Nghiên cứu tạo dòng thuốc lá chuyển gen RNAi kháng đồng thời SMV và BYMV tại Đại học Sư phạm Thái Nguyên

Dưới đây là meta tags cho bài viết: { "ai_description": "Nghiên cứu tạo dòng thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNai kháng đồng thời SMV và BMYV. Tìm hiểu về

• Tác giả: Nguyễn Thị Phương Ngân
• Người hướng dẫn: GS. Chu Hoàng Mậu
• Trường học: Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Sinh học
• Đề tài: Tạo dòng thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi kháng đồng thời SMV và BYMV
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

Tóm tắt

I. Tổng quan về luận văn

Luận văn thạc sĩ này nghiên cứu về việc tạo dòng thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi kháng đồng thời SMV và BYMV. Đây là một chủ đề quan trọng trong lĩnh vực di truyền học và sinh học phân tử. Việc tạo ra các dòng thuốc lá chuyển gen có khả năng kháng virus sẽ giúp giảm thiểu thiệt hại do bệnh virus gây ra.

1.1. Giới thiệu về SMV và BYMV

SMV và BYMV là hai loại virus gây bệnh khảm trên cây đậu tương và cây thuốc lá. Chúng gây ra các triệu chứng như khảm lá, giảm năng suất và chất lượng cây trồng.

1.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu

Nghiên cứu này có tầm quan trọng lớn trong việc tạo ra các giải pháp mới để kiểm soát bệnh virus trên cây trồng. Việc tạo ra các dòng thuốc lá chuyển gen kháng virus sẽ giúp giảm thiểu thiệt hại do bệnh virus gây ra và tăng cường năng suất cây trồng.

II. Phân tích và vấn đề

Phân tích và vấn đề là một phần quan trọng của luận văn này. Việc phân tích các dữ liệu và kết quả nghiên cứu sẽ giúp chúng ta hiểu rõ hơn về cơ chế kháng virus của các dòng thuốc lá chuyển gen. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều vấn đề cần được giải quyết, chẳng hạn như việc tối ưu hóa quá trình chuyển gen và tăng cường khả năng kháng virus của các dòng thuốc lá chuyển gen.

2.1. Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu được sử dụng trong luận văn này bao gồm việc sử dụng kỹ thuật PCR để phân tích sự có mặt của cấu trúc chuyển gen và kỹ thuật real-time PCR để phân tích số lượng bản sao virus trong cây thuốc lá chuyển gen.

2.2. Kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng các dòng thuốc lá chuyển gen có khả năng kháng virus cao hơn so với các dòng thuốc lá không chuyển gen. Tuy nhiên, vẫn cần phải tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quá trình chuyển gen và tăng cường khả năng kháng virus của các dòng thuốc lá chuyển gen.

III. Giải pháp và phương pháp

Giải pháp và phương pháp được sử dụng trong luận văn này bao gồm việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen để tạo ra các dòng thuốc lá chuyển gen kháng virus. Phương pháp này đã được chứng minh là hiệu quả trong việc tạo ra các dòng cây trồng kháng virus.

3.1. Kỹ thuật chuyển gen

Kỹ thuật chuyển gen được sử dụng để chuyển cấu trúc chuyển gen vào cây thuốc lá. Đây là một phương pháp quan trọng trong việc tạo ra các dòng cây trồng chuyển gen.

3.2. Ưu điểm của phương pháp

Ưu điểm của phương pháp này là khả năng tạo ra các dòng cây trồng chuyển gen kháng virus với hiệu suất cao. Phương pháp này cũng có thể được sử dụng để tạo ra các dòng cây trồng kháng virus khác.

IV. Kết luận và ứng dụng

Kết luận và ứng dụng của luận văn này là việc tạo ra các dòng thuốc lá chuyển gen kháng virus có khả năng kháng SMV và BYMV. Đây là một kết quả quan trọng trong việc tạo ra các giải pháp mới để kiểm soát bệnh virus trên cây trồng.

4.1. Kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng các dòng thuốc lá chuyển gen có khả năng kháng virus cao hơn so với các dòng thuốc lá không chuyển gen.

4.2. Ứng dụng của nghiên cứu

Ứng dụng của nghiên cứu này là việc tạo ra các dòng cây trồng chuyển gen kháng virus có khả năng kháng SMV và BYMV. Đây là một giải pháp quan trọng trong việc kiểm soát bệnh virus trên cây trồng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Trong sản xuất nông nghiệp toàn cầu, cây đậu tương (Glycine max) là cây thực phẩm và nguyên liệu thức ăn chăn nuôi chiến lược. Tuy nhiên, cây trồng này thường xuyên đối mặt với hơn 100 loại virus gây hại nghiêm trọng, trong đó Soybean mosaic virus (SMV) và Bean yellow mosaic virus (BYMV) là hai tác nhân nguy hiểm hàng đầu. Khi bị đồng nhiễm cả hai chủng virus thuộc chi Potyvirus, năng suất đậu tương có thể sụt giảm nghiêm trọng từ 66% đến 80%, thậm chí lên đến 95% trong các điều kiện lây nhiễm thực nghiệm.

Tại Việt Nam, các biện pháp canh tác truyền thống và thuốc bảo vệ thực vật không thể điều trị triệt để mầm bệnh virus, trong khi nguồn giống kháng tự nhiên đối với cả SMV và BYMV còn vô cùng hạn chế. Xuất phát từ thực tế này, đề tài tập trung giải quyết bài toán cấp thiết: Ứng dụng kỹ thuật can thiệp RNA (RNA interference - RNAi) nhằm tạo ra nguồn vật liệu di truyền có khả năng kháng đồng thời hai loài virus SMV và BYMV. Mục tiêu cụ thể là chuyển thành công cấu trúc RNAi mang đoạn gen bảo thủ CPi (SMV-BYMV) vào mô lá cây thuốc lá (Nicotiana tabacum C9-1) – sinh vật mô hình kinh điển trong công nghệ sinh học thực vật.

Nghiên cứu được triển khai thực nghiệm toàn diện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật và Phòng thí nghiệm Trọng điểm công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học trong giai đoạn 2013-2015. Kết quả đạt được ghi nhận tỷ lệ chuyển gen và tái sinh chồi đạt 75%, xác nhận 100% dòng thế hệ T0 mang gen chuyển và làm giảm mật độ virus tới 1,93 lần so với đối chứng. Thành công này tạo tiền đề khoa học vững chắc để phát triển các giống đậu tương chuyển gen kháng đa virus trong tương lai.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng cơ chế bất hoạt gen sau phiên mã (Post-Transcriptional Gene Silencing - PTGS), cụ thể là con đường can thiệp RNA (RNAi) từng đoạt giải Nobel Y học năm 2006 của Andrew Fire và Craig Mello. Khi các phân tử RNA sợi đôi (dsRNA) ngoại lai xâm nhập hoặc biểu hiện trong tế bào thực vật, enzyme Dicer sẽ nhận diện và phân cắt thành các đoạn RNA can thiệp ngắn (siRNA) có kích thước từ 21 đến 28 nucleotide. Sau đó, chuỗi đơn siRNA tích hợp vào phức hệ tắt gen RISC (RNA-induced silencing complex) để dẫn đường phân cắt chính xác chuỗi mRNA đích của virus gây bệnh.

Bên cạnh đó, nghiên cứu vận dụng lý thuyết kháng qua trung gian protein vỏ (Coat Protein-Mediated Resistance). Hệ gen của Potyvirus là RNA sợi đơn dương dài khoảng 10.000 nucleotide mã hóa cho polyprotein chức năng, trong đó gen CP giữ vai trò quyết định trong việc hình thành vỏ capsid và truyền bệnh. Nhóm nghiên cứu đã sử dụng vector pK7GW-CPi (SMV-BYMV) chứa đoạn chèn 573 bp, bao gồm 294 bp từ gen CP của SMV liên kết cùng 279 bp từ gen CP của BYMV dưới sự điều khiển của promoter CaMV 35S mạnh, tạo nên cấu trúc kẹp tóc (hairpin RNA) bất hoạt đồng thời hai loại virus.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng 80 mẫu mảnh lá bánh tẻ (kích thước 1 cm x 1 cm) từ cây thuốc lá in vitro khỏe mạnh 3-4 tuần tuổi của giống C9-1, được phân chia ngẫu nhiên thành 2 lô thí nghiệm độc lập (40 mẫu/lô) cùng các lô đối chứng âm và đối chứng dương. Phương pháp biến nạp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chủng CV58C1 mang cấu trúc plasmid tái tổ hợp được lựa chọn nhờ khả năng tích hợp bền vững đoạn T-DNA vào hệ gen thực vật. Quá trình chọn lọc và tái sinh diễn ra trên môi trường MS bổ sung 50 mg/l kanamycin và 400 mg/l cefotaxime.

Để phân tích phân tử, DNA tổng số được tách chiết từ lá non theo phương pháp CTAB cải tiến. Sự hiện diện của gen chuyển được kiểm tra bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-Fi/BYMV-CPi-Ri nhân bản đoạn kích thước 573 bp. Khả năng kháng bệnh sinh học được đánh giá qua phương pháp lây nhiễm nhân tạo bằng dịch nghiền virus kết hợp bột cọ xát Carborundum qua 3 đợt, mỗi đợt cách nhau 15 ngày. Mức độ nhân lên của virus được định lượng chính xác bằng kỹ thuật Real-time RT-PCR với bộ kit SYBR Green I, dựa trên đường chuẩn tuyến tính Y = -168,15x + 4202,7 với nồng độ chuẩn từ 10 đến 1000 bản sao. Việc lựa chọn Real-time RT-PCR đảm bảo độ nhạy cao và định lượng trực tiếp số lượng bản sao virus trong mô thực vật mà không cần qua điện di thứ cấp.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình nghiên cứu đã ghi nhận những kết quả thực nghiệm nổi bật trên cả phương diện nuôi cấy mô, sinh học phân tử và thử nghiệm sinh học:

Thứ nhất, hiệu suất cảm ứng tạo chồi và tái sinh cây chuyển gen đạt mức rất cao. Từ 80 mảnh lá biến nạp ban đầu, có trung bình 30 mảnh lá phát sinh cụm chồi trên môi trường chọn lọc chứa kanamycin 50 mg/l, đạt tỷ lệ cảm ứng 75%. Tổng số chồi thu được là 64 chồi với hệ số 2,62 chồi/mảnh lá, tỷ lệ tạo chồi đạt 62,5%. Ngược lại, 100% mẫu ở lô đối chứng không chuyển gen đặt trên môi trường kháng sinh đều bị vàng úa và chết hoàn toàn sau 2 tuần.

Thứ hai, kết quả kiểm tra di truyền khẳng định 100% số dòng phân tích đã tích hợp thành công cấu trúc RNAi. Điện di sản phẩm PCR của toàn bộ 21 dòng thuốc lá thế hệ T0 đều xuất hiện vạch khuếch đại đặc hiệu kích thước trên 500 bp (tương ứng chính xác với đoạn 573 bp của vector chuẩn pK7GW-CPi), trong khi mẫu đối chứng âm không xuất hiện băng vạch này.

Thứ ba, khả năng ức chế nhân lên của virus vượt trội trong điều kiện lây nhiễm nhân tạo. Sau 3 chu kỳ lây nhiễm trực tiếp SMV và BYMV, các dòng chuyển gen như T05, T012, T019 duy trì trạng thái sinh trưởng xanh tốt, không xuất hiện triệu chứng khảm hay xoăn lá. Phân tích Real-time RT-PCR cho thấy hàm lượng bản sao virus SMV ở cây đối chứng không chuyển gen đạt mức trung bình 810,00 bản sao/1 g lá, cao hơn 1,93 lần so với các dòng chuyển gen (trung bình 418,67 bản sao/1 g lá; trong đó dòng T01 chỉ có 386 bản sao, T03 có 404 bản sao và T02 có 466 bản sao).

Thảo luận kết quả

Sự suy giảm rõ rệt số lượng bản sao virus SMV ở các dòng thuốc lá chuyển gen minh chứng cơ chế RNAi đã được kích hoạt hiệu quả trong tế bào chủ. Khi Potyvirus xâm nhập, cấu trúc hairpin RNA phiên mã từ cassette CPi kích thích cỗ máy tế bào phân giải nhanh chóng bộ gen RNA của virus trước khi chúng kịp lắp ráp vỏ protein và di chuyển liên bào.

Dữ liệu định lượng có thể được trực quan hóa thông qua biểu đồ khuếch đại chu kỳ ngưỡng (Cycle Threshold - Ct) của Real-time RT-PCR. Trên đồ thị, các mẫu chuyển gen đạt điểm bùng phát huỳnh quang muộn hơn đáng kể (giá trị Ct dao động từ 22,23 đến 22,70) so với mẫu đối chứng không chuyển gen (giá trị Ct đạt 20,17). Điều này tương ứng với lượng cDNA virus ban đầu thấp hơn gần một nửa.

Kết quả này hoàn toàn tương đồng với các công bố quốc tế, như nghiên cứu của Yan và cộng sự đạt hiệu quả kháng 83% - 90% đối với TMV trên thuốc lá, hay công trình của Bonfim đạt độ kháng 93% đối với BGMV trên cây đậu. Mức độ biểu hiện tính kháng có sự dao động nhẹ giữa các dòng T0 (từ 386 đến 466 bản sao) được giải thích là do hiệu ứng vị trí (position effect) khi đoạn T-DNA gắn ngẫu nhiên vào các vùng dị nhiễm sắc hoặc nguyên nhiễm sắc khác nhau trên hệ gen thực vật.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các phát hiện thực nghiệm giá trị của đề tài, các khuyến nghị ứng dụng và định hướng nghiên cứu tiếp theo được đề xuất như sau:

Thứ nhất, chuyển giao ngay cấu trúc biểu hiện pK7GW-CPi (573 bp) sang đối tượng cây trồng mục tiêu là cây đậu tương. Các Viện nghiên cứu Nông nghiệp và Học viện Nông nghiệp cần thực hiện biến nạp cấu trúc này vào các giống đậu tương thuần chủ lực tại Việt Nam (như DT84, DT96, Đ9) qua mô sẹo đỉnh sinh trưởng, đặt mục tiêu tạo ra các dòng đậu tương kháng SMV và BYMV với tỷ lệ sống sót trên 80% trong khung thời gian 24 tháng.

Thứ hai, triển khai đánh giá tính ổn định di truyền của gen chuyển qua các thế hệ T1, T2 và T3. Nhóm nghiên cứu phân tử cần phối hợp với trung tâm khảo nghiệm giống thực hiện gieo hạt, phân ly kiểu hình và phân tích mức độ biểu hiện gen liên tục trong thời gian 18 tháng nhằm chọn lọc các dòng đồng hợp tử ổn định phục vụ sản xuất.

Thứ ba, hoàn thiện quy trình kiểm chuẩn dịch hại bằng công nghệ Real-time RT-PCR. Cục Bảo vệ thực vật nên áp dụng bộ mồi và phương trình đường chuẩn tuyến tính Y = -168,15x + 4202,7 để thiết lập quy chuẩn chẩn đoán nhanh mầm bệnh khảm lá cho các vùng thâm canh đậu tương trọng điểm tại Đồng bằng sông Hồng và Tây Nguyên trong vòng 12 tháng.

Thứ tư, xây dựng hồ sơ an toàn sinh học theo Nghị định 69/2010/NĐ-CP. Đơn vị quản lý công nghệ sinh học nông nghiệp cần chủ trì thực hiện các thử nghiệm đánh giá tác động môi trường và an toàn thực phẩm đối với cây trồng mang cấu trúc RNAi trong thời hạn 36 tháng nhằm sớm thương mại hóa giống cây chuyển gen.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung học thuật và quy trình thực nghiệm của luận văn là tài liệu tham khảo giá trị cho 4 nhóm đối tượng chính:

Thứ nhất, các nhà khoa học và nghiên cứu viên chuyên ngành Di truyền học, Công nghệ sinh học thực vật. Luận văn cung cấp chi tiết thiết kế vector chuyển gen Gateway, kỹ thuật tạo cấu trúc can thiệp RNA sợi kép và quy trình tái sinh mô thực vật in vitro.

Thứ hai, các kỹ sư nông học và chuyên gia chọn tạo giống cây trồng. Tài liệu cung cấp cơ sở thực tiễn để định hướng giải pháp phòng trừ tổng hợp bệnh virus học thực vật, hỗ trợ tạo ra các giống cây họ Đậu chống chịu tốt, giúp giảm thiểu thiệt hại năng suất từ 50% đến 80%.

Thứ ba, học viên cao học, nghiên cứu sinh và sinh viên ngành Sinh học. Bản luận văn là một nghiên cứu tình huống chuẩn mực về cách thức kết hợp giữa nuôi cấy mô tế bào, kỹ thuật PCR kiểm tra chèn gen và phân tích định lượng số lượng bản sao bằng Real-time RT-PCR.

Thứ tư, các nhà quản lý nông nghiệp và doanh nghiệp sản xuất hạt giống. Dữ liệu luận văn giúp định hình chiến lược đầu tư vào công nghệ chuyển gen nhằm nâng cao tính tự chủ nguồn nguyên liệu đạm thực vật, giảm áp lực nhập khẩu hàng triệu tấn bột đậu tương mỗi năm.

Câu hỏi thường gặp

Đoạn gen chuyển CPi (SMV-BYMV) có kích thước bao nhiêu và bắt nguồn từ đâu? Đoạn chèn CPi có tổng chiều dài 573 bp, là cấu trúc khảm nhân tạo gồm đoạn 294 bp thuộc gen mã hóa protein vỏ (CP) của Soybean mosaic virus và đoạn 279 bp thuộc gen CP của Bean yellow mosaic virus. Thiết kế này giúp kích hoạt cơ chế can thiệp RNA để phân hủy cùng lúc cả hai loại virus.

Hiệu quả tái sinh chồi của mô lá thuốc lá chuyển gen đạt mức độ nào? Quá trình cảm ứng trên môi trường nuôi cấy đạt tỷ lệ tạo chồi 75% với mật độ 2,62 chồi/mảnh lá. Trên môi trường chứa chất kháng sinh chọn lọc kanamycin 50 mg/l và cefotaxime 400 mg/l, các chồi chuyển gen sinh trưởng bình thường, trong khi 100% mẫu đối chứng không chuyển gen đều chết úa.

Kỹ thuật PCR và Real-time RT-PCR chứng minh điều gì trong luận văn? Phản ứng PCR xác nhận 100% (21/21) dòng thuốc lá T0 mang đoạn gen CPi kích thước 573 bp. Kỹ thuật Real-time RT-PCR định lượng chính xác số lượng bản sao virus, chỉ ra rằng cây đối chứng chứa 810 bản sao/1 g lá, cao hơn 1,93 lần so với cây chuyển gen (trung bình 418,67 bản sao/1 g lá).

Vì sao lại thử nghiệm trên cây thuốc lá C9-1 thay vì chuyển trực tiếp vào đậu tương? Cây thuốc lá Nicotiana tabacum C9-1 là sinh vật mô hình có chu kỳ sinh trưởng ngắn, hiệu suất tái sinh in vitro cao và mẫn cảm với các virus họ Potyviridae. Thử nghiệm trên mô hình thuốc lá giúp tối ưu hóa vector và kiểm chứng tính năng của cấu trúc RNAi trước khi thực hiện trên đậu tương.

Cây chuyển gen có khả năng duy trì tính kháng virus bền vững không? Các cây chuyển gen ở thế hệ T0 biểu hiện tính kháng mạnh mẽ qua 3 đợt lây nhiễm nhân tạo liên tiếp, giữ lá xanh tốt không bị xoăn khảm. Tuy nhiên, tính ổn định di truyền cần tiếp tục được theo dõi ở các thế hệ sau (T1, T2) để đảm bảo gen không bị tắt biểu hiện.

Kết luận

Công trình nghiên cứu đã hoàn thành xuất sắc các mục tiêu khoa học đề ra với 5 kết quả cốt lõi:

• Chuyển thành công vector pK7GW/SMV-BYMV-CPi vào giống thuốc lá C9-1 thông qua A. tumefaciens với tỷ lệ cảm ứng chồi đạt 75%.
• Tái sinh hoàn chỉnh các dòng cây chuyển gen trên môi trường chọn lọc kháng sinh và đưa ra trồng thành công trong điều kiện nhà lưới.
• Xác nhận 21/21 dòng thuốc lá thế hệ T0 (tỷ lệ 100%) mang cấu trúc chuyển gen CPi kích thước 573 bp bằng kỹ thuật PCR.
• Khẳng định tính kháng sinh học vượt trội của các dòng chuyển gen qua 3 đợt lây nhiễm nhân tạo với biểu hiện sinh trưởng xanh tốt.
• Định lượng bằng Real-time RT-PCR chứng minh các dòng chuyển gen làm suy giảm mật độ bản sao virus SMV tới 1,93 lần (đạt trung bình 418,67 bản sao/1 g lá so với 810,00 bản sao ở đối chứng).

Đóng góp lớn nhất của luận văn là thiết lập thành công hệ thống biểu hiện RNAi kháng kép hai loại virus nguy hiểm SMV và BYMV. Trong kế hoạch 12-24 tháng tới, hướng nghiên cứu cần nhanh chóng được mở rộng trên cây đậu tương thực địa. Hãy đón đọc và ứng dụng các phát hiện giá trị từ luận văn để cùng chung tay thúc đẩy nền nông nghiệp công nghệ cao bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. SOYBEAN MOSAIC VIRUS VÀBEAN YELLOW MOSAIC VIRUS 1. Bênḥ khảm ởcây đâụ tương Đậu tương nói riêng vàthưc̣ vâṭnói chung dễ bị nhiễm các bênḥ như bênḥ khảm, bệnh xoăn lá do virus; bệnh gỉ sắt do nấm Phakopsora pachyrhizi, bệnh Sương mai (đốm phấn) do nấm Peronospora manshurica, bệnh lở cổ rễ do nấm Rhizoctonia solani hoặc Fusarium solani fsp phaseoly, bệnh đốm lá vi khuẩn hại đậu tương và một số bệnh hại khác. Đối với cây đâụ tương, thống kê trên thế giới cho thấy có hơn 100 loại virus gây hại vàphân bố rộng khắp và gây thiệt hại lớn đến năng suất và chất lượng sản phẩm.

Cây đậu tương bị nhiễm bệnh nặng, năng suất có thể bị giảm đến 50% khi trồng ở ngoài đồng, thậm chí mức giảm có thể lên đến 93% - 95% trong điều kiện lây nhiễm trong phòng thí nghiệm [11]. Một số nước có tỷ lệ thiệt hại lớn do bệnh virus ở đậu tương, như vùng Georgia ở Mỹ (37%), Australia và Thái lan (60%), New Zealand và khu vực Bắc Mỹ (40-50%)[11], [17], [33]. Bệnh khảm đậu tương do virus nhóm khảm (Potyvirus) gây ra. Bệnh được phát hiện lần đầu tiên ở Mỹ vào năm 1900 và đến nay virus khảm đậu tương đã có mặt ở hầu hết các vùng trồng đậu tương trên thế giới.

Việt Nam cũng đã công bố phát hiện loại virus này từ năm 1994, chủ yếu tập trung ở những vùng trồng đậu tương lớn, như khu vực trung du, miền núi Bắc bộ, khu vực Đồng bằng sông Hồng và Tây Nguyên [4], [11]. Các nhà khoa học đã xác định trong một số loài virus đặc biệt nguy hiểm, gây hại trên cây đậu tương, có Soybean mosaic virus (SMV) và Bean yellow mosaic virus (BYMV) [10], [11], [31]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn 5 SMV là loài virus gây bệnh khảm ở cây đậu tương, thuộc nhóm Potyvirus, họ Potyviridae, và là một trong những virus chủ yếu nhất gây bệnh ở đậu tương. Bệnh do SMV gây ra xảy ra trên phạm vi toàn thế giới [10], [25].

Khi bị bệnh lá cây có những phần xanh nhạt, đậm và biến vàng xen kẽ. Lá non ở ngọn khảm mạnh và biến dạng, các đốt thân co ngắn, cây chùn lại, phát triển chậm. Quả ít và thường lép biến dạng, sần sùi, có vị đắng. Lá cây đậu tương bị nhiễm SMV SMV gây thiệt hại đáng kể về năng suất, thậm chí ở một số trường hợp tổn thất có thể lên đến 94% tổng sản lượng đậu tương.

Những cây đậu tương bị nhiễm SMV thường sinh trưởng phát triển chậm, hình thái thân, lá, quả bị biến dạng, và khi bị nhiễm ở giai đoạn muộn sẽ làm giảm sản lượng và chất lượng hạt [35] [36]. Họ Potyviridae được biết đến là có số lượng loài lớn nhất trong các họ virus gây bệnh ở thực vật. Nếu nhiễm đồng thời Potyvirus và các loài virus khác thì thiệt hại về năng suất và chất lượng hạt đậu tương tăng lên gấp bội [48]. Những cây bị nhiễm Potyvirus cũng dễ bị nhiễm thêm các nấm gây bệnh hơn [48].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn 6 SMV sinh ra thể vùi trong tế bào cây bệnh. Thể vùi có dạng hình múi khế hay hình chong chóng. Thời gian tồn tại của virus trong cây bệnh là 2-5 ngày, nhiệt độ mất hoạt tính Q10 là 55- 70 0C. Khi bị chiếu tia cực tím virus bị mất hoạt tính trong hai giờ.

Độ pH thích hợp là 6. Nhiệt độ thích hợp để virus nhân lên trong tế bào cây bệnh là 21-260C. Tại Hoa Kỳ, SMV đã được phân thành chín chủng bằng cách sử dụng các phản ứng di truyền trên tám giống cây. Ngoài SMV, BYMV cũng gây nên bệnh khảm ở đậu tương.

Trước đây, bệnh khảm vàng lá do BYMV gây ra thường bị nhầm lẫn với bệnh khảm do SMV và sau này mới được xác nhận là do virus khác gây ra. Bệnh này tương đối ít nghiêm trọng hơn bệnh khảm, hầu như cây vẫn tăng trưởng và cho năng suất bình thường. BYMV là một loại virus thuộc chi potyvirus, họ potyviridae, có vật liệu di truyền là sợi đơn RNA. So với phần lớn các potyvirus BYMV có phạm vi ký chủ rất rộng trên toàn thế giới, có khả năng lây nhiễm bệnh vào cả các cây họ đậu và không thuộc họ đậu.

BYMV có dạng sợi mềm, có chiều dài khoảng 750 nm, đường kính 15nm. BYMV không được lan truyền qua hạt giống mà chỉ có thể lan truyền qua các loài rầy mềm như Aphis tabae Seop và Macrosiphum pisi Kalt. Virus này có một số dạng chuyên tính khác nhau, gây ra các triệu chứng bệnh khác nhau và có thể chịu được độ pha loãng 1:1000 và mất hoạt tính ở 56-60 0C [27]. Đối với cây đậu tương, SMV và BYMV có thể nhiễm đồng thời trên cùng một cây và triệu chứng rất khó phân biệt.

Ảnh hưởng của việc nhiễm cùng lúc nhiều loại virus khác nhau dẫn tới năng suất đậu tương có thể bị giảm từ 66% - 80% [34]. Bằng các quan sát thực địa nhóm tác giả ở Ukraine Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn 7 đã xác định được triệu chứng nhiễm hai loại SMV và BYMV ở đậu tương vùng Cherkassy, Vinnitsa, Kiev và kết quả đã được xác nhận bằng kính hiển vi điện tử và kỹ thuật ELISA [41]. Trên cơ sở phân tích gen và thiết lập cây phát sinh loài một số tác giả cho rằng BYMV phân lập từ các vùng thuộc Cộng hòa Séc được phân bố ở ba nhóm trên sơ đồ hình cây và không phụ thuộc vào cây chủ [45]. Phản ứng của cây đậu tương đối với SMV và BYMV phụ thuộc vào kiểu gen của giống, chủng virus, tuổi cây, thời gian lây nhiễm, nhiệt độ không khí và các điều kiện môi trường khác [11],[23].

SMV và BYMV có thể xâm nhiễm trực tiếp vào tế bào đậu tương hoặc có thể xâm nhiễm qua môi giới trung gian là rệp. Virus và cơ thể côn trùng có mối quan hệ sinh học với nhau. Virus có thể tiềm ẩn một thời gian dài trong cơ thể côn trùng, qua tuyến nước bọt để đi vào hệ thống tiêu hoá thấm qua thành ruột vào máu rồi trở lại tuyến nước bọt. Sau giai đoạn tiềm ẩn, virus được nhân lên trong cơ thể côn trùng và ở thời điểm này côn trùng có khả năng truyền bệnh một cách nhanh chóng.

Tuy nhiên khả năng truyền bệnh của côn trùng cũng có những hạn chế do tuổi của côn trùng thường rất ngắn [8], [9],[11]. SMV có khả năng xâm nhập vào tế bào qua các vết thương nhẹ do cọ xát giữa các cây với nhau, hoặc còn có thể truyền bệnh trong trường hợp hạt phấn bị nhiễm virus rơi vào noãn của cây. SMV di chuyển trong tế bào chất và có thể di chuyển sang tế bào khác thông qua các sợi liên bào. Sau 3 ngày virus mới nhiễm hết một lá đơn, sau 4 ngày thì mới nhiễm hết đoạn gân của lá kép và một phần đoạn thân sát gốc [11], [47].

Sau 5 ngày virus nhiễm hết dọc thân chính và các lá ngọn, khoảng sau 25 ngày virus có thể nhiễm trên toàn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www. Khi cây trưởng thành có thể bị nhiễm virus từ 90 - 100% ở các mức độ biểu hiện bệnh khác nhau [11], [48]. SMV và BYMV có cấu tạo đơn giản, gồm hai thành phần chính là protein (60 - 95%) và nucleic acid (5 - 40%) [52]. Hệ gen của SMV và BYMV là RNA sợi đơn dương (RNA (+)).

Đời sống của Potyvirus sau khi xâm nhập vào các tế bào chủ qua mô tổn thương bao gồm quá trình dịch mã, xử lý polyprotein, nhân lên của mRNA, quá trình lắp ráp RNA và protein vỏ thành hạt virus và di chuyển đến các tế bào khác, tới các bộ phận của cây và các cây khác [48]. SMV lan truyền qua rệp vừng, bọ trĩ và hạt giống bị nhiễm bệnh. Rệp ăn lá từ cây này sang cây khác và mang theo mầm bệnh. Trên thế giới có khoảng 30 loài rệp truyền virus SMV.

Nghiên cứu gần đây đã khẳng định rệp vừng ở đậu tương (Aphis Glycine) là môṭ vector của virus khảm đậu tương. Rệp càng nhiều thì tỉ lệ nhiễm bệnh càng cao. Vậy cách hiệu quả nhất kiểm soát bệnh là tạo ra giống đậu tương kháng virus SMV nhằm nâng cao năng suất và chất lượng đậu tương [8],[9]. Hệ gen của SMV, BYMV và Potyvirrus Các Potyvirus có dạng thanh, khúc khuỷu dài khoảng 750 nm và đường kính là 11-15 nm và bao gồm các protein vỏ được sắp xếp đối xứng, xoắn ốc xung quanh phân tử RNA sợi đơn dương.

Phân tử RNA có khoảng 10. Hệ gen RNA có đầu 3’gắn đuôi poly A và một protein virion kết nối gen (VPg) ở đầu 5’. RNA virus được dịch mã tạo ra một polyprotein được phân cắt bởi protease tạo thành ít nhất 10 phân tử protein [39] (hình 1. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.

Sơ đồcấu trúc hệ protein của potyvirus [39] (UTR) vùng 5 'và 3': vùng chưa dịch mã; CP: protein vỏ của virus; Nib: RNA polymerase phụ thuộc RNA;P1, P3, Nia: protease; CI: protein hình trụ; VPg: protein liên kết; HC-Pro: thành phần trợ giúp và protease. Theo Won-Seok Lim và cs (2003), trình tự nucleotide hoàn chỉnh của hệ gen SMV chủng G5 (SMV-G5), G7H (SMV-G7H) gồm 9588 nucleotide (chưa kể đuôi poly A), chứa một khung đọc mở (ORF) mã hóa cho một polyprotein mà sau đó được phân cắt thành 10 phân tử protein chức năng. So sánh trình tự amino acid của 2 chủng G5 và G7 với các chủng SMV khác cho thấy sự tương đồng lớn giữa chúng. Hệ số tương đồng về trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn giữa chủng SMV-G5 và SMV-G7H là 99% [38], [54].

Trình tự đầy đủ các nucleotide của các chủng này có thể cung cấp những cơ sở để xác định các yếu tố quyết định đến triệu chứng bệnh khảm ở cây đậu tương, từ đó có các biện pháp hiệu quả để phòng trừ SMV cho cây đậu tương. Gen CP là gen đặc trưng nhất ở các Potyvirus, mã hóa protein CP được chia thành ba vùng: vùng đầu N, vùng lõi và vùng đầu C. Chức năng của CP thể hiện trong sự nhân lên, capsid hóa, di chuyển của virus từ tế bào đến tế bào và trong sự truyền virus của côn trùng truyền bệnh. Chính vai trò quan trọng của gen CP đối với hoạt động sống của Potyvirus mà trình tự gen này Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn 10 được sử dụng để kháng lại chính các loài virus gây bệnh trong kỹ thuật chuyển gen theo nguyên lý RNAi [18], [19], [42].