Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong những thập kỷ gần đây, tỷ lệ mắc các bệnh lý dị ứng như hen suyễn, viêm mũi dị ứng và viêm da dị ứng gia tăng đáng kể trên toàn cầu ở cả các quốc gia phát triển lẫn đang phát triển, tạo nên gánh nặng điều trị và ảnh hưởng tiêu cực đến chất lượng sống của người bệnh. Histamin cùng thụ thể H1 đóng vai trò trung tâm trong cơ chế bệnh sinh dị ứng. Trong khi các thuốc kháng histamin H1 thế hệ thứ nhất tồn tại nhiều nhược điểm như tác dụng an thần gây buồn ngủ và ức chế cholinergic, các hoạt chất thế hệ thứ hai thể hiện tính chọn lọc cao trên thụ thể H1 ngoại vi, không gây buồn ngủ và được khuyến cáo là lựa chọn đầu tay trong điều trị viêm mũi dị ứng và mày đay.

Bilastin là hoạt chất kháng histamin thế hệ hai chọn lọc cao, được phê duyệt tại Liên minh Châu Âu vào năm 2010 cho người từ 12 tuổi trở lên và gần đây đã được chấp thuận mở rộng cho trẻ em từ 6 đến dưới 12 tuổi. Để phục vụ công tác kiểm tra chất lượng, đánh giá sinh khả dụng (SKD) và thử nghiệm tương đương sinh học (TĐSH) các chế phẩm chứa bilastin, yêu cầu đặt ra là phải sở hữu phương pháp phân tích có độ nhạy và độ tin cậy cao. Tuy nhiên, việc định lượng bilastin trong dịch sinh học gặp nhiều thách thức do nồng độ thuốc trong huyết tương sau khi dùng liều điều trị tương đối thấp (nồng độ đỉnh $C_{max}$ thực tế dao động từ $99{,}1 \pm 24{,}1\text{ ng/ml}$ đến $1277{,}9 \pm 404{,}9\text{ ng/ml}$ ứng với liều 10–100 mg/ngày), nền mẫu huyết tương phức tạp chứa nhiều protein và hợp chất nội sinh, trong khi các phương pháp quang phổ thông thường hay sắc ký lỏng hiệu năng cao truyền thống không đáp ứng được độ nhạy hoặc yêu cầu quy trình xử lý mẫu kéo dài.

Tại Việt Nam, ở thời điểm thực hiện đề tài chưa có công trình nào công bố việc xây dựng phương pháp định lượng bilastin trong dịch sinh học. Xuất phát từ thực tiễn trên, khóa luận tốt nghiệp dược sĩ của tác giả Lê Trần Bình tại Trường Đại học Dược Hà Nội (thực hiện tại Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc Gia) đã triển khai đề tài nhằm thực hiện 02 mục tiêu cụ thể:

  1. Xây dựng phương pháp định lượng bilastin trong huyết tương bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS).
  2. Thẩm định phương pháp định lượng bilastin trong huyết tương đã xây dựng theo các hướng dẫn quốc tế.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài:

  • Đối tượng nghiên cứu: Mẫu huyết tương người tự tạo (sử dụng huyết tương người bình thường, không chứa hoạt chất, nhận từ Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương, sau đó được thêm chuẩn bilastin ở các dải nồng độ xác định).
  • Phạm vi nghiên cứu: Thực nghiệm xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích in vitro trên nền mẫu sinh học, hoàn thành vào tháng 05 năm 2023 tại phòng thí nghiệm của Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc Gia – Trường Đại học Dược Hà Nội.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận được xây dựng dựa trên các nền tảng lý thuyết phân tích hóa dược và hướng dẫn chuẩn hóa quốc tế:

  • Đặc tính dược lý và hóa lý của bilastin: Công thức phân tử $\text{C}{28}\text{H}{37}\text{N}3\text{O}3$ (khối lượng phân tử $463{,}6\text{ g/mol}$), tên khoa học Acid 2-[4-[2-[4-[1-(2-ethoxyethyl)benzimidazol-2-yl]piperidin-1-yl]ethyl]phenyl]-2-methylpropanoic. Hoạt chất có điểm chảy khoảng $202^\circ\text{C}$, $\log P = 2{,}3$, $\text{p}K_a = 4{,}06$; tan trong ethanol, chloroform, dung dịch $\text{NaOH}$ và $\text{HCl } 1\text{N}$, rất ít tan trong nước và methanol, không tan trong acetonitril. Về dược động học, thuốc hấp thu nhanh qua đường tiêu hóa ($t{max} \approx 1{,}3\text{ giờ}$), sinh khả dụng đường uống đạt khoảng 61%, tỷ lệ gắn kết protein huyết tương cao (84–90%), thời gian bán thải ($t{1/2}$) trung bình khoảng 14,5 giờ và gần như không bị chuyển hóa qua Cytochrom P450 (bài tiết nguyên vẹn khoảng 95% qua phân và nước tiểu).
  • Nguyên lý sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần (LC-MS/MS): Kết hợp khả năng phân tách chọn lọc của sắc ký lỏng pha đảo (RP-UPLC) với detector khối phổ ba tứ cực ($Q_1, Q_2, Q_3$). Nguồn ion hóa phun điện tử (ESI) ở chế độ ion dương ($\text{ESI}^+$) chuyển hóa các phân tử chất phân tích thành ion proton hóa $[\text{M}+\text{H}]^+$ ở pha khí; tứ cực $Q_1$ chọn lọc ion mẹ, buồng va chạm $Q_2$ dùng khí trơ phân mảnh tạo ion con đặc trưng, và tứ cực $Q_3$ cô lập ion con để ghi nhận tín hiệu theo chế độ MRM (Multiple Reaction Monitoring).
  • Hướng dẫn thẩm định phân tích sinh học: Khung hướng dẫn thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học của Cơ quan Quản lý Dược phẩm Châu Âu (EMA) và Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (US-FDA).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm và hệ thống trang thiết bị gồm có:

  • Thiết bị phân tích chính: Hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu năng ACQUITY UPLC I-Class kết hợp đầu dò khối phổ ba tứ cực Xevo TQ-XS Triple Quadrupole (Waters, Mỹ), điều khiển và thu nhận số liệu qua phần mềm MassLynx; cột phân tích Acquity UPLC BEH $\text{C}_{18}$ ($50 \times 2{,}1\text{ mm}; 1{,}7\ \mu\text{m}$).
  • Thiết bị phụ trợ: Cân phân tích Mettler Toledo XPE105 ($d = 0{,}01\text{ mg}$), máy ly tâm lạnh Hettich Mikro 220R, máy lắc xoáy Vortex mixer VM-300, tủ bảo quản sâu Sanyo MDF-U333 (nhiệt độ $-30^\circ\text{C} \pm 5^\circ\text{C}$).
  • Hóa chất và chất chuẩn: Chất chuẩn bilastin do Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương cung cấp (Số kiểm soát: C0122388, hàm lượng nguyên trạng 98,8%); chất chuẩn nội (IS) carbamazepin (Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, SKS: WS); dung môi acetonitril (ACN), methanol (MeOH) đạt tiêu chuẩn dùng cho LC-MS (hãng VWR International); nước cất độ tinh khiết cao cho LC-MS (Thermo Fisher Scientific); acid formic và amoni format tinh khiết phân tích (Merck).
  • Phương pháp chuẩn bị và xử lý mẫu: Áp dụng kỹ thuật kết tủa protein huyết tương (Protein Precipitation – PPT) bằng dung môi hữu cơ ACN, ly tâm tách loại tạp protein nhằm làm sạch mẫu dịch sinh học trước khi tiêm vào hệ thống UPLC-MS/MS.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các tài liệu khoa học trong và ngoài nước liên quan đến hoạt chất và phương pháp phân tích dịch sinh học:

  • Đặc điểm hoạt chất: Cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc hóa học, tính chất lý hóa, cơ chế dược lực học (đối kháng cạnh tranh chọn lọc trên thụ thể histamin H1 ngoại vi, không ảnh hưởng đến các thụ thể muscarinic, adrenergic hay thụ thể histamin khác) và các thông số dược động học cơ bản ($C_{max}, t_{max}, t_{1/2}$, tỷ lệ liên kết protein huyết tương).
  • Tổng quan các phương pháp định lượng bilastin: So sánh các kỹ thuật định lượng bilastin trong dược phẩm (bột, viên nén bằng phương pháp quang phổ cận hồng ngoại MicroNIR, HPLC-UV, LC-MS) và các phương pháp định lượng trong huyết tương đã công bố trên thế giới. Tác giả chỉ ra các công trình trước đây chủ yếu dùng kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) hoặc chiết lỏng - lỏng (LLE) kết hợp LC-MS/MS với chất chuẩn nội đồng vị bilastin-d6 hoặc papaverin.
  • Đặc điểm nền mẫu dịch sinh học và kỹ thuật xử lý mẫu: Phân tích bản chất huyết tương người (khoảng 91,5% nước, 7% protein và 1,5% ion vô cơ/chất hữu cơ nhỏ) và đối chiếu ba kỹ thuật chiết tách: tủa protein (PPT), chiết lỏng - lỏng (LLE), chiết pha rắn (SPE). Qua phân tích ưu nhược điểm, tác giả lập luận kỹ thuật PPT bằng dung môi hữu cơ là lựa chọn tối ưu về chi phí, tốc độ và độ đơn giản để xử lý lượng mẫu lớn trong nghiên cứu TĐSH tại điều kiện Việt Nam.
  • Nguyên lý LC-MS/MS và quy định thẩm định: Phân tích nguyên tắc ion hóa ESI, cơ chế phân mảnh CID trong bộ ba tứ cực, và hệ thống hóa các chỉ tiêu thẩm định bắt buộc theo EMA và US-FDA (độ phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ nhiễm chéo, khoảng tuyến tính/mô hình trọng số, LLOQ, độ đúng - độ chính xác trong ngày và khác ngày, độ pha loãng, hiệu suất thu hồi và độ ổn định mẫu).

Chương 2. Nguyên vật liệu, thiết bị, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm và các tiêu chí chấp nhận cho từng thử nghiệm thẩm định:

  • Chuẩn bị các dung dịch chuẩn và mẫu thử:
    • Dung dịch chuẩn gốc bilastin pha trong MeOH ($600\ \mu\text{g/ml}$), pha loãng bậc 1 trong dung môi $\text{MeOH} - \text{nước}$ (1:1, tt/tt) thành dung dịch làm việc $12\ \mu\text{g/ml}$, tiếp tục pha loãng trong nước thành dung dịch làm việc $600\text{ ng/ml}$.
    • Dung dịch chuẩn nội gốc carbamazepin trong MeOH ($500\ \mu\text{g/ml}$), pha loãng bằng $\text{MeOH} - \text{nước}$ (1:1, tt/tt) thành dung dịch làm việc $2\ \mu\text{g/ml}$.
    • Quy trình chuẩn bị dãy đường chuẩn trong huyết tương gồm 8 nồng độ (S1 đến S8: 3, 6, 12, 30, 60, 180, 360, $600\text{ ng/ml}$) cùng các mẫu kiểm tra chất lượng (QC) độc lập: LLOQ ($3\text{ ng/ml}$), LQC ($9\text{ ng/ml}$), SQC ($72\text{ ng/ml}$), MQC ($300\text{ ng/ml}$), HQC ($480\text{ ng/ml}$) và mẫu kiểm tra độ thích hợp hệ thống SST ($240\text{ ng/ml}$).
  • Quy trình thẩm định phương pháp: Thiết kế chi tiết các bước thực nghiệm để kiểm tra độ thích hợp hệ thống (tiêm lặp lại 6 lần mẫu SST); độ đặc hiệu (trên 6 lô huyết tương trắng độc lập so sánh với mẫu nồng độ LLOQ); độ nhiễm chéo (tiêm xen kẽ mẫu trắng sau mẫu ULOQ); khảo sát đường chuẩn và kiểm tra sự không đồng nhất phương sai bằng F-test; đánh giá các mô hình trọng số ($1, 1/X^{1/2}, 1/X, 1/X^2$) dựa trên tổng phần dư sai số tương đối ($\sum\text{RE}%$); độ đúng và độ chính xác trong ngày (6 lặp lại/nồng độ) và khác ngày (phân tích qua 5 ngày độc lập); độ pha loãng 2 lần; hiệu suất thu hồi chiết tách; khảo sát độ ổn định (ở nhiệt độ phòng trong 4 giờ, sau 5 chu kỳ đông - rã đông, và trong bộ tiêm mẫu tự động auto-sampler ở $4^\circ\text{C}$ sau 24 giờ).
  • Phương pháp xử lý số liệu: Quy định các công thức toán học tính tỷ lệ diện tích pic (Y = $\text{S}{\text{BIL}} / \text{S}{\text{IS}}$), phương trình hồi quy tuyến tính ($Y = aX + b$), độ đúng ($%$) và hệ số biến thiên ($\text{CV}%$) phản ánh độ chính xác.

Chương 3. Thực nghiệm, kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm tối ưu hóa điều kiện đo và toàn bộ số liệu thẩm định:

  • Tối ưu hóa thông số khối phổ và sắc ký:
    • Qua ghi toàn phổ (Full scan) ở chế độ $\text{ESI}^+$, xác định ion mẹ của bilastin là $[\text{M}+\text{H}]^+$ tại $m/z = 463{,}80$. Năng lượng phân mảnh được tối ưu hóa tạo ion con bền vững có cường độ cao nhất tại $m/z = 271{,}72$ (năng lượng va chạm $\text{CE} = 36\text{ V}$). Thông số nguồn ion: điện thế mao quản (Capillary voltage) $3{,}0\text{ kV}$, điện thế cone (Cone voltage) $15\text{ V}$, nhiệt độ khử dung môi $500^\circ\text{C}$, lưu lượng khí khử dung môi $950\text{ L/h}$, lưu lượng khí cone $150\text{ L/h}$.
    • Đối với chất chuẩn nội, qua khảo sát ba hoạt chất (papaverin, gliclazid, carbamazepin): papaverin bị loại do xuất hiện nhiễm chéo kéo dài sang mẫu trắng tiêm kế tiếp; gliclazid bị loại do thời gian lưu kéo dài và pic bị chẻ; carbamazepin được lựa chọn tối ưu với cặp ion chuyển mức $m/z\ 236{,}70 \rightarrow 164{,}70$ ($\text{CE} = 39\text{ V}$, Cone $15\text{ V}$).
    • Về pha động sắc ký, hệ $\text{MeOH} - \text{dung dịch acid formic } 0{,}1%$ gây dính pic giữa BIL và IS; hệ $\text{ACN} - \text{dung dịch acid formic } 0{,}1%$ xuất hiện hiện tượng chẻ đỉnh pic. Hỗn hợp ACN và nước chứa amoni format $10\text{ mM}$ cùng acid formic $0{,}1%$ tỷ lệ 35:65 (tt/tt) cho hình dạng pic sắc nét, cân đối, tách hoàn toàn hai chất với thời gian phân tích ngắn chỉ $2{,}4\text{ phút}$ ở tốc độ dòng $0{,}2\text{ ml/phút}$, thể tích tiêm $2\ \mu\text{l}$, nhiệt độ cột $40^\circ\text{C}$, nhiệt độ buồng mẫu $4^\circ\text{C}$.
    • Về xử lý mẫu: Tủa protein bằng ACN theo tỷ lệ dung môi : huyết tương là 3:1 ($1{,}5\text{ ml ACN} : 0{,}5\text{ ml huyết tương}$) giúp loại bỏ trên 99% lượng protein nội sinh, giảm ức chế ion mà vẫn đảm bảo độ nhạy phân tích.
  • Dữ liệu thẩm định phương pháp:
    • Độ thích hợp hệ thống: Thời gian lưu trung bình của bilastin là $0{,}874\text{ phút}$ ($\text{CV} = 0{,}3%$) và carbamazepin là $1{,}733\text{ phút}$ ($\text{CV} = 0{,}3%$). Diện tích pic của bilastin có $\text{CV} = 1{,}2%$, IS có $\text{CV} = 2{,}0%$, tỷ số diện tích pic bilastin/IS có $\text{CV} = 1{,}8%$ (tất cả đều đạt yêu cầu $\le 5{,}0%$).
    • Độ đặc hiệu và độ nhiễm chéo: Trên 6 mẫu huyết tương trắng độc lập, tín hiệu nền tại thời gian lưu của bilastin cao nhất chỉ bằng $13{,}2%$ đáp ứng của mẫu LLOQ ($< 20%$) và tại thời gian lưu của IS chỉ bằng $0{,}2%$ đáp ứng của IS ($< 5%$). Thử nghiệm nhiễm chéo ghi nhận đáp ứng mẫu trắng sau ULOQ tại vị trí bilastin đạt tối đa $10{,}9%$ LLOQ và tại vị trí IS đạt tối đa $0{,}5%$.
    • Khoảng tuyến tính và mô hình hồi quy: Thực nghiệm kiểm định F cho giá trị $F_{\text{thực nghiệm}} = 65275{,}61$ vượt xa giá trị giới hạn $F_{\text{lý thuyết}} = 15{,}98$ ($p = 0{,}01$), chứng minh phương sai không đồng nhất trên khoảng nồng độ $3 - 600\text{ ng/ml}$. Trong 4 mô hình trọng số khảo sát, mô hình với trọng số $w_i = 1/X^2$ cho tổng sai số dư nhỏ nhất ($\sum\text{RE}% = 204{,}8$ so với $1576{,}2$ của mô hình không dùng trọng số). Cả 5 đường chuẩn thiết lập độc lập đều có hệ số tương quan $r \ge 0{,}9955$, độ đúng các điểm chuẩn dao động từ $87{,}9%$ đến $111{,}1%$.
    • Giới hạn định lượng dưới (LLOQ): Được xác định ở mức $3\text{ ng/ml}$. Tỷ lệ tín hiệu pic LLOQ so với mẫu trắng đạt từ 10,9 đến 21,5 lần (yêu cầu $\ge 5$ lần); độ đúng trung bình qua 3 ngày phân tích ($n = 18$) đạt $100{,}4%$ với độ chính xác $\text{CV} = 6{,}7 - 6{,}8%$.

Bảng tổng hợp kết quả độ đúng và độ chính xác của phương pháp qua các nồng độ kiểm tra:

Mức nồng độ Nồng độ lý thuyết (ng/ml) Độ đúng trong ngày (%) Độ chính xác trong ngày - CV (%) Độ đúng khác ngày (%) Độ chính xác khác ngày - CV (%)
LLOQ 3 101,6 2,8 96,4 8,3
LQC 9 99,5 5,4 97,8 5,1
SQC 72 103,8 2,8 99,6 6,5
MQC 300 97,3 3,1 95,6 4,2
HQC 480 101,6 4,7 96,2 5,3
  • Độ pha loãng mẫu: Khi pha loãng mẫu 2 lần với huyết tương trắng ở các dải nồng độ kiểm tra (LAC, SAC, MAC, HAC), độ đúng đạt từ $94{,}5%$ đến $113{,}9%$ và hệ số biến thiên $\text{CV} \le 4{,}5%$.
  • Hiệu suất thu hồi (tỷ lệ thu hồi): Tỷ lệ thu hồi của bilastin sau quá trình kết tủa protein đạt từ $107{,}3%$ đến $109{,}9%$ ($\text{CV} \le 2{,}1%$), tỷ lệ thu hồi của IS carbamazepin đạt từ $97{,}1%$ đến $102{,}3%$ ($\text{CV} \le 3{,}0%$).
  • Độ ổn định của chất phân tích: Hoạt chất trong huyết tương có độ ổn định tốt ở nhiệt độ phòng sau 4 giờ (độ lệch nồng độ $+5{,}8%$ ở LQC và $+0{,}4%$ ở HQC); ổn định sau 5 chu kỳ đông - rã đông (độ lệch $+11{,}7%$ ở LQC và $+4{,}9%$ ở HQC); mẫu dịch sau xử lý lưu trong auto-sampler ở $4^\circ\text{C}$ sau 24 giờ có độ lệch $+11{,}4%$ ở LQC và $-10{,}5%$ ở HQC (tất cả các mức độ lệch đều nằm trong giới hạn cho phép $\pm 15%$ với $\text{CV} < 15%$).

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

  • Đã thiết lập thành công phương pháp định lượng bilastin trong huyết tương người bằng UPLC-MS/MS sử dụng cột Acquity UPLC BEH $\text{C}_{18}$ ($50 \times 2{,}1\text{ mm}; 1{,}7\ \mu\text{m}$), pha động đẳng dòng gồm ACN và đệm amoni format $10\text{ mM}$ có chứa acid formic $0{,}1%$ (35:65, tt/tt), tốc độ dòng $0{,}2\text{ ml/phút}$, thể tích tiêm $2\ \mu\text{l}$, thời gian phân tích chỉ $2{,}4\text{ phút/mẫu}$.
  • Quy trình xử lý mẫu tinh gọn qua 1 bước tủa protein bằng ACN (tỷ lệ dung môi : huyết tương = 3:1) kết hợp ly tâm $10000\text{ vòng/phút}$ trong 5 phút.
  • Phương pháp được thẩm định đầy đủ theo hướng dẫn của US-FDA và EMA:
    • Khoảng tuyến tính rộng: $3 - 600\text{ ng/ml}$ với mô hình hồi quy tuyến tính có trọng số $1/X^2$, hệ số tương quan $r \ge 0{,}9955$.
    • Giới hạn định lượng dưới đạt $\text{LLOQ} = 3\text{ ng/ml}$.
    • Độ đúng trong ngày và khác ngày đạt $95{,}6% - 103{,}8%$; độ chính xác biểu thị qua $\text{CV}$ dao động từ $2{,}8%$ đến $8{,}3%$.
    • Tỷ lệ thu hồi chiết tách cao và đồng nhất: bilastin đạt $107{,}3% - 109{,}9%$, IS đạt $97{,}1% - 102{,}3%$.
    • Chứng minh hoạt chất ổn định trong huyết tương ít nhất 4 giờ ở nhiệt độ phòng, qua 5 chu kỳ đông - rã đông và bền vững 24 giờ trong khay tiêm mẫu tự động ở $4^\circ\text{C}$.

Đóng góp so với các nghiên cứu trước

  • Tác giả tự đánh giá đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam xây dựng quy trình định lượng bilastin trong huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS.
  • So với các nghiên cứu sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) của Belen Sádaba hay Nerea Jauregizar, quy trình tủa protein trong khóa luận tiết kiệm đáng kể chi phí hóa chất, giảm thiểu các bước thao tác trung gian phức tạp, phù hợp với năng lực thiết bị và nguồn lực phân tích tại Việt Nam.
  • So với kỹ thuật chiết lỏng - lỏng (LLE) của Joanna Gieroń có $\text{LLOQ} = 10\text{ ng/ml}$, phương pháp này có giới hạn định lượng thấp hơn ($3\text{ ng/ml}$), tiêu tốn ít dung môi hữu cơ hơn và thời gian sắc ký ngắn hơn ($2{,}4\text{ phút}$ so với thời gian chạy dài của các cột sắc ký truyền thống cỡ hạt $5\ \mu\text{m}$).
  • Giải quyết bài toán chuẩn nội: Khắc phục tình trạng khan hiếm và đắt đỏ của chất chuẩn đồng vị bilastin-d6 bằng việc lựa chọn thành công carbamazepin – một hoạt chất sẵn có, chi phí thấp, cho pic đối xứng, không bị nhiễm chéo và có hiệu suất phân mảnh ổn định tương đương phân tích chất chính.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế: Nghiên cứu mới dừng lại ở việc thẩm định trên nền mẫu huyết tương tự tạo in vitro (huyết tương người bình thường thêm chuẩn bilastin trong phòng thí nghiệm), chưa được kiểm chứng trực tiếp trên mẫu huyết tương thực tế thu nhận từ người tình nguyện hoặc bệnh nhân sau khi uống thuốc; chưa khảo sát độ ổn định đông lạnh dài ngày (vài tháng) của mẫu sinh học do giới hạn thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
  • Hướng nghiên cứu tiếp: Ứng dụng quy trình phân tích và thẩm định này vào các thử nghiệm đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học (SKD/TĐSH) của các chế phẩm thuốc viên nén bilastin sản xuất trong nước so với thuốc phát minh trên người tình nguyện khỏe mạnh tại Việt Nam.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn cao đối với:

  • Sinh viên, học viên sau đại học chuyên ngành Dược học, Hóa phân tích, Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất học: Có thể tham khảo phương pháp tối ưu hóa các thông số khối phổ ba tứ cực (chọn cặp ion mẹ - con, điện thế cone, năng lượng va chạm CE), cách thức xử lý hiện tượng phương sai không đồng nhất thông qua kiểm định F và lựa chọn mô hình trọng số đường chuẩn ($1/X^2$).
  • Nghiên cứu viên tại các trung tâm thử nghiệm tương đương sinh học (BE/BA): Khóa luận cung cấp thông số thực nghiệm hoàn chỉnh, có thể chuyển giao hoặc áp dụng trực tiếp quy trình xử lý mẫu tủa protein bằng ACN và điều kiện sắc ký đẳng dòng $2{,}4\text{ phút}$ để phân tích các lô mẫu sinh học quy mô lớn với chi phí tiết kiệm.

Câu hỏi thường gặp

1. Vì sao đề tài lựa chọn carbamazepin làm chất chuẩn nội (IS) thay vì papaverin hay chuẩn đồng vị bilastin-d6?
Chuẩn đồng vị bilastin-d6 tuy tối ưu nhất về lý thuyết nhưng rất đắt đỏ và khó tiếp cận tại Việt Nam. Khi khảo sát các chất thay thế thông thường, papaverin bị loại bỏ do gây hiện tượng nhiễm chéo sang mẫu tiêm kế tiếp (tiêm dung môi MeOH sau papaverin vẫn xuất hiện pic tại thời gian lưu của chất này); gliclazid có thời gian lưu dài và pic bị chẻ đỉnh; trong khi carbamazepin cho tín hiệu ion hóa bền vững, không gây nhiễm chéo, thời gian lưu tách biệt ($1{,}733\text{ phút}$) và quy trình chiết tách đồng nhất với bilastin.

2. Căn cứ nào dẫn đến việc áp dụng mô hình hồi quy tuyến tính có trọng số $1/X^2$ cho đường chuẩn?
Tác giả đã thực hiện kiểm định F (F-test) so sánh sai số tại hai nồng độ LLOQ và ULOQ. Kết quả cho thấy $F_{\text{thực nghiệm}} = 65275{,}61$ lớn hơn rất nhiều so với giá trị tra bảng $F_{\text{lý thuyết}} = 15{,}98$ ($p = 0{,}01$), chứng minh tập hợp số liệu có phương sai không đồng nhất. Khảo sát 4 mô hình trọng số ($1, 1/X^{1/2}, 1/X, 1/X^2$) cho thấy mô hình $1/X^2$ có tổng phần dư độ đúng nhỏ nhất ($\sum\text{RE}% = 204{,}8$), giúp phương trình đường chuẩn có độ đúng cao nhất tại các điểm nồng độ thấp.

3. Quy trình kết tủa protein xử lý mẫu huyết tương được tiến hành cụ thể như thế nào?
Lấy $0{,}5\text{ ml}$ mẫu huyết tương rã đông, thêm $50\ \mu\text{l}$ dung dịch chuẩn nội carbamazepin ($2\ \mu\text{g/ml}$), lắc xoáy trong 5 giây. Tiếp tục thêm $1{,}5\text{ ml}$ dung môi acetonitril (tỷ lệ thể tích dung môi : huyết tương là 3:1), lắc xoáy 5 giây, sau đó đem ly tâm với tốc độ $10000\text{ vòng/phút}$ trong 5 phút ở nhiệt độ lạnh. Hút lớp dịch nổi phía trên cho vào vial phân tích trên khay tiêm mẫu tự động.

4. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) của phương pháp là bao nhiêu và có đáp ứng yêu cầu phân tích nồng độ thuốc trong máu không?
Giới hạn LLOQ của phương pháp được xác định là $3\text{ ng/ml}$. Mức nồng độ này có đáp ứng pic cao gấp $10{,}9 - 21{,}5$ lần mẫu trắng, độ đúng đạt $100{,}4%$ và độ chính xác $\text{CV} \le 6{,}8%$. Mức $3\text{ ng/ml}$ hoàn toàn đáp ứng yêu cầu theo dõi dược động học của bilastin trên lâm sàng (vốn có nồng độ đỉnh $C_{max}$ từ khoảng $99\text{ ng/ml}$ đến $1277\text{ ng/ml}$).

5. Hoạt chất bilastin trong mẫu dịch sinh học có ổn định trong quá trình thao tác và phân tích không?
Các dữ liệu thẩm định thực nghiệm xác nhận bilastin trong mẫu huyết tương hoàn toàn ổn định trong ít nhất 4 giờ ở nhiệt độ phòng (độ lệch nồng độ $\le 5{,}8%$), ổn định qua 5 chu kỳ đông lạnh ($-30^\circ\text{C}$) và rã đông (độ lệch $\le 11{,}7%$), đồng thời dịch chiết sau xử lý để trong buồng tiêm mẫu tự động ở $4^\circ\text{C}$ duy trì độ ổn định đến 24 giờ (độ lệch $\le 11{,}4%$), đều nằm trong giới hạn cho phép $\pm 15%$ của hướng dẫn EMA/FDA.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Lê Trần Bình đã xây dựng thành công phương pháp định lượng bilastin trong huyết tương người bằng kỹ thuật UPLC-MS/MS với thời gian chạy sắc ký ngắn ($2{,}4\text{ phút}$) và quy trình xử lý mẫu kết tủa protein bằng acetonitril đơn giản, hiệu quả. Phương pháp đã được thẩm định toàn diện theo các tiêu chí nghiêm ngặt của US-FDA và EMA trên khoảng tuyến tính $3 - 600\text{ ng/ml}$, chứng minh độ đặc hiệu cao, không nhiễm chéo, độ đúng và độ chính xác tốt cùng giới hạn định lượng dưới đạt $3\text{ ng/ml}$. Kết quả nghiên cứu cung cấp một quy trình phân tích tin cậy, kinh tế, sẵn sàng ứng dụng vào các nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học cho các chế phẩm thuốc chứa bilastin tại Việt Nam.