Tổng quan nghiên cứu

Bệnh đái tháo đường typ 2 là một trong những bệnh mạn tính phổ biến, đặc biệt tại các nước đang phát triển, với tỷ lệ mắc ngày càng gia tăng. Metformin được xem là thuốc điều trị đầu tay, tuy nhiên khi đơn trị liệu không đạt hiệu quả, việc phối hợp với các thuốc khác như empagliflozin là cần thiết để kiểm soát đường huyết hiệu quả hơn. Theo Thông tư số 07/2022/TT-BYT của Bộ Y tế, metformin nằm trong danh mục các dược chất yêu cầu báo cáo số liệu nghiên cứu tương đương sinh học khi đăng ký thuốc. Do đó, việc xây dựng phương pháp định lượng đồng thời metformin và empagliflozin trong huyết tương người là cần thiết để phục vụ các nghiên cứu tương đương sinh học các chế phẩm phối hợp trên thị trường.

Nghiên cứu được thực hiện tại Trường Đại học Dược Hà Nội và Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương trong giai đoạn 2022-2023, nhằm xây dựng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) định lượng đồng thời metformin và empagliflozin trong huyết tương người. Phương pháp này cần đảm bảo độ nhạy cao, thời gian phân tích ngắn, sử dụng ít thể tích mẫu huyết tương và phù hợp với điều kiện trang thiết bị, kinh tế của Việt Nam. Kết quả nghiên cứu góp phần nâng cao chất lượng đánh giá tương đương sinh học, hỗ trợ phát triển và quản lý các chế phẩm điều trị đái tháo đường typ 2.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

  • Dược động học của metformin và empagliflozin: Metformin hấp thu không hoàn toàn, nồng độ tối đa trong huyết tương dưới 5 µg/ml, thải trừ chủ yếu qua thận; empagliflozin hấp thu nhanh, nồng độ tối đa trong huyết tương thấp (khoảng 100-300 ng/ml), thải trừ qua nước tiểu và phân.
  • Kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS): Kết hợp khả năng phân tách sắc ký lỏng với độ nhạy và độ đặc hiệu cao của khối phổ, sử dụng nguồn ion hóa phun sương điện tử (ESI) và bộ phân tích khối tứ cực chập ba để định lượng chính xác các dược chất trong mẫu sinh học.
  • Kỹ thuật xử lý mẫu huyết tương: Tủa protein bằng acetonitril kết hợp đông lạnh mẫu nhằm loại bỏ protein và các tạp chất, làm sạch mẫu, tăng độ nhạy và độ chính xác của phương pháp.
  • Chuẩn nội đồng vị ổn định: Sử dụng metformin-d6 và empagliflozin-d4 làm chuẩn nội để giảm thiểu ảnh hưởng của quá trình xử lý mẫu và phân tích, đảm bảo độ chính xác và độ lặp lại cao.
  • Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của US-FDA: Bao gồm các chỉ tiêu độ đặc hiệu, chọn lọc, giới hạn định lượng dưới (LLOQ), độ đúng, độ chính xác, ảnh hưởng nền mẫu, ảnh hưởng tan huyết và mỡ máu, độ ổn định và tỷ lệ thu hồi.

Phương pháp nghiên cứu

  • Nguồn dữ liệu: Mẫu huyết tương trắng và huyết tương tự tạo được chuẩn bị tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương; mẫu huyết tương người tình nguyện uống viên nén phối hợp empagliflozin 12,5 mg/metformin 1000 mg.
  • Phương pháp phân tích: Xây dựng và tối ưu phương pháp LC-MS/MS với cột Hypersil Gold C8 (50x2,1 mm, 1,9 µm), pha động MeCN – amoni bicarbonat 7,5 mM (35:65), tốc độ dòng 0,2 ml/phút, thể tích tiêm 20 µl, nguồn ion hóa ESI+.
  • Xử lý mẫu: Tủa protein bằng acetonitril theo tỷ lệ 1:3, ly tâm, bảo quản mẫu ở -70°C trong 15 phút, rã đông và cô đặc mẫu, hòa tan cắn trong hỗn hợp MeCN – amoni bicarbonat 7,5 mM (2:8).
  • Cỡ mẫu: Thẩm định phương pháp trên 6 lô huyết tương trắng khác nhau, mỗi lô gồm nhiều mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra; phân tích mẫu huyết tương của 2 người tình nguyện trong nghiên cứu tương đương sinh học.
  • Phân tích số liệu: Sử dụng phần mềm Xcalibur 2.2 để xử lý dữ liệu sắc ký, Excel để tính toán các chỉ tiêu thống kê; áp dụng hồi quy tuyến tính có trọng số (1/x²) để xây dựng đường chuẩn.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Xây dựng phương pháp LC-MS/MS định lượng đồng thời metformin và empagliflozin:

    • Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) đạt 15 ng/ml cho metformin và 1,5 ng/ml cho empagliflozin, thấp hơn nhiều so với các phương pháp trước đây.
    • Khoảng tuyến tính rộng: 15-3000 ng/ml với metformin, 1,5-300 ng/ml với empagliflozin, hệ số tương quan r > 0,99.
    • Thời gian phân tích mẫu ngắn, khoảng 3,8 phút/mẫu, phù hợp với phân tích số lượng lớn.

  2. Phương pháp xử lý mẫu huyết tương hiệu quả:

    • Tủa protein bằng acetonitril kết hợp đông lạnh mẫu ở -70°C giúp loại bỏ protein và các tạp chất, làm sạch mẫu, tăng tỷ lệ thu hồi và độ nhạy.
    • Tỷ lệ thu hồi metformin đạt khoảng 51-55%, empagliflozin đạt 99,6-107,6%, độ lệch chuẩn tương đối (CV) dưới 10%.

  3. Thẩm định phương pháp đạt các tiêu chuẩn nghiêm ngặt:

    • Độ đúng trong ngày và khác ngày nằm trong khoảng 85-115% (LLOQ chấp nhận 80-120%).
    • Độ chính xác với CV dưới 15% (LLOQ dưới 20%).
    • Không có ảnh hưởng đáng kể của nền mẫu, tan huyết và mỡ máu.
    • Độ ổn định của dược chất trong huyết tương và dung môi đạt trên 85% trong các điều kiện bảo quản và xử lý mẫu.

  4. Ứng dụng thành công trong nghiên cứu tương đương sinh học:

    • Phương pháp được áp dụng để định lượng nồng độ metformin và empagliflozin trong huyết tương của 2 người tình nguyện uống viên nén phối hợp.
    • Các thông số dược động học như Cmax và Tmax phù hợp với các nghiên cứu quốc tế, chứng tỏ tính chính xác và khả thi của phương pháp.

Thảo luận kết quả

Phương pháp LC-MS/MS được xây dựng đã khắc phục được các hạn chế của phương pháp HPLC-UV truyền thống, đặc biệt là độ nhạy thấp đối với empagliflozin do nồng độ trong huyết tương rất thấp. Việc lựa chọn nguồn ion hóa ESI+ và cặp ion đặc trưng phù hợp giúp tăng cường tín hiệu và độ đặc hiệu phân tích. Kỹ thuật tủa protein kết hợp đông lạnh mẫu là giải pháp kinh tế, đơn giản, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam, đồng thời đảm bảo tỷ lệ thu hồi và độ chính xác cao.

So sánh với các nghiên cứu trước, phương pháp này có giới hạn định lượng dưới thấp hơn, khoảng tuyến tính rộng hơn, đáp ứng tốt các yêu cầu thẩm định theo hướng dẫn US-FDA. Việc sử dụng chuẩn nội đồng vị ổn định giúp giảm thiểu sai số do biến thiên trong quá trình xử lý mẫu và phân tích, nâng cao độ tin cậy kết quả.

Dữ liệu thu được từ mẫu người tình nguyện cho thấy phương pháp có thể ứng dụng hiệu quả trong các nghiên cứu tương đương sinh học, hỗ trợ đánh giá chất lượng và hiệu quả của các chế phẩm phối hợp metformin và empagliflozin trên thị trường.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Triển khai áp dụng phương pháp trong các nghiên cứu tương đương sinh học:

    • Động từ hành động: Áp dụng, triển khai.
    • Target metric: Đánh giá tương đương sinh học các chế phẩm phối hợp metformin và empagliflozin.
    • Timeline: Ngay sau khi hoàn thành thẩm định.
    • Chủ thể thực hiện: Các phòng thí nghiệm kiểm nghiệm thuốc, viện nghiên cứu dược.

  2. Mở rộng nghiên cứu để định lượng các chế phẩm có hàm lượng khác nhau:

    • Động từ hành động: Nghiên cứu, phát triển.
    • Target metric: Phương pháp phù hợp với nhiều dạng và hàm lượng thuốc.
    • Timeline: 1-2 năm tiếp theo.
    • Chủ thể thực hiện: Các nhóm nghiên cứu dược học, công ty dược.

  3. Đào tạo và chuyển giao kỹ thuật cho các phòng thí nghiệm trong nước:

    • Động từ hành động: Đào tạo, chuyển giao.
    • Target metric: Nâng cao năng lực phân tích thuốc trong dịch sinh học.
    • Timeline: 6-12 tháng.
    • Chủ thể thực hiện: Trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương.

  4. Cập nhật và hoàn thiện quy trình chuẩn nội và xử lý mẫu phù hợp với điều kiện thực tế:

    • Động từ hành động: Cập nhật, tối ưu.
    • Target metric: Tăng độ chính xác, giảm chi phí phân tích.
    • Timeline: Liên tục trong quá trình áp dụng.
    • Chủ thể thực hiện: Các phòng thí nghiệm phân tích.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Dược học, Hóa phân tích:

    • Lợi ích: Hiểu rõ kỹ thuật LC-MS/MS, quy trình xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học.
    • Use case: Áp dụng trong nghiên cứu dược động học, phát triển thuốc mới.

  2. Phòng thí nghiệm kiểm nghiệm thuốc và sinh học phân tử:

    • Lợi ích: Áp dụng phương pháp phân tích đồng thời metformin và empagliflozin, nâng cao chất lượng kiểm nghiệm.
    • Use case: Đánh giá tương đương sinh học, kiểm tra chất lượng thuốc phối hợp.

  3. Cơ quan quản lý dược phẩm và y tế:

    • Lợi ích: Tham khảo quy trình thẩm định phương pháp phân tích thuốc theo tiêu chuẩn quốc tế.
    • Use case: Xây dựng tiêu chuẩn, hướng dẫn đăng ký lưu hành thuốc.

  4. Công ty dược phẩm sản xuất và phân phối thuốc điều trị đái tháo đường:

    • Lợi ích: Nắm bắt kỹ thuật phân tích để kiểm soát chất lượng sản phẩm, nghiên cứu phát triển sản phẩm mới.
    • Use case: Thực hiện nghiên cứu tương đương sinh học, kiểm soát chất lượng nguyên liệu và thành phẩm.

Câu hỏi thường gặp

  1. Tại sao cần định lượng đồng thời metformin và empagliflozin trong huyết tương?
    Định lượng đồng thời giúp đánh giá chính xác nồng độ hai dược chất trong cùng một mẫu, tiết kiệm thời gian và chi phí, đồng thời phục vụ nghiên cứu tương đương sinh học các chế phẩm phối hợp, đảm bảo hiệu quả điều trị.

  2. Phương pháp LC-MS/MS có ưu điểm gì so với HPLC-UV?
    LC-MS/MS có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn, phù hợp với dược chất có nồng độ thấp như empagliflozin trong huyết tương, cho phép định lượng chính xác với giới hạn định lượng dưới thấp và thời gian phân tích ngắn.

  3. Tại sao chọn phương pháp tủa protein kết hợp đông lạnh mẫu để xử lý huyết tương?
    Phương pháp này đơn giản, nhanh, tiết kiệm chi phí, loại bỏ hiệu quả protein và tạp chất, làm sạch mẫu, tăng độ nhạy và độ chính xác phân tích, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam.

  4. Chuẩn nội đồng vị ổn định có vai trò gì trong phân tích?
    Chuẩn nội đồng vị ổn định giúp kiểm soát biến thiên trong quá trình xử lý mẫu và phân tích, nâng cao độ chính xác và độ lặp lại của phương pháp, giảm thiểu sai số do ảnh hưởng nền mẫu và thiết bị.

  5. Phương pháp đã xây dựng có thể áp dụng cho các dạng thuốc phối hợp khác không?
    Có, với khoảng tuyến tính rộng và giới hạn định lượng dưới thấp, phương pháp phù hợp để phân tích các chế phẩm phối hợp metformin và empagliflozin với nhiều hàm lượng khác nhau trên thị trường.

Kết luận

  • Đã xây dựng thành công phương pháp LC-MS/MS định lượng đồng thời metformin và empagliflozin trong huyết tương người với độ nhạy cao và thời gian phân tích ngắn.
  • Phương pháp sử dụng kỹ thuật tủa protein kết hợp đông lạnh mẫu, chuẩn nội đồng vị ổn định, đảm bảo độ chính xác và độ lặp lại cao.
  • Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn US-FDA cho kết quả đạt yêu cầu về độ đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác, ảnh hưởng nền mẫu và độ ổn định.
  • Ứng dụng thành công trong nghiên cứu tương đương sinh học trên người tình nguyện, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam.
  • Đề xuất triển khai áp dụng phương pháp trong các nghiên cứu tương đương sinh học và kiểm nghiệm thuốc phối hợp metformin – empagliflozin trên thị trường.

Call-to-action: Các phòng thí nghiệm và nhà nghiên cứu được khuyến khích áp dụng và phát triển phương pháp này để nâng cao chất lượng nghiên cứu và kiểm nghiệm thuốc điều trị đái tháo đường typ 2.