Luận văn thạc sĩ về hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase từ thực vật

• Tác giả: Trần Giang Sơn
• Người hướng dẫn: TS. Hà Cam Anh
• Trường học: Đại học Bách Khoa, ĐHQG TP. Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học
• Đề tài: Nghiên Cứu Hoạt Chất Ức Chế Enzyme α-Glucosidase Từ Thực Vật
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

• LỜI CÁM ƠN
• TÓM TẮT LUẬN VĂN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG
• 1.1. Bệnh DTD trên thế giới và Việt Nam
• 1.2. Định nghĩa và phương pháp chuẩn đoán
• 1.3. Các biến chứng của bệnh DTD tuýp 2
• 1.4. Các phương pháp điều trị bệnh DTD tuýp 2
• 1.5. Điều trị bệnh DTD tuýp 2 bằng thực vật
• 1.5.1. Phương pháp ức chế enzyme ơ-gucosidase
• 1.5.2. Các nghiên cứu trong và ngoài nước gần đây
• 1.5.3. Các hoạt tính của thực vật hỗ trợ ngăn ngừa các biến chứng của bệnh DTD tuýp 2
• 1.6. Các loài thực vật khảo sát
• 1.6.1. Cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum.)
• 1.6.2. Cây bình bát (Annona reticulate L.)
• 1.6.3. Dây bình bát (Coccinia grandis (L) Voigt)
• 1.6.4. Cây nghề (Polygonum pulchrum Bl.)
• 1.6.5. Cây rau trai (Commelina communis)
• 2. CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
• 2.1. Mục tiêu, đối tượng và nội dung nghiên cứu
• 2.1.1. Mục tiêu và đối tượng nghiên cứu
• 2.1.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.2. Hóa chất và thiết bị
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp đo độ âm
• 2.3.2. Phương pháp xác định độ tro toàn phần
• 2.3.3. Định lượng polyphenol tổng theo phương pháp Folin — Ciocalteau
• 2.3.4. Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme a-glucosidase in vitro
• 2.3.5. Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa theo phương pháp DPPH
• 2.3.6. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
• 2.3.7. Khảo sát hoạt tính kháng viêm
• 2.4. Nội dung thực nghiệm
• 2.4.1. Sàng lọc khả năng ức chế enzyme a-glucosidase của năm loài thực vật
• 2.4.2. Sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme a-glucosidase và khả năng ngăn ngừa biến chứng của DTD tuýp 2 của cây có hoạt tính mạnh nhất
• 2.4.3. Nghiên cứu quy trình chiết
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Sàng lọc khả năng ức chế enzyme a-glucosidase của năm loài thực vật
• 3.1.1. Chuẩn bị và đánh giá nguyên liệu
• 3.1.2. Hiệu suất chiết
• 3.1.3. Hàm lượng polyphenol tổng và khả năng ức chế enzyme a-glucosidase
• 3.2. Sàng lọc khả năng ức chế enzyme a-glucosidase và ngăn ngừa biến chứng của DTD tuýp 2 của cây DHCĐ An Giang
• 3.2.1. Chuẩn bị và đánh giá nguyên liệu
• 3.2.2. Hiệu suất chiết
• 3.2.3. Hàm lượng polyphenol tổng và khả năng ức chế enzyme a-glucosidase
• 3.2.4. Khảo sát các hoạt tính hỗ trợ ngăn ngừa biến chứng DTD tuýp 2
• 3.2.5. So sánh và đánh giá
• 3.3. Nghiên cứu quy trình chiết cao tổng
• 3.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết lên cao tổng
• 3.3.2. Ảnh hưởng của thời gian chiết lên cao tổng
• 3.3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ chiết lên cao tổng
• 3.3.4. Đánh giá sản phẩm cao tổng
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

I. Giới thiệu về bệnh đái tháo đường

Bệnh đái tháo đường (DTD) là một trong những bệnh mãn tính không lây nhiễm phổ biến trên thế giới. Theo WHO, DTD là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ tư ở các nước phát triển. Tăng glucose máu mãn tính trong DTD dẫn đến rối loạn chức năng các cơ quan nội tạng, gây ra các biến chứng nghiêm trọng như bệnh tim mạch, suy thận, và mù mắt. Tại Việt Nam, tỷ lệ người mắc DTD đã gia tăng nhanh chóng, với 5-7% dân số bị ảnh hưởng. Việc điều trị DTD thường bao gồm dinh dưỡng, luyện tập và sử dụng thuốc, nhưng các loại thuốc hiện có thường đi kèm với nhiều tác dụng phụ. Do đó, việc tìm kiếm các phương pháp điều trị từ thực vật là cần thiết.

1.1. Tình hình bệnh DTD tại Việt Nam

Tại Việt Nam, số người mắc bệnh DTD đã tăng gấp đôi trong 10 năm qua. Theo các nghiên cứu, tỷ lệ mắc DTD ở Việt Nam lên đến 5,7%, cao hơn so với con số 3,7% mà IDF đưa ra. Điều này cho thấy sự cần thiết phải có các biện pháp phòng ngừa và điều trị hiệu quả hơn. Các nghiên cứu cho thấy rằng nhiều người không nhận thức được tình trạng bệnh của mình cho đến khi có biến chứng nghiêm trọng. Gánh nặng kinh tế từ DTD cũng rất lớn, chiếm khoảng 12% tổng chi phí chăm sóc sức khỏe.

II. Nghiên cứu hoạt chất ức chế enzyme α glucosidase

Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định các hoạt chất có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase từ năm loài thực vật thu hái ở An Giang. Kết quả cho thấy cây diệp hạ châu đắng có hoạt tính ức chế mạnh nhất với IC50 là 4,35 µg/mL, thấp hơn 1,6 lần so với acarbose, một loại thuốc điều trị DTD phổ biến. Việc xác định hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase là rất quan trọng trong việc phát triển các phương pháp điều trị mới cho bệnh DTD.

2.1. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng phương pháp chiết xuất để thu nhận các hoạt chất từ năm loài thực vật. Các mẫu được phân tích để xác định hàm lượng polyphenol tổng và khả năng ức chế enzyme α-glucosidase. Kết quả cho thấy rằng lá của cây diệp hạ châu đắng có hoạt tính ức chế enzyme mạnh nhất, với IC50 là 1,01 µg/mL. Điều này cho thấy tiềm năng của cây diệp hạ châu đắng trong việc điều trị DTD.

III. Đánh giá hoạt tính kháng viêm và kháng khuẩn

Ngoài khả năng ức chế enzyme α-glucosidase, nghiên cứu cũng khảo sát hoạt tính kháng viêm và kháng khuẩn của các cao chiết từ thực vật. Kết quả cho thấy cây diệp hạ châu đắng không chỉ có khả năng ức chế enzyme mà còn có hoạt tính kháng viêm và kháng khuẩn tốt. Điều này mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc phát triển các sản phẩm từ thiên nhiên có tác dụng điều trị bệnh DTD và ngăn ngừa các biến chứng.

3.1. Tính khả thi trong ứng dụng thực tiễn

Việc sử dụng các hoạt chất từ thực vật trong điều trị DTD không chỉ giúp giảm thiểu tác dụng phụ mà còn có thể mang lại hiệu quả cao trong việc kiểm soát bệnh. Các loài thực vật như diệp hạ châu đắng có thể được sử dụng như một phương pháp điều trị bổ sung, giúp cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân DTD. Hơn nữa, việc phát triển các sản phẩm từ thiên nhiên có thể giảm sự phụ thuộc vào thuốc tổng hợp, mang lại lợi ích kinh tế cho người dân.

Tổng quan nghiên cứu

Bệnh đái tháo đường (DTD) là một trong những bệnh mãn tính không lây nhiễm phổ biến và có mức độ nguy hiểm cao trên toàn cầu. Theo Liên đoàn Đái tháo đường Quốc tế (IDF), năm 2015 có khoảng 8,8% dân số thế giới mắc DTD, tương đương 382 triệu người, dự kiến tăng lên 592 triệu vào năm 2035. Ở Việt Nam, tỷ lệ mắc DTD năm 2014 là khoảng 5-7%, trong đó DTD tuýp 2 chiếm 90-95%. Bệnh gây ra nhiều biến chứng nghiêm trọng như tổn thương mắt, thận, tim mạch và thần kinh, đồng thời tạo gánh nặng kinh tế lớn với chi phí điều trị toàn cầu lên đến 415 tỷ USD năm 2015.

Hiện nay, các phương pháp điều trị DTD tuýp 2 chủ yếu bao gồm dinh dưỡng, luyện tập và sử dụng thuốc. Tuy nhiên, thuốc tổng hợp thường có nhiều tác dụng phụ như tăng cân, loãng xương, rối loạn tiêu hóa và chi phí cao. Do đó, việc tìm kiếm các hoạt chất tự nhiên có khả năng ức chế enzyme a-glucosidase, giúp giảm hấp thu glucose và ngăn ngừa biến chứng DTD, đang được quan tâm. Nghiên cứu này tập trung sàng lọc các hoạt chất ức chế enzyme a-glucosidase từ năm loài thực vật thu hái tại An Giang, Việt Nam, gồm diệp hạ châu đắng, cây bình bát, dây bình bát, cây nghề và rau trai. Mục tiêu là xác định loài có hoạt tính mạnh nhất, khảo sát các bộ phận của cây, đánh giá các hoạt tính hỗ trợ ngăn ngừa biến chứng DTD và tối ưu quy trình chiết xuất nhằm ứng dụng trong thực phẩm chức năng và dược phẩm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Cơ chế ức chế enzyme a-glucosidase: Enzyme a-glucosidase thủy phân oligosaccharide thành glucose tại ruột non, làm tăng đường huyết sau ăn. Việc ức chế enzyme này giúp giảm hấp thu glucose, kiểm soát đường huyết hiệu quả.
• Hoạt tính polyphenol và tác dụng sinh học: Polyphenol là nhóm hợp chất có khả năng chống oxy hóa, kháng viêm và kháng khuẩn, góp phần ngăn ngừa biến chứng DTD.
• Mô hình đánh giá hoạt tính sinh học in vitro: Sử dụng các phương pháp đo hoạt tính ức chế enzyme a-glucosidase, kháng oxy hóa (DPPH), kháng viêm (ức chế biến tính albumin) và kháng khuẩn (khuếch tán trên đĩa thạch).
• Khái niệm IC50: Nồng độ mẫu cần thiết để ức chế 50% hoạt tính enzyme, chỉ số đánh giá hiệu quả ức chế enzyme.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Năm loài thực vật được thu hái tại Long Xuyên, An Giang, Việt Nam. Nguyên liệu được sơ chế, phơi khô, xay bột và bảo quản theo tiêu chuẩn dược điển.
• Phương pháp phân tích:
  • Định lượng polyphenol tổng theo phương pháp Folin-Ciocalteau.
  • Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme a-glucosidase in vitro dựa trên phản ứng thủy phân p-NPG.
  • Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH.
  • Đánh giá hoạt tính kháng viêm qua ức chế biến tính albumin.
  • Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch với các chủng vi khuẩn gram dương và gram âm.
• Cỡ mẫu và chọn mẫu: Mỗi loài thực vật được xử lý thành ba lô mẫu độc lập, mỗi mẫu được phân tích ba lần để đảm bảo độ tin cậy.
• Timeline nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trong vòng 12 tháng, từ thu hái nguyên liệu, chuẩn bị mẫu, phân tích đến tối ưu quy trình chiết xuất.
• Tối ưu quy trình chiết: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ (45-85°C), thời gian (1-5 giờ) và tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (10:1 đến 50:1 mL/g) với dung môi nước nhằm đạt hiệu suất chiết và hoạt tính ức chế enzyme cao nhất.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Khả năng ức chế enzyme a-glucosidase của năm loài thực vật:
   • Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) có hoạt tính mạnh nhất với IC50 là 4,35 µg/mL, thấp hơn 1,6 lần so với acarbose (thuốc chuẩn).
   • Các loài còn lại có IC50 cao hơn nhiều, thể hiện hoạt tính ức chế yếu hơn.
2. Hoạt tính ức chế enzyme của các bộ phận cây diệp hạ châu đắng:
   • Lá có hoạt tính mạnh nhất với IC50 là 1,01 µg/mL, vượt trội so với rễ, thân cành và quả.
   • Hàm lượng polyphenol tổng của lá cũng cao nhất, đạt 128,83 mg GAE/g cao.
3. Hoạt tính hỗ trợ ngăn ngừa biến chứng DTD:
   • Cao lá và cao toàn cây diệp hạ châu đắng thể hiện khả năng kháng oxy hóa mạnh (IC50 DPPH khoảng 40-50 µg/mL).
   • Hoạt tính kháng viêm và kháng khuẩn cũng được ghi nhận, với hiệu quả ức chế biến tính albumin và ức chế vi khuẩn Staphylococcus aureus, Escherichia coli.
4. Tối ưu quy trình chiết xuất:
   • Nhiệt độ chiết 65°C, thời gian 2 giờ và tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 20:1 mL/g cho hiệu suất chiết cao nhất và hoạt tính ức chế enzyme tốt nhất với IC50 là 9,26 µg/mL.
   • Các điều kiện khác như nhiệt độ thấp hơn hoặc cao hơn, thời gian ngắn hoặc dài hơn, tỷ lệ dung môi không phù hợp làm giảm hiệu quả chiết và hoạt tính sinh học.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy diệp hạ châu đắng là loài thực vật có tiềm năng cao trong việc ức chế enzyme a-glucosidase, hỗ trợ điều trị DTD tuýp 2 và ngăn ngừa biến chứng. Hoạt tính ức chế enzyme của lá vượt trội so với các bộ phận khác, phù hợp với hàm lượng polyphenol cao nhất tại bộ phận này. Các hoạt tính kháng oxy hóa, kháng viêm và kháng khuẩn bổ sung giúp giảm stress oxy hóa và viêm, hai yếu tố quan trọng trong cơ chế phát triển biến chứng DTD.

So sánh với các nghiên cứu trong và ngoài nước, IC50 của diệp hạ châu đắng thấp hơn nhiều so với các loài thực vật khác như cây bình bát, dây bình bát, cây nghề và rau trai, cũng như so với acarbose. Điều này khẳng định giá trị dược liệu của diệp hạ châu đắng trong điều trị DTD.

Việc tối ưu quy trình chiết xuất với dung môi nước ở điều kiện 65°C, 2 giờ và tỷ lệ 20:1 mL/g không chỉ đảm bảo hiệu suất chiết cao mà còn thân thiện với môi trường và phù hợp cho sản xuất thực phẩm chức năng. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh IC50 của các loài thực vật, biểu đồ hàm lượng polyphenol và biểu đồ hiệu suất chiết theo các điều kiện chiết khác nhau.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển sản phẩm thực phẩm chức năng từ diệp hạ châu đắng:
   • Áp dụng quy trình chiết xuất tối ưu (65°C, 2 giờ, tỷ lệ 20:1) để sản xuất cao chiết giàu polyphenol và hoạt tính ức chế enzyme a-glucosidase.
   • Mục tiêu giảm IC50 dưới 10 µg/mL, thời gian triển khai 12-18 tháng, chủ thể thực hiện là các doanh nghiệp dược phẩm và thực phẩm chức năng.
2. Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động và an toàn:
   • Thực hiện các nghiên cứu in vivo và thử nghiệm lâm sàng để đánh giá hiệu quả và độ an toàn của cao chiết diệp hạ châu đắng.
   • Thời gian 24-36 tháng, chủ thể là các viện nghiên cứu và trường đại học.
3. Khuyến khích trồng và bảo tồn nguồn nguyên liệu tại An Giang:
   • Hỗ trợ nông dân trồng diệp hạ châu đắng theo tiêu chuẩn hữu cơ, đảm bảo nguồn nguyên liệu sạch và ổn định.
   • Mục tiêu tăng diện tích trồng lên khoảng 50 ha trong 3 năm, chủ thể là chính quyền địa phương và các tổ chức nông nghiệp.
4. Tăng cường đào tạo và chuyển giao công nghệ:
   • Tổ chức các khóa đào tạo về kỹ thuật chiết xuất và kiểm soát chất lượng cho các doanh nghiệp vừa và nhỏ.
   • Thời gian 6-12 tháng, chủ thể là các trường đại học và trung tâm nghiên cứu.
5. Xây dựng hệ thống kiểm soát chất lượng và tiêu chuẩn hóa sản phẩm:
   • Thiết lập tiêu chuẩn chất lượng cao chiết diệp hạ châu đắng dựa trên hàm lượng polyphenol và hoạt tính ức chế enzyme.
   • Chủ thể thực hiện là các cơ quan quản lý dược phẩm và tiêu chuẩn quốc gia.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành dược học, kỹ thuật hóa học, công nghệ sinh học:
   • Học hỏi phương pháp sàng lọc hoạt tính enzyme, kỹ thuật chiết xuất và đánh giá hoạt tính sinh học.
   • Áp dụng làm cơ sở cho các đề tài nghiên cứu tiếp theo về dược liệu và điều trị DTD.
2. Doanh nghiệp sản xuất thực phẩm chức năng và dược phẩm:
   • Tham khảo quy trình chiết xuất tối ưu và dữ liệu hoạt tính sinh học để phát triển sản phẩm mới hỗ trợ điều trị DTD.
   • Tăng cường năng lực nghiên cứu và phát triển sản phẩm dựa trên nguồn nguyên liệu bản địa.
3. Cơ quan quản lý y tế và dược phẩm:
   • Sử dụng kết quả nghiên cứu để xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và chính sách phát triển dược liệu trong điều trị DTD.
   • Hỗ trợ định hướng phát triển ngành dược liệu và thực phẩm chức năng tại Việt Nam.
4. Bác sĩ, chuyên gia dinh dưỡng và người bệnh DTD:
   • Hiểu rõ về các lựa chọn điều trị bổ sung từ thảo dược có hiệu quả và an toàn.
   • Áp dụng kiến thức để tư vấn và lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp, giảm tác dụng phụ của thuốc tổng hợp.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao cần ức chế enzyme a-glucosidase trong điều trị đái tháo đường?
   Ức chế enzyme a-glucosidase giúp làm chậm quá trình thủy phân carbohydrate thành glucose tại ruột non, từ đó giảm hấp thu glucose và kiểm soát đường huyết sau ăn hiệu quả, hạn chế biến chứng DTD.

2. Hoạt tính ức chế enzyme của diệp hạ châu đắng có mạnh không so với thuốc chuẩn?
   Diệp hạ châu đắng có IC50 là 4,35 µg/mL, thấp hơn 1,6 lần so với acarbose, cho thấy hoạt tính ức chế enzyme rất mạnh và tiềm năng ứng dụng cao.

3. Các hoạt tính hỗ trợ ngăn ngừa biến chứng DTD của diệp hạ châu đắng là gì?
   Ngoài ức chế enzyme, diệp hạ châu đắng còn có hoạt tính kháng oxy hóa, kháng viêm và kháng khuẩn, giúp giảm stress oxy hóa và viêm, hai yếu tố quan trọng trong phát triển biến chứng DTD.

4. Quy trình chiết xuất tối ưu của diệp hạ châu đắng là gì?
   Chiết bằng dung môi nước ở 65°C trong 2 giờ với tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 20:1 mL/g cho hiệu suất chiết và hoạt tính ức chế enzyme cao nhất.

5. Làm thế nào để ứng dụng kết quả nghiên cứu vào thực tế?
   Có thể phát triển sản phẩm thực phẩm chức năng hoặc dược phẩm từ cao chiết diệp hạ châu đắng, đồng thời triển khai nghiên cứu lâm sàng để đánh giá hiệu quả và an toàn, hỗ trợ người bệnh DTD.

Kết luận

• Diệp hạ châu đắng là loài thực vật có hoạt tính ức chế enzyme a-glucosidase mạnh nhất trong năm loài khảo sát, với IC50 chỉ 4,35 µg/mL, vượt trội so với thuốc chuẩn acarbose.
• Lá diệp hạ châu đắng chứa hàm lượng polyphenol cao nhất (128,83 mg GAE/g cao) và có hoạt tính ức chế enzyme mạnh nhất (IC50 1,01 µg/mL).
• Cao chiết diệp hạ châu đắng còn thể hiện các hoạt tính kháng oxy hóa, kháng viêm và kháng khuẩn, góp phần ngăn ngừa biến chứng DTD tuýp 2.
• Quy trình chiết xuất tối ưu với dung môi nước ở 65°C, 2 giờ và tỷ lệ 20:1 mL/g đạt hiệu suất chiết và hoạt tính sinh học cao, phù hợp cho sản xuất thực phẩm chức năng.
• Nghiên cứu mở ra hướng phát triển sản phẩm tự nhiên hỗ trợ điều trị DTD, đồng thời đề xuất các bước tiếp theo gồm nghiên cứu lâm sàng, phát triển sản phẩm và bảo tồn nguồn nguyên liệu.

Hành động tiếp theo là triển khai nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động và thử nghiệm lâm sàng, đồng thời phối hợp với các doanh nghiệp để phát triển sản phẩm ứng dụng thực tế, góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống cho người bệnh đái tháo đường.