ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, vai trò của các cytokin tiền viêm trong các đáp ứng miễn dịch ngày càng được quan tâm, hầu hết các phương pháp điều trị chống viêm mới đều hướng đến mục tiêu điều hòa mức độ các cytokin này. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng, nồng độ interleukin 6 (IL6) trong máu tăng cao là nguyên nhân chính gây ra các triệu chứng liên quan đến các bệnh lý viêm như bệnh Crohn, viêm khớp dạng thấp (RA), suy hô hấp cấp trong COVID-19 và ung thư. Các liệu pháp điều trị bằng thuốc sinh học là các kháng thể đơn dòng có khả năng ức chế đường truyền tín hiệu của IL6 như tocilizumab, salirumab, olokizumab đã và đang được phát triển.1,2 Trong bệnh lý viêm, IL6 đóng vai trò quyết định trong sự chuyển đổi từ viêm cấp tính sang viêm mạn tính bằng cách thay đổi bản chất sự tập trung bạch cầu tại ổ viêm từ bạch cầu trung tính đa nhân thành bạch cầu đơn nhân/đại thực bào.3 Ngoài ra, IL6 còn có tác dụng kích thích lên tế bào T và B, tạo điều kiện thuận lợi cho các phản ứng viêm mạn tính. Đường truyền tín hiệu của IL6 được hình thành khi IL6 kết hợp với thụ thể đặc hiệu IL6R dạng hòa tan tại vị trí I và thụ thể truyền tin glycoprotein130 (gp130) tại vị trí IIIa, từ đó kích hoạt các tín hiệu xuôi dòng như JAK/STAT và gây ra các bệnh lý liên quan.4,5 Trong bệnh lý ung thư, cytokin này được xác định như một dấu ấn sinh học ung thư thông qua việc sàng lọc các chất trung gian gây viêm.6 Khi đường truyền tín hiệu IL6/JAK/STAT3 tăng hoạt động một cách bất thường dẫn đến thúc đẩy sự tăng sinh, sống sót, xâm lấn và di căn của các tế bào, đồng thời ngăn chặn phản ứng miễn dịch chống khối u.7 Thông qua việc điều chỉnh các yếu tố tác động đến đường truyền tín hiệu IL6, cụ thể là vị trí tương tác giữa IL6 với IL6R (vị trí I) và gp130 (vị trí IIIa), các nhà nghiên cứu hướng tới cải thiện kết quả điều trị của bệnh nhân ung thư bằng cách tăng cường các đáp ứng hướng đích hiệu quả.8 Có thể thấy rằng, chiến lược điều trị viêm và ung thư nhắm vào mục tiêu IL6 là hữu hiệu, đặc biệt là hướng phát triển các thuốc có cấu trúc phân tử nhỏ sử dụng đường uống đang trở thành hướng nghiên cứu tiềm năng.
Trên đường truyền tín hiệu của IL6, các thế hệ thuốc cấu trúc phân tử nhỏ ức chế IL6 thông qua ức chế các janus kinase (JAKs) như tofacitinib, ruxolitinib, 2 baricitinib hay ức chế gp130 như bazedoxifen, raloxifen đã được phát triển,9 nhưng vẫn chưa có chất phân tử nhỏ nào ức chế thông qua gắn kết trực tiếp lên IL6 hoặc IL6R được công bố. Đa phần các nghiên cứu chỉ dừng lại ở thử nghiệm in vitro. Nguyên nhân có thể do các nghiên cứu trước thiếu thông tin về cấu trúc protein mục tiêu hoặc chọn protein không phù hợp, cũng như việc đánh giá ái lực gắn kết protein- phối tử chưa được chú trọng.10-12 Độc tính cũng như việc không thỏa các tiêu chí dược động học có thể là một trong những rào cản lớn cho các thuốc phân tử nhỏ. Sàng lọc in silico dựa trên cấu trúc protein mục tiêu kết hợp thử nghiệm lý sinh trên in vitro chính là nền tảng cho nghiên cứu tìm kiếm các các cấu trúc phân tử nhỏ ức chế IL6.
Bên cạnh đó, việc dự đoán các đặc tính dược động học giúp giảm thiểu được rủi ro cho các bước thử nghiệm tiền lâm sàng, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí cho nghiên cứu. Hiện nay, các cấu trúc 3D protein dạng đơn lẻ và phức hợp của IL6, IL6R đã được xác định và công bố trên ngân hàng dữ liệu protein (Protein databank – RCSB), theo đó mô hình hóa về sự tương tác giữa các protein này cũng ngày càng sáng tỏ.10-12 Thêm vào đó, sự phát triển của các thư viện cấu trúc phân tử nhỏ khiến cho hướng thiết kế thuốc ức chế IL6 dựa trên cấu trúc trở nên tiềm năng. Tuy nhiên, đa phần các nghiên cứu trước đây của Li,13 Zhou14 và Sato15 chỉ mới dừng lại ở giai đoạn docking, chưa tiến hành phân tích chi tiết tương tác linh động giữa protein-phối tử bằng phương pháp mô phỏng động lực học phân tử hoặc không tiến hành dự đoán các đặc tính dược động học cho thuốc phân tử nhỏ dùng đường uống như nghiên cứu của Sharma,16 điều này cũng có thể trở thành trở ngại lớn cho các thử nghiệm in vitro, in vivo. Vì vậy, để lấp đầy các khoảng trống của các nghiên cứu trước, nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu ―Nghiên cứu sàng lọc các cấu trúc phân tử nhỏ có khả năng gắn kết IL6, IL6R và đánh giá khả năng năng gắn kết bằng các phương pháp lý sinh‖, tập trung vào các nội dung cụ thể như sau: 1.
Sàng lọc in silico các chất gắn kết IL6, IL6R tại vị trí I từ các ngân hàng dữ liệu 2. Đánh giá in vitro các chất tiềm năng trên khả năng ức chế gắn kết phức hợp IL6/IL6R và khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thư qua trung gian IL6. Sàng lọc in silico các chất gắn kết IL6 tại vị trí IIIa từ các ngân hàng dữ liệu 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.
Interleukin 6 và đƣờng truyền tín hiệu 1. Họ interleukin 6 Họ cytokin IL6 thuộc nhóm cytokin bốn vòng xoắn và là một trong những họ cytokin lớn nhất, bao gồm IL6, IL11, yếu tố ức chế bệnh bạch cầu (LIF), oncostatin M (OSM), yếu tố dinh dưỡng thần kinh thể mi (CNTF), cytokin giống cardiotrophin (CLC), cardiotrophin -1 (CT-1) và IL27. Các cytokin này sử dụng chung thụ thể truyền tín hiệu gp130 thông qua các homodimer hoặc heterodimer gp130. Hoạt tính sinh học riêng biệt của các cytokin thuộc họ IL6 được kiểm soát bởi sự biểu hiện giới hạn của các thụ thể đặc hiệu (thụ thể α) cho từng loại cytokin.
Trong họ IL6, chỉ duy nhất IL11 có thể tạo thành với phức hợp hexameric IL11/IL11R/gp130 với 2 tiều đơn vị gp130 tương tự IL6, các cytokin còn lại chỉ liên kết với 1 tiểu đơn vị gp130 sau khi kết hợp với thụ thể đặc hiệu riêng cho từng cytokin.1 mô tả tương tác của các cytokin họ IL6 với các thụ thể với gp130 là thụ thể truyền tín hiệu chung. Sự kết hợp giữa interleukin họ IL6 với thụ thể đặc hiệu và thụ thể chung gp130 1. Interleukin 6 IL6 lần đầu tiên được xác định vào năm 1986 bởi Harino và cộng sự như một yếu tố kích thích tế bào B (BSF-2) giúp tăng cường sự biệt hóa của tế bào B, tạo hiệu ứng cho các tế bào sản xuất kháng thể, còn được gọi là IFN-β2. IL6 được tạo ra từ nhiều loại tế 4 bào bao gồm tế bào T và B, bạch cầu đơn nhân, tế bào nội mô, nguyên bào sợi, tế bào sừng, tế bào trung mô, tế bào mỡ và một số tế bào khối u.
IL6 liên kết với TGF-β (yếu tố tăng trưởng chuyển dạng beta) tạo ra sự biệt hóa của các tế bào T CD4+ sơ cấp thành các tế bào Th17, nhưng IL6 lại ức chế sự phát triển của tế bào T điều hòa (Treg). Sự mất cân bằng giữa tế bào Th17 và tế bào Treg chính là nguyên nhân gây ra rối loạn điều hòa các phản ứng miễn dịch, phát triển các bệnh tự miễn và viêm. IL6 đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh phản ứng viêm cấp tính, tạo máu, kiểm soát trao đổi chất, tái tạo gan, chuyển hóa xương và tiến triển ung thư thông qua việc tác động lên các tế bào tương ứng.2 mô tả hoạt tính sinh học của IL6 trên các tế bào khác nhau. Chức năng sinh học của interleukin 6 đối với các tế bào liên quan Trong phản ứng viêm cấp tính, IL6 kích thích tế bào gan sản xuất các protein giai đoạn cấp tính (APP) như protein phản ứng C (CRP), fibrinogen, amyloid huyết thanh A (SAA) và hepcidin.
Nồng độ cao của amyloid A và hepcidin trong huyết thanh gây ra bệnh amyloidosis và thiếu máu do viêm. Trong tủy xương, IL6 tạo ra các tế bào megakaryocyte (tế bào nhân lớn) trưởng thành, chịu trách nhiệm sản xuất tiểu cầu và thúc đẩy hoạt hóa tế bào gốc tạo máu. Ngoài ra, IL6 còn thúc đẩy sự biệt hóa hủy cốt bào, tạo mạch, tăng sinh tế bào sừng, tế bào trung mô và sự phát triển u tủy.20 5 Gen IL6 nằm trên nhiễm sắc thể 7p21 chứa 4 intron và 5 exon. Cấu trúc không gian ba chiều của IL6 có thể được hình dung dưới dạng một chuỗi đơn bao gồm bốn chuỗi xoắn riêng biệt, được dán nhãn A, B, C và D.
Ngoài ra, còn tồn tại một chuỗi xoắn ngắn E thứ năm nằm bên ngoài bó A-D, lồng vào nhau giữa các vòng xoắn C và B. Sự định hướng của các vòng xoắn cho thấy sự sắp xếp song song với các vòng xoắn A và B chạy theo hướng ngược lại với các vòng xoắn C và D, mang lại đặc điểm cấu trúc đặc biệt cho IL6. Cấu trúc tinh thể được chụp bằng nhiễu xạ tia X với độ phân giải 1,9 Å cho thấy cấu trúc của IL6 bắt đầu từ 19 acid amin ở đầu N. Chuỗi xoắn dài đầu tiên (A) kéo dài từ Ser21 đến Ala45 và được nối với chuỗi xoắn B bằng một vòng xoắn 25 acid amin (A-B loop).
Đặc điểm cấu trúc của A-B loop được hình thành bởi cầu một nối disulfid (Cys44-Cys50) với 3 nhóm cấu trúc gồm vòng quay β-I (Ala68– Asp71), cầu nối disulfid (Cys73–Cys83) và vòng quay β-II (Gln75–Phe78). Chuỗi xoắn B (Glu80-Gln102) mang một đoạn nối chéo giữa các vòng xoắn B và C (B-C loop) mở rộng từ Asn103 đến Ser108. Chuỗi xoắn C (Glu109–Lys129) nối với chuỗi acid amin Leu133–Asp140 mang rãnh kỵ nước gồm Leu133, Ile136 và Pro139 và một chuỗi xoắn ngắn bổ sung (E) nằm bên ngoài bốn bó xoắn chính. Vòng xoắn E này được hình thành bởi các acid amin từ Pro141 đến Gln152.
Tiếp theo, các acid amin từ Gln156–Arg182 tạo thành chuỗi xoắn D, cuối cùng là hai acid amin ở đầu C của IL6 gồm Gln183 và Met184.3A mô tả cấu trúc không gian ba chiều của IL6 và Hình 1.3B định dạng các vị trí tương tác của IL6 với các thụ thể. Cấu trúc không gian ba chiều IL6 (A) và vị trí tương tác của IL6 với thụ thể (B) 6 1. Thụ thể IL6 (IL6R/IL6Rα) Thụ thể dạng gắn màng của IL6 (mIL6R) lần đầu tiên được xác định vào năm 1988 bởi Yamasaki và cộng sự. mIL6R là một protein với 468 acid amin gồm một peptid tín hiệu 19 acid amin, một vùng ngoại bào 339 acid amin, phần xuyên màng 28 acid amin và miền tế bào chất 82 acid amin.