Xây Dựng Phương Pháp Định Lượng Đồng Thời Metformin và Empagliflozin Trong Huyết Tương

Nghiên cứu phương pháp định lượng đồng thời metformin và empagliflozin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS tại Hà Nội 2023.

• Tác giả: Phạm Thanh Huyền
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Liên
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược Học
• Đề tài: Phương Pháp Định Lượng Đồng Thời Metformin và Empagliflozin Trong Huyết Tương Bằng Sắc Ký Lỏng Khối Phổ
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 2. TỔNG QUAN VỀ METFORMIN VÀ EMPAGLIFLOZIN
• 2.1. Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa
• 2.2. Dược lực học
• 2.3. Dược động học
• 2.4. Các thông số dược động học của metformin và empagliflozin
• 3. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC
• 3.1. Kỹ thuật xử lý mẫu
• 3.2. Kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS
• 3.3. Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học
• 4. NHẬN XÉT CHUNG VỀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 5. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 5.1. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
• 5.1.1. Chất chuẩn, dung môi, hóa chất
• 5.1.2. Thiết bị, dụng cụ phân tích
• 5.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
• 5.3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 5.3.1. Xây dựng và tối ưu phương pháp phân tích
• 5.3.2. Thẩm định phương pháp phân tích
• 5.3.3. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng định lượng nồng độ metformin và empagliflozin trong mẫu huyết tương người tình nguyện
• 5.3.4. Công thức tính kết quả và xử lý số liệu
• 6. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 6.1. XÂY DỰNG VÀ TỐI ƯU PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
• 6.1.1. Xác định điều kiện khối phổ định lượng MET và EMP
• 6.1.2. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký
• 6.1.2.1. Khảo sát thành phần và tỷ lệ pha động
• 6.1.2.2. Khảo sát cột sắc ký
• 6.1.2.3. Khảo sát tốc độ dòng
• 6.1.3. Xác định quy trình xử lý mẫu huyết tương
• 6.1.4. Lựa chọn chuẩn nội
• 6.1.5. Kết quả xây dựng phương pháp LC-MS/MS định lượng đồng thời metformin và empagliflozin trong huyết tương người
• 6.2. KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
• 6.2.1. Độ đặc hiệu – chọn lọc của phương pháp
• 6.2.2. Xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ)
• 6.2.3. Xây dựng đường chuẩn và khoảng tuyến tính
• 6.2.4. Độ đúng, độ chính xác của phương pháp
• 6.2.4.1. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày
• 6.2.4.2. Độ đúng, độ chính xác khi pha loãng mẫu
• 6.2.4.3. Độ đúng, độ chính xác mở rộng
• 6.2.5. Ảnh hưởng của nền mẫu. Ảnh hưởng của tan huyết và mỡ máu
• 6.2.6. Xác định tỷ lệ thu hồi của chất phân tích và chuẩn nội
• 6.2.7. Nghiên cứu độ ổn định
• 6.3. ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐÃ XÂY DỰNG ĐỊNH LƯỢNG METFORMIN VÀ EMPAGLIFLOZIN TRONG MẪU HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI TÌNH NGUYỆN
• 6.3.1. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI METFORMIN VÀ EMPAGLIFLOZIN TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI
• 6.3.1.1. Về điều kiện phổ khối
• 6.3.1.2. Điều kiện sắc ký. Kỹ thuật xử lý mẫu. Lựa chọn chuẩn nội
• 6.3.2. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
• 6.3.3. ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐÃ XÂY DỰNG ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG METFORMIN VÀ EMPAGLIFLOZIN TRONG MẪU HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI TÌNH NGUYỆN
• 7. KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Định Lượng Metformin Empagliflozin LC MS MS

Bài viết này tập trung vào phương pháp định lượng đồng thời hai dược chất quan trọng trong điều trị đái tháo đường typ 2: Metformin và Empagliflozin. Việc kết hợp hai hoạt chất này mang lại hiệu quả cao trong kiểm soát đường huyết. Tuy nhiên, việc định lượng đồng thời chúng trong huyết tương gặp nhiều thách thức do nồng độ khác nhau và tính chất lý hóa phức tạp. Mục tiêu của nghiên cứu là xây dựng và thẩm định một phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) có độ nhạy cao, nhanh chóng và phù hợp với điều kiện thực tế tại Việt Nam. Phương pháp này sẽ được ứng dụng để định lượng Metformin và Empagliflozin trong các nghiên cứu tương đương sinh học, đảm bảo chất lượng và hiệu quả của các chế phẩm thuốc trên thị trường.

1.1. Vai trò Metformin và Empagliflozin trong điều trị tiểu đường

Metformin, một biguanid, là lựa chọn đầu tay trong điều trị đái tháo đường typ 2. Nó giúp giảm sản xuất glucose tại gan, tăng độ nhạy insulin và giảm hấp thu glucose ở ruột. Empagliflozin, một chất ức chế SGLT2, hoạt động bằng cách giảm tái hấp thu glucose ở thận, tăng cường bài tiết glucose qua nước tiểu. Sự kết hợp này giúp kiểm soát đường huyết hiệu quả hơn so với đơn trị liệu. Theo nghiên cứu, "Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ và cơ quan quản lý Thuốc Châu Âu đã phê duyệt viên nén cố định liều kết hợp giữa metformin và empagliflozin vào năm 2015, làm hạ đường huyết với cơ chế bổ sung để làm tăng kiểm soát đường huyết ở bệnh nhân đái tháo đường typ 2".

1.2. Tại sao cần định lượng đồng thời hai dược chất

Việc định lượng đồng thời Metformin và Empagliflozin trong huyết tương là cần thiết cho các nghiên cứu tương đương sinh học (TĐSH). Theo Thông tư số 07/2022/TT-BYT, Metformin nằm trong danh mục các dược chất yêu cầu báo cáo số liệu nghiên cứu TĐSH. Định lượng đồng thời giúp đánh giá chính xác sự hấp thu, phân bố, chuyển hóa và thải trừ của cả hai hoạt chất, đảm bảo các chế phẩm thuốc kết hợp có hiệu quả và an toàn tương đương với thuốc gốc. Điều này đặc biệt quan trọng khi các chế phẩm generic ngày càng phổ biến trên thị trường.

II. Thách Thức Định Lượng Metformin Empagliflozin Huyết Tương

Định lượng đồng thời Metformin và Empagliflozin trong huyết tương đặt ra nhiều thách thức. Empagliflozin thường có nồng độ rất thấp trong huyết tương, đòi hỏi phương pháp phân tích phải có độ nhạy cao. Tính chất lý hóa khác biệt giữa hai hoạt chất, như độ tan, tính acid-base, cũng gây khó khăn trong quá trình chuẩn bị mẫu và phân tích. Thể tích huyết tương thu được từ bệnh nhân thường hạn chế, do đó phương pháp cần tối ưu để sử dụng ít mẫu nhất. Ngoài ra, việc phát triển một quy trình đơn giản, nhanh chóng và hiệu quả về chi phí là rất quan trọng để áp dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm kiểm nghiệm thuốc tại Việt Nam.

2.1. Độ nhạy phương pháp cho Empagliflozin nồng độ thấp

Nồng độ thấp của Empagliflozin trong huyết tương yêu cầu phương pháp phân tích phải có giới hạn định lượng dưới (LLOQ) phù hợp. Các phương pháp thông thường có thể không đủ nhạy để phát hiện và định lượng chính xác Empagliflozin. Điều này đòi hỏi việc tối ưu hóa các thông số của hệ thống LC-MS/MS, bao gồm lựa chọn ion tiền chất và ion sản phẩm phù hợp, điều chỉnh điện áp và dòng khí để tăng cường độ nhạy của máy. Bên cạnh đó, quy trình chuẩn bị mẫu cần được thiết kế để giảm thiểu mất mát chất phân tích và loại bỏ các chất gây nhiễu từ nền mẫu huyết tương.

2.2. Khác biệt lý hóa của Metformin và Empagliflozin

Metformin và Empagliflozin có tính chất lý hóa rất khác nhau. Metformin là một base mạnh, tan tốt trong nước, trong khi Empagliflozin là một hợp chất trung tính, ít tan trong nước hơn. Sự khác biệt này ảnh hưởng đến việc lựa chọn dung môi, pha động và cột sắc ký phù hợp để tách và phân tích đồng thời cả hai chất. Quy trình chuẩn bị mẫu cũng cần phải được điều chỉnh để đảm bảo cả hai hoạt chất được chiết xuất hiệu quả và không bị mất mát trong quá trình xử lý. Sự lựa chọn chuẩn nội (IS) phù hợp cũng rất quan trọng để bù trừ cho sự khác biệt này.

2.3. Hạn chế thể tích mẫu huyết tương

Trong các nghiên cứu lâm sàng, đặc biệt là nghiên cứu trên trẻ em hoặc bệnh nhân có vấn đề về sức khỏe, thể tích huyết tương thu được có thể bị hạn chế. Do đó, phương pháp định lượng cần được thiết kế để sử dụng ít mẫu nhất mà vẫn đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả. Điều này có thể đạt được bằng cách tối ưu hóa quy trình chuẩn bị mẫu để giảm thiểu số lượng các bước và sử dụng các kỹ thuật chiết xuất và làm sạch mẫu có hiệu quả cao. Việc sử dụng hệ thống LC-MS/MS có độ nhạy cao cũng giúp giảm thiểu lượng mẫu cần thiết cho phân tích.

III. Giải Pháp Xây Dựng Phương Pháp LC MS MS Định Lượng Metformin

Để giải quyết các thách thức trên, nghiên cứu này tập trung vào xây dựng và tối ưu hóa một phương pháp LC-MS/MS cho phép định lượng đồng thời Metformin và Empagliflozin trong huyết tương người. Phương pháp này bao gồm các bước chính: chuẩn bị mẫu, sắc ký lỏng và khối phổ. Chuẩn bị mẫu được thực hiện bằng phương pháp tủa protein đơn giản để loại bỏ các thành phần gây nhiễu từ nền mẫu. Điều kiện sắc ký được tối ưu hóa để tách hiệu quả hai hoạt chất trên cột pha đảo C18. Thông số khối phổ được điều chỉnh để đạt độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất. Cuối cùng, phương pháp được thẩm định theo các hướng dẫn quốc tế để đảm bảo độ chính xác, độ tin cậy và độ ổn định.

3.1. Tối ưu hóa điều kiện sắc ký lỏng LC

Việc lựa chọn và tối ưu hóa điều kiện sắc ký lỏng (LC) là rất quan trọng để tách hiệu quả Metformin và Empagliflozin. Cột pha đảo C18 thường được sử dụng cho phân tích các hợp chất hữu cơ. Pha động bao gồm hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ (acetonitrile hoặc methanol) với chất điều chỉnh pH (formic acid hoặc ammonium formate). Tỷ lệ pha động, tốc độ dòng và nhiệt độ cột cần được tối ưu hóa để đạt độ phân giải tốt nhất và thời gian phân tích ngắn nhất. Việc sử dụng cột có kích thước hạt nhỏ (dưới 2 µm) cũng có thể cải thiện độ phân giải và độ nhạy của phương pháp.

3.2. Tối ưu hóa điều kiện khối phổ MS

Tối ưu hóa các thông số của khối phổ (MS) là yếu tố then chốt để đạt độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong phân tích. Metformin và Empagliflozin được ion hóa bằng kỹ thuật phun điện tử (ESI) ở chế độ dương. Lựa chọn ion tiền chất và ion sản phẩm phù hợp (MRM transitions) là rất quan trọng để giảm thiểu nhiễu nền và tăng cường tín hiệu. Các thông số như điện áp phun, nhiệt độ nguồn ion, điện áp ống kính và năng lượng va chạm cần được điều chỉnh để tối đa hóa cường độ tín hiệu của các ion quan tâm. Sử dụng chuẩn nội đồng vị (isotope-labeled internal standards) cũng giúp cải thiện độ chính xác và độ tin cậy của phương pháp.

3.3. Quy trình chuẩn bị mẫu đơn giản và hiệu quả

Quy trình chuẩn bị mẫu đóng vai trò quan trọng trong việc loại bỏ các chất gây nhiễu từ nền mẫu huyết tương và làm giàu chất phân tích. Phương pháp tủa protein bằng acetonitrile hoặc methanol là một lựa chọn đơn giản và hiệu quả để loại bỏ protein. Sau khi tủa, mẫu được ly tâm và phần dịch nổi được thu thập để phân tích. Để tăng cường độ nhạy, có thể sử dụng thêm các kỹ thuật chiết xuất như chiết pha rắn (SPE) hoặc chiết lỏng-lỏng (LLE). Tuy nhiên, các kỹ thuật này có thể làm tăng thời gian và chi phí phân tích. Việc lựa chọn quy trình chuẩn bị mẫu phù hợp cần cân nhắc giữa độ nhạy, độ đặc hiệu, thời gian và chi phí.

IV. Ứng Dụng Định Lượng Metformin Empagliflozin Trong Huyết Tương

Phương pháp LC-MS/MS đã xây dựng được ứng dụng để định lượng Metformin và Empagliflozin trong mẫu huyết tương của người tình nguyện sau khi uống chế phẩm chứa đồng thời hai dược chất này. Kết quả cho thấy phương pháp có độ nhạy, độ chính xác và độ tin cậy cao. Đường chuẩn tuyến tính trong khoảng nồng độ phù hợp với các nghiên cứu tương đương sinh học. Phương pháp cũng cho thấy khả năng chịu ảnh hưởng của nền mẫu tốt, ít bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như tan huyết và mỡ máu. Kết quả này chứng minh rằng phương pháp LC-MS/MS này có thể được sử dụng để đánh giá tương đương sinh học của các chế phẩm chứa Metformin và Empagliflozin trên thị trường.

4.1. Kết quả thẩm định phương pháp phân tích

Phương pháp LC-MS/MS đã được thẩm định theo các hướng dẫn quốc tế (ví dụ: FDA, EMA) để đảm bảo độ tin cậy của kết quả. Các thông số thẩm định bao gồm: độ đặc hiệu (selectivity), giới hạn định lượng (LLOQ), khoảng tuyến tính (linearity), độ đúng (accuracy), độ chính xác (precision), độ ổn định (stability) và hiệu ứng nền mẫu (matrix effect). Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp đáp ứng các tiêu chí chấp nhận, chứng minh rằng phương pháp có thể được sử dụng để định lượng Metformin và Empagliflozin trong huyết tương với độ tin cậy cao.

4.2. Định lượng trong mẫu huyết tương người tình nguyện

Mẫu huyết tương từ người tình nguyện sau khi uống chế phẩm chứa Metformin và Empagliflozin đã được phân tích bằng phương pháp LC-MS/MS đã xây dựng. Nồng độ của Metformin và Empagliflozin trong mẫu được xác định và đánh giá. Kết quả cho thấy nồng độ của hai hoạt chất thay đổi theo thời gian, phù hợp với dược động học đã biết của chúng. Đường cong nồng độ theo thời gian được xây dựng và các thông số dược động học như Cmax, Tmax và AUC được tính toán. Kết quả này cung cấp thông tin quan trọng về sự hấp thu và thải trừ của Metformin và Empagliflozin từ chế phẩm.

V. Kết Luận LC MS MS Cho Định Lượng Metformin Empagliflozin

Nghiên cứu đã xây dựng và thẩm định thành công một phương pháp LC-MS/MS đơn giản, nhanh chóng và hiệu quả để định lượng đồng thời Metformin và Empagliflozin trong huyết tương người. Phương pháp này có độ nhạy cao, phù hợp để định lượng Empagliflozin ở nồng độ thấp. Quy trình chuẩn bị mẫu đơn giản giúp giảm thiểu thời gian và chi phí phân tích. Phương pháp này đã được ứng dụng thành công để định lượng Metformin và Empagliflozin trong mẫu huyết tương của người tình nguyện, chứng minh tính khả thi và độ tin cậy của phương pháp. Phương pháp LC-MS/MS này có tiềm năng lớn để sử dụng trong các nghiên cứu tương đương sinh học và kiểm soát chất lượng thuốc.

5.1. Tiềm năng ứng dụng trong kiểm soát chất lượng thuốc

Ngoài ứng dụng trong các nghiên cứu tương đương sinh học, phương pháp LC-MS/MS này cũng có thể được sử dụng trong kiểm soát chất lượng thuốc. Nó có thể được sử dụng để xác định hàm lượng Metformin và Empagliflozin trong các chế phẩm thuốc, đảm bảo rằng các sản phẩm trên thị trường đáp ứng các tiêu chuẩn chất lượng. Phương pháp cũng có thể được sử dụng để phát hiện các chất giả mạo hoặc chất lượng kém, bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

5.2. Hướng phát triển và nghiên cứu tiếp theo

Trong tương lai, nghiên cứu có thể được mở rộng để phát triển các phương pháp LC-MS/MS cho các hoạt chất khác trong điều trị đái tháo đường. Nghiên cứu cũng có thể tập trung vào việc phát triển các kỹ thuật chuẩn bị mẫu mới, chẳng hạn như chiết vi lỏng (microextraction), để giảm thiểu lượng mẫu cần thiết và tăng cường độ nhạy của phương pháp. Bên cạnh đó, việc đánh giá sự ổn định của Metformin và Empagliflozin trong các điều kiện khác nhau (nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm) cũng là một hướng nghiên cứu quan trọng để đảm bảo chất lượng thuốc trong quá trình bảo quản và sử dụng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh đái tháo đường typ 2 là một trong những bệnh mạn tính phổ biến, đặc biệt tại các nước đang phát triển, với tỷ lệ mắc ngày càng gia tăng. Metformin được xem là thuốc điều trị đầu tay, tuy nhiên khi đơn trị liệu không đạt hiệu quả, việc phối hợp với các thuốc khác như empagliflozin là cần thiết để kiểm soát đường huyết hiệu quả hơn. Theo Thông tư số 07/2022/TT-BYT của Bộ Y tế, metformin nằm trong danh mục các dược chất yêu cầu báo cáo số liệu nghiên cứu tương đương sinh học khi đăng ký thuốc. Do đó, việc xây dựng phương pháp định lượng đồng thời metformin và empagliflozin trong huyết tương người là cần thiết để phục vụ các nghiên cứu tương đương sinh học các chế phẩm phối hợp trên thị trường.

Nghiên cứu được thực hiện tại Trường Đại học Dược Hà Nội và Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương trong giai đoạn 2022-2023, nhằm xây dựng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) định lượng đồng thời metformin và empagliflozin trong huyết tương người. Phương pháp này cần đảm bảo độ nhạy cao, thời gian phân tích ngắn, sử dụng ít thể tích mẫu huyết tương và phù hợp với điều kiện trang thiết bị, kinh tế của Việt Nam. Kết quả nghiên cứu góp phần nâng cao chất lượng đánh giá tương đương sinh học, hỗ trợ phát triển và quản lý các chế phẩm điều trị đái tháo đường typ 2.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Dược động học của metformin và empagliflozin: Metformin hấp thu không hoàn toàn, nồng độ tối đa trong huyết tương dưới 5 µg/ml, thải trừ chủ yếu qua thận; empagliflozin hấp thu nhanh, nồng độ tối đa trong huyết tương thấp (khoảng 100-300 ng/ml), thải trừ qua nước tiểu và phân.
• Kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS): Kết hợp khả năng phân tách sắc ký lỏng với độ nhạy và độ đặc hiệu cao của khối phổ, sử dụng nguồn ion hóa phun sương điện tử (ESI) và bộ phân tích khối tứ cực chập ba để định lượng chính xác các dược chất trong mẫu sinh học.
• Kỹ thuật xử lý mẫu huyết tương: Tủa protein bằng acetonitril kết hợp đông lạnh mẫu nhằm loại bỏ protein và các tạp chất, làm sạch mẫu, tăng độ nhạy và độ chính xác của phương pháp.
• Chuẩn nội đồng vị ổn định: Sử dụng metformin-d6 và empagliflozin-d4 làm chuẩn nội để giảm thiểu ảnh hưởng của quá trình xử lý mẫu và phân tích, đảm bảo độ chính xác và độ lặp lại cao.
• Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của US-FDA: Bao gồm các chỉ tiêu độ đặc hiệu, chọn lọc, giới hạn định lượng dưới (LLOQ), độ đúng, độ chính xác, ảnh hưởng nền mẫu, ảnh hưởng tan huyết và mỡ máu, độ ổn định và tỷ lệ thu hồi.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Mẫu huyết tương trắng và huyết tương tự tạo được chuẩn bị tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương; mẫu huyết tương người tình nguyện uống viên nén phối hợp empagliflozin 12,5 mg/metformin 1000 mg.
• Phương pháp phân tích: Xây dựng và tối ưu phương pháp LC-MS/MS với cột Hypersil Gold C8 (50x2,1 mm, 1,9 µm), pha động MeCN – amoni bicarbonat 7,5 mM (35:65), tốc độ dòng 0,2 ml/phút, thể tích tiêm 20 µl, nguồn ion hóa ESI+.
• Xử lý mẫu: Tủa protein bằng acetonitril theo tỷ lệ 1:3, ly tâm, bảo quản mẫu ở -70°C trong 15 phút, rã đông và cô đặc mẫu, hòa tan cắn trong hỗn hợp MeCN – amoni bicarbonat 7,5 mM (2:8).
• Cỡ mẫu: Thẩm định phương pháp trên 6 lô huyết tương trắng khác nhau, mỗi lô gồm nhiều mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra; phân tích mẫu huyết tương của 2 người tình nguyện trong nghiên cứu tương đương sinh học.
• Phân tích số liệu: Sử dụng phần mềm Xcalibur 2.2 để xử lý dữ liệu sắc ký, Excel để tính toán các chỉ tiêu thống kê; áp dụng hồi quy tuyến tính có trọng số (1/x²) để xây dựng đường chuẩn.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Xây dựng phương pháp LC-MS/MS định lượng đồng thời metformin và empagliflozin:

   • Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) đạt 15 ng/ml cho metformin và 1,5 ng/ml cho empagliflozin, thấp hơn nhiều so với các phương pháp trước đây.
   • Khoảng tuyến tính rộng: 15-3000 ng/ml với metformin, 1,5-300 ng/ml với empagliflozin, hệ số tương quan r > 0,99.
   • Thời gian phân tích mẫu ngắn, khoảng 3,8 phút/mẫu, phù hợp với phân tích số lượng lớn.

2. Phương pháp xử lý mẫu huyết tương hiệu quả:

   • Tủa protein bằng acetonitril kết hợp đông lạnh mẫu ở -70°C giúp loại bỏ protein và các tạp chất, làm sạch mẫu, tăng tỷ lệ thu hồi và độ nhạy.
   • Tỷ lệ thu hồi metformin đạt khoảng 51-55%, empagliflozin đạt 99,6-107,6%, độ lệch chuẩn tương đối (CV) dưới 10%.

3. Thẩm định phương pháp đạt các tiêu chuẩn nghiêm ngặt:

   • Độ đúng trong ngày và khác ngày nằm trong khoảng 85-115% (LLOQ chấp nhận 80-120%).
   • Độ chính xác với CV dưới 15% (LLOQ dưới 20%).
   • Không có ảnh hưởng đáng kể của nền mẫu, tan huyết và mỡ máu.
   • Độ ổn định của dược chất trong huyết tương và dung môi đạt trên 85% trong các điều kiện bảo quản và xử lý mẫu.

4. Ứng dụng thành công trong nghiên cứu tương đương sinh học:

   • Phương pháp được áp dụng để định lượng nồng độ metformin và empagliflozin trong huyết tương của 2 người tình nguyện uống viên nén phối hợp.
   • Các thông số dược động học như Cmax và Tmax phù hợp với các nghiên cứu quốc tế, chứng tỏ tính chính xác và khả thi của phương pháp.

Thảo luận kết quả

Phương pháp LC-MS/MS được xây dựng đã khắc phục được các hạn chế của phương pháp HPLC-UV truyền thống, đặc biệt là độ nhạy thấp đối với empagliflozin do nồng độ trong huyết tương rất thấp. Việc lựa chọn nguồn ion hóa ESI+ và cặp ion đặc trưng phù hợp giúp tăng cường tín hiệu và độ đặc hiệu phân tích. Kỹ thuật tủa protein kết hợp đông lạnh mẫu là giải pháp kinh tế, đơn giản, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam, đồng thời đảm bảo tỷ lệ thu hồi và độ chính xác cao.

So sánh với các nghiên cứu trước, phương pháp này có giới hạn định lượng dưới thấp hơn, khoảng tuyến tính rộng hơn, đáp ứng tốt các yêu cầu thẩm định theo hướng dẫn US-FDA. Việc sử dụng chuẩn nội đồng vị ổn định giúp giảm thiểu sai số do biến thiên trong quá trình xử lý mẫu và phân tích, nâng cao độ tin cậy kết quả.

Dữ liệu thu được từ mẫu người tình nguyện cho thấy phương pháp có thể ứng dụng hiệu quả trong các nghiên cứu tương đương sinh học, hỗ trợ đánh giá chất lượng và hiệu quả của các chế phẩm phối hợp metformin và empagliflozin trên thị trường.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Triển khai áp dụng phương pháp trong các nghiên cứu tương đương sinh học:

   • Động từ hành động: Áp dụng, triển khai.
   • Target metric: Đánh giá tương đương sinh học các chế phẩm phối hợp metformin và empagliflozin.
   • Timeline: Ngay sau khi hoàn thành thẩm định.
   • Chủ thể thực hiện: Các phòng thí nghiệm kiểm nghiệm thuốc, viện nghiên cứu dược.

2. Mở rộng nghiên cứu để định lượng các chế phẩm có hàm lượng khác nhau:

   • Động từ hành động: Nghiên cứu, phát triển.
   • Target metric: Phương pháp phù hợp với nhiều dạng và hàm lượng thuốc.
   • Timeline: 1-2 năm tiếp theo.
   • Chủ thể thực hiện: Các nhóm nghiên cứu dược học, công ty dược.

3. Đào tạo và chuyển giao kỹ thuật cho các phòng thí nghiệm trong nước:

   • Động từ hành động: Đào tạo, chuyển giao.
   • Target metric: Nâng cao năng lực phân tích thuốc trong dịch sinh học.
   • Timeline: 6-12 tháng.
   • Chủ thể thực hiện: Trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương.

4. Cập nhật và hoàn thiện quy trình chuẩn nội và xử lý mẫu phù hợp với điều kiện thực tế:

   • Động từ hành động: Cập nhật, tối ưu.
   • Target metric: Tăng độ chính xác, giảm chi phí phân tích.
   • Timeline: Liên tục trong quá trình áp dụng.
   • Chủ thể thực hiện: Các phòng thí nghiệm phân tích.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Dược học, Hóa phân tích:

   • Lợi ích: Hiểu rõ kỹ thuật LC-MS/MS, quy trình xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học.
   • Use case: Áp dụng trong nghiên cứu dược động học, phát triển thuốc mới.

2. Phòng thí nghiệm kiểm nghiệm thuốc và sinh học phân tử:

   • Lợi ích: Áp dụng phương pháp phân tích đồng thời metformin và empagliflozin, nâng cao chất lượng kiểm nghiệm.
   • Use case: Đánh giá tương đương sinh học, kiểm tra chất lượng thuốc phối hợp.

3. Cơ quan quản lý dược phẩm và y tế:

   • Lợi ích: Tham khảo quy trình thẩm định phương pháp phân tích thuốc theo tiêu chuẩn quốc tế.
   • Use case: Xây dựng tiêu chuẩn, hướng dẫn đăng ký lưu hành thuốc.

4. Công ty dược phẩm sản xuất và phân phối thuốc điều trị đái tháo đường:

   • Lợi ích: Nắm bắt kỹ thuật phân tích để kiểm soát chất lượng sản phẩm, nghiên cứu phát triển sản phẩm mới.
   • Use case: Thực hiện nghiên cứu tương đương sinh học, kiểm soát chất lượng nguyên liệu và thành phẩm.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao cần định lượng đồng thời metformin và empagliflozin trong huyết tương?
   Định lượng đồng thời giúp đánh giá chính xác nồng độ hai dược chất trong cùng một mẫu, tiết kiệm thời gian và chi phí, đồng thời phục vụ nghiên cứu tương đương sinh học các chế phẩm phối hợp, đảm bảo hiệu quả điều trị.

2. Phương pháp LC-MS/MS có ưu điểm gì so với HPLC-UV?
   LC-MS/MS có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn, phù hợp với dược chất có nồng độ thấp như empagliflozin trong huyết tương, cho phép định lượng chính xác với giới hạn định lượng dưới thấp và thời gian phân tích ngắn.

3. Tại sao chọn phương pháp tủa protein kết hợp đông lạnh mẫu để xử lý huyết tương?
   Phương pháp này đơn giản, nhanh, tiết kiệm chi phí, loại bỏ hiệu quả protein và tạp chất, làm sạch mẫu, tăng độ nhạy và độ chính xác phân tích, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam.

4. Chuẩn nội đồng vị ổn định có vai trò gì trong phân tích?
   Chuẩn nội đồng vị ổn định giúp kiểm soát biến thiên trong quá trình xử lý mẫu và phân tích, nâng cao độ chính xác và độ lặp lại của phương pháp, giảm thiểu sai số do ảnh hưởng nền mẫu và thiết bị.

5. Phương pháp đã xây dựng có thể áp dụng cho các dạng thuốc phối hợp khác không?
   Có, với khoảng tuyến tính rộng và giới hạn định lượng dưới thấp, phương pháp phù hợp để phân tích các chế phẩm phối hợp metformin và empagliflozin với nhiều hàm lượng khác nhau trên thị trường.

Kết luận

• Đã xây dựng thành công phương pháp LC-MS/MS định lượng đồng thời metformin và empagliflozin trong huyết tương người với độ nhạy cao và thời gian phân tích ngắn.
• Phương pháp sử dụng kỹ thuật tủa protein kết hợp đông lạnh mẫu, chuẩn nội đồng vị ổn định, đảm bảo độ chính xác và độ lặp lại cao.
• Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn US-FDA cho kết quả đạt yêu cầu về độ đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác, ảnh hưởng nền mẫu và độ ổn định.
• Ứng dụng thành công trong nghiên cứu tương đương sinh học trên người tình nguyện, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam.
• Đề xuất triển khai áp dụng phương pháp trong các nghiên cứu tương đương sinh học và kiểm nghiệm thuốc phối hợp metformin – empagliflozin trên thị trường.

Call-to-action: Các phòng thí nghiệm và nhà nghiên cứu được khuyến khích áp dụng và phát triển phương pháp này để nâng cao chất lượng nghiên cứu và kiểm nghiệm thuốc điều trị đái tháo đường typ 2.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh tiểu đường hay đái tháo đường là tình trạng rối loạn chuyển hóa mạn tính, cơ thể không tự sản sinh insulin hoặc insulin tiết ra không đủ để hấp thu glucose trong máu dẫn đến lượng đường trong máu cao hơn mức bình thường. Hiện nay, bệnh tiểu đường ngày càng phổ biến và gia tăng nhanh ở các nước đang phát triển. Các hướng dẫn điều trị đái tháo đường typ 2 của thế giới cũng như Việt Nam đều khuyến cáo sử dụng metformin là lựa chọn điều trị đầu tay. Khi metformin đơn trị liệu không đủ làm giảm đường huyết về mục tiêu điều trị thì sẽ phải kết hợp thuốc.

Việc phối hợp thuốc điều trị ở bệnh đái tháo đường typ 2 là rất cần thiết để đảm bảo mục tiêu kiểm soát đường huyết nhanh và bền vững hơn. Hiện nay, trên thị trường đã có nhiều dạng thuốc kết hợp giữa metformin và các thuốc khác, đem lại sự thuận tiện cho người bệnh. Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ và cơ quan quản lý Thuốc Châu Âu đã phê duyệt viên nén cố định liều kết hợp giữa metformin và empagliflozin vào năm 2015, làm hạ đường huyết với cơ chế bổ sung để làm tăng kiểm soát đường huyết ở bệnh nhân đái tháo đường typ 2 [1], [2]. Theo quy định tại Thông tư số 07/2022/TT-BYT của Bộ Y tế về hướng dẫn báo cáo số liệu nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học trong đăng ký thuốc thì metformin nằm trong danh mục các dược chất yêu cầu báo cáo số liệu nghiên cứu tương đương sinh học khi đăng ký thuốc [3].

Để thực hiện các nghiên cứu tương đương sinh học các chế phẩm chứa metformin và empagliflozin cần phải xây dựng được phương pháp định lượng hai hoạt chất này trong huyết tương đáp ứng các quy định hiện hành. Tuy nhiên, do nồng độ empagliflozin trong huyết tương rất thấp, các tính chất lý hóa của metformin và empagliflozin có nhiều điểm không giống nhau nên cần phải phát triển một phương pháp phân tích có đủ độ nhạy, cần ít thể tích huyết tương, thời gian phân tích mẫu ngắn và đặc biệt là phù hợp với điều kiện trang thiết bị, kinh tế của Việt Nam để có thể định lượng đồng thời metformin và empagliflozin trong huyết tương người phục vụ công tác đánh giá tương đương sinh học của các chế phẩm có chứa metformin và empagliflozin trên thị trường. Vì vậy, đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời metformin và empagliflozin trong huyết tương người bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS)” được 1 thực hiện với các mục tiêu cụ thể như sau: 1. Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời metformin và empagliflozin trong huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS.

Ứng dụng phương pháp để định lượng metformin, empagliflozin trong mẫu huyết tương người tình nguyện uống chế phẩm chứa đồng thời hai dược chất này trong nghiên cứu tương đương sinh học. TỔNG QUAN VỀ METFORMIN VÀ EMPAGLIFLOZIN 1. Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa Hình 1. Công thức cấu tạo của metformin - Công thức phân tử: C5H11N5 - Khối lượng phân tử: 129,16 g/mol - Tên khoa học: 3-(diaminomethylidene)-1,1-dimethylguanidine - Metformin ở dạng tinh thể màu trắng, dễ tan trong nước, khó tan trong ethanol 96%, thực tế không tan trong aceton và methylen clorid; hệ số logP = -2,6; pKa = 12,4 [4], [5].

Dược lực học Metformin là một thuốc chống đái tháo đường nhóm biguanid. Thuốc không kích thích giải phóng insulin từ các tế bào beta tuyến tụy. Thuốc không có tác dụng hạ đường huyết ở người không bị đái tháo đường. Metformin làm giảm nồng độ glucose trong huyết tương khi đói và sau bữa ăn, ở người bệnh đái tháo đường typ 2 (không phụ thuộc insulin).

Metformin có thể tác dụng theo 3 cơ chế: (1) giảm sản xuất glucose tại gan bằng cách ức chế tái tạo glucose và phân giải glycogen; (2) tại cơ, bằng cách tăng độ nhạy cảm với insulin, tăng hấp thu và sử dụng glucose ngoại vi; (3) và làm chậm sự hấp thu glucose ở ruột. Metformin kích thích tổng hợp glycogen nội bào bằng cách hoạt hóa enzyme glycogen synthase. Metformin cũng làm giảm nồng độ cholesterol toàn phần, LDL cholesterol và triglycerid [6]. Dược động học 3 Hấp thu: Metformin hấp thu chậm và không hoàn toàn ở đường tiêu hóa, chủ yếu ở ruột non.

Sinh khả dụng tuyệt đối của 500 mg hoặc 850 mg metformin hydroclorid uống lúc đói xấp xỉ 50 - 60%. Sau khi dùng đường uống, metformin hydroclorid được hấp thu không hoàn toàn và có thể bão hòa. Dược động học hấp thu của metformin hydroclorid được cho là không tuyến tính. Ở mức liều và chế độ liều của metformin hydroclorid, nồng độ thuốc trong huyết tương ở trạng thái ổn định đạt được trong vòng 24 đến 48 giờ và thường thấp hơn 1 µg/ml.

Trong các thử nghiệm lâm sàng có đối chứng, nồng độ tối đa của metformin trong huyết tương (Cmax) không vượt quá 5 µg/ml ngay cả ở mức liều tối đa. Thức ăn làm giảm mức độ và làm chậm không đáng kể quá trình hấp thu của metformin hydroclorid. Sau khi dùng liều 850 mg, đã ghi nhận được nồng độ đỉnh của thuốc trong huyết tương giảm 40%, AUC (diện tích dưới đường cong) giảm 25% và thời gian đến khi đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương kéo dài thêm 35 phút. Chưa rõ ý nghĩa lâm sàng của tình trạng giảm này.

Phân bố: Thuốc liên kết với protein huyết tương không đáng kể. Metformin phân bố nhanh chóng vào các mô và dịch cơ thể. Thuốc cũng phân bố vào trong hồng cầu. Chuyển hóa: Thuốc không bị chuyển hóa ở gan và không bài tiết qua mật.

Thải trừ: Sau khi uống, khoảng 90% lượng thuốc hấp thu được thải trừ qua đường nước tiểu trong vòng 24 giờ đầu ở dạng không đổi. Không phát hiện được một chất chuyển hóa nào ở người. Nửa đời của thuốc trong huyết tương là 1,5 - 4,5 giờ [6], [7]. Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa Hình 1.

Công thức cấu tạo của empagliflozin 4 - Công thức phân tử: C23H27ClO7 - Khối lượng phân tử: 450,9 g/mol - Tên khoa học: (2S,3R,4R,5S,6R)-2-[4-chloro-3-[[4-[(3S)-oxolan-3- yl]oxyphenyl]methyl]phenyl]-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol - Empagliflozin ở dạng chất rắn kết tinh, màu trắng đến hơi vàng; rất khó tan trong nước (pH 1 – 7,4), khó tan trong acetonitril và ethanol, hơi tan trong methanol và không tan trong toluen; hệ số logP = 1,79 [1], [8]. Dược lực học Empagliflozin là thuốc ức chế mạnh, cạnh tranh có chọn lọc, có khả năng hồi phục kênh đồng vận chuyển Na-glucose 2 (SGLT2). Empagliflozin cải thiện kiểm soát đường huyết ở những bệnh nhân đái tháo đường typ 2 theo cơ chế giảm tái hấp thu đường ở thận. Thông qua việc ức chế SGLT2, lượng đường thừa sẽ được bài tiết qua nước tiểu.

Empagliflozin cải thiện nồng độ đường huyết khi đói và sau khi ăn. Cơ chế tác dụng của empagliflozin không phụ thuộc chức năng tế bào beta và con đường sử dụng insulin nên dẫn đến nguy cơ hạ glucose máu thấp [7]. Dược động học Hấp thu: Sau khi uống, empagliflozin nhanh chóng được hấp thu với nồng độ đỉnh trong huyết tương (Cmax) xuất hiện với giá trị tmax trung vị khoảng 1,5 giờ. Sau đó, nồng độ huyết tương giảm theo 2 pha với một pha phân bố nhanh và một pha kết thúc tương đối chậm.

Ở trạng thái ổn định nồng độ trung bình của thuốc trong huyết tương (AUC) và Cmax tương ứng là 1870 nmol.giờ/l và 259 nmol/l với empagliflozin 10 mg và 4740 nmol.giờ/l và 687 nmol/l với empagliflozin 25 mg, dùng 1 lần một ngày. Nồng độ toàn thân của empagliflozin tăng tỉ lệ với liều. Uống 25 mg empagliflozin sau bữa ăn có nhiều chất béo và nhiều calo làm giảm nhẹ nồng độ empagliflozin trong tuần hoàn; AUC giảm khoảng 16% và Cmax giảm khoảng 37% so với uống thuốc khi đói. Ảnh hưởng được ghi nhận của thức ăn đến dược động học của empagliflozin được xem như không đáng kể trên lâm sàng và empagliflozin có thể được dùng cùng hoặc không cùng với thức ăn.

Phân bố: Thể tích phân bố ở trạng thái ổn định biểu kiến được ước tính là 73,8l. Tỉ 5 lệ phân bố trong hồng cầu xấp xỉ 36,8% và gắn kết protein huyết tương là 86,2%. Chuyển hóa: Không có chất chuyển hoá chính nào của empagliflozin được tìm thấy trong huyết tương người và chất chuyển hóa chủ yếu là 3 chất liên hợp glucuronid (2-O-, 3-O-, và 6-O-glucuronid). Nồng độ trong tuần hoàn của mỗi chất chuyển hóa là ít hơn 10% tổng số các chất liên quan đến thuốc.

Thải trừ: nửa đời thải trừ biểu kiến của empagliflozin ước tính khoảng 12,4 giờ và độ thanh thải đường uống biểu kiến là 10,6 l/giờ. Biến thiên giữa các cá thể và thặng dư của độ thanh thải empagliflozin đường uống tương ứng là 39,1% và 35,8%. Với liều dùng 1 lần trong ngày, nồng độ huyết tương ở trạng thái ổn định của empagliflozin đạt được sau khi dùng liều thứ năm. Sau khi dùng dạng uống dung dịch [14C]-empagliflozin trên người tình nguyện khoẻ mạnh, khoảng 95,6% thuốc liên quan có hoạt tính phóng xạ được tìm thấy trong phân (41,2%) hoặc nước tiểu (54,4%).

Phần lớn thuốc có hoạt tính phóng xạ được tìm thấy trong phân là không đổi so với thuốc ban đầu và xấp xỉ một nửa thuốc có hoạt tính phóng xạ được bài tiết trong nước tiểu dưới dạng không đổi so với ban đầu [7]. Dạng thuốc phối hợp giữa empagliflozin và metformin hydroclorid với cơ chế bổ sung làm tăng kiểm soát đường huyết ở bệnh nhân đái tháo đường typ 2. Hiện nay, các chế phẩm kết hợp metformin và empagliflozin trên thị trường dưới dạng viên nén, viên nén bao phim, viên nén giải phóng kéo dài với các hàm lượng empagliflozin/metformin hydroclorid tương ứng là 5/500 mg, 5/850 mg, 5/1000 mg, 12,5/500 mg, 12,5/850 mg, 12,5/1000 mg. Các thông số dược động học của metformin và empagliflozin Nồng độ đỉnh trong huyết tương (Cmax), thời gian đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương (tmax), thời gian bán thải (T1/2) của metformin và empagliflozin trong một số nghiên cứu được trình bày trong Bảng 1.