Tổng quan nghiên cứu

Vitamin nhóm B là các hợp chất vi lượng hòa tan trong nước đóng vai trò thiết yếu đối với quá trình chuyển hóa năng lượng và duy trì chức năng thần kinh của cơ thể con người. Hiện nay, khoa học đã phân lập được hơn 30 loại vitamin khác nhau, trong đó bộ ba thiamin (B1), pyridoxin (B6) và cobalamin (B12) giữ vị trí trung tâm trong quá trình phát triển thể chất của trẻ nhỏ. Nhu cầu bổ sung hàng ngày đối với trẻ từ 1 đến 3 tuổi là khoảng 0,5 mg vitamin B1, 0,5 mg vitamin B6 và 0,9 µg vitamin B12; ở người trưởng thành, nhu cầu này có thể lên tới 1,5 mg B1, 2,0 mg B6 và 2,8 µg B12 mỗi ngày. Nhằm đáp ứng nhu cầu này, các dòng sữa công thức như Dielac Alpha Gold và Dielac Grow Plus của Công ty Cổ phần Sữa Việt Nam (Vinamilk) đã tăng cường bổ sung vi chất với tỷ lệ tiêu chuẩn nghiêm ngặt.

Vấn đề đặt ra trong thực tiễn kiểm nghiệm là nền mẫu sữa chứa hàm lượng protein, lipid và khoáng chất phức tạp, gây cản trở lớn đến việc định lượng chính xác các vitamin tồn tại ở hàm lượng vết. Đề tài luận văn thạc sĩ Hóa học chuyên ngành Hóa phân tích thực hiện tại Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên năm 2019 hướng tới mục tiêu xây dựng quy trình phân tích đồng thời 3 loại vitamin B1, B6 và B12 trên cùng một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Nghiên cứu tiến hành khảo sát thực nghiệm trên các lô sữa bột (khối lượng tịnh 100 g) và sữa tươi tiệt trùng (thể tích 180 mL) lưu hành trên thị trường. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn quan trọng, giúp tối ưu hóa thời gian phân tích mẫu, giảm thiểu 30% lượng dung môi tiêu thụ và cung cấp công cụ kiểm soát chất lượng chính xác với hệ số tương quan tuyến tính đạt trên 0,999.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên nguyên lý sắc ký phân bố pha đảo (Reversed-Phase HPLC) kết hợp với định luật quang phổ hấp thụ phân tử tử ngoại - khả kiến (UV-Vis) qua đầu dò dãy diod quang (Photodiode Array - PDA). Kỹ thuật sắc ký pha đảo khai thác sự khác biệt về tính phân cực giữa pha tĩnh không phân cực liên kết chuỗi alkyl C18 và pha động phân cực gồm dung dịch đệm photphat và axetonitril (ACN). Quá trình rửa giải đẳng dòng (isocratic) cho phép tách riêng biệt các thành phần dựa trên hệ số phân bố của từng chất.

Về mặt hóa học phân tích, vitamin B1 (thiamin monohydroclorua, khối lượng mol 265,35 g/mol) có tính bazơ yếu và hấp thụ cực đại tại bước sóng 246 nm trong môi trường axit. Vitamin B6 (pyridoxin hydroclorua, khối lượng mol 205,64 g/mol) tồn tại ở dạng muối bền vững, hấp thụ bức xạ quang học mạnh nhất ở bước sóng 291 nm. Vitamin B12 (cyanocobalamin, khối lượng mol 1355,37 g/mol) là phức chất cơ kim chứa nguyên tử Coban hóa trị III, có vùng hấp thụ đặc trưng tại bước sóng 361 nm. Mô hình toán học áp dụng phương trình hồi quy tuyến tính bình phương tối thiểu và phương pháp thêm chuẩn (standard addition) để loại bỏ triệt để sai số do hiệu ứng nền mẫu phức tạp của sữa công thức.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng hóa chất chuẩn đối chứng độ tinh khiết cao từ hãng Merck bao gồm: vitamin B1 (> 97,5%), vitamin B6 (> 98,8%) và vitamin B12 (> 98,5%). Cỡ mẫu thực nghiệm được thiết kế đại diện gồm 4 đối tượng thương phẩm: sữa bột Dielac Alpha Gold (lô sản xuất R3), sữa bột Dielac Grow Plus (lô sản xuất E7), sữa tươi Dielac Alpha Gold 180 mL (lô 0D72GPG03) và sữa tươi Dielac Grow Plus 180 mL (lô 0E72GPG15). Phương pháp chọn mẫu ngẫu nhiên theo lô sản xuất chuẩn tại các điểm phân phối bán lẻ chính thức, đảm bảo tính đại diện cho sản phẩm tiêu dùng thực tế.

Lý do lựa chọn hệ thống HPLC Waters Acquity Arc trang bị detector PDA và cột tách C18 (kích thước hạt 5 µm, chiều dài 250 mm, đường kính 6,1 mm) là khả năng ghi nhận đồng thời tín hiệu tại 3 bước sóng tối ưu khác nhau chỉ trong một lần tiêm mẫu, vượt trội hơn so với detector UV-Vis đơn bước sóng và không đòi hỏi quy trình tạo dẫn xuất huỳnh quang phức tạp. Quy trình xử lý mẫu sử dụng lượng cân chính xác 5,0000 g đối với mẫu sữa bột và 15,0 mL đối với mẫu sữa tươi, hòa tan trong dung môi đệm photphat pH = 3,0 kết hợp rung siêu âm khử khí, ly tâm lắng tách protein và lọc dịch qua màng lọc microporous 0,45 µm trước khi bơm vào hệ thống sắc ký. Toàn bộ thực nghiệm được hoàn thiện từ tháng 6 đến tháng 11 năm 2019 tại phòng thí nghiệm chuyên sâu Khoa Hóa học.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình khảo sát điều kiện sắc ký đã xác lập được bộ thông số tối ưu cho phép tách hoàn toàn 3 pic cấu tử mà không xảy ra hiện tượng chồng chéo hoặc doãn chân pic. Tỷ lệ pha động tối ưu được lựa chọn là dung dịch đệm photphat pH = 3,0 hòa trộn với axetonitril theo tỷ lệ thể tích 80:20, vận hành ở tốc độ dòng ổn định 1,0 mL/phút. Các bước sóng định lượng chọn lọc trên detector PDA lần lượt là 246 nm cho vitamin B1, 291 nm cho vitamin B6 và 361 nm cho vitamin B12.

+---------------+------------------------+-------------------+-----------------+
| Vitamin       | Bước sóng phát hiện    | Phương trình      | Hệ số tương     |
|               | tối ưu (nm)            | hồi quy (ppm)     | quan (R²)       |
+---------------+------------------------+-------------------+-----------------+
| Vitamin B1    | 246                    | y = 58779x + 47083| 0,9998          |
| Vitamin B6    | 291                    | y = 58276x + 35206| 0,9996          |
| Vitamin B12   | 361                    | y = 58860x - 14962| 0,9993          |
+---------------+------------------------+-------------------+-----------------+

Khoảng nồng độ tuyến tính của phương pháp được thiết lập từ 0,4 ppm đến 2,8 ppm cho cả 3 hoạt chất với hệ số tương quan R² đều đạt trên 0,999. Giới hạn phát hiện (LOD) đạt mức 0,054 ppm đối với B1; 0,095 ppm đối với B6 và 0,076 ppm đối với B12. Khi áp dụng phương pháp thêm chuẩn trên nền mẫu sữa bột Dielac Alpha Gold, phương trình hồi quy đạt độ tuyến tính cao với R² = 0,9988 cho cả B1 và B6, R² = 0,9998 cho B12. Trên nền sữa bột Dielac Grow Plus, hệ số tương quan của đường thêm chuẩn vitamin B1 đạt mức 0,9998. Kết quả định lượng thực tế cho thấy hàm lượng các vitamin trong mẫu sữa bột đạt từ 95% đến 104% so với giá trị công bố trên nhãn dinh dưỡng (0,63 mg B1; 0,75 mg B6; 1,5 µg B12 trên 100 g Dielac Alpha Gold và 1,1 mg B1; 1,1 mg B6; 2,2 µg B12 trên 100 g Dielac Grow Plus).

Thảo luận kết quả

Môi trường đệm photphat có pH = 3,0 đóng vai trò quyết định trong việc ổn định trạng thái ion hóa của phân tử thiamin và pyridoxin, ngăn ngừa phản ứng phân hủy vòng thiazol thường gặp trong môi trường trung tính hoặc kiềm. Việc điều chỉnh tốc độ dòng ở mức 1,0 mL/phút giúp pic sắc ký sắc nét, thời gian lưu giữ cân đối và giảm áp suất làm việc của cột so với tốc độ 1,2 mL/phút.

Dữ liệu thực nghiệm khi biểu diễn qua các sắc ký đồ và biểu đồ so sánh hình cột cho thấy sự tương thích chặt chẽ giữa hàm lượng thực tế đo được và hàm lượng lý thuyết ghi trên nhãn bao bì của Vinamilk. Sai lệch tương đối luôn duy trì dưới ngưỡng 5%, chứng minh tính đồng nhất cao trong dây chuyền phối trộn công nghiệp. So với công trình của một số tác giả quốc tế trước đây sử dụng chế độ rửa giải gradient kéo dài 30 đến 55 phút, phương pháp rửa giải đẳng dòng trong luận văn này đã rút ngắn tổng thời gian phân tích xuống dưới 15 phút, đồng thời giảm thiểu đáng kể sai số dịch chuyển đường nền.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm nâng cao hiệu quả kiểm soát an toàn dinh dưỡng thực phẩm và chuẩn hóa quy trình phân tích vi lượng, luận văn đưa ra 4 khuyến nghị cụ thể:

  1. Chuẩn hóa quy trình HPLC-PDA đẳng dòng thành Tiêu chuẩn cơ sở (TCCS): Các phòng thử nghiệm thực phẩm cần ban hành văn bản quy trình thao tác chuẩn (SOP) dựa trên hệ pha động đệm photphat pH = 3,0 và ACN (80:20). Mục tiêu đạt độ lặp lại có độ lệch chuẩn tương đối (RSD) dưới 2,0%, thực hiện hoàn tất trong quý 1 bởi trưởng bộ phận kiểm nghiệm.
  2. Nâng cấp công nghệ xử lý mẫu bằng kỹ thuật chiết pha rắn tự động (SPE): Doanh nghiệp chế biến sữa cần đầu tư hệ thống cột chiết C18 SPE tự động nhằm thay thế phương pháp ly tâm thủ công. Giải pháp này giúp tăng hiệu suất thu hồi mẫu từ khoảng 85% lên trên 98%, rút ngắn 50% thời gian chuẩn bị mẫu trong giai đoạn 6 tháng đầu năm.
  3. Mở rộng phạm vi thẩm định phương pháp trên các nền sản phẩm bổ sung vi chất khác: Các viện nghiên cứu dinh dưỡng cần áp dụng mở rộng mô hình này để phân tích đồng thời thêm các vitamin tan trong nước khác như vitamin B2, B3 và B9 trên các nền thực phẩm dinh dưỡng y học và bột ăn dặm trẻ em trước quý 4.
  4. Tăng cường tần suất kiểm tra đột xuất hàm lượng vi chất trên thị trường lưu thông: Cơ quan thanh tra an toàn thực phẩm cần định kỳ lấy mẫu kiểm nghiệm vi chất đối với tối thiểu 10% các lô sữa lưu thông trên thị trường hàng quý, đảm bảo quyền lợi dinh dưỡng chính đáng của người tiêu dùng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và kết quả nghiên cứu mang lại giá trị tham khảo chuyên sâu cho 4 nhóm đối tượng chính:

  • Kỹ thuật viên và chuyên viên phân tích tại phòng thí nghiệm LAB: Sử dụng trực tiếp các thông số kỹ thuật tối ưu (tỷ lệ dung môi, tốc độ dòng, bước sóng PDA) để xây dựng và thẩm định phương pháp thử nghiệm đạt chuẩn ISO/IEC 17025.
  • Bộ phận R&D và QA/QC tại các nhà máy sản xuất sữa: Áp dụng phương pháp phân tích nhanh phục vụ việc kiểm tra chất lượng nguyên liệu đầu vào và kiểm soát độ đồng đều hàm lượng vi chất trong thành phẩm trước khi xuất xưởng.
  • Học viên cao học, nghiên cứu sinh và sinh viên ngành Hóa học, Dược học, Công nghệ thực phẩm: Nắm vững phương pháp luận xây dựng đường chuẩn thêm mẫu trên nền sinh học phức tạp và kỹ thuật vận hành thiết bị HPLC-PDA hiện đại.
  • Cán bộ quản lý tại các cơ quan kiểm chuẩn và an toàn vệ sinh thực phẩm: Sử dụng dữ liệu khoa học làm căn cứ xây dựng quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về giới hạn dung sai hàm lượng vi chất bổ sung trong thực phẩm công thức dành cho trẻ nhỏ.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao cần xác định đồng thời cả 3 loại vitamin B1, B6 và B12 trong một lần chạy sắc ký?

Việc tích hợp phân tích đồng thời giúp tiết kiệm hơn 60% thời gian thực nghiệm và giảm chi phí hóa chất phân tích so với việc tách riêng rẽ từng chất. Đồng thời, kỹ thuật này hạn chế tối đa nguy cơ sai số do thao tác lặp lại nhiều lần trên các mẫu sữa có giá trị dinh dưỡng cao.

Ưu điểm nổi bật của detector PDA so với detector UV-Vis thông thường trong nghiên cứu này là gì?

Detector PDA cho phép quét toàn bộ phổ hấp thụ từ 200 nm đến 400 nm trong cùng một thời điểm, giúp lựa chọn bước sóng hấp thụ cực đại riêng biệt cho từng chất (246 nm cho B1, 291 nm cho B6 và 361 nm cho B12), tăng cường độ chọn lọc và độ nhạy của phép đo.

Vì sao phương pháp thêm chuẩn được áp dụng thay vì phương pháp đường chuẩn ngoại đơn thuần trên nền sữa?

Nền mẫu sữa chứa nhiều hợp chất hữu cơ phức tạp như protein, chất béo và khoáng chất có thể làm suy giảm hoặc tăng cường tín hiệu phân tích (hiệu ứng nền). Phương pháp thêm chuẩn trực tiếp các nồng độ từ 0,8 ppm đến 3,6 ppm vào mẫu giúp triệt tiêu hoàn toàn sai số hệ thống này.

Điều kiện pH = 3,0 của pha động có vai trò gì trong quá trình sắc ký?

Tại pH = 3,0, các nhóm chức của vitamin B1 và B6 tồn tại ở trạng thái ion hóa ổn định, hạn chế tối đa sự phân hủy hóa học và ức chế sự tương tác bất lợi với các nhóm silanol tự do trên bề mặt cột C18, từ đó tạo ra pic sắc ký sắc nét và đối xứng.

Giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp có đáp ứng được yêu cầu kiểm nghiệm thực tế không?

Giới hạn phát hiện của phương pháp dao động từ 0,054 ppm đến 0,095 ppm, thấp hơn nhiều so với nồng độ thực tế của các vitamin có trong 5,0 g sữa bột hoặc 15,0 mL sữa tươi thương phẩm, hoàn toàn đáp ứng các tiêu chuẩn kiểm nghiệm nghiêm ngặt của ngành thực phẩm.

Kết luận

  • Tối ưu hóa thành công quy trình sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) sử dụng đầu dò PDA để xác định đồng thời vitamin B1, B6 và B12 trong sữa công thức.
  • Xác lập các điều kiện phân tích chuẩn xác gồm cột tách C18, pha động đệm photphat pH = 3,0 : ACN (tỷ lệ 80:20), tốc độ dòng 1,0 mL/phút với các bước sóng chọn lọc 246 nm, 291 nm và 361 nm.
  • Đạt độ tuyến tính xuất sắc với hệ số tương quan R² từ 0,9993 đến 0,9998 và giới hạn phát hiện LOD đạt từ 0,054 đến 0,095 ppm.
  • Giải quyết triệt để ảnh hưởng của hiệu ứng nền mẫu sữa bột và sữa tươi Dielac thông qua phương pháp thêm chuẩn với độ tin cậy cao.
  • Định hướng nghiên cứu tiếp theo trong giai đoạn 12 đến 24 tháng tới là mở rộng tích hợp phân tích đa vitamin nhóm B và tự động hóa khâu xử lý mẫu.

Quý độc giả, các nhà nghiên cứu và kỹ thuật viên phân tích có thể ứng dụng trực tiếp quy trình thực nghiệm này vào công tác kiểm nghiệm thực tế để nâng cao độ chính xác và hiệu quả kinh tế cho đơn vị.