Luận án tiến sĩ nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống ung thư của hai loài xương quạt dianella ensifolia và côm hải nam elaeocarpus hainanensis

Luận án tiến sĩ hóa học phân tích nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống ung thư của hai loài xương quạt dianella ensifolia, xây dựng cơ sở lý luận, kiểm chứng thực

• Tác giả: Bá Thị Châm
• Người hướng dẫn: PGS. Vũ Đình Hoàng
• Trường học: Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
• Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
• Đề tài: Nghiên cứu hóa học và hoạt tính chống ung thư của Dianella ensifolia và Elaeocarpus hainanensis
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về chi Dianella
• 1.2. Đặc điểm thực vật
• 1.3. Công dụng trong y học cổ truyền
• 1.4. Thành phần hóa học
• 1.5. Hoạt tính sinh học
• 1.6. Tổng quan về loài Dianella ensifolia
• 1.7. Đặc điểm thực vật
• 1.8. Ứng dụng trong y học cổ truyền
• 1.9. Thành phần hóa học
• 1.10. Hoạt tính sinh học
• 1.11. Tổng quan về chi Côm (Elaeocarpus)
• 1.12. Đặc điểm thực vật
• 1.13. Ứng dụng trong y học cổ truyền
• 1.14. Thành phần hóa học
• 1.15. Hoạt tính sinh học
• 1.16. Tổng quan về loài Elaeocarpus hainanensis
• 1.17. Đặc điểm thực vật
• 1.18. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
• 1.19. Về hoạt tính chống ung thư của các cucurbitane
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.2. Phương pháp phân lập các chất
• 2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học
• 2.4. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học
• 2.5. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào
• 2.6. Phương pháp phân tích số lượng tế bào, chu trình tế bào, xác định cảm ứng tế bào chết theo chương trình apoptosis
• 2.7. Phương pháp xác định biểu hiện một số gen liên quan đến ung thư bằng phương pháp Real-time PCR
• 3. CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM
• 3.1. Loài Xương quạt (Dianella ensifolia)
• 3.1.1. Chiết phân lớp các hoạt chất
• 3.1.2. Chiết, tách các hợp chất
• 3.1.3. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ
• 3.2. Loài Côm hải nam (Elaeocarpus hainanensis)
• 3.2.1. Chiết phân lớp các hoạt chất
• 3.2.2. Chiết, tách các chất
• 3.2.3. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ
• 3.3. Thử hoạt tính chống ung thư
• 3.3.1. Các hợp chất phân lập từ loài Xương quạt
• 3.3.2. Các hợp chất phân lập từ loài Côm hải nam
• 3.3.3. Các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học
• 3.3.4. Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập từ loài Xương quạt (Dianella ensifolia)
• 3.3.5. Xác định cấu trúc hóa học các chất từ loài Côm hải nam (Elaeocarpus hainanensis)
• 3.3.6. Các hợp chất cucurbitacin
• 3.3.7. Các hợp chất olean triterpene
• 3.3.8. Các hợp chất khác
• 3.3.9. Kết quả nghiên cứu hoạt tính chống ung thư
• 3.3.9.1. Hoạt tính chống ung thư của các hợp chất phân lập từ cây Xương quạt
• 3.3.9.2. Hoạt tính chống ung thư của các hợp chất phân lập từ cây Côm hải nam
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
• CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu chung

Nghiên cứu hóa học và hoạt tính chống ung thư của Dianella ensifolia và Elaeocarpus hainanensis đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học. Hai loài thực vật này không chỉ có giá trị trong y học cổ truyền mà còn chứa nhiều hợp chất có tiềm năng chống ung thư. Dianella ensifolia là một loài thuộc chi Dianella, nổi bật với các hoạt chất có tác dụng sinh học đa dạng. Trong khi đó, Elaeocarpus hainanensis cũng đã được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học, đặc biệt là các hợp chất triterpen cucurbitane. Việc nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về thành phần hóa học mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các loại thuốc chống ung thư từ thiên nhiên.

II. Thành phần hóa học

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng Dianella ensifolia chứa nhiều hợp chất flavonoid, quinone, và triterpenoid. Các hợp chất này đã được phân lập và xác định cấu trúc bằng các phương pháp sắc ký và phổ. Đặc biệt, các hợp chất triterpen cucurbitane từ Elaeocarpus hainanensis cũng đã được xác định và cho thấy hoạt tính sinh học đáng kể. Việc phân tích thành phần hóa học không chỉ giúp xác định các hợp chất có lợi mà còn cung cấp cơ sở cho việc phát triển các sản phẩm dược phẩm từ thiên nhiên. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các hợp chất này có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, mở ra tiềm năng ứng dụng trong điều trị ung thư.

III. Hoạt tính chống ung thư

Hoạt tính chống ung thư của các hợp chất phân lập từ Dianella ensifolia và Elaeocarpus hainanensis đã được thử nghiệm trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau. Kết quả cho thấy các hợp chất này có khả năng gây độc tế bào và ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Đặc biệt, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hợp chất cucurbitacin từ Elaeocarpus hainanensis có tác dụng mạnh mẽ trong việc ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Điều này cho thấy tiềm năng lớn của các loài thực vật này trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư mới. Việc nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của các hợp chất này sẽ giúp tối ưu hóa hiệu quả điều trị và giảm thiểu tác dụng phụ.

IV. Kết luận và triển vọng

Nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính chống ung thư của Dianella ensifolia và Elaeocarpus hainanensis đã mở ra nhiều hướng đi mới trong lĩnh vực dược liệu. Các hợp chất phân lập từ hai loài thực vật này không chỉ có giá trị trong y học cổ truyền mà còn có tiềm năng lớn trong việc phát triển các loại thuốc chống ung thư. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các sản phẩm từ thiên nhiên sẽ góp phần quan trọng trong việc điều trị ung thư, đồng thời bảo tồn và phát huy giá trị của nguồn tài nguyên thực vật phong phú của Việt Nam.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Công trình "Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống ung thư của hai loài Xương quạt (Dianella ensifolia) và Côm hải nam (Elaeocarpus hainanensis)" do nghiên cứu sinh Bá Thị Châm thực hiện tại Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Vũ Đình Hoàng và PGS. Trịnh Thị Thủy. Luận án thuộc chuyên ngành Hóa hữu cơ, mã số 9 44 01 14, hoàn thành và bảo vệ năm 2023 tại Học viện Khoa học và Công nghệ.

Về tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu, văn bản luận án nêu rõ Việt Nam có đặc điểm khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm, thảm thực vật đa dạng với nguồn hợp chất thứ cấp phong phú về cấu trúc và hoạt tính sinh học. Trong điều trị ung thư, khoảng 50% thuốc đang sử dụng có nguồn gốc phân lập hoặc bán tổng hợp từ thiên nhiên (như Taxol, vinca alkaloid, camptothecin, podophyllotoxin). Các hợp chất phenolic tự nhiên như curcumin từ củ nghệ (Curcumin longa) hay epigallocatechin-3-gallate (EGCG) từ chè xanh (Camellia sinensis) cũng đã được chứng minh có khả năng làm chậm tiến trình ung thư trên các mô hình nghiên cứu. Tuy nhiên, việc khai thác hoạt chất chống ung thư từ các loài thực vật bản địa chưa được tiến hành đầy đủ. Chi Dianella có khoảng 30 loài nhưng mới chỉ có 9 loài được tìm hiểu về thành phần hóa học; trong đó loài Xương quạt (Dianella ensifolia) tuy được chú ý nhất nhưng vẫn cần bổ sung các nghiên cứu chiết tách chất sạch và thăm dò hoạt tính gây độc tế bào. Đối với loài Côm hải nam (Elaeocarpus hainanensis), đến năm 2022 các công bố quốc tế và trong nước mới phát hiện 16 hợp chất terpenoid (chủ yếu là triterpene cucurbitane có hoạt tính ức chế tế bào ung thư mạnh). Do đó, việc nghiên cứu có hệ thống từ phân lập, xác định cấu trúc đến kiểm tra hoạt tính và bước đầu giải thích cơ chế tác dụng ở mức phân tử là đòi hỏi thực tiễn cấp thiết.

Mục tiêu nghiên cứu tổng quát của luận án là tìm kiếm các hoạt chất có tác dụng chống ung thư đa tác dụng và đa cơ chế từ nguồn thực vật Việt Nam. Các mục tiêu cụ thể gồm:

1. Xác định thành phần hóa học của hai loài Xương quạt (Dianella ensifolia) và Côm hải nam (Elaeocarpus hainanensis).
2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào, chống ung thư của các hợp chất phân lập được từ hai loài nghiên cứu; chọn lọc chất có hoạt tính tốt để tiếp tục nghiên cứu tác dụng ở mức độ phân tử.

Nội dung chính của luận án được triển khai qua 3 nhiệm vụ khoa học:

1. Phân lập các hợp chất từ loài Xương quạt (Dianella ensifolia) và Côm hải nam (Elaeocarpus hainanensis) bằng các phương pháp sắc ký;
2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp phổ;
3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư (cytotoxicity) của các chất sạch phân lập được. Chất có hoạt tính tốt được nghiên cứu tác động chống ung thư ở mức độ phân tử, tạo cơ sở khoa học và kiến nghị cho việc ứng dụng trong phòng và điều trị bệnh ung thư.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng: Mẫu thực vật của loài Xương quạt (Dianella ensifolia (L.) DC., họ Hành - Liliaceae) và Côm hải nam (Elaeocarpus hainanensis Oliv., họ Côm - Elaeocarpaceae).
• Phạm vi không gian và thời gian thu thập mẫu:
  • Mẫu Xương quạt được ThS. Trần Thái Vinh (Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên) thu hái và định danh thực vật vào tháng 5 năm 2017 tại khu vực Tây Nguyên; mẫu tiêu bản được lưu trữ tại Khoa Hóa học, Trường Đại học Công nghiệp Hà Nội.
  • Mẫu Côm hải nam (thân cành và lá) được thu thập tại tỉnh Hà Tĩnh vào tháng 11 năm 2019; tên khoa học do TS. Đỗ Ngọc Đài (Khoa Lâm nghiệp, Trường Đại học Kinh tế Nghệ An) định danh; mẫu tiêu bản mang ký hiệu 40TN/EH lưu giữ tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
• Phạm vi nội dung: Giới hạn ở việc chiết tách, phân lập hợp chất sạch, xác định cấu trúc hóa học bằng các phương pháp phổ vật lý hiện đại, khảo sát hoạt tính gây độc trên các dòng tế bào ung thư in vitro, và phân tích cơ chế phân tử (chu trình tế bào, apoptosis, biểu hiện gen) trên dòng tế bào bạch cầu cấp OCI-AML3.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Trong Chương 1, tác giả hệ thống hóa các công trình nghiên cứu về thực vật học, công dụng cổ truyền, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai chi Dianella và Elaeocarpus.

Đối với chi Dianella, chi này gồm khoảng 30 loài, phân bố chủ yếu ở Đông Nam Á, Đông Nam châu Phi, Úc, New Zealand và các đảo Thái Bình Dương. Về hóa thực vật, hơn 40 hợp chất đã được tìm thấy từ 9 loài:

• Flavonoid: Đã phân lập 14 hợp chất từ các loài D. ensifolia, D. longifolia, D. nigra, D. tasmanica, tiêu biểu là (-)-4'-hydroxy-7-methoxyflavan, (2S)-3',4'-dihydroxy-7-methoxyflavan, tupichinol A [21]; chrysosplenol C [22, 23]; các sắc tố delphinidin glycoside [24]; (2S)-2′,4′-dihydroxy-7-methoxy-8-methylflavan và (2S)-2′-hydroxy-4′,7-dimethoxy-8-methylflavan [25].
• Quinone: Có 8 hợp chất thuộc nhóm naphthoquinone, dinaphthaquinone và triquinone từ 5 loài, bao gồm armandinol, chrysophanol từ lá D. ensifolia [26]; chrysophanic acid từ D. longifolia [22, 29]; dianellinone, imbricatonol, stypandrone, trianellinone từ D. revoluta [27, 28, 30, 32].
• Naphthalene: Gồm dianellidin, dianellin, dianellose, stelladerol, 5-hydroxydianellin [24, 28, 30, 31, 35].
• Riêng loài D. ensifolia, các nghiên cứu trước phát hiện thêm triterpenoid cycloartane (cycloneolitsol, cyclopholidonol, 22-hydroxy-cyclolaudenol [38]); năm mono-phenol như rhizinoic acid, methyl orsellinate, DP (UP302) [9, 21, 34]; và các thành phần tinh dầu chính như allo-aromadendrene (7,3%), geranylacetone (6,2%), perhydrofarnesyl acetone (4,4%), longifolene (4,2%), β-caryophyllene (4,0%) [6].
• Về hoạt tính sinh học: Hợp chất 22-hydroxy-cyclolaudenol có khả năng kháng tế bào ung thư hắc tố B16-F10 (IC50 = 3,92 µM), ung thư phổi A549 (IC50 = 10,39 µM), ung thư vú MDA-MB-231 (IC50 = 25,08 µM) theo Tang và cộng sự (2016) [38]. Cao chiết methanol của lá D. ensifolia gây độc tế bào HeLa với IC50 đạt 506,43 µg/mL [39]. Tinh dầu phần trên mặt đất ức chế dòng tế bào ung thư gan HepG2 và vú MCF-7 với IC50 dao động trong khoảng 56,53 - 61,35 µg/mL [6].

Đối với chi Côm (Elaeocarpus), toàn chi có khoảng 360 loài, trong đó Việt Nam có 38 loài. Các nghiên cứu từ năm 1969 đến năm 2022 đã công bố hơn 90 hợp chất từ 16 loài:

• Terpenoid: Phân lập 39 hợp chất, phân nhóm chính là triterpenoid khung oleane, lanostane và đặc biệt là cucurbitane. 12 triterpenoid cucurbitane đã được tìm thấy gồm cucurbitacin D, F, G, H, I, O, 23,24-dihydrocucurbitacin F, các elaeocarpucin A-H, petiolaticin A-D [11, 50, 51, 52].
• Alkaloid: Có 18 hợp chất thuộc nhóm indolizidine, indol (elaeocarpidine) và carbazole (eustifoline B), phân lập từ lá các loài E. sphaericus, E. densiflorus, E. polydactylus [56, 57, 58].
• Flavonoid và Phenol: Phân lập các dẫn xuất apigenin, hyperin, myricitrin, quercetin cùng 3 polyphenol khung ellagic acid từ thân cành E. sylvestris [60, 61, 62].
• Riêng loài Côm hải nam (E. hainanensis): Meng và cộng sự (2008) tại Trung Quốc công bố 10 hợp chất gồm 3 chất mới (16α,23α-epoxy-3β,20β-dihydroxy-10αH,23βH-cucurbit-5,24-dien-11-one và hai dạng glycoside của nó) cùng 7 chất đã biết; nhóm tác giả chứng minh cucurbitacin D và cucurbitacin I có độc tính mạnh trên tế bào A549 và BEL-7402 với IC50 < 1 µM [11]. Tại Việt Nam, Nga và cộng sự (2018) phân lập 2 oleane mới (1α-hydroxy-olean-12-en-3-O-α-L-arabinopyranoside và 1α-hydroxy-olean-12-en-3-O-β-D-xylopyranoside) cùng 5 cucurbitacin [13]. Năm 2020, Tùng và cộng sự bổ sung thêm 1α-hydroxy-olean-11-oxo-12-en-3-O-β-L-arabinopyranoside [12].

Về hoạt tính của lớp chất cucurbitane: Đây là nhóm triterpenoid bốn vòng đặc trưng, được ghi nhận có khả năng bắt giữ chu kỳ tế bào tại pha G1/M hoặc G2/M, ức chế con đường truyền tín hiệu JAK/STAT3, ngăn chặn trùng hợp F-actin, kích hoạt tiến trình apoptosis và hiệp đồng tác dụng với các thuốc hóa trị như cisplatin, gefitinib [67, 69, 72, 74].

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết: Các nghiên cứu hóa thực vật trên hai loài D. ensifolia và E. hainanensis ở Việt Nam còn rời rạc; chưa có khảo sát đầy đủ về phổ tác dụng gây độc tế bào của các chất sạch trên các dòng tế bào ung thư khác nhau; đặc biệt thiếu vắng các dữ liệu thực nghiệm về cơ chế phân tử (chu trình tế bào, cảm ứng apoptosis và sự thay đổi biểu hiện của các gen ung thư đích) của các cucurbitacin trên dòng tế bào bạch cầu nguyên bào tủy cấp OCI-AML3.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết của hóa học các hợp chất thiên nhiên kết hợp với dược lý học thực nghiệm và sinh học phân tử tế bào ung thư. Khung phân tích đi từ chiết tách phân đoạn theo độ phân cực dung môi, tinh chế sắc ký, giải mã cấu trúc bằng hệ thống phổ hiện đại, đến đánh giá sàng lọc hoạt tính in vitro và khảo sát cơ chế điều hòa gen.

Phương pháp phân lập hóa học

• Sắc ký lớp mỏng (TLC): Bản mỏng nhôm tráng sẵn silica gel 60 F254 dày 0,2 mm (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm, hoặc phun thuốc thử vanilin/H2SO4 10% pha trong ethanol rồi nung nóng ở nhiệt độ khoảng 110°C đến khi hiện màu vết.
• Sắc ký cột (CC): Sử dụng chất hấp phụ pha thường là silica gel 60 với các cỡ hạt 0,06-0,20 mm và 0,040-0,063 mm (Merck); sắc ký rây phân tử trên gel Sephadex LH-20; sắc ký pha đảo RP-18.
• Sắc ký lớp mỏng điều chế: Thực hiện trên bản mỏng thủy tinh tráng sẵn silica gel 60G F254 (Merck), cạo lớp hấp phụ chứa chất và giải hấp phụ bằng dung môi hữu cơ thích hợp.

Phương pháp xác định cấu trúc hóa học

• Đo độ quay cực ([α]D): Sử dụng máy phân cực kế tự động JASCO P-2000 Polarimeter tại Viện Hóa sinh biển.
• Phổ hồng ngoại (FT-IR): Đo trên máy Bruker TENSOR 37 FT-IR tại Viện Hóa học.
• Phổ khối lượng: Phổ ESI-MS đo trên máy Agilent 1260; phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS ghi trên máy Q-TOF LC/MS tại Viện Hóa học và Viện Hóa sinh biển.
• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Đo trên các máy Bruker Avance 500 MHz và Bruker NEO 600 MHz. Áp dụng phổ 1D (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT-90, DEPT-135) và phổ 2D (1H-1H COSY, HSQC, HMQC, HMBC, NOESY). Dung môi sử dụng gồm CDCl3, CD3OD và DMSO-d6; chất nội chuẩn là tetramethylsilane (TMS) hoặc tín hiệu dung môi dư.

Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học

1. Phương pháp Sulforhodamine B (SRB): Thực hiện theo quy trình chuẩn của Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) trên các dòng tế bào ung thư: A549 (phổi), T24 (bàng quang), Huh-7 (gan), 8505 (tuyến giáp không biệt hóa), SNU-1 (dạ dày). Tế bào được nuôi trong đĩa 96 giếng (190 µL/giếng), xử lý chất thử trong 72 giờ ở 37°C, 5% CO2. Cố định tế bào bằng trichloroacetic acid (TCA) 20% trong 1 giờ, nhuộm bằng dung dịch SRB 30 phút, rửa 3 lần bằng acid acetic 1%, hòa tan thuốc nhuộm bằng Tris base 10 mM và đọc mật độ quang (OD) tại bước sóng 540 nm trên máy ELISA Plate Reader (Biotek). Chất đối chứng dương là ellipticine (ở các nồng độ 10; 2; 0,4; 0,08 µg/mL). Giá trị IC50 được tính toán qua phần mềm TableCurve 2Dv4.
2. Phương pháp MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide): Thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư: A549 (phổi), Hep3B (gan), HeLa (cổ tử cung), MCF-7 (vú phụ thuộc estrogen). Tế bào nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 hoặc DMEM bổ sung 10% FBS, penicillin (100 U/mL) và streptomycin (100 µg/mL). Sau 72 giờ tiếp xúc với chất thử, bổ sung 0,5 mg/mL MTT, ủ 4 giờ ở 37°C, hòa tan tinh thể formazan bằng isopropanol và đo OD ở bước sóng 570 nm. Mẫu thử có tỷ lệ tế bào sống sót CS ≤ 50% được coi là có hoạt tính. Chất đối chứng dương là camptothecin.
3. Phân tích chu trình tế bào và cảm ứng apoptosis: Dòng tế bào ung thư tủy xương cấp tính OCI-AML3 được nuôi trong môi trường RPMI 1640 bổ sung 10% FBS với mật độ 2×10^5 tế bào/mL. Thu tế bào, rửa bằng đệm PBS, nhuộm DNA bằng propidium iodide (PI, 50 µg/mL trong PBS) trong 30 phút ở 4°C. Phân tích huỳnh quang trên máy đo dòng chảy tế bào Coulter Epics XL-MCL (Beckman Coulter Inc.), dữ liệu được xử lý bằng phần mềm FlowJo.
4. Phương pháp Real-time PCR (RT-PCR): Đánh giá mức biểu hiện gen ung thư trên tế bào OCI-AML3:
   • Tách chiết mARN bằng bộ kit Qiagen RNeasy Plus Micro kit.
   • Phiên mã ngược tổng hợp cDNA bằng QuantiTect Reverse Transcription kit (Qiagen) có sử dụng Quantiscript Reverse Transcriptase.
   • Phản ứng RT-PCR thực hiện theo TaqMan assay với tổng thể tích 20 µL, sử dụng TaqMan Gene Expression Master Mix và các bộ mồi đánh dấu TaqMan Gene Expression assay gồm: mã Hs00998133_m1 (cho gen TGF-β), Hs00919915_m1 (cho gen ZNF-217), Hs00174128_m1 (cho gen TNF-α) và Hs00187848_m1 (cho gen Bcl-2) do Thermo Fisher Scientific cung cấp. Phản ứng chạy trên hệ máy ABI-7300 Real-Time Cycler. Mức độ biểu hiện tương đối của các gen được xác định qua phương pháp so sánh chu kỳ ngưỡng 2^-ΔΔCt.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng kết 82 tài liệu tham khảo trong và ngoài nước liên quan trực tiếp đến đề tài:

• Phân tích hệ thống thực vật học và các nghiên cứu hóa học trên chi Dianella, chi tiết hóa các nhóm hợp chất đặc trưng gồm 14 flavonoid, 8 quinone, 6 naphthalene glycoside và các triterpenoid khung cycloartane.
• Phân tích chi tiết thành phần hóa thực vật của chi Côm (Elaeocarpus), nhấn mạnh vào 39 terpenoid, 18 alkaloid đặc trưng, cùng các polyphenol. Luận án làm rõ các công trình của Meng (2008), Nga (2018) và Tùng (2020) về các triterpenoid cucurbitane và oleane từ loài Côm hải nam.
• Trình bày tổng quan cơ chế tác dụng chống ung thư của các cucurbitacin tự nhiên (cucurbitacin B, D, E, I), chỉ ra các con đường tác động điển hình: ức chế chu kỳ tế bào tại pha G2/M hoặc G1/M, ức chế tín hiệu JAK/STAT3, kích hoạt apoptosis, tác động lên tế bào gốc ung thư và khả năng hiệp đồng điều trị ung thư khi phối hợp với thuốc hóa trị liệu.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết nguồn gốc nguyên liệu và toàn bộ quy trình công nghệ phục vụ nghiên cứu:

• Ghi nhận thông tin mẫu thu hái thực vật: Mẫu Xương quạt (Dianella ensifolia) thu hái tháng 5/2017 tại Tây Nguyên; mẫu Côm hải nam (Elaeocarpus hainanensis) thu hái tháng 11/2019 tại Hà Tĩnh kèm mã tiêu bản 40TN/EH.
• Mô tả các quy trình kỹ thuật phân lập: Sắc ký lớp mỏng phân tích, sắc ký lớp mỏng điều chế, sắc ký cột chất hấp phụ silica gel pha thường, Sephadex LH-20 và pha đảo RP-18.
• Liệt kê đầy đủ thông số kỹ thuật của hệ thống thiết bị đo phổ: Polarimeter JASCO P-2000, FT-IR Bruker TENSOR 37, ESI-MS Agilent 1260, HR-ESI-MS Q-TOF LC/MS, NMR Bruker 500 MHz và 600 MHz.
• Trình bày quy trình thử nghiệm sinh học in vitro chuẩn xác: Đánh giá độc tính tế bào bằng phương pháp SRB và MTT trên 8 dòng tế bào ung thư; quy trình nuôi cấy dòng OCI-AML3; kỹ thuật nhuộm PI đo tế bào dòng chảy trên máy Coulter Epics XL-MCL; quy trình chiết tách mARN, tổng hợp cDNA và thực hiện phản ứng Real-time PCR trên hệ thống ABI-7300 Real-Time Cycler theo phương pháp 2^-ΔΔCt.

Chương 3: Thực nghiệm

Chương này trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm chiết xuất, phân lập và thông số phổ của các hợp chất:

• Đối với mẫu Xương quạt (Dianella ensifolia): Bột dược liệu khô được ngâm chiết, tạo các cặn chiết phân đoạn bằng dung môi có độ phân cực tăng dần gồm n-hexane, dichloromethane (DCM), ethyl acetat (EtOAc) và butanol (BuOH). Từ các phân đoạn này, bằng sắc ký cột lặp lại, đã phân lập được 10 hợp chất tinh khiết ký hiệu từ DN1 đến DN10. Luận án ghi nhận chi tiết hằng số vật lý, độ quay cực, giá trị m/z trên phổ khối và các tín hiệu hóa học (độ dịch chuyển hóa học δ, độ bội, hằng số tương tác J) trên phổ 1H-NMR, 13C-NMR của từng chất.
• Đối với mẫu Côm hải nam (Elaeocarpus hainanensis): Thân cành và lá khô được chiết phân đoạn thu cặn chiết dichloromethane (DCM) và cặn chiết methanol (MeOH). Tiến hành phân tách sắc ký trên silica gel pha thường, pha đảo RP-18 và rây phân tử Sephadex LH-20 thu được 15 hợp chất tinh khiết ký hiệu từ EH1 đến EH15. Tất cả các hợp chất đều được đo đạc đầy đủ dữ liệu phổ HR-ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC, COSY, NOESY.
• Ghi nhận thông số các bước thực nghiệm thử hoạt tính sinh học in vitro và khảo sát biểu hiện gen liên quan đến ung thư.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương này tập trung chứng minh cấu trúc hóa học và phân tích kết quả thử nghiệm sinh học:

1. Về xác định cấu trúc hóa học:

• Từ loài Xương quạt (Dianella ensifolia), cấu trúc của 10 hợp chất (DN1 - DN10) được xác định thông qua so sánh dữ liệu phổ đo được với tài liệu tham khảo:
  • Nhóm flavan và flavonoid: Hợp chất DN1, DN2, DN3 (được làm sáng tỏ là 7,4′-dimethoxyflavan), DN4 (5-hydroxy-7,4′-dimethoxyflavan), DN5, DN6, DN8 (biflavonoid amentoflavone).
  • Nhóm glycoside và steroid: Hợp chất DN7 (naphthalene glycoside dianellose), DN9 (sitosterone), và DN10.
• Từ loài Côm hải nam (Elaeocarpus hainanensis), cấu trúc của 15 hợp chất (EH1 - EH15) được chứng minh đầy đủ:
  • Nhóm triterpene cucurbitane: Gồm EH1 (cucurbitacin D), EH2 (cucurbitacin I), EH3 (3-epi-isocucurbitacin D), EH4 (cucurbitacin F), EH5 (cucurbitacin H), EH6, EH7, cùng các hợp chất có cấu trúc mới là EH8, EH9 và EH10. Các dữ liệu phổ 2D (HMBC, HSQC, COSY, NOESY) và khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS được thảo luận chi tiết để xác lập vị trí nhóm thế và cấu hình lập thể.
  • Nhóm triterpene khung oleane: Hợp chất EH11, EH12 và hợp chất mới EH13 (được khẳng định đầy đủ tương tác qua phổ COSY, NOESY, HMBC).
  • Các hợp chất khác: Hợp chất EH14 (5-(hydroxymethyl)-2-furancarboxaldehyde) và hợp chất megastigmane monoterpene EH15 (blumenol A).

Ký hiệu hợp chất	Khung cấu trúc hóa học	Tên hợp chất / Dạng cấu trúc xác định	Nguồn gốc phân lập
DN1 - DN6	Flavan / Flavonoid	7,4′-dimethoxyflavan (DN3), 5-hydroxy-7,4′-dimethoxyflavan (DN4)...	Dianella ensifolia
DN7	Naphthalene glycoside	Dianellose	Dianella ensifolia
DN8	Biflavonoid	Amentoflavone	Dianella ensifolia
DN9	Steroid	Sitosterone	Dianella ensifolia
EH1	Triterpene cucurbitane	Cucurbitacin D	Elaeocarpus hainanensis
EH2	Triterpene cucurbitane	Cucurbitacin I	Elaeocarpus hainanensis
EH3	Triterpene cucurbitane	3-epi-isocucurbitacin D	Elaeocarpus hainanensis
EH4	Triterpene cucurbitane	Cucurbitacin F	Elaeocarpus hainanensis
EH5	Triterpene cucurbitane	Cucurbitacin H	Elaeocarpus hainanensis
EH6, EH7	Triterpene cucurbitane	Các dẫn xuất cucurbitacin	Elaeocarpus hainanensis
EH8, EH9, EH10	Triterpene cucurbitane	Các hợp chất cucurbitacin mới	Elaeocarpus hainanensis
EH11, EH12	Triterpene oleane	Các hợp chất olean triterpenoid	Elaeocarpus hainanensis
EH13	Triterpene oleane	Hợp chất olean triterpene mới	Elaeocarpus hainanensis
EH14	Dẫn xuất furan	5-(hydroxymethyl)-2-furancarboxaldehyde	Elaeocarpus hainanensis
EH15	Megastigmane monoterpenoid	Blumenol A	Elaeocarpus hainanensis

2. Về kết quả hoạt tính sinh học:

• Thử nghiệm ức chế tế bào ung thư của các hợp chất từ Xương quạt: Các hợp chất DN1 - DN10 được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào; một số dẫn xuất flavan thể hiện tác dụng ức chế ở mức độ trung bình và yếu trên các dòng tế bào thử nghiệm.
• Thử nghiệm ức chế tế bào ung thư của các hợp chất từ Côm hải nam: Các hợp chất cucurbitacin thể hiện hoạt tính gây độc tế bào vượt trội so với các nhóm chất khác:
  • Hợp chất EH1 (cucurbitacin D), EH2 (cucurbitacin I), EH3 (3-epi-isocucurbitacin D) thể hiện hoạt tính ức chế mạnh trên nhiều dòng tế bào ung thư, đặc biệt là dòng tế bào bạch cầu nguyên bào tủy cấp tính OCI-AML3.
• Nghiên cứu tác động ở mức độ tế bào và phân tử trên dòng tế bào OCI-AML3:
  • Phân tích chu trình tế bào: Các hợp chất cucurbitacin gây ức chế tiến trình phân bào thông qua sự bắt giữ chu trình tế bào ở các pha phân chia.
  • Hoạt tính cảm ứng apoptosis: Phân tích dòng chảy tế bào nhuộm PI chứng minh các hợp chất cucurbitacin từ loài Côm hải nam kích hoạt quá trình chết tế bào theo chương trình (apoptosis).
  • Tác động đến mức biểu hiện gen ung thư bằng kỹ thuật Real-time PCR:
    • Xử lý tế bào OCI-AML3 với hợp chất EH1 ở nồng độ 0,3 µg/mL dẫn đến sự biến đổi rõ rệt mức biểu hiện của 4 gen đích: làm giảm biểu hiện gen chống chết theo chương trình Bcl-2 và các gen liên quan tăng sinh ZNF-217, TGF-β; đồng thời điều hòa biểu hiện gen TNF-α.
    • Xử lý tế bào OCI-AML3 với hợp chất EH3 ở nồng độ 0,5 µg/mL cũng làm thay đổi biểu hiện của các gen TNF-α, Bcl-2, TGF-β và ZNF-217, khẳng định cơ chế ức chế tăng sinh và kích hoạt apoptosis thông qua điều biến phiên mã gen.

Phương pháp thử nghiệm	Dòng tế bào ung thư khảo sát	Chất đối chứng dương	Thông số theo dõi chính
Phương pháp SRB	A549, T24, Huh-7, 8505, SNU-1	Ellipticine (0,08 - 10 µg/mL)	Đo mật độ quang OD ở 540 nm, xác định giá trị IC50
Phương pháp MTT	A549, Hep3B, HeLa, MCF-7	Camptothecin	Đo mật độ quang OD ở 570 nm, tỷ lệ tế bào sống sót CS (%)
Đo tế bào dòng chảy (Flow cytometry)	OCI-AML3	Đối chứng không xử lý chất	Tỷ lệ tế bào chết theo apoptosis, phân bố chu trình tế bào
Real-time PCR (TaqMan assay)	OCI-AML3 (xử lý EH1 0,3 µg/mL; EH3 0,5 µg/mL)	Đối chứng nội bộ (so sánh 2^-ΔΔCt)	Mức biểu hiện mARN của các gen: TNF-α, Bcl-2, TGF-β, ZNF-217

---

Kết quả và những đóng góp mới

Các đóng góp mới về mặt khoa học lý luận và thực tiễn của luận án gồm:

1. Đóng góp về hóa học các hợp chất thiên nhiên:

• Từ loài Xương quạt (Dianella ensifolia), đã phân lập và xác định cấu trúc của 10 hợp chất tinh khiết (DN1 - DN10), gồm các flavan, biflavonoid (amentoflavone), naphthalene glycoside (dianellose) và steroid (sitosterone), làm phong phú thêm dữ liệu thành phần hóa thực vật của loài này tại Việt Nam.
• Từ loài Côm hải nam (Elaeocarpus hainanensis), đã phân lập và xác định cấu trúc của 15 hợp chất tinh khiết (EH1 - EH15) thuộc các nhóm triterpenoid cucurbitane, triterpenoid oleane, dẫn xuất furan và megastigmane monoterpenoid.
• Xác định được cấu trúc hóa học của các hợp chất mới: Luận án đã phát hiện các hợp chất cucurbitane mới (EH8, EH9, EH10) và hợp chất oleane mới (EH13) từ loài Côm hải nam; xác lập trọn vẹn dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D và phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS cho các chất mới này.

2. Đóng góp về hoạt tính sinh học và cơ chế dược lý:

• Cung cấp số liệu sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào có hệ thống của các hợp chất từ hai loài thực vật trên nhiều dòng tế bào ung thư người (A549, T24, Huh-7, 8505, SNU-1, Hep3B, HeLa, MCF-7 và OCI-AML3).
• Khẳng định các hợp chất cucurbitacin từ loài Côm hải nam (đặc biệt là EH1 - cucurbitacin D và EH3 - 3-epi-isocucurbitacin D) thể hiện hoạt tính ức chế mạnh tế bào bạch cầu nguyên bào tủy cấp OCI-AML3.
• Làm sáng tỏ cơ chế tác dụng chống ung thư ở mức độ tế bào và phân tử của EH1 và EH3 trên dòng tế bào OCI-AML3: Các hợp chất này gây ức chế chu trình tế bào, cảm ứng tế bào chết theo chương trình (apoptosis) và điều biến có ý nghĩa mức biểu hiện của các gen liên quan đến ung thư gồm TNF-α, Bcl-2, TGF-β và ZNF-217.

3. Kiến nghị và giải pháp:

• Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính chống ung thư in vivo trên mô hình động vật thực nghiệm đối với các hợp chất cucurbitacin có hoạt tính nổi bật (EH1, EH3).
• Khảo sát độc tính bán trường diễn và các thông số dược động học của các hoạt chất tiềm năng trước khi định hướng nghiên cứu ứng dụng bào chế dược phẩm hỗ trợ điều trị ung thư.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

• Hoạt tính sinh học của các hợp chất mới dừng lại ở các thử nghiệm in vitro trên các dòng tế bào nuôi cấy; chưa tiến hành khảo sát hoạt tính in vivo trên mô hình động vật do giới hạn nguồn mẫu hoạt chất sạch thu nhận được.
• Địa bàn thu hái mẫu thực vật mới giới hạn ở một số điểm cục bộ (Tây Nguyên đối với Xương quạt và Hà Tĩnh đối với Côm hải nam), chưa khảo sát được sự biến thiên hàm lượng của các nhóm hoạt chất theo mùa và theo các vùng sinh thái khác nhau.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Mở rộng quy mô chiết xuất để thu nhận lượng lớn hơn các hoạt chất tiềm năng (EH1, EH3, EH8) phục vụ các thử nghiệm dược lý chuyên sâu in vivo.
• Đánh giá độc tính cấp tính, độc tính bán trường diễn và dược động học của cucurbitacin D (EH1) và 3-epi-isocucurbitacin D (EH3).
• Nghiên cứu bán tổng hợp hoặc biến đổi cấu trúc hóa học trên khung cucurbitane nhằm giảm thiểu độc tính tế bào chung và tăng cường tính chọn lọc trên các dòng tế bào ung thư đích.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn đối với:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Dược liệu học, Dược lý học và Sinh học phân tử.
• Cán bộ nghiên cứu tại các viện nghiên cứu và trường đại học hoạt động trong lĩnh vực sàng lọc hoạt chất sinh học tự nhiên và phát triển thuốc mới.
• Các chuyên gia R&D trong ngành công nghiệp dược phẩm quan tâm đến nguồn nguyên liệu triterpene và flavonoid định hướng ứng dụng hỗ trợ điều trị ung thư.

Nội dung có giá trị tham khảo cụ thể:

• Quy trình phân lập và làm sạch bằng các hệ dung môi sắc ký cột silica gel, Sephadex LH-20 và RP-18 cho các hợp chất phân cực trung bình và phân cực cao (flavan, naphthalene glycoside, cucurbitacin, oleane).
• Hệ thống dữ liệu phổ 1D-NMR, 2D-NMR (COSY, HSQC, HMBC, NOESY) và HR-ESI-MS của các dẫn xuất cucurbitane và oleane, là cơ sở đối chiếu cho việc giải cấu trúc các hợp chất tự nhiên tương tự.
• Giao thức thực nghiệm chuẩn hóa về thử nghiệm độc tính tế bào (SRB, MTT), phân tích chu trình tế bào/apoptosis qua Flow cytometry và quy trình RT-PCR TaqMan assay khảo sát 4 gen ung thư (TNF-α, Bcl-2, TGF-β, ZNF-217).

---

Câu hỏi thường gặp

1. Mẫu thực vật nghiên cứu trong luận án được thu thập tại địa phương nào và do ai giám định tên khoa học?
Mẫu Xương quạt (Dianella ensifolia) được thu hái tại Tây Nguyên vào tháng 5/2017 và do ThS. Trần Thái Vinh (Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên) định danh; mẫu Côm hải nam (Elaeocarpus hainanensis) được thu thập tại tỉnh Hà Tĩnh vào tháng 11/2019 và do TS. Đỗ Ngọc Đài (Đại học Kinh tế Nghệ An) định danh, lưu giữ tại Viện Hóa học dưới mã tiêu bản 40TN/EH.

2. Tổng cộng có bao nhiêu hợp chất tinh khiết được phân lập từ hai loài thực vật trong luận án?
Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc của tổng cộng 25 hợp chất tinh khiết, bao gồm 10 hợp chất từ loài Xương quạt (ký hiệu từ DN1 đến DN10) và 15 hợp chất từ loài Côm hải nam (ký hiệu từ EH1 đến EH15). Trong đó, có các hợp chất mới thuộc khung cucurbitane (EH8, EH9, EH10) và khung oleane (EH13).

3. Hoạt tính chống ung thư của các hợp chất sạch được đánh giá bằng những phương pháp nào và trên các dòng tế bào nào?
Luận án áp dụng phương pháp SRB trên 5 dòng tế bào (A549, T24, Huh-7, 8505, SNU-1) với đối chứng dương ellipticine; phương pháp MTT trên 4 dòng tế bào (A549, Hep3B, HeLa, MCF-7) với đối chứng dương camptothecin; phân tích chu trình tế bào và apoptosis qua đo dòng chảy tế bào (Flow cytometry) nhuộm PI trên dòng OCI-AML3; và phương pháp Real-time PCR định lượng mức biểu hiện gen trên dòng OCI-AML3.

**4. Hai hợp chất nào từ loài Côm hải nam được

Trích đoạn nội dung tài liệu

Bà GIÁO DĀC VÀ ĐÀO T¾O VIàN HÀN LÂM KHOA HàC VÀ CÔNG NGHà VIàT NAM HàC VIàN KHOA HàC VÀ CÔNG NGHà ----------------------------- BÁ THÞ CHÂM NGHIÊN CĄU THÀNH PHÀN HÓA HàC VÀ HO¾T TÍNH CHÞNG UNG TH¯ CĂA HAI LOÀI X¯¡NG QU¾T (Dianella ensifolia) VÀ CÔM HÀI NAM (Elaeocarpus hainanensis) LU¾N ÁN TI¾N SĨ HÓA HĀU C¡ Hà Nßi – 2023 Bà GIÁO DĀC VÀ ĐÀO T¾O VIàN HÀN LÂM KHOA HàC VÀ CÔNG NGHà VIàT NAM HàC VIàN KHOA HàC VÀ CÔNG NGHà ----------------------------- BÁ THÞ CHÂM NGHIÊN CĄU THÀNH PHÀN HÓA HàC VÀ HO¾T TÍNH CHÞNG UNG TH¯ CĂA HAI LOÀI X¯¡NG QU¾T (Dianella ensifolia) VÀ CÔM HÀI NAM (Elaeocarpus hainanensis) Chuyên ngành: Hóa hữu c¡ Mã số: 9 44 01 14 LU¾N ÁN TI¾N SĨ HÓA HàC NG¯äI H¯âNG DÀN KHOA HàC: 1. Trßnh Thß Thăy Hà Nßi - 2023 i LâI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án: "Nghiên cứu thành phần hóa hác và ho¿t tính chống ung th° căa hai loài X°¡ng qu¿t (Dianella ensifolia) và Côm hÁi nam (Elaeocarpus hainanensis)" là công trình nghiên cứu căa chính mình d°ãi sự h°ãng dÁn khoa hác căa tập thể h°ãng dÁn. Luận án sử dāng thông tin trích dÁn từ nhiều nguồn tham khÁo khác nhau và các thông tin trích dÁn đ°ÿc ghi rõ nguồn gốc. Các kết quÁ nghiên cứu căa tôi đ°ÿc công bố chung vãi các tác giÁ khác đã đ°ÿc sự nhÃt trí căa đồng tác giÁ khi đ°a vào luận án.

Các số liáu, kết quÁ đ°ÿc trình bày trong luận án là hoàn toàn trung thực và ch°a từng đ°ÿc công bố trong bÃt kỳ mát công trình nào khác ngoài các công trình công bố căa tác giÁ. Luận án đ°ÿc hoàn thành trong thåi gian tôi làm nghiên cứu sinh t¿i Hác vián Khoa hác và Công nghá, Vián Hàn lâm Khoa hác và Công nghá Viát Nam. Hà Nội, ngày tháng năm 20 Tác giÁ lu¿n án (Ký và ghi rõ họ tên) ii LâI CÀM ¡N Luận án này đ°ÿc thực hián t¿i Vián Hóa hác –Vián hàn lâm Khoa hác và Công nghá Viát nam. Trong suốt thåi gian hác tập và nghiên cứu t¿i Vián, tác giÁ đã nhận đ°ÿc rÃt nhiều sự giúp đỡ quý báu căa các thầy cô, các nhà khoa hác, các đồng nghiáp cÁ trong và ngoài Vián cũng nh° căa b¿n bè và gia đình.

Tôi xin trân tráng bày tỏ låi cám ¡n sâu sắc nhÃt tãi PGS. Vũ Đình Hoàng và PGS. Trinh Thß Thăy là những ng°åi thầy đã dành nhiều thåi gian tâm huyết h°ãng dÁn chỉ bÁo cho tôi tận tình về khoa hác cũng nh° chuyên môn. Đồng thåi các thầy còn đáng viên và t¿o mái điều kián hết sức thuận lÿi để tôi hoàn thành luận án này.

Tôi xin chân thành cám ¡n Ban lãnh đ¿o Vián Hóa hác cùng các cán bá căa Vián hóa hác đã quan tâm giúp đỡ tôi, t¿o mái điều kián tốt nhÃt để tôi hoàn thành luận án này. Tôi cũng bày tỏ lòng biết ¡n tãi tập thể phòng Nghiên cứu các hÿp chÃt tự nhiên và phòng Hóa sinh ứng dāng đã quan tâm giúp đỡ t¿o điều kián thuận lÿi cho tôi trong quá trình hác tập và nghiên cứu. Tôi xin trân tráng cám ¡n Ban lãnh đ¿o Hác vián Khoa hác và Công nghá cùng tập thể cán bá thuác Hác vián đã giúp đỡ t¿o điều kián tốt nhÃt cho tôi trong quá trình hác tập. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ¡n chân thành và sâu sắc tãi toàn thể gia đình, b¿n bè và những ng°åi thân đã luôn quan tâm, khích lá, dành thåi gian cho tôi trong suốt thåi gian hác tập và nghiên cứu.

Xin trân tráng cám ¡n! Tác giÁ Bá Thß Châm iii MĀC LĀC LâI CAM ĐOAN. iii DANH MĀC CHĀ VI¾T TÀT. vi DANH MĀC HÌNH. viii DANH MĀC BÀNG.

xii MỞ ĐÀU.1 CH¯¡NG 1: TàNG QUAN TÀI LIàU. Táng quan về chi Dianella. Đặc điểm thực vật. Công dụng trong y học cổ truyền.

Thành phần hóa học. Hoạt tính sinh học. Tổng quan về loài Dianella ensifolia. Đặc điểm thực vật.

Āng dụng trong y học cổ truyền. Thành phần hóa học. Ho¿t tính sinh học. Táng quan về chi Côm (Elaeocarpus).

Đặc điểm thực vật. Āng dụng trong y học cổ truyền. Thành phần hóa học. Hoạt tính sinh học.

Tổng quan về loài Elaeocarpus hainanensis. Đặc điểm thực vật. Thành phần hóa học và ho¿t tính sinh học. Về hoạt tính chống ung thư của các cucurbitane .25 CH¯¡NG 2: ĐÞI T¯þNG VÀ PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĄU.

PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĄU. Phương pháp phân lập các chất. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học.

Đánh giá ho¿t tính gây độc tế bào. Phương pháp phân tích số lượng tế bào, chu trình tế bào, xác định cÁm āng tế bào chết theo chương trình apoptosis. Phương pháp xác định biểu hiện một số gen liên quan đến ung thư bằng phương pháp Real-time PCR .34 CH¯¡NG 3: THỰC NGHIàM. Loài X°¢ng qu¿t (D.

Chiết phân lớp các hoạt chất. Chiết, tách các hợp chất. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ. Loài Côm hÁi nam (E.

Chiết phân lớp các hoạt chất. Chiết, tách các chất. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ. Thÿ ho¿t tính chßng ung th° .1 Các hợp chất phân lập từ loài Xương quạt.

Các hợp chất phân lập từ loài Côm hải nam. Các k¿t quÁ nghiên cąu về thành phÁn hóa hác. Xác định cấu trúc hóa học cÿa các chất phân lập từ loài Xương quạt (Dianella ensifolia). Xác định cấu trúc hóa học các chất từ loài Côm hải nam (Elaeocarpus hainanensis).

Các hợp chất cucurbitacin. Các hợp chất olean triterpene. Các hợp chất khác. K¿t quÁ nghiên cąu ho¿t tính chßng ung th°.

Hoạt tính chống ung thư của các hợp chất phân lập từ cây Xương quạt. Hoạt tính chống ung thư cÿa các hợp chất phân lập từ cây Côm hải nam.120 K¾T LU¾N VÀ KI¾N NGHÞ.129 NHĀNG ĐÓNG GÓP MàI CĂA LU¾N ÁN .131 CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BÞ CÓ LIÊN QUAN Đ¾N LU¾N ÁN .132 TÀI LIàU THAM KHÀO .146 vi DANH MĀC CHĀ VI¾T TÀT Kí hiáu Ti¿ng anh Dißn giÁi 13 C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Phổ cáng h°çng từ h¿t nhân Resonance Spectroscopy cacbon 13 1 H-NMR Proton Nuclear Magnetic Phổ cáng h°çng từ h¿t nhân Resonance Spectroscopy proton 8505 Human undifferentiated thyroid Ung th° biểu mô tuyến giáp carcinoma không biát hóa ç ng°åi A549 Human lung carcinoma Ung th° phổi ç ng°åi ATTC American Type Culture Trung tâm l°u giữ chăng Hoa Collection kỳ br broad COSY 1 H-1H-Correlation Spectroscopy Phổ 2 chiều thể hián t°¡ng tác giữa proton căa các carbon kế cận nhau Cq Cacbon không liên kết vãi hidro d doublet DCM Dichlomethan dd doublet of doublets Doublet căa doublet DEPT Distortionless Enhancement by Phổ DEPT Polarisation Transfer DMEM Dulbecco9s Modifile Eagle Medium dt doublet of triplets ESI-MS Electrospray Ionization Mass Phổ khối ion hóa phun mù đián Spectra tử EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol Hela Human cervix carcinoma Ung th° tử cung ç ng°åi Hep3B Human hepatocellular carcinoma Ung th° gan ng°åi HMBC Heteronuclear Mutiple Bone Phổ t°¡ng tác dß h¿t nhân qua Connectivity nhiều liên kết HSQC Heteronuclear Single-Quantum Phổ t°¡ng tác dß h¿t nhân qua Coherence mát liên kết vii HR-ESI-MS High Resolution Electrospray Phổ khối l°ÿng phân giÁi cao Ionization Mass Spetrum phun mù đián tử Huh-7 Human hepatocyte-derived Ung th° gan ç ng°åi carcinoma IC50 Inhibition concentration at 50% Nồng đá ức chế 50% J (Hz) Hằng số t°¡ng tác tính bằng Hz MCF-7 Human breast carcinoma Ung th° vú ng°åi phā thuác estrogen m multiplet MeOH Methanol NOESY Nuclear Overhauser Enhancemen Phổ 2 chiều thể hián t°¡ng tác Spectroscopy giữa các proton gần nhau trong không gian OCI/AML3 Acute myeloid leukemia Ung th° b¿ch cầu nguyên bào tăy cÃp tính OD Optical density Mật đá quang hác RPMI Roswell Park Memorial Institute RT-PCR Real-time reverse transcription polymerase chain reaction q quartet quint quintet s singlet T24 Human urine bladder carcinoma Ung th° bàng quang ç ng°åi TLC Thin layer chromatography Sắc ký lãp mỏng SNU-1 Human gastric carcinoma Ung th° d¿ dày ç ng°åi  (ppm) ppm = part per million Đá dßch chuyển hóa hác tính bằng phần triáu viii DANH MĀC HÌNH Hình 1. Ành minh họa một số loài điển hình thuộc chi Dianella. Cấu trúc một số flavonoid được tìm thấy ở chi Dianella.

Cấu trúc một số quinone được tìm thấy ở chi Dianella. Cấu trúc một số naphthalene được tìm thấy ở chi Dianella. Cấu trúc các hợp chất triterpenoid được phân lập từ loài D. Cấu trúc các hợp chất khác được phân lập từ loài D.

Cấu trúc cÿa các chất trong tinh dầu cÿa loài D. Một số loài điển hình thuộc chi Côm phân bố t¿i Việt Nam. Cấu trúc một số terpenoid tìm thấy ở chi Elaeocarpus. Cấu trúc một số alkaloid tìm thấy ở chi Elaeocarpus.

Cấu trúc các flavonoid được tìm thấy ở chi Elaeocarpus. Cấu trúc các chất khác tìm được ở chi Elaeocarpus. Cấu trúc hóa học khung cucurbitane. Cấu trúc hóa học cÿa cucurbitacin có tác dụng gây độc tế bào ung thư.

Ành tiêu bÁn cây Xương qu¿t (D. Ành loài Côm hÁi nam (E. Sơ đồ t¿o cao chiết từ mẫu loài Xương qu¿t (D. Sơ đồ phân lập các chất từ cặn chiết n-hexane và buthanol cÿa loài Xương qu¿t.

Sơ đồ phân lập các chất từ cặn chiết ethyl acetat cÿa loài Xương qu¿t. Sơ đồ phân lập chất từ cặn chiết dichloromethan cÿa loài Xương qu¿t. Sơ đồ t¿o cao chiết từ loài Côm hÁi nam (E. Sơ đồ phân lập các chất từ cặn chiết DCM cÿa loài Côm hÁi nam.

Sơ đồ phân lập các chất từ cặn chiết methanol cÿa loài Côm hÁi nam. Cấu trúc hóa học cÿa chất DN1. Phổ CD cÿa hợp chất DN1. Phổ HR-ESI-MS (negative) cÿa hợp chất DN1.

Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) cÿa hợp chất DN1. Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) cÿa hợp chất DN1. Phổ HMBC cÿa hợp chất DN1. Cấu trúc hóa học cÿa hợp chất DN2.

Phổ HR-ESI-MS (negative) cÿa hợp chất DN2. Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) cÿa hợp chất DN2. Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) cÿa hợp chất DN2. Phổ HMBC cÿa hợp chất DN2.

Cấu trúc hóa học cÿa hợp chất DN3. Cấu trúc hóa học cÿa hợp chất DN4. Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) cÿa hợp chất DN4. Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) hợp chất DN4.

Phổ HSQC cÿa hợp chất DN4. Phổ HMBC cÿa hợp chất DN4. Phổ NOESY cÿa hợp chất DN4. Phổ khối (+)-HR ESI MS cÿa hợp chất DN4.

Cấu trúc hóa học cÿa hợp chất DN5. Phổ khối (-)-HR-ESI-MS cÿa hợp chất DN5. Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500MHz) cÿa hợp chất DN5. Phổ 13C-NMR (CDCl3, 125MHz) cÿa hợp chất DN5.

Phổ HSQC cÿa hợp chất DN5. Phổ HMBC cÿa hợp chất DN5. Cấu trúc hóa học cÿa hợp chất DN6. Cấu trúc hóa học cÿa hợp chất DN7.

Cấu trúc hóa học cÿa hợp chất DN8 .