MỞ ĐẦU Bệnh gút là bệnh viêm khớp do vi tinh thể, đặc trưng bởi những đợt viêm khớp cấp tái phát, có lắng đọng tinh thể muối urat natri trong các mô, gây ra do rối loạn chuyển hóa nhân purin tăng acid uric trong máu [3]. Với người bị bệnh gút, khi nồng độ acid uric quá cao, những tinh thể nhỏ của acid uric được hình thành, tập trung lại ở khớp đặc biệt là các khớp ở ngón chân cái, gây viêm, sưng và đau đớn cho bệnh nhân. Tuy nhiên, gút là bệnh lành tính và có thể phòng ngừa và khống chế bằng thuốc cũng như thay đổi chế độ ăn [3]. Trong nội khoa, các thuốc dùng trong điều trị bệnh gút bao gồm các thuốc chống viêm (colchicin, NSAIDs, corticoid), thuốc làm giảm acid uric máu (gồm nhóm ức chế tổng hợp acid uric và nhóm tăng đào thải acid uric).
Allopurinol là thuốc thuộc nhóm ức chế tổng hợp acid uric, được chỉ định khi tình trạng viêm khớp đã thuyên giảm [2], [3], [8]. Allopurinol được Hội Thấp khớp học Hoa Kỳ (ACR) khuyến cáo là thuốc được lựa chọn đầu tiên trong điều trị gút trong hướng dẫn năm 2020 và cũng là thuốc duy nhất được khuyến cáo đầu tiên trong điều trị gút cho tất cả các bệnh nhân mắc bệnh từ giai đoạn 3 trở lên có bệnh thận mạn tính [15]. Thuốc này có trong Danh mục thuốc thiết yếu tân dược ban hành lần thứ VI năm 2013 và Danh mục thuốc tân dược thuộc phạm vi thanh toán của quỹ bảo hiểm y tế năm 2015 [4], [5]. Thị trường Việt Nam đang lưu hành allopurinol dạng generic với nhiều biệt dược khác nhau, có giá thành thấp hơn so với thuốc phát minh.
Theo định hướng phát triển y tế để đảm bảo an sinh xã hội và quyền lợi của người bệnh, cần tiến hành đánh giá khả năng thay thế thuốc phát minh bằng thuốc tương đương thông qua thử nghiệm chứng minh tương đương sinh học với thuốc phát minh, đòi hỏi phương pháp định lượng allopurinol và oxypurinol trong huyết tương người có độ nhạy, độ đặc hiệu và độ chính xác phù hợp. Với liều dùng hằng ngày của allopurinol trong điều trị từ 100 mg đến tối đa 800 mg, nồng độ tối đa của allopurinol và chất chuyển hoá oxypurinol lên đến 2-5 µg/mL [2], [8], [10], [16] là có thể định lượng bằng HPLC- UV. Liều lượng allopurinol hằng ngày dựa vào nồng độ acid uric máu và khi sử dụng thuốc cần lưu ý theo dõi chặt chẽ tác dụng phụ trong những ngày đầu dùng thuốc, thậm chí sau 1-2 tuần [2], [3], [8], [15]. Có nhiều yếu tố như tuổi, giới tính, hút thuốc lá và di truyền có liên quan đến nồng độ acid uric trong máu [6], [22], [24].
Hiện nay, đã bắt đầu có nghiên cứu tại Việt Nam nhằm so sánh các biến thể gen ở người bình thường so với bệnh nhân gút, tìm ra yếu tố nguy cơ gây bệnh và dự đoán đáp ứng với các liệu pháp điều trị giảm acid uric máu [6], cần có các thông tin về gen, nồng độ acid uric, nồng độ thuốc điều trị trong huyết tương bệnh nhân gút, từ đây yêu cầu một phương pháp định lượng allopurinol và chất chuyển hóa có hoạt tính là oxypurinol trong huyết tương người bệnh gút trong các nghiên cứu này. Trên thế giới đã có một số công trình định lượng đồng thời allopurinol và oxypurinol trong huyết tương bằng các kỹ thuật khác nhau như LC-UV, LCMS/MS, UPLC-MS/MS [10], [11], [14], [16], [17], [18], [20], [26]. Tuy nhiên, cho đến nay chưa có phương pháp định lượng đồng thời allopurinol và chất chuyển hóa oxypurinol trong huyết tương người được công bố ở Việt Nam. Vì những lý do trên, đề tài “Xây dựng quy trình định lượng đồng thời allopurinol và chất chuyển hóa oxypurinol trong huyết tương người bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao” được thực hiện để góp phần vào việc nghiên cứu dược động học của allopurinol trên bệnh nhân gút tại Việt Nam cũng như đánh giá tương đương sinh học của các chế phẩm chứa allopurinol đang lưu hành.
Mục tiêu cụ thể của đề tài là: - Khảo sát điều kiện sắc ký thích hợp cho việc định lượng đồng thời allopurinol và chất chuyển hóa oxypurinol trong huyết tương người bằng phương pháp HPLC. - Lựa chọn IS đạt yêu cầu và khảo sát phương pháp xử lý mẫu huyết tương. - Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời allopurinol và oxypurinol trong huyết tương người bằng phương pháp HPLC theo hướng dẫn của US-FDA và EMA hiện hành.1 Tổng quan về allopurinol và oxypurinol 1.1 Công thức cấu tạo allopurinol Công thức phân tử: C5H4N4O Danh pháp IUPAC: 1,5-dihydro-4H-pyrazolo[3,4-d] pyrimidin-4-on [1]. Tên khác: 1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-ol [30]; Alopurinol [2].
Khối lượng phân tử: 136,11 g/mol [1], [29]. Tính chất lý hóa: - Bột trắng hay gần như trắng [1], [30]. - Độ tan: 80,0 mg/dL nước, tan tốt hơn trong môi trường kiềm [30]. - Rất khó tan trong ethanol 96% [1], tan trong các dung dịch kiềm loãng [1].1 Cơ chế tác dụng và dược động học 1.1 Cơ chế tác dụng Allopurinol và chất chuyển hóa oxypurinol làm giảm sản xuất acid uric do cạnh tranh enzym xanthin oxydase là enzym chuyển hypoxanthin thành xanthin và chuyển xanthin thành acid uric.
Do đó allopurinol làm giảm nồng độ acid uric cả trong huyết thanh và trong nước tiểu [2], [8].2 Sự chuyển hóa hypoxanthin thành xanthin và acid uric, từ allopurinol thành oxypurinol [9] Hình 1.3 Cơ chế làm giảm sản xuất acid uric của allopurinol và oxypurinol [27] 4 .2 Dược động học Các thông số dược động học của allopurinol và oxypurinol trong huyết tương có sự thay đổi theo nhóm tuổi và các bệnh mắc kèm [2], [8], [15], [16], [17], [24].1 Tóm tắt các thông số dược động học của allopurinol Cmax AUC0-t Tmax (giờ) Liều Hoạt chất (µg/mL) (µg.giờ/mL) Mean ± TLTK Mean ± SD Mean ± SD SD 300 mg ALO 2-3 2-6 [2] ALO OXY 5 - 6,5 - 100 – ALO 0,5 -1,4 1-2 300 mg [8] ALO OXY 2,4-6,4 3-4 ALO 2,32 ± 1,94±0,83 9,286 ± 5,9 Generic 1,06 300 mg ALO 2,10 ± ALO 2,01±0,90 9,39 ± 5,23 [10] Thuốc phát minh 0,96 OXY 6,32 ± 5,88 ±1,71 221,06 ± 67,30 Generic 2,66 OXY 6,12 ± 6,04± 1,59 225,88 ± 59,36 Thuốc phát minh 2,45 ALO 1,24 ±0,21 4,38 ±0,67 0,6-2,5 Cao tuổi ALO 1,24 ±0,21 4,38 ±0,67 0,6-2,5 200 mg trẻ tuổi [16] ALO OXY 5,63±0.83 260±46 2,0-10 Cao tuổi OXY 3,75±0.25 166±23 2,0-10 trẻ tuổi - Hấp thu: Sau khi uống, khoảng 80 – 90 % liều được hấp thu nhanh qua đường tiêu hóa [2], [8]. - Phân bố: Allopurinol đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương sau 2 – 6 giờ ở liều thường dùng [2]. Allopurinol không gắn với protein huyết tương [2], [8]. Sau khi uống một liều 300 mg, Cmax trong huyết tương của allopurinol khoảng 2 µg/mL [2].
- Chuyển hóa: Khoảng 70 – 76 % allopurinol được chuyển hóa chủ yếu ở gan thành oxypurinol. Thời gian bán thải của allopurinol khoảng 1 – 3 giờ. chuyển hóa khác của allopurinol là allopurinol-riboside và oxypurinol-7-riboside [2], [8]. - Thải trừ: Cả allopurinol và oxypurinol được liên hợp thành dạng ribonucleosid tương ứng.
Khoảng 70 % liều dùng hàng ngày được thải trừ trong nước tiểu là oxypurinol và tới 10 % là allopurinol. Dùng kéo dài có thể thay đổi tỉ lệ này, vì allopurinol ức chế chuyển hóa của chính nó. Phần còn lại của liều được thải trừ qua phân. Cả allopurinol và oxypurinol được tìm thấy trong sữa mẹ [2], [8].
- Liều lượng: Liều khởi đầu với bệnh nhân gút mỗi ngày 100 mg, tăng dần sau mỗi tuần thêm 100 mg, đến khi nồng độ urat trong huyết thanh giảm xuống 0,36 mmol/lit hoặc thấp hơn hoặc cho tới khi đạt tới liều tối đa khuyến cáo 800 mg. Liều thường dùng mỗi ngày ở người lớn trong trường hợp bệnh nhẹ là 200 - 300 mg/ngày, gút có sạn urat (tophi) trung bình là 400 - 600 mg/ngày. Liều đến 300 mg uống một lần trong ngày, liều trên 300 mg phải chia nhiều lần để giảm nguy cơ kích ứng dạ dày. Duy trì uống đủ nước để phòng ngừa lắng đọng xanthin ở thận.
Sau khi nồng độ urat huyết thanh đã được kiểm soát, có thể giảm liều. Liều duy trì trung bình ở người lớn là 300 mg/ngày và liều tối thiểu có tác dụng là 100 - 200 mg/ngày. Phải dùng allopurinol liên tục, ngừng thuốc có thể dẫn đến tăng nồng độ urat huyết thanh.4 Công thức cấu tạo của oxypurinol Công thức phân tử: C5H4N4O2 [22]. Danh pháp 1H,2H,4H,5H,6H-pyrazolo[3,4-d] pyrimidin-4,6-dion [22].
Tên khác : Oxipurinol, alloxanthin [22]. Khối lượng phân tử: 152,1 g/mol [22]. Tính chất lý hóa: - Dạng rắn [22] Ít tan trong nước, tan trong dung dịch hydroxyd kiềm loãng [22]. - Oxypurinol là một chất chuyển hóa có hoạt tính của allopurinol.
Dưới tác dụng của enzym xanthin oxydase, allopurinol bị oxy hoá thành oxypurinol [2], [6].5 Allopurinol và các chất chuyển hóa [21] Dược động học của oxypurinol:: - Phân bố: Oxypurinol đạt nồng độ đỉnh 2-10 giờ sau khi uống allopurinol [2]. Oxypurinol không gắn với protein huyết tương [2], [8]. Sau khi uống một liều 300 mg allopurinol nồng độ cao nhất trong huyết tương của oxypurinol khoảng 5 – 6,5 µg/ml, có thể tăng lên đến 30 – 50 µg/ml ở bệnh nhân suy thận [2]. - Chuyển hoá: Khoảng 70 – 76 % allopurinol được chuyển hóa chủ yếu ở gan thành oxypurinol.
Oxypurinol tiếp tục được chuyển hoá thành oxypurinol-7-riboside [2], [8]. T1/2 trong huyết tương của oxypurinol khoảng 12 – 30 giờ, kéo dài rõ rệt ở bệnh nhân suy thận. - Thải trừ: Oxypurinol được liên hợp thành dạng ribonucleosid. Thải trừ chủ yếu qua thận nhưng thải chậm do oxypurinol được tái hấp thu ở ống thận.
Khoảng 70 % liều dùng hàng ngày được thải trừ trong nước tiểu là oxypurinol [2], [8].2 Chuẩn nội trong phân tích dịch sinh học 1.1 Mục đích và yêu cầu chuẩn nội trong phân tích dịch sinh học Các quy trình định lượng các chất trong dịch sinh học với nền mẫu phức tạp thường phải qua nhiều giai đoạn tách chiết, có thể làm mất mẫu dẫn đến kết quả phân tích không chính xác. Mục đích chính của việc sử dụng chuẩn nội (IS) là giảm sai số và đạt độ lặp lại cao trong phép định lượng liên quan đến lượng chất phân tích có trong mẫu [7]. Do đó, IS cần được thêm vào trong quy trình xử lý mẫu càng sớm càng tốt, thường được thêm ngay sau khi lấy mẫu hoặc trước khi xử lý mẫu. Ngoài ra, cấu trúc hóa học, tính chất hóa học và vật lý của IS phải càng gần với các chất phân tích càng tốt.
Cùng điều kiện sắc ký, IS phải có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích có trong mẫu. IS có độ tinh khiết cao, không có các tạp chất gây nhiễu cho chất phân tích trong mẫu [25].