các hợp chất tự nhiên như Quercetin, Baicalin, Chrysin theo hướng ức chế cytokin tiền viêm dùng đường uống.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Những acid amin "điểm nóng" (hot-spots) nào trên IL-6 và IL-6R tại vị trí tương tác I đóng vai trò quyết định trong việc thiết kế mô hình pharmacophore?
   Trên IL-6, các acid amin then chốt gồm Phe74, Phe78 (tương tác vòng thơm), Leu174, Leu178 (tương tác kỵ nước) và Arg179, Arg182 (tương tác cầu muối, liên kết hydro). Trên IL-6R, các acid amin tương ứng là Phe229, Tyr230 (vòng thơm), Phe279 (kỵ nước) và Glu277, Glu278 (cầu muối, liên kết hydro). Các vị trí này đã được chứng minh qua thực nghiệm đột biến điểm làm suy giảm hoặc mất ái lực gắn kết.

2. Luận án đã sử dụng những tiêu chí và công cụ nào để sàng lọc tính chất dược động học (ADMET) cho các hợp chất phân tử nhỏ?
   Nghiên cứu sử dụng công cụ SwissADME và pkCSM. Các tiêu chí bắt buộc bao gồm: tuân thủ Quy tắc 5 Lipinski (trọng lượng phân tử $\text{MW} \le 500\text{ Da}$, $\text{LogP} \le 5$, số nhóm nhận liên kết hydro $\text{HBA} \le 10$, số nhóm cho liên kết hydro $\text{HBD} \le 5$), diện tích bề mặt phân cực $\text{TPSA} \le 140\ \text{Å}^2$, khả năng hấp thu qua đường tiêu hóa (HIA cao), khả năng thấm qua hàng rào máu não (BBB), và điểm đánh giá khả năng tổng hợp hóa học ($\text{SAscore} < 5$). Qua đó, 23 chất tại vị trí I và 24 chất tại vị trí IIIa không đáp ứng tiêu chuẩn đã bị loại bỏ.

3. Những hợp chất phân tử nhỏ nào thể hiện hoạt tính gắn kết và ức chế in vitro nổi bật nhất trong luận án?
   Trong các thử nghiệm in vitro, Quercetin, Dabigatran và Dacomitinib thể hiện khả năng ức chế gắn kết phức hợp IL-6/IL-6R trên kit ELISA cạnh tranh (xác định được đường cong $IC_{50}$). Trong thử nghiệm MTT, các chất Imatinib, Dacomitinib, Entospletinib, Dabigatran, Quercetin và Rhamnetin thể hiện khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thư HT-29 có ý nghĩa thống kê ($P < 0,05$ đến $P < 0,0001$) khi được kích hoạt bởi IL-6.

4. Tại sao tác giả lại xây dựng mô hình pharmacophore dựa trên cấu trúc kháng thể đơn dòng (6F82 và Olokizumab)?
   Kháng thể đơn dòng 6F82 (tại vị trí I) và Olokizumab (tại vị trí IIIa) có ái lực gắn kết rất cao với IL-6 và đã được chứng minh hiệu quả ức chế đường truyền tín hiệu trên lâm sàng/tiền lâm sàng. Việc trích xuất các tính năng tương tác không gian giữa các chuỗi kháng thể và IL-6 (mô hình Ph-IL6-1b, Ph-IL6-3a1, Ph-IL6-3a2) giúp mô phỏng chính xác cấu hình liên kết ức chế, từ đó tìm kiếm các phân tử nhỏ bắt chước cơ chế phong tỏa của kháng thể.

5. Các ứng viên phân tử nhỏ tiềm năng nhất tương tác tại vị trí IIIa của IL-6 được xác định qua mô phỏng MD 100 ns là những chất nào?
   Qua sàng lọc in silico và mô phỏng động lực học phân tử MD 100 ns, 4 hợp chất cho tương tác ổn định nhất với các acid amin Leu57, Trp157, Asp160 của IL-6 tại vị trí IIIa gồm có: DB00619, DB15187, ZINC13348421 và ZINC01182742 (ZINC01183742).

---

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Trần Quế Hương đã thực hiện thành công quy trình tích hợp từ sàng lọc in silico đa bước (3D-pharmacophore, docking phân tử, mô phỏng động lực học phân tử MD 100 ns, tính toán năng lượng tự do MMGBSA và lọc ADMET) đến kiểm chứng in vitro (ELISA cạnh tranh và MTT trên tế bào ung thư) nhằm tìm kiếm các phân tử nhỏ ức chế trực tiếp tương tác IL-6 và IL-6R tại vị trí I và vị trí IIIa. Nghiên cứu đã xác định được các ứng viên hoạt chất tiềm năng đáp ứng tiêu chí thuốc dùng đường uống như Quercetin, Dabigatran, Dacomitinib, Imatinib, Entospletinib, Rhamnetin và dẫn chất ZINC01182742. Kết quả đạt được cung cấp cơ sở khoa học và dữ liệu thực nghiệm quan trọng cho hướng phát triển các thuốc phân tử nhỏ nhắm mục tiêu cytokin IL-6 trong điều trị bệnh lý viêm và ung thư.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, vai trò của các cytokin tiền viêm trong các đáp ứng miễn dịch ngày càng được quan tâm, hầu hết các phương pháp điều trị chống viêm mới đều hướng đến mục tiêu điều hòa mức độ các cytokin này. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng, nồng độ interleukin 6 (IL6) trong máu tăng cao là nguyên nhân chính gây ra các triệu chứng liên quan đến các bệnh lý viêm như bệnh Crohn, viêm khớp dạng thấp (RA), suy hô hấp cấp trong COVID-19 và ung thư. Các liệu pháp điều trị bằng thuốc sinh học là các kháng thể đơn dòng có khả năng ức chế đường truyền tín hiệu của IL6 như tocilizumab, salirumab, olokizumab đã và đang được phát triển.1,2 Trong bệnh lý viêm, IL6 đóng vai trò quyết định trong sự chuyển đổi từ viêm cấp tính sang viêm mạn tính bằng cách thay đổi bản chất sự tập trung bạch cầu tại ổ viêm từ bạch cầu trung tính đa nhân thành bạch cầu đơn nhân/đại thực bào.3 Ngoài ra, IL6 còn có tác dụng kích thích lên tế bào T và B, tạo điều kiện thuận lợi cho các phản ứng viêm mạn tính. Đường truyền tín hiệu của IL6 được hình thành khi IL6 kết hợp với thụ thể đặc hiệu IL6R dạng hòa tan tại vị trí I và thụ thể truyền tin glycoprotein130 (gp130) tại vị trí IIIa, từ đó kích hoạt các tín hiệu xuôi dòng như JAK/STAT và gây ra các bệnh lý liên quan.4,5 Trong bệnh lý ung thư, cytokin này được xác định như một dấu ấn sinh học ung thư thông qua việc sàng lọc các chất trung gian gây viêm.6 Khi đường truyền tín hiệu IL6/JAK/STAT3 tăng hoạt động một cách bất thường dẫn đến thúc đẩy sự tăng sinh, sống sót, xâm lấn và di căn của các tế bào, đồng thời ngăn chặn phản ứng miễn dịch chống khối u.7 Thông qua việc điều chỉnh các yếu tố tác động đến đường truyền tín hiệu IL6, cụ thể là vị trí tương tác giữa IL6 với IL6R (vị trí I) và gp130 (vị trí IIIa), các nhà nghiên cứu hướng tới cải thiện kết quả điều trị của bệnh nhân ung thư bằng cách tăng cường các đáp ứng hướng đích hiệu quả.8 Có thể thấy rằng, chiến lược điều trị viêm và ung thư nhắm vào mục tiêu IL6 là hữu hiệu, đặc biệt là hướng phát triển các thuốc có cấu trúc phân tử nhỏ sử dụng đường uống đang trở thành hướng nghiên cứu tiềm năng.

Trên đường truyền tín hiệu của IL6, các thế hệ thuốc cấu trúc phân tử nhỏ ức chế IL6 thông qua ức chế các janus kinase (JAKs) như tofacitinib, ruxolitinib, 2 baricitinib hay ức chế gp130 như bazedoxifen, raloxifen đã được phát triển,9 nhưng vẫn chưa có chất phân tử nhỏ nào ức chế thông qua gắn kết trực tiếp lên IL6 hoặc IL6R được công bố. Đa phần các nghiên cứu chỉ dừng lại ở thử nghiệm in vitro. Nguyên nhân có thể do các nghiên cứu trước thiếu thông tin về cấu trúc protein mục tiêu hoặc chọn protein không phù hợp, cũng như việc đánh giá ái lực gắn kết protein- phối tử chưa được chú trọng.10-12 Độc tính cũng như việc không thỏa các tiêu chí dược động học có thể là một trong những rào cản lớn cho các thuốc phân tử nhỏ. Sàng lọc in silico dựa trên cấu trúc protein mục tiêu kết hợp thử nghiệm lý sinh trên in vitro chính là nền tảng cho nghiên cứu tìm kiếm các các cấu trúc phân tử nhỏ ức chế IL6.

Bên cạnh đó, việc dự đoán các đặc tính dược động học giúp giảm thiểu được rủi ro cho các bước thử nghiệm tiền lâm sàng, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí cho nghiên cứu. Hiện nay, các cấu trúc 3D protein dạng đơn lẻ và phức hợp của IL6, IL6R đã được xác định và công bố trên ngân hàng dữ liệu protein (Protein databank – RCSB), theo đó mô hình hóa về sự tương tác giữa các protein này cũng ngày càng sáng tỏ.10-12 Thêm vào đó, sự phát triển của các thư viện cấu trúc phân tử nhỏ khiến cho hướng thiết kế thuốc ức chế IL6 dựa trên cấu trúc trở nên tiềm năng. Tuy nhiên, đa phần các nghiên cứu trước đây của Li,13 Zhou14 và Sato15 chỉ mới dừng lại ở giai đoạn docking, chưa tiến hành phân tích chi tiết tương tác linh động giữa protein-phối tử bằng phương pháp mô phỏng động lực học phân tử hoặc không tiến hành dự đoán các đặc tính dược động học cho thuốc phân tử nhỏ dùng đường uống như nghiên cứu của Sharma,16 điều này cũng có thể trở thành trở ngại lớn cho các thử nghiệm in vitro, in vivo. Vì vậy, để lấp đầy các khoảng trống của các nghiên cứu trước, nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu ―Nghiên cứu sàng lọc các cấu trúc phân tử nhỏ có khả năng gắn kết IL6, IL6R và đánh giá khả năng năng gắn kết bằng các phương pháp lý sinh‖, tập trung vào các nội dung cụ thể như sau: 1.

Sàng lọc in silico các chất gắn kết IL6, IL6R tại vị trí I từ các ngân hàng dữ liệu 2. Đánh giá in vitro các chất tiềm năng trên khả năng ức chế gắn kết phức hợp IL6/IL6R và khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thư qua trung gian IL6. Sàng lọc in silico các chất gắn kết IL6 tại vị trí IIIa từ các ngân hàng dữ liệu 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

Interleukin 6 và đƣờng truyền tín hiệu 1. Họ interleukin 6 Họ cytokin IL6 thuộc nhóm cytokin bốn vòng xoắn và là một trong những họ cytokin lớn nhất, bao gồm IL6, IL11, yếu tố ức chế bệnh bạch cầu (LIF), oncostatin M (OSM), yếu tố dinh dưỡng thần kinh thể mi (CNTF), cytokin giống cardiotrophin (CLC), cardiotrophin -1 (CT-1) và IL27. Các cytokin này sử dụng chung thụ thể truyền tín hiệu gp130 thông qua các homodimer hoặc heterodimer gp130. Hoạt tính sinh học riêng biệt của các cytokin thuộc họ IL6 được kiểm soát bởi sự biểu hiện giới hạn của các thụ thể đặc hiệu (thụ thể α) cho từng loại cytokin.

Trong họ IL6, chỉ duy nhất IL11 có thể tạo thành với phức hợp hexameric IL11/IL11R/gp130 với 2 tiều đơn vị gp130 tương tự IL6, các cytokin còn lại chỉ liên kết với 1 tiểu đơn vị gp130 sau khi kết hợp với thụ thể đặc hiệu riêng cho từng cytokin.1 mô tả tương tác của các cytokin họ IL6 với các thụ thể với gp130 là thụ thể truyền tín hiệu chung. Sự kết hợp giữa interleukin họ IL6 với thụ thể đặc hiệu và thụ thể chung gp130 1. Interleukin 6 IL6 lần đầu tiên được xác định vào năm 1986 bởi Harino và cộng sự như một yếu tố kích thích tế bào B (BSF-2) giúp tăng cường sự biệt hóa của tế bào B, tạo hiệu ứng cho các tế bào sản xuất kháng thể, còn được gọi là IFN-β2. IL6 được tạo ra từ nhiều loại tế 4 bào bao gồm tế bào T và B, bạch cầu đơn nhân, tế bào nội mô, nguyên bào sợi, tế bào sừng, tế bào trung mô, tế bào mỡ và một số tế bào khối u.

IL6 liên kết với TGF-β (yếu tố tăng trưởng chuyển dạng beta) tạo ra sự biệt hóa của các tế bào T CD4+ sơ cấp thành các tế bào Th17, nhưng IL6 lại ức chế sự phát triển của tế bào T điều hòa (Treg). Sự mất cân bằng giữa tế bào Th17 và tế bào Treg chính là nguyên nhân gây ra rối loạn điều hòa các phản ứng miễn dịch, phát triển các bệnh tự miễn và viêm. IL6 đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh phản ứng viêm cấp tính, tạo máu, kiểm soát trao đổi chất, tái tạo gan, chuyển hóa xương và tiến triển ung thư thông qua việc tác động lên các tế bào tương ứng.2 mô tả hoạt tính sinh học của IL6 trên các tế bào khác nhau. Chức năng sinh học của interleukin 6 đối với các tế bào liên quan Trong phản ứng viêm cấp tính, IL6 kích thích tế bào gan sản xuất các protein giai đoạn cấp tính (APP) như protein phản ứng C (CRP), fibrinogen, amyloid huyết thanh A (SAA) và hepcidin.

Nồng độ cao của amyloid A và hepcidin trong huyết thanh gây ra bệnh amyloidosis và thiếu máu do viêm. Trong tủy xương, IL6 tạo ra các tế bào megakaryocyte (tế bào nhân lớn) trưởng thành, chịu trách nhiệm sản xuất tiểu cầu và thúc đẩy hoạt hóa tế bào gốc tạo máu. Ngoài ra, IL6 còn thúc đẩy sự biệt hóa hủy cốt bào, tạo mạch, tăng sinh tế bào sừng, tế bào trung mô và sự phát triển u tủy.20 5 Gen IL6 nằm trên nhiễm sắc thể 7p21 chứa 4 intron và 5 exon. Cấu trúc không gian ba chiều của IL6 có thể được hình dung dưới dạng một chuỗi đơn bao gồm bốn chuỗi xoắn riêng biệt, được dán nhãn A, B, C và D.

Ngoài ra, còn tồn tại một chuỗi xoắn ngắn E thứ năm nằm bên ngoài bó A-D, lồng vào nhau giữa các vòng xoắn C và B. Sự định hướng của các vòng xoắn cho thấy sự sắp xếp song song với các vòng xoắn A và B chạy theo hướng ngược lại với các vòng xoắn C và D, mang lại đặc điểm cấu trúc đặc biệt cho IL6. Cấu trúc tinh thể được chụp bằng nhiễu xạ tia X với độ phân giải 1,9 Å cho thấy cấu trúc của IL6 bắt đầu từ 19 acid amin ở đầu N. Chuỗi xoắn dài đầu tiên (A) kéo dài từ Ser21 đến Ala45 và được nối với chuỗi xoắn B bằng một vòng xoắn 25 acid amin (A-B loop).

Đặc điểm cấu trúc của A-B loop được hình thành bởi cầu một nối disulfid (Cys44-Cys50) với 3 nhóm cấu trúc gồm vòng quay β-I (Ala68– Asp71), cầu nối disulfid (Cys73–Cys83) và vòng quay β-II (Gln75–Phe78). Chuỗi xoắn B (Glu80-Gln102) mang một đoạn nối chéo giữa các vòng xoắn B và C (B-C loop) mở rộng từ Asn103 đến Ser108. Chuỗi xoắn C (Glu109–Lys129) nối với chuỗi acid amin Leu133–Asp140 mang rãnh kỵ nước gồm Leu133, Ile136 và Pro139 và một chuỗi xoắn ngắn bổ sung (E) nằm bên ngoài bốn bó xoắn chính. Vòng xoắn E này được hình thành bởi các acid amin từ Pro141 đến Gln152.

Tiếp theo, các acid amin từ Gln156–Arg182 tạo thành chuỗi xoắn D, cuối cùng là hai acid amin ở đầu C của IL6 gồm Gln183 và Met184.3A mô tả cấu trúc không gian ba chiều của IL6 và Hình 1.3B định dạng các vị trí tương tác của IL6 với các thụ thể. Cấu trúc không gian ba chiều IL6 (A) và vị trí tương tác của IL6 với thụ thể (B) 6 1. Thụ thể IL6 (IL6R/IL6Rα) Thụ thể dạng gắn màng của IL6 (mIL6R) lần đầu tiên được xác định vào năm 1988 bởi Yamasaki và cộng sự. mIL6R là một protein với 468 acid amin gồm một peptid tín hiệu 19 acid amin, một vùng ngoại bào 339 acid amin, phần xuyên màng 28 acid amin và miền tế bào chất 82 acid amin.