ĐẶT VẤN ĐỀ Vấn đề an toàn thực phẩm đang thu h t rất nhiều sự quan tâm. Trong đó, ngộ độc do nhiễm nội độc tố đƣợc sinh từ các chủng nấm mốc Aspergillus sp. và Penicillium sp., ngày càng gia tăng. Các nội độc tố bao gồm nhiều dạng, đặc biệt đƣợc quan tâm vì khả năng gây độc cao hơn các loại khác là Ochratoxin A (OTA) và Aflatoxin B1 (AFB1).
Theo phân loại các chất có khả năng gây ung thƣ cho ngƣời và động vật, AFB1 đƣợc ghi nhận thuộc nhóm gây ung thƣ nhóm 1, độc tính trên gan, mật; OTA đƣợc xếp vào nhóm 2B có khả năng gây ung thƣ cho ngƣời và động vật. Kết quả nghiên cứu trên các bệnh nhân ung thƣ gan điều trị tại Hà Nội phát hiện có AFB1 trong tổ chức gan của hơn 83% bệnh nhân. Theo các tác giả, bệnh ung thƣ gan nguyên phát ở Việt Nam liên quan chặt chẽ v i nhiễm AFB1 qua thực phẩm. [14] Trong các thực phẩm chiếm sản lƣợng l n, cà phê là một thức uống rất thông dụng và đƣợc yêu thích bởi nhiều lợi ích cho sức khỏe, nhƣng bị phát hiện v i khả năng gây ngộ độc bởi các nội độc tố, đặc biệt là ung thƣ gan và thận.
Nội độc tố chính đƣợc nghiên cứu nhiều trên cà phê là OTA. Tuy nhiên, những nghiên cứu về nội độc tố AFB1 trên cà phê vẫn còn hạn chế, mặc dù đây là nội độc tố có độc tính cao và khá phổ biến. Nghiên cứu của C. Magnoli và cộng sự cho thấy 25% của 100 mẫu cà phê bị nhiễm A.
Mức nhiễm OTA dao động 2,7 – 14 ppb và AFB1 9,5 – 17,5 ng/g sợi nấm. [25] Từ đó cho thấy, nội độc tố AFB1 vẫn đƣợc phát hiện trong cà phê nhƣng vẫn chƣa đƣợc quan tâm nghiên cứu. Và đến nay vẫn chƣa tìm thấy các nghiên cứu phân tích đồng thời OTA và AFB1 trên hạt cà phê ở Việt Nam. 2 Để kiểm soát mức độ nhiễm các nội độc tố này, các nƣ c trên thế gi i kể cả Việt Nam đã phát triển nhiều phƣơng pháp phân tích.
Các phƣơng pháp bao gồm sắc ký l p mỏng (TLC) [16], [24], [50], miễn dịch huỳnh quang (ELISA) [16] và sắc ký lỏng hiệu năng cao v i đầu dò huỳnh quang (LC-FD) [12], [13], [19], [21], [22]. Trong đó, phƣơng pháp LC-FD đƣợc sử dụng khá phổ biến, đây là phƣơng pháp đƣợc đƣa vào hƣ ng dẫn trong AOAC và TCVN. Phép phân tích này cho độ nhạy và độ chính xác cao, tuy nhiên nhƣợc điểm của phƣơng pháp cần thiết phải tạo dẫn xuất thích hợp, qua nhiều bƣ c xử lý mẫu, thiết bị cũng không quá phổ biến và phân tích vết đồng thời nhiều thành phần lại càng gặp khó khăn về tính đặc hiệu, độ nhạy của phƣơng pháp. Trong các kỹ thuật phân tích hiện đại, sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ (LC-MS/MS) đƣợc ứng dụng ngày càng nhiều trong phân tích vết, cho phép phân tích đồng thời nhiều chất v i độ nhạy, độ chính xác cao, đặc biệt đây là phƣơng pháp đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu nhằm khẳng định lại kết quả cho các phƣơng pháp khác nhƣ ELISA và LC-FD.
[29] Xuất phát từ nhu cầu trên, việc phát triển quy trình phân tích đồng thời 2 loại nội độc tố phổ biến và có độc tính cao OTA và AFB1 trong cà phê bằng phƣơng pháp LC-MS/MS có tính m i và rất cần thiết. Vì thế, ch ng tôi tiến hành đề tài: "Nghiên cứu xây dựng quy trình định lƣợng Ochratoxin A và Aflatoxin B1 trong hạt cà phê bằng phƣơng pháp LC-MS/MS”. Với mục tiêu: 1. Nghiên cứu xây dựng và thẩm định quy trình định lƣợng đồng thời Ochratoxin A và Aflatoxin B1 trong hạt cà phê bằng phƣơng pháp LC- MS/MS.
Ứng dụng quy trình đã thẩm định để xác định hàm lƣợng nội độc tố Ochratoxin A và Aflatoxin B1 trong hạt cà phê đƣợc thu thập tại Thành Phố Cần Thơ. 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về nội độc tố Ochratoxin A và Aflatoxin B1 1. Ochratoxin A Nội độc tố Ochratoxin là một sản phẩm chuyển hoá thứ cấp của một số loài nấm mốc Aspergillus ochraceus và Penicillium verrucosum.
Ochratoxin có mặt trong khắp các loại nông sản thực phẩm: ngũ cốc, thảo dƣợc, bia, cà phê. trong các sản phẩm có nguồn gốc động vật do bị lây nhiễm trƣ c. Về cấu tr c, tất cả các nội độc tố Ochratoxin đều là dẫn xuất của isocoumarin, liên kết v i -phenylalanin. Có tổng cộng 4 dạng Ochratoxin đã đƣợc tìm thấy, bao gồm Ochratoxin A, Ochratoxin B, Ochratoxin C và Ochratoxin α.
Trong đó, Ochratoxin A (OTA) là nội độc tố phổ biến nhất trong nhóm các Ochratoxin. OTA lần đầu tiên đƣợc tìm thấy ở nấm mốc A. ochraceus vùng Nam Phi bởi Scott (1965) trên hạt l a bị nhiễm A. Khối lƣợng phân tử: 403,8 g/mol.
Cấu tr c hóa học của Ochratoxin A (Nguồn: The Chemistry of Mycotoxins, năm 2013 [49]) 4 OTA có tinh thể không màu, bền v i nhiệt và có thể phát huỳnh quang màu xanh lá hoặc xanh dƣơng dƣ i tác động của tia cực tím (UV). Dạng acid (xanh lá) ở max = 213 nm và dạng kiềm (xanh dƣơng) ởmax = 332 nm. OTA ít tan trong nƣ c ở điều kiện pH có tính acid và trung tính, nhƣng hòa tan trong đệm carbonat loãng và hầu hết các dung môi hữu cơ nhƣ cloroform, ethanol, methanol, và xylen. OTA dễ bị phân hủy bởi ánh sáng, điều kiện ẩm ƣ t, trong môi trƣờng kiềm hoặc chất tẩy rửa, nhƣng đặc biệt ổn định trong dung dịch ethanol trong bóng tối.
Nội độc tố đƣợc sản sinh nhiều nhất ở nhiệt độ từ 20 – 25°C. Sự sản sinh OTA phụ thuộc chủng nấm mốc, hoạt tính của nƣ c trong hạt, cơ chất, nhiệt độ. OTA rất bền vững v i các xử lý nhiệt nên ổn định trong hầu hết các điều kiện chế biến thực phẩm. Chỉ trong điều kiện làm nóng cực độ thì xảy ra một số phân hủy.
[1], [52], [49] * Độc tính – Cơ chế tác động Độc tính của OTA đã đƣợc rất nhiều nhà khoa học tiến hành nghiên cứu. Cơ quan quốc tế về Nghiên cứu Ung thƣ (IARC) xếp loại OTA vào nhóm 2B có khả năng gây ung thƣ cho ngƣời và động vật [52]. Các nghiên cứu đều cho thấy rằng phân tử này có thể có nhiều tác dụng nhƣ gây độc trên thận, gan, thần kinh, gây quái thai và bệnh lý miễn dịch. Nội độc tố nấm mốc ít khi gây ra ngộ độc cấp tính, nó gây hại cơ thể từ từ, do đó làm cho ch ng ta không hề hay biết.
Nhƣng khi phát sinh triệu chứng thì những cơ quan bộ phận ch ng tấn công đã hƣ hại nghiêm trọng và khó chữa trị. Liều gây chết trên heo: LD50 1 – 6 mg/kg, ở gà: LD50 3,6 mg/kg đối v i gà con 10 ngày tuổi. Đánh giá đƣợc thực hiện bởi Ủy ban chuyên gia FAO/ WHO về thực phẩm (JECFA) đã thiết lập lƣợng tiêu thụ hàng tuần tạm thời cho phép của OTA 112 ng/kg trọng lƣợng cơ thể, trong đó 12% lƣợng OTA thuộc về cà phê. [53] 5 Cơ chế tác động của OTA là gây ức chế sự vận chuyển của acid ribonucleic (tRNA) và các acid amin.
Tác động làm ức chế sự tổng hợp protein trong tế bào và cơ thể. Sự ức chế miễn dịch của OTA đƣợc biểu hiện làm giảm thực bào và ức chế tế bào lympho. Tác động đến các tế bào màng ti thể và gây ra các hiệu ứng khác nhau trên ti thể. Kích thích sự hình thành DNA trong thận, gan và lá lách.
Các DNA này là các sợi đơn bị phá vỡ. Bệnh thận là ảnh hƣởng độc hại l n nhất của OTA. Thận sƣng to làm cho việc đào thải chất độc ra khỏi cơ thể trở nên hết sức khó khăn, từ đó làm cho triệu chứng ngộ độc trở nên trầm trọng. Gây tổn thƣơng tế bào gan: tất cả các trƣờng hợp xác định sự ngộ độc OTA đều có bệnh tích giống nhau ở chỗ gan bị hƣ hại nặng.
Tùy theo mức độ nhiễm ít hay nhiều, lâu hay mau mà tình trạng bệnh trên gan khác nhau. Biểu hiện chung là ban đầu gan động vật (điển hình là gà) biến thành màu vàng tƣơi, mật sƣng, sau đó gan sƣng phồng và bắt đầu nổi các mụn nhỏ trên bề mặt làm cho nó gồ ghề, đôi khi có những nốt hoại tử màu trắng, sau cùng do nhiễm khuẩn mà gan trở nên bở và dễ vỡ. Độc tính thần kinh: ở chuột gây ra nhiều dị dạng trong hệ thần kinh trung ƣơng, độc đối v i các tế bào thần kinh và có thể tiếp cận bất cứ l c nào v i mô thần kinh (não, võng mạc). Gây ung thƣ: OTA đƣợc dự đoán là một chất gây ung thƣ ở con ngƣời dựa trên bằng chứng đầy đủ về khả năng gây ung thƣ ở động vật thí nghiệm.
Khi nhiễm phân tử này trong thức ăn có liên quan đến các khối u tế bào gan, khối u ở thận (u nang thận và các tế bào thận), u xơ gan (một số biểu hiện cấu tr c của phôi) và các nốt gan hạch to ở chuột đực. Trong một nghiên cứu khác, sử dụng OTA trong ung thƣ biểu mô tế bào và u nang gây ra ở chuột cái. Việc sử dụng OTA ở chuột nhắt đã làm tăng tỉ lệ mắc u nang tế bào thận và ung thƣ biểu mô tuyến giáp; hơn nữa, di căn của khối u tế bào thận cũng đƣợc quan 6 sát thấy ở chuột. OTA làm tăng tỉ lệ và sự đa dạng của u xơ v ở những con chuột cái.
Tuy nhiên, không có nghiên cứu đầy đủ trên ngƣời về mối quan hệ giữa OTA và ung thƣ đƣợc báo cáo. Theo EC 466/2001 của The European Commission, đƣa ra mức quy định gi i hạn cho nội độc tố OTA trong hạt cà phê rang là 5 µg/Kg. [29] Nội dung quy định trong QCVN số 8-1: 2011/BYT - Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối v i gi i hạn ô nhiễm nội độc tố vi nấm trong thực phẩm, do ban soạn thảo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về gi i hạn ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm biên soạn, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm trình duyệt và đƣợc ban hành theo Thông tƣ số 02/2011/TT-BYT ngày 13 tháng 01 năm 2011 của Bộ trƣởng Bộ Y tế, đã quy định về gi i hạn nội độc tố Ochratoxin A trong các loại thực phẩm. Aflatoxin B1 Các Aflatoxin đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào những năm 1960 và đƣợc xác định là độc tố sinh ra từ nấm Aspergillus flavus.
Sau đó, Aflatoxin cũng đƣợc tìm thấy ở một số loài Aspergillus khác và Penicillium. Tên "Aflatoxin" là viết tắt của độc tố (Aspergillus flavus Toxins).