ĐẶT VẤN ĐỀ Flavonoid là một nhóm hợp chất polyphenol, đƣợc phân bố rộng khắp thế giới. Hợp chất này đóng vai trò đáng kể trong dƣợc học khác nhau bao gồm: phòng ngừa bệnh tim mạch vành, chống viêm, và các hoạt động chống ung thƣ, quercetin và rutin có hoạt tính chống oxy hóa, loại bỏ gốc tự do [13], [20]. Hòe hoa đặc biệt là nụ Hòe chứa hàm lƣợng rutin khá cao, hoạt chất có tác dụng giảm nhồi máu não, chống viêm, làm giảm quá trình oxy hóa lipoprotein tỷ trọng thấp, chống xuất huyết, chống đông máu, chống dị ứng, chống cục máu đông, bảo vệ gan, chống co thắt và chống ung thƣ [12], [13], [18]. Định lƣợng flavonoid rutin trong nụ Hòe đã đƣợc một số tác giả trên thế giới thực hiện.
Tuy nhiên tại Việt Nam chƣa có nhiều công trình nghiên cứu định lƣợng rutin trong nụ Hòe bằng kỹ thuật HPLC. Dƣợc điển Việt Nam IV định lƣợng rutin bằng phƣơng pháp so màu. Đề tài này đƣợc thực hiện nhằm mục tiêu xây dựng quy trình định lƣợng rutin trong nụ Hòe bằng kỹ thuật (HPLC), một công cụ phân tích ƣu tiên cho định tính và định lƣợng các hợp chất trong các loại thuốc thảo dƣợc vì có độ nhạy, độ chính xác, độ đặc hiệu cao. Phƣơng pháp HPLC là một phƣơng pháp thích hợp để định lƣợng của các thành phần hóa học có trong nguyên liệu đa thành phần trong thực vật [10], [30], [24].
Nhằm góp phần nâng cao tiêu chuẩn kiểm định chất lƣợng cho nguồn nguyên liệu nụ Hòe rất phong phú và có giá trị sinh học này, chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình định lượng rutin trong nụ Hòe bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” với các mục tiêu cụ thể nhƣ sau: Khảo sát các điều kiện để xây dựng quy trình định lƣợng rutin trong nụ Hòe bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Thẩm định quy trình theo các yêu cầu của ICH [16]. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. TỔNG QUAN VỀ CÂY HÒE 2.
Đặc điểm thực vật 2. Tên và vị trí trong giới thực vật Tên Việt Nam: Hòe. Tên khác: Hòe hoa, hòe mễ, lài luồng (Tày). Tên khoa học: Styphnolobium japonicum (L.
Tên đồng nghĩa: Sophora japonica L. Tên nƣớc ngoài: Japanese pagoda – tree, Chinese scholar tree (Trung Quốc), Umbrella tree (Anh), Sophora (Pháp). Thuộc họ đậu: Fabaceae [5]. Theo hệ thống phân loại thực vật Takhtajan A.
(2009), cây Hòe Styphnolobium japonicum (L.) Schott có vị trí phân loại nhƣ sau [28]: Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp hoa hồng (Rosidae) Bộ Đậu (Fabales) Họ Đậu (Fabaceae) Phân họ Đậu (Faboideae) Chi Styphnolobium Hòe (Styphnolobium japonicum (L. Mô tả thực vật chi Styphnolobium Chi là loài cây thân gỗ nhỏ và cây bụi trong phân họ Đậu (Faboideae) của họ Đậu (Fabaceae). Thân có vỏ hơi nứt nẻ, có đốm trắng, có lông, cành nằm ngang, trơn tăng trƣởng nhanh. Lá kép lông chim lẻ, mọc so le, lá sớm rụng, lá kèm rất nhỏ.
Hoa mọc thành chùm ở nách, rủ xuống, hiếm ở đầu cuối và hoa có hình chùy; cuống nhỏ. Đài hoa có lông, tiền khai van, đài hoa ngắn hoặc gần trục. Tràng hoa cánh ngắn, tiền khai cờ, phiến gần tròn thùy ngắn, cánh hoa cong lên ở mép, cánh cờ rộng. Quả đậu, hình bầu dục hoặc gần tròn.
Hạt hình đậu hơi dẹt. Rễ không có khả năng tạo ra mối quan hệ cộng sinh với vi khuẩn nốt rễ (vi khuẩn cố định đạm) trên rễ của chúng (chi Sophora có đặc điểm này). Chi Styphnolobium có số nhiễm sắc thể 2n = 28, Styphnolobium japonicum (L.) Schott có số nhiễm sắc thể 2n = 28 (trong khi chi Sophora có số nhiễm sắc thể 2n = 18). Do đó, Styphnolobium japonicum (L.) Schott đƣợc phân loại thuộc chi Styphnolobium thay vì chi Sophora theo những báo cáo trƣớc đây [32], [33].
Mô tả thực vật Styphnolobium japonicum (L.) Cây Hòe là một cây to cao 5 – 7 m, có khi đến 10 m. Thân có vỏ hơi nứt nẻ và thân nằm ngang, cành hình trụ, nhẵn, màu lục nhạt, trên có những chấm trắng, có lông mịn màu trắng. Lá kép lông chim lẻ mọc so le, gồm 13 – 15 lá chét mọc đối, các cặp lá chét to dần về phía ngọn cuống. Lá chét hình bầu dục gốc tròn thuôn nhọn hai đầu, mép nguyên, hơi có lông, màu xanh đậm ở mặt trên và màu lục nhạt nhất là ở mặt dƣới, dài 3 – 4,5 cm, rộng 1,2 – 2 cm; gân lông chim, gân chính nổi rõ ở mặt dƣới, 3 – 5 cặp gân phụ, có ít lông màu nâu trên gân; cuống phình dài 2 – 2,5 mm.
Hoa mọc thành cụm hoa kép. Cụm hoa mọc ở đầu cành thành chùm dài 20 cm, phân nhánh nhiều, hoa nhỏ màu trắng hoặc vàng nhạt. Hoa lƣỡng tính, không đều, mẫu 5. Cuống hoa màu xanh, dài 2 mm, có lông nâu.
Lá bắc nhỏ, dạng vảy rụng sớm để lại 4 một vết màu nâu. Đài hoa: 5 lá đài màu xanh, không đều, dính nhau tạo thành ống dài 3 mm, mặt ngoài các lá đài có lông, tiền khai van. Tràng hoa: 5 cánh hoa rời, tiền khai cờ, mỗi cánh có 1 gân chính và nhiều gân phụ màu xanh; 2 cánh bên màu trắng xanh, móng ngắn 3 mm màu tím, phiến dài 7 – 8 mm, rộng 3 – 4 mm; 2 cánh trƣớc trắng xanh tạo thành lƣờn, rời, móng ngắn 2,5 – 3 mm màu tím, phiến dài 8 – 9 mm, rộng 4 – 5 mm. Bộ nhị: 10 nhị rời đính trên một vòng, không đều, chỉ nhị màu trắng, dạng sợi cong ở gần ngọn, dài 9 – 13 mm; bao phấn màu vàng, thuôn dài, 2 ô, hƣớng trong, nứt dọc, đính giữa; hạt phấn rời, hình hạt gạo, màu vàng có rãnh, dài 20 – 22,5 µm.
Bộ nhụy: 2 lá noãn, bầu trên 1 ô màu xanh, có lông màu nâu, nhiều noãn đính mép; vòi nhụy màu trắng, dài 3 mm. Quả đậu, dài 4 – 9 cm, không mở, thắt lại thành từng khúc (2 – 6 khúc) không đều nhau, mỗi khúc hình bầu dục hoặc gần tròn; quả non màu vàng chanh, nhẵn bóng, có nhựa mủ; quả già khô xác, màu nâu vàng, nhăn nheo. Hạt hình hạt đậu, màu xanh, hơi dẹt dài 1 – 1,2 cm, rộng 0,7 – 0,8 cm, không nội nhũ, vỏ hạt màu đen bóng [3], [5]. Hình lấy từ trang nzdl.
Cây Hòe Styphnolobium japonicum (L. Phân bố sinh thái Chi Stypnolobium gồm hầu hết là cây bụi hay cây gỗ, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Cây Hòe đƣợc định danh và công bố đầu tiên ở Nhật Bản, ngoài ra còn phân bố ở nhiều nơi nhƣ: Trung Quốc, Ý, Mỹ (Washington, Denver, Cleveland, Philadelphia) …[19]. Ở Việt Nam Hòe đƣợc trồng rộng rãi ở các tỉnh phía bắc, Tây Nguyên, ven biển miền Trung.
Những tỉnh trồng nhiều hòe hiện nay là Thái Bình, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Nam, Lai Châu (vùng Điện Biên), Sơn La, Vĩnh Phúc, Bắc Giang … Hòe thuộc cây gỗ trung sinh, ƣa sáng và ƣa ẩm. Vài năm trở lại đây, cây đƣợc trồng có kết quả tốt ở cả vùng đồi, đất cao nguyên ở Mộc Châu, Điện Biên, Đắc Lắc, hoặc ở đất mới khai hoang vùng Tam Điệp (Ninh Bình). Nhiệt độ không khí trung bình khoảng 23 – 26 0C. Những cây trồng ở Trại thuốc Tam Đảo phát triển kém hơn cây trồng ở vùng đồi trung du và đồng bằng [5], [3].
Thu hái chế biến Sau 3 – 4 năm bắt đầu thu hoạch. Cây càng sống lâu, càng những năm sau thu hoạch càng cao. Hoa phải hái lúc còn nụ mới chứa nhiều hoạt chất, phơi hay sấy khô [3], [5]. Bộ phận dùng Chủ yếu là nụ hoa đã phơi hoặc sấy nhẹ đến khô, và các bộ phận khác nhƣ hoa đã nở (hòe hoa), quả (hòe giác), lá và rễ đã đƣợc phơi hoặc sấy khô [3], [5].
Thành phần hóa học Thành phần hóa học trong nụ Hòe phức tạp, chủ yếu gồm: flavonoid, saponin triterpenoid, tinh dầu… 2. Một số thành phần hóa học trong nụ Hòe. Bộ phận Flavonoid Rutin, genistin, sophoricosid, sophorabiosid, Sophoraflavonolosid, genistein 7,4’-di-O-β-D-glucopyransoid, Kaempferol 3-O-α–L- Nụ hoa rhamnopyranosyl (1-6) β-D-glucopyranosyl (1-2) β-D- glucopyranosid [11]. Trifolirhizin, Glycitin, Ononin, 5-hydroxypseudobaptigenin-7-O- Thân cây glucosid, Calycosin-7-O-glucosid, Paratensein-7-O-glucosid, glycitein-4’-O-β-D-glucosid, daidzein, puerol A, calycosin [26].
Rutin Trifolirhizin 5-hydroxypseudobaptigenin-7-O-glucosid 7 R1 R2 R3 R4 R5 H CH3 H H glucose Ononin H H H OC glucose Glycitin H3 OH CH3 H H glucose Calycosin-7-O- glucosid OH CH3 OH H glucose Paratensein-7-O- glucosid H glucose H OC OH Glycitein-4’-O- H3 β-D-glucosid H H OH H glucose Genistin H glucose OH H H Sophoricosid H glucose OH H H Sophorabiosid (2-1) rhamnose H glucose OH H glucose Genistein 7,4’- di-O-b-D- glucopyransoid R1 R2 glucose (2-1) glucose H Sophoraflavonoloside glucose (2-1) glucose H Kaempferol 3-O-a–L- (6-1) rhamnose rhamnopyranosyl(1R6)b- D-glucopyranosyl(1R2)b- D-glucopyranoside. Cấu tr c ột số f avonoid trong c Hòe. Puerol A 8 R1 R2 R3 R4 R5 H OH H H OH Daidzein OH OCH3 H H OH Calycosin Hình 2. Một số isof avonoid g cosid trong c Hòe.
R = glucose: Genistein 7-O-β-D-glucopyranosid-4′-O-(6′′′-O-α-L-rhamnopyranosyl)-β- sophorosid. R = rhamose: Genistein 7-O-α-D-glucopyranosid-4′-O-(6′′′-O-α-L-ramnopyranosyl)-β- sophorosid. Cấu tr c ột số isoflavonoid trong cây Hòe. Saponin triterpenoid Các saponin triterpenoids có trong nụ Hòe gồm các chất: Betulin là dẫn chất triterpenoid nhóm lupan , Sophoradiol là dẫn chất của nhóm olean, Azukisaponinl I, II, V chiếm tỷ lệ lần lƣợt là 0,033%, 0,030%, 0,013%, Soyasaponin I, III chiếm tỷ lệ lần lƣợt là 0,033%, 0,032%, và Kaikasaponin I, II, III chiếm tỷ lệ lần lƣợt là 0,042%, 0,025%, 0,036% [34].
9 R1 R2 R3 4 H OH H Azukisaponin V 4a CH3 OH H 5 H H OH Soyasaponin I 5a CH3 H OH R1 R2 R3 R4 7 H H OH H Kaikasaponin 7a CH3 H OH H II 7b CH3 CH3 OCH3 H 8 H H H OH Kaikasaponin 8a CH3 H H OH III 8b CH3 CH3 H OCH3 R1 R2 R3 R4 1 H OH H CH3 Azukisaponin 1a CH3 OH H CH3 I 2 H OH H CH2OH Azukisaponin 2a CH3 OH H CH3OH II 3 H H OH CH2OH Soyasaponin 3a CH3 H OH CH2OH III 10 R1 R2 6 H H 6a CH3 H Kaikasaponin I 6b CH3 CH3 Hình 2. Một số saponin trong c Hòe. Tinh dầu Các tinh dầu có trong nụ Hòe gồm các chất: Linalool – 38,1 mg/kg, hexahydrofarnesylaceton – 40,5 mg/kg, eugenol – 61,9 mg/kg, acid nonanoic – 26,1 mg/kg, acid decanoic – 18,6 mg/kg, acid dodecanoic – 68,4 mg/kg, acid tetradecanoic – 29,0 mg/kg, acid linoleic – 21,3 mg/kg [23]. Tác dụng tăng cường sức đề kháng, giảm thẩm thấu của mao mạch Rutin và quercetin đều có tác dụng tăng cƣờng sức đề kháng, điều trị các bệnh lý có liên quan đến rối loạn vi tuần hoàn, giảm tính thẩm thấu của mao mạch, hồi phục tính đàn hồi của mao mạch đã bị tổn thƣơng.