Luận văn tốt nghiệp: Tác dụng ức chế enzym α glucosidase của cây chè vằng jasminum subtriplinerve

Luận văn tốt nghiệp nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp nghiên cứu tác dụng ức chế enzym α glucosidase của cây chè vằng jasminum, điều tra thực trạng, phân tích số liệu, đề xuất biện

• Tác giả: Lê Minh Ngọc
• Người hướng dẫn: PGS. Bùi Thanh Tùng
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Nghiên Cứu Tác Dụng Ức Chế Enzym α – Glucosidase Của Cây Chè Vằng
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG BIỂU
• DANH MỤC HÌNH VẼ
• MỞ ĐẦU
• 0.1. Bệnh đái tháo đường
• 0.2. Cơ chế bệnh sinh
• 0.3. Các biến chứng của bệnh ĐTĐ
• 0.4. Điều trị bệnh ĐTĐ
• 0.5. Enzym α-glucosidase và chất ức chế enzym α-glucosidase
• 0.6. Phương pháp docking phân tử
• 0.7. Quy trình docking
• 0.8. Quy tắc Lipinski về các hợp chất giống thuốc
• 0.9. Dự đoán các thông số dược động học và độc tính
• 0.10. Cây Chè vằng - Jasminum subtriplinerve
• 0.11. Vị trí phân loại của cây Chè vằng
• 0.12. Đặc điểm thực vật và vị trí phân bố
• 0.13. Thành phần hoá học
• 0.14. Tác dụng sinh học
• 1. CHƯƠNG 1: BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG
• 1.1. Khái niệm
• 1.2. Phân loại
• 1.3. Cơ chế bệnh sinh
• 1.3.1. Cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 1
• 1.3.2. Cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 2
• 1.4. Các biến chứng của bệnh ĐTĐ
• 1.5. Điều trị bệnh ĐTĐ
• 1.5.1. Điều trị ĐTĐ typ 1
• 1.5.2. Điều trị ĐTĐ typ 2
• 1.5.3. Một số yếu tố cần xem xét khi lựa chọn thuốc hạ đường huyết
• 1.6. Enzym α-glucosidase và chất ức chế enzym α-glucosidase
• 1.6.1. Enzym α-glucosidase
• 1.6.1.1. Cấu trúc của enzym α-glucosidase
• 1.6.1.2. Cơ chế hoạt động của enzym α-glucosidase
• 1.6.2. Chất ức chế enzym α-glucosidase
• 1.6.3. Cấu trúc của hoạt chất acarbose, miglitol
• 1.7. Phương pháp docking phân tử
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ QUÁ TRÌNH CHIẾT CAO CHÈ VẰNG
• 3.1. Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của cây Chè vằng trên mô hình in vitro
• 3.2. Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của các hợp chất trong cây Chè vằng bằng phương pháp docking phân tử
• 3.2.1. Đánh giá mô hình Docking
• 3.2.2. Tiến hành docking các hợp chất có tiềm năng ức chế alpha-glucosidase
• 3.3. Kết quả đánh giá quy tắc 5 tiêu chí của Lipinski
• 3.4. Dự đoán đặc tính hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ và độc tính (ADMET)
• 3.5. Về tác dụng ức chế enzym α-glucosidase
• 3.6. Về phương pháp sàng lọc ảo
• 3.7. Về kỹ thuật docking phân tử
• 3.8. Về kết quả sàng lọc ảo
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Giới thiệu về cây chè vằng và enzym α glucosidase

Cây chè vằng (cây chè vằng) (Jasminum subtriplinerve) là một loại dược liệu quý, được biết đến với nhiều tác dụng sinh học. Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng cây chè vằng có khả năng ức chế enzym α-glucosidase, một enzym quan trọng trong quá trình chuyển hóa carbohydrate. Enzym này có vai trò trong việc phân hủy tinh bột thành glucose, từ đó ảnh hưởng đến mức đường huyết trong cơ thể. Việc ức chế enzym này có thể giúp kiểm soát đường huyết, đặc biệt trong điều trị bệnh đái tháo đường. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng việc sử dụng các chất ức chế enzym α-glucosidase có thể làm giảm lượng đường trong máu sau bữa ăn, từ đó hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường hiệu quả hơn.

1.1. Tác dụng sinh học của cây chè vằng

Cây chè vằng đã được nghiên cứu và chứng minh có nhiều tác dụng sinh học, bao gồm kháng khuẩn, chống oxy hóa và hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường. Các hợp chất có trong cây chè vằng như flavonoid và polyphenol có khả năng ức chế enzym α-glucosidase, từ đó làm giảm quá trình hấp thụ glucose từ ruột. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các sản phẩm từ thiên nhiên nhằm hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường. Nghiên cứu cho thấy rằng cây chè vằng không chỉ an toàn mà còn hiệu quả trong việc kiểm soát đường huyết, mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các loại thuốc từ thiên nhiên.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của cây chè vằng được thực hiện trên hai mô hình chính: in vitro và in silico. Mô hình in vitro cho phép đánh giá trực tiếp tác dụng của các hợp chất chiết xuất từ cây chè vằng lên enzym α-glucosidase. Trong khi đó, mô hình in silico sử dụng phương pháp docking phân tử để dự đoán khả năng liên kết của các hợp chất với enzym. Phương pháp này giúp xác định các hợp chất tiềm năng có khả năng ức chế enzym một cách hiệu quả. Kết quả từ cả hai mô hình sẽ được so sánh và phân tích để đưa ra những kết luận chính xác về tác dụng của cây chè vằng trong việc ức chế enzym α-glucosidase.

2.1. Nghiên cứu in vitro

Trong nghiên cứu in vitro, các mẫu chiết xuất từ cây chè vằng được thử nghiệm trên enzym α-glucosidase để đánh giá khả năng ức chế. Kết quả cho thấy rằng các hợp chất trong cây chè vằng có tác dụng ức chế mạnh mẽ enzym này, với giá trị IC50 thấp. Điều này cho thấy cây chè vằng có tiềm năng lớn trong việc phát triển thành sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng việc sử dụng cây chè vằng có thể giúp giảm thiểu các tác dụng phụ không mong muốn của các loại thuốc điều trị hiện có.

2.2. Nghiên cứu in silico

Mô hình in silico sử dụng phương pháp docking phân tử để phân tích khả năng liên kết của các hợp chất trong cây chè vằng với enzym α-glucosidase. Kết quả cho thấy rằng nhiều hợp chất có khả năng gắn kết mạnh mẽ với vị trí hoạt động của enzym, từ đó ức chế hoạt động của enzym này. Phân tích docking cho phép dự đoán các thông số dược động học và độc tính của các hợp chất, giúp xác định những hợp chất tiềm năng nhất cho việc phát triển thuốc. Nghiên cứu này không chỉ cung cấp thông tin quý giá về tác dụng của cây chè vằng mà còn mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các loại thuốc từ thiên nhiên.

III. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy cây chè vằng có tác dụng ức chế enzym α-glucosidase mạnh mẽ, với các hợp chất tiềm năng được xác định thông qua cả hai mô hình nghiên cứu. Việc ức chế enzym này có thể giúp kiểm soát đường huyết hiệu quả, từ đó hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng việc sử dụng các chất ức chế enzym α-glucosidase có thể làm giảm lượng đường trong máu sau bữa ăn, từ đó hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường hiệu quả hơn. Kết quả này không chỉ khẳng định giá trị của cây chè vằng trong y học cổ truyền mà còn mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các sản phẩm từ thiên nhiên nhằm hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường.

3.1. Đánh giá tác dụng ức chế enzym

Kết quả từ nghiên cứu cho thấy rằng cây chè vằng có khả năng ức chế enzym α-glucosidase với giá trị IC50 thấp, cho thấy hiệu quả cao trong việc kiểm soát đường huyết. Các hợp chất trong cây chè vằng không chỉ có tác dụng ức chế enzym mà còn có khả năng giảm thiểu các tác dụng phụ không mong muốn của các loại thuốc điều trị hiện có. Điều này mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm từ thiên nhiên, an toàn và hiệu quả hơn trong điều trị bệnh tiểu đường.

3.2. Ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường từ thiên nhiên. Cây chè vằng có thể được sử dụng như một thành phần trong các sản phẩm thực phẩm chức năng hoặc thuốc điều trị, giúp kiểm soát đường huyết hiệu quả. Việc phát triển các sản phẩm này không chỉ mang lại lợi ích cho sức khỏe cộng đồng mà còn góp phần vào việc bảo tồn và phát triển nguồn dược liệu quý giá của Việt Nam.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Đái tháo đường (ĐTĐ) là một hội chứng rối loạn chuyển hóa không đồng nhất đặc trưng bởi tình trạng tăng glucose huyết mạn tính do rối loạn bài tiết insulin, giảm hoạt tính của insulin hoặc kết hợp cả hai yếu tố. Theo thống kê của Hiệp hội Đái tháo đường Quốc tế (IDF) năm 2021, toàn cầu có khoảng 537 triệu người trưởng thành (20–79 tuổi) đang sống chung với bệnh đái tháo đường. Tại Việt Nam, đái tháo đường được dự báo sẽ trở thành một trong bảy nguyên nhân gây tử vong và tàn tật hàng đầu vào năm 2030.

Trong kiểm soát đường huyết sau bữa ăn đối với bệnh nhân đái tháo đường tuýp 2, ức chế enzym α-glucosidase (enzym xúc tác quá trình thủy phân carbohydrate thành glucose tại ruột non) là một trong những đích can thiệp dược lý quan trọng. Mặc dù các hoạt chất ức chế α-glucosidase tổng hợp như acarbose hay miglitol đang được sử dụng trên lâm sàng, chúng thường gây ra nhiều tác dụng không mong muốn trên đường tiêu hóa như đầy hơi, đau bụng, tiêu chảy và buồn nôn. Do đó, xu hướng tìm kiếm các hợp chất ức chế α-glucosidase có nguồn gốc tự nhiên từ dược liệu có độ an toàn cao đang nhận được nhiều sự quan tâm.

Cây Chè vằng (Jasminum subtriplinerve Blume, họ Nhài Oleaceae) là loài thực vật phân bố phổ biến tại Việt Nam và khu vực châu Á. Dược liệu này đã được nghiên cứu về các hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, chống oxy hóa và gây độc tế bào. Tuy nhiên, các nghiên cứu thực nghiệm về tác dụng hạ đường huyết và ức chế enzym α-glucosidase của Chè vằng tại Việt Nam còn hạn chế. Nhằm cung cấp dữ liệu khoa học phục vụ định hướng phát triển sản phẩm hỗ trợ điều trị đái tháo đường, khóa luận thực hiện hai nhiệm vụ nghiên cứu chính:

1. Đánh giá tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của các phân đoạn cao chiết từ lá cây Chè vằng trên mô hình thực nghiệm in vitro.
2. Xác định các hợp chất thành phần trong cây Chè vằng có tiềm năng ức chế enzym α-glucosidase thông qua phương pháp mô phỏng gắn kết phân tử (molecular docking), đánh giá quy tắc Lipinski và dự đoán dược động học – độc tính (in silico).

Phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng thực vật: Lá cây Chè vằng (Jasminum subtriplinerve Blume) thu hái tại Hà Nội vào tháng 10 năm 2021, lưu giữ tại Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội.
• Dữ liệu cấu trúc hóa học: Cơ sở dữ liệu gồm 39 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc từ lá Chè vằng, tổng hợp từ các công bố khoa học trong nước trên các tạp chí quốc tế (Natural Product Research, Journal of Asian Natural Products Research).
• Thời gian và địa điểm thực hiện: Năm 2022, tại Trường Đại học Y Dược (ĐHQGHN) và Viện Công nghệ sinh học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam).

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận kết hợp đồng thời phương pháp thực nghiệm sinh hóa (in vitro) và các công cụ tin sinh dược học (in silico) dựa trên các khung lý thuyết sau:

• Khung lý thuyết bệnh sinh và đích tác dụng: Áp dụng tiêu chuẩn chẩn đoán và phân loại của Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ (ADA, 2022); cơ chế xúc tác của enzym α-glucosidase (thuộc nhóm glycoside hydrolase GH13 và GH31) trong việc phân cắt liên kết α-1,4-glycoside giải phóng phân tử α-D-glucose; cơ chế ức chế cạnh tranh của các chất ức chế α-glucosidase (AGIs).
• Khung đánh giá độ giống thuốc và dược động học: Bộ 5 quy tắc Lipinski (Rule of 5 - RO5) nhằm sàng lọc đặc tính giống thuốc đường uống (Khối lượng phân tử MW < 500 Da; LogP < 5; số nhóm cho liên kết hydro HBD ≤ 5; số nhóm nhận liên kết hydro HBA ≤ 10; độ khúc xạ phân tử MR từ 40–130) và mô hình phân tích đặc tính ADMET (Hấp thu, Phân bố, Chuyển hóa, Thải trừ và Độc tính).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm (in vitro):

• Chiết xuất và phân đoạn: 500 g bột lá khô Chè vằng được chiết ngấm kiệt bằng dung môi ethanol (EtOH) 70% ở nhiệt độ phòng (tỷ lệ 1:10 kg/L, 3 lần × 3 ngày). Dịch chiết gộp được cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu cao toàn phần EtOH. Cao toàn phần được phân tán trong nước nóng và chiết lỏng – lỏng phân đoạn lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexane, ethyl acetate (EtOAc), n-butanol (BuOH) và cắn nước.
• Thử nghiệm ức chế enzym: Phản ứng ức chế enzym Yeast α-glucosidase (0,5 U/mL) sử dụng cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG) trong đệm phosphat pH 6,8. Phản ứng được dừng bằng dung dịch $\text{Na}_2\text{CO}3$ 0,2 M và đo mật độ quang (OD) tại bước sóng 405 nm trên máy đo ELISA Plate Reader (Biotek). Chất đối chứng dương là acarbose. Giá trị $\text{IC}{50}$ được tính toán bằng phần mềm TableCurve 2Dv4.

Phương pháp mô phỏng sàng lọc ảo (in silico):

• Chuẩn bị cấu trúc protein đích: Cấu trúc tinh thể isomaltase từ nấm men Saccharomyces cerevisiae (mã PDB ID: 3A4A, độ phân giải 1,30 Å, có tính tương đồng cao với α-glucosidase) đồng kết tinh với phối tử α-D-glucopyranose. Protein được chuẩn bị bằng phần mềm MGL AutoDockTools 1.5.6 (loại nước, thêm nguyên tử hydro và điện tích Kollman). Thiết lập hộp lưới (Grid Box) kích thước 28 Å × 28 Å × 28 Å bao trùm trung tâm hoạt động tại tọa độ X = 21,286; Y = -0,781; Z = 18,638.
• Chuẩn bị phối tử: Cấu trúc 3D của 39 hợp chất và acarbose được tải từ PubChem hoặc dựng bằng ChemOffice 19.0, tối ưu hóa năng lượng dưới trường lực MMFF94 bằng phần mềm Avogadro.
• Quy trình docking và thẩm định mô hình: Thực hiện bằng phần mềm AutoDock Vina. Thẩm định mô hình docking thông qua phương pháp re-docking phối tử đồng tinh thể α-D-glucopyranose vào thụ thể, đối chiếu độ sai lệch bình phương trung bình gốc (RMSD).
• Đánh giá ADMET và trực quan hóa: Sử dụng công cụ trực tuyến pkCSM để tính toán các thông số dược động học và độc tính. Phân tích tương tác không gian 2D và 3D của phức hợp protein – ligand bằng phần mềm Discovery Studio Visualizer 2020 và UCSF Chimera 1.15.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương 1 tổng hợp các tài liệu học thuật về 4 nhóm nội dung chính:

• Bệnh đái tháo đường: Trình bày định nghĩa, phân loại theo ADA 2022 (tuýp 1, tuýp 2, thai kỳ, nguyên nhân khác), cơ chế bệnh sinh do tự miễn phá hủy tế bào β đảo tụy (tuýp 1) hoặc do kháng insulin kết hợp suy giảm chức năng tế bào β (tuýp 2), các biến chứng cấp/mạn tính và các nhóm thuốc điều trị hiện hành.
• Enzym α-glucosidase và chất ức chế: Cấu trúc phân tử của họ glycoside hydrolase (GH13, GH31), cơ chế xúc tác thủy phân liên kết α-1,4-glycoside ở đầu tận không khử của đường đa/đường đôi. Cơ chế tác dụng và hạn chế của các thuốc AGI kinh điển (acarbose, miglitol), đồng thời tổng kết một số nghiên cứu chiết xuất hoạt chất ức chế α-glucosidase tự nhiên từ thực vật (Curcuma longa, Gypsophila oldhamiana, Piper umbellatum).
• Phương pháp sàng lọc ảo và docking phân tử: Cơ sở toán học của thuật toán tìm kiếm cấu dạng và hàm tính điểm (scoring function), quy trình chuẩn bị protein/phối tử, bộ tiêu chuẩn Lipinski RO5 và các công cụ dự đoán ADMET (pkCSM).
• Cây Chè vằng (Jasminum subtriplinerve Blume): Phân loại thực vật học, hình thái, vùng phân bố tại Việt Nam (Hòa Bình, Thái Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh), tổng quan thành phần hóa học (terpene glycoside, flavonoid glycoside, phenylpropanoid glycoside, triterpenoid) và các tác dụng sinh học đã được ghi nhận (kháng khuẩn, chống oxy hóa bằng DPPH, độc tế bào Hep-G2 và RD).

Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm và các thông số kỹ thuật:

• Thiết bị và hóa chất phục vụ chiết xuất dung môi phân đoạn và thử nghiệm sinh hóa trên phiến 96 giếng.
• Công thức tính phần trăm ức chế enzym: $$% \text{ ức chế} = 100% - \left(\frac{A_{\text{mẫu thử}}}{A_{\text{đối chứng}}} \times 100\right)$$ trong đó $A = \text{OD}{\text{thí nghiệm}} - \text{OD}{\text{blank}}$.
• Quy trình sàng lọc ảo 5 bước: (1) Chuẩn bị thụ thể 3A4A; (2) Chuẩn bị 39 phối tử; (3) Chạy docking bằng AutoDock Vina; (4) Thẩm định giá trị RMSD; (5) Xử lý năng lượng liên kết và phân tích liên kết tương tác.
• Thiết lập ngưỡng đánh giá đặc tính dược động học theo pkCSM: độ tan, tính thấm Caco2 (log Papp), tỷ lệ hấp thu qua ruột (%), thể tích phân bố VDss, tính thấm hàng rào máu não (logBB), tương tác cytochrome P450 (CYP2D6, CYP3A4), độ thanh thải toàn phần và các thử nghiệm độc tính (AMES, độc gan, nhạy cảm da).

Chương 3. Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm và dữ liệu mô phỏng thu được:

1. Kết quả chiết xuất và phân đoạn: Từ 500 g bột lá khô Chè vằng, chiết xuất bằng EtOH 70% thu được 71,79 g cao toàn phần (hiệu suất chiết 14,4%). Sau khi phân bố lỏng – lỏng, khối lượng các phân đoạn thu được gồm:

• Cao phân đoạn n-hexane: 1,04 g
• Cao phân đoạn ethyl acetate: 14,66 g
• Cao phân đoạn n-butanol: 21,78 g
• Phân đoạn cắn nước: 29,81 g

2. Kết quả ức chế enzym α-glucosidase in vitro: Hoạt tính ức chế enzym của các phân đoạn dịch chiết được so sánh trực tiếp với chất đối chứng dương acarbose:

Mẫu nghiên cứu	Nồng độ 500 µg/mL (% ức chế)	Nồng độ 100 µg/mL (% ức chế)	Nồng độ 20 µg/mL (% ức chế)	Nồng độ 4 µg/mL (% ức chế)	$\text{IC}_{50}$ (µg/mL)
Cao toàn phần EtOH	19,92 ± 1,56	2,74 ± 0,89	2,47 ± 2,89	1,93 ± 1,24	> 500
Phân đoạn n-Hexane	104,60 ± 4,72	99,75 ± 3,26	89,97 ± 2,19	16,66 ± 0,10	7,27 ± 0,71
Phân đoạn Ethyl acetate	102,19 ± 2,33	99,88 ± 1,07	89,54 ± 3,51	15,57 ± 1,07	7,42 ± 0,95
Phân đoạn n-Butanol	17,14 ± 0,37	4,24 ± 0,82	2,74 ± 0,28	1,53 ± 0,16	> 500
Phân đoạn Cắn nước	12,76 ± 1,07	0,97 ± 1,75	1,25 ± 0,19	1,73 ± 1,47	> 500
Acarbose (Chứng dương)	75,20 ± 0,62	48,57 ± 1,96	20,64 ± 0,34	8,32 ± 0,62	127,53 ± 1,73

3. Kết quả thẩm định mô hình và docking phân tử:

• Thử nghiệm re-docking phân tử α-D-glucopyranose vào vị trí hoạt động của thụ thể 3A4A cho kết quả trùng khớp cấu dạng với sai số $\text{RMSD} = 0,5\text{ \AA}$ (< 1,0 Å), khẳng định thông số docking có độ tin cậy cao.
• Docking 39 hợp chất của Chè vằng xác định được 8 hợp chất có năng lượng liên kết thấp nhất (ái lực gắn kết mạnh nhất), đều thấp hơn năng lượng liên kết của acarbose (-8,9 kcal/mol):

STT	Tên hợp chất	Năng lượng liên kết (kcal/mol)	Các acid amin tạo liên kết hydro
1	Rutin	-10,4	ASP352, ASP307, ARG315, THR310, GLU277
2	Nicotiflorin	-10,4	ARG315, TYR158, HIS280, THR310, GLU277
3	Verbascoside	-9,7	ASP307, HIS280, PRO312, GLU277, ASP352, TYR158...
4	Isoquercitrin	-9,4	ASP307, ASP242, ARG315, GLU277, ASP352, ARG442...
5	Isoverbascoside	-9,2	ASP215, ASP242, SER311, SER240, ASN415...
6	Stigmasterol	-9,2	PRO312
7	Astragalin	-9,1	THR310, ASP352, GLN353, TYR158, ARG315, PRO312
8	Chevangin B (3)	-9,1	ARG315, ASP242, GLU277, TYR158, ASP307, ASP352

4. Kết quả lọc quy tắc Lipinski và dự đoán ADMET: Trong 8 hợp chất trên, có 4 hợp chất thỏa mãn các tiêu chí của quy tắc Lipinski để tiến hành đánh giá ADMET: Astragalin, Isoquercitrin, Verbascoside và Stigmasterol.

Thông số dược động học & độc tính	Astragalin	Isoquercitrin	Verbascoside	Stigmasterol
Độ tan trong nước (log mol/L)	-2,883	-2,883	-2,878	-6,045
Tính thấm Caco2 (log Papp, $10^{-6}\text{ cm/s}$)	0,306	0,242	0,096	1,213
Hấp thu qua đường ruột (%)	48,052	47,842	41,178	94,970
Tính thấm hàng rào máu não (logBB)	-1,374	-1,452	-1,863	0,447
Cơ chất CYP2D6 / CYP3A4	Không / Không	Không / Không	Không / Không	Không / Có
Ức chế CYP2D6 / CYP3A4	Không / Không	Không / Không	Không / Không	Không / Không
Độ thanh thải toàn phần (log mL/min/kg)	0,634	0,554	0,618	0,937
Độc tính AMES / Độc tính gan	Không / Không	Không / Không	Không / Không	Không / Không

Chương 4. Bàn luận

Chương 4 tập trung phân tích ý nghĩa của các phát hiện:

• Về hoạt tính ức chế in vitro: Phân đoạn n-hexane ($\text{IC}{50} = 7,27\text{ }\mu\text{g/mL}$) và ethyl acetate ($\text{IC}{50} = 7,42\text{ }\mu\text{g/mL}$) thể hiện khả năng ức chế α-glucosidase mạnh gấp hơn 17 lần so với chất đối chứng acarbose ($\text{IC}_{50} = 127,53\text{ }\mu\text{g/mL}$). Điều này chứng minh các hoạt chất có hoạt tính tập trung chủ yếu ở nhóm phân cực trung bình và kém phân cực trong lá Chè vằng.
• Về mô hình sàng lọc in silico và tương tác phân tử: 4 hợp chất tiềm năng (Astragalin, Isoquercitrin, Verbascoside, Stigmasterol) tương tác chặt chẽ với các acid amin xúc tác quan trọng tại trung tâm hoạt động của enzym như GLU277, ASP352, ARG442, ARG446, GLN279 và HIS280. Trong đó, verbascoside và stigmasterol chia sẻ lần lượt 15 và 17 acid amin tương tác chung với thuốc chuẩn acarbose.
• Về đặc tính ADMET: Stigmasterol có tỷ lệ hấp thu đường ruột cao (94,97%), trong khi các flavonoid glycoside (astragalin, isoquercitrin) và verbascoside có mức hấp thu trung bình (41–48%). Cả 4 chất đều không thể hiện độc tính gây đột biến gen (AMES) và không gây độc tế bào gan trên mô hình dự đoán.

---

Kết quả và đóng góp

• Dữ liệu thực nghiệm mới về hoạt tính sinh học: Khóa luận chứng minh dịch chiết phân đoạn n-hexane và ethyl acetate từ lá cây Chè vằng có tác dụng ức chế mạnh enzym α-glucosidase in vitro với $\text{IC}_{50}$ lần lượt là $7,27 \pm 0,71\text{ }\mu\text{g/mL}$ và $7,42 \pm 0,95\text{ }\mu\text{g/mL}$, vượt trội so với chất đối chứng acarbose ($127,53 \pm 1,73\text{ }\mu\text{g/mL}$).
• Xây dựng cơ sở dữ liệu và xác định các phân tử tiềm năng: Tổng hợp cơ sở dữ liệu cấu trúc của 39 hợp chất có trong cây Chè vằng, sàng lọc thành công 4 hợp chất có tiềm năng phát triển thuốc/sản phẩm hỗ trợ điều trị đái tháo đường gồm: Astragalin, Isoquercitrin, Verbascoside và Stigmasterol. Cả 4 chất đều đáp ứng quy tắc Lipinski, có năng lượng liên kết với thụ thể thấp hơn acarbose và sở hữu hồ sơ an toàn ADMET thuận lợi.
• Đóng góp học thuật: Cung cấp cơ sở khoa học hiện đại kết hợp giữa sinh hóa thực nghiệm và hóa tin học cho việc sử dụng Chè vằng trong y học cổ truyền, đồng thời định hướng cho việc phân lập các hoạt chất hạ đường huyết từ hai phân đoạn dịch chiết tiềm năng.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Nghiên cứu thực nghiệm in vitro mới thực hiện trên các phân đoạn cao chiết thô và bán tinh khiết mà chưa tiến hành phân lập riêng lẻ từng đơn chất tinh khiết trong phân đoạn n-hexane và ethyl acetate để thử hoạt tính trực tiếp. Ngoài ra, kết quả mô phỏng in silico là dự đoán trên mô hình tính toán máy tính, cần kiểm chứng thực nghiệm sinh học chuyên sâu.
• Hướng nghiên cứu tiếp được đề xuất:
  1. Tiến hành phân lập và xác định cấu trúc hóa học chi tiết của các đơn chất có trong phân đoạn n-hexane và ethyl acetate từ lá cây Chè vằng nhằm kiểm chứng hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của từng chất.
  2. Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết và cơ chế tác dụng của các phân đoạn n-hexane và ethyl acetate trên mô hình động vật thực nghiệm (in vivo).

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng sử dụng: Khóa luận là tài liệu tham khảo cho sinh viên, học viên cao học, nghiên cứu sinh và các nhà nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Dược học, Dược liệu học, Dược lý học, Hóa dược và Công nghệ sinh học.
• Nội dung giá trị: Quy trình chiết xuất phân đoạn dung môi dược liệu; phương pháp thực nghiệm đánh giá ức chế enzym α-glucosidase sử dụng cơ chất pNPG trên phiến 96 giếng; quy trình tích hợp mô phỏng sàng lọc ảo AutoDock Vina, thẩm định mô hình bằng chỉ số RMSD và phân tích dược động học/độc tính bằng pkCSM.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Phân đoạn chiết nào từ lá cây Chè vằng thể hiện tác dụng ức chế α-glucosidase mạnh nhất?
Phân đoạn n-hexane và phân đoạn ethyl acetate thể hiện hoạt tính ức chế mạnh nhất với giá trị $\text{IC}{50}$ lần lượt là $7,27 \pm 0,71\text{ }\mu\text{g/mL}$ và $7,42 \pm 0,95\text{ }\mu\text{g/mL}$, trong khi cao toàn phần ethanol, phân đoạn n-butanol và phân đoạn nước đều có $\text{IC}{50} > 500\text{ }\mu\text{g/mL}$.

2. Mô hình docking phân tử sử dụng cấu trúc protein đích nào và tiêu chuẩn thẩm định ra sao?
Nghiên cứu sử dụng cấu trúc tinh thể isomaltase từ nấm men Saccharomyces cerevisiae (PDB ID: 3A4A, độ phân giải 1,30 Å). Mô hình được thẩm định bằng cách re-docking phân tử α-D-glucopyranose vào vị trí hoạt động; kết quả đạt giá trị $\text{RMSD} = 0,5\text{ \AA}$ (đạt chuẩn cho phép < 1,0 Å), chứng minh phương pháp tính toán có độ chính xác cao.

3. Trong số 39 hợp chất của Chè vằng, những chất nào có ái lực liên kết mạnh nhất và chất nào được chọn sau sàng lọc?
Có 8 hợp chất đạt năng lượng liên kết thấp nhất từ -9,1 đến -10,4 kcal/mol (mạnh hơn acarbose ở mức -8,9 kcal/mol) gồm: Rutin, Nicotiflorin, Verbascoside, Isoquercitrin, Isoverbascoside, Stigmasterol, Astragalin và Chevangin B. Sau khi sàng lọc qua quy tắc 5 tiêu chí của Lipinski, 4 hợp chất thỏa mãn điều kiện giống thuốc được lựa chọn là Astragalin, Isoquercitrin, Verbascoside và Stigmasterol.

4. Kết quả dự đoán dược động học và độc tính (ADMET) của 4 hợp chất tiềm năng cho thấy điều gì?
Cả 4 hợp chất (Astragalin, Isoquercitrin, Verbascoside, Stigmasterol) đều không có độc tính gây đột biến gen (thử nghiệm AMES âm tính), không gây độc cho gan và không gây kích ứng da. Về hấp thu, Stigmasterol có khả năng hấp thu qua ruột cao nhất (94,97%), trong khi 3 chất còn lại đạt mức từ 41,18% đến 48,05%.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Lê Minh Ngọc đã hoàn thành việc đánh giá hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của cây Chè vằng (Jasminum subtriplinerve Blume) thông qua sự kết hợp giữa mô hình thực nghiệm sinh hóa in vitro và mô phỏng gắn kết phân tử in silico. Kết quả thực nghiệm xác định hai phân đoạn chiết n-hexane và ethyl acetate có hoạt tính ức chế α-glucosidase mạnh vượt trội so với thuốc chuẩn acarbose. Đồng thời, mô hình sàng lọc ảo từ 39 hợp chất đã xác định được 4 phân tử tiềm năng (Astragalin, Isoquercitrin, Verbascoside, Stigmasterol) thỏa mãn các tiêu chí giống thuốc Lipinski và an toàn về mặt dược động học. Công trình cung cấp cơ sở khoa học thực chứng quan trọng cho việc tiếp tục nghiên cứu phân lập hoạt chất và thử nghiệm in vivo trên mô hình điều trị đái tháo đường từ nguồn dược liệu Chè vằng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. Bệnh đái tháo đường 1. Khái niệm Đái tháo đường là hội chứng các rối loạn chuyển hóa không đồng nhất, đặc trưng bởi sự tăng glucose huyết do rối loạn bài tiết insulin hay sự giảm hoạt tính của insulin, hoặc cả hai 5. Tăng glucose mạn tính trong thời gian dài gây nên những rối loạn chuyển hóa carbohydrate, protide, lipide, gây tổn thương ở nhiều cơ quan khác nhau, đặc biệt ở tim và mạch máu, thận, mắt, thần kinh 6.

Bệnh đái tháo đường là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới, cần được chẩn đoán, phát hiện và điều trị theo đúng nguyên tắc để đảm bảo sức khoẻ và chất lượng cuộc sống. Phân loại Theo Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ (ADA) năm 2022, ĐTĐ có thể được phân thành các loại sau 7: - ĐTĐ tuýp 1: còn gọi là ĐTĐ phụ thuộc insulin hay ĐTĐ ở ngưởi trẻ, được gây ra bởi sự phá hủy tế bào β đảo tuỵ, thường dẫn đến thiếu insulin tuyệt đối. - ĐTĐ tuýp 2: hay còn gọi là ĐTĐ không phụ thuộc insulin, do giảm chức năng của tế bào beta tụy tiến triển trên nền tảng đề kháng insulin. - ĐTĐ thai kỳ: được chẩn đoán vào giai đoạn thứ hai hoặc thứ ba của thai kỳ mà trước thời kỳ mang thai không có dấu hiệu rõ ràng của bệnh đái tháo đường.

- ĐTĐ do các nguyên nhân khác: các nguyên nhân khác gồm hội chứng đái tháo đường đơn gen , bệnh của tuyến tuỵ ngoại tiết, bệnh nội tiết, hoặc do thuốc, hoá chất như sử dụng glucocorticoid, trong điều trị HIV/AIDS hoặc sau khi cấy ghép nội tạng. Cơ chế bệnh sinh 1. Cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 1 Đái tháo đường typ 1 là một tình trạng đặc trưng bởi sự phá hủy các tế bào β đảo tụy thông qua hệ thống trung gian miễn dịch, dẫn đến tình trạng thiếu hụt insulin 8. Cụ thể, các tế bào bạch huyết bao quanh tiểu đảo (viêm quanh mô) và sau đó đi vào bên trong tiểu đảo, gây ra sự suy giảm tế bào β và kết quả dẫn đến tiểu đường typ 1 9.

2 Luan van Quá trình bệnh sinh được thúc đẩy thêm bởi sự tương tác giữa các yếu tố di truyền và các yếu tố môi trường bên ngoài. Nghiên cứu chỉ ra rằng, hơn 60 gen có thể ảnh hưởng đến nguy cơ phát triển bệnh ĐTĐ typ 1, đặc biệt là những người mang kháng nguyên HLA DR4, DQ2, DQ8 10. Bên cạnh yếu tố di truyền, một số yếu tố môi trường được coi là yếu tố nguy cơ như virus, vị trí địa lý, tuổi, cân nặng, chế độ ăn uống và tập luyện 11. Cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 2 Bệnh ĐTĐ typ 2, hay còn gọi là "bệnh tiểu đường không phụ thuộc insulin", chiếm 90–95% tổng số người mắc bệnh tiểu đường 7.

Có nhiều nguyên nhân khác nhau dẫn đến bệnh tiểu đường typ 2, trong đó hai yếu tố đóng vai trò quan trọng là sự đề kháng insulin và sự suy giảm chức năng bài tiết insulin 12. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, cơ chế của sự kháng insulin bao gồm các thụ thể insulin bị rối loạn chức năng, các con đường truyền tín hiệu của thụ thể không ổn định và những bất thường trong vận chuyển glucose hoặc chuyển hóa glucose 13. Các yếu tố môi trường cũng đóng vai trò lớn trong cơ chế phát sinh bệnh ĐTĐ typ 2, như béo phì, ít tập luyện thể thao, tuổi cao,…Phần lớn các bệnh nhân tiểu đường typ 2 bị thừa cân hoặc béo phì. Việc có cân nặng quá mức sẽ gây ra tình trạng kháng insulin ở một mức độ nào đó 7.

Ở người bị béo phì, nồng độ axit béo tự do 13 trong máu cao sẽ ức chế cạnh tranh với glucose, gây nên tình trạng kháng insulin 13. Tăng axit béo tự do còn ức chế trực tiếp lên quá trình gắn insulin với thụ thể đặc hiệu trên màng tế bào và hoạt động của insulin tại tế bào gan 14. Khi glucose huyết tăng, sẽ xuất hiện tăng bài tiết insulin để kiểm soát nồng độ glucose huyết. Nhưng sau đó, glucose huyết vẫn tiếp tục tăng cao, lúc này khả năng bài tiết insulin của tuỵ sẽ không đáp ứng kịp với mức độ tăng glucose huyết.

Do ảnh hưởng của việc tăng đường huyết quá mức sẽ dẫn đến chức năng của tế bào β bị suy giảm. Hậu quả là tế bào β giảm tiết insulin 14. Các biến chứng của bệnh ĐTĐ Bệnh nhân mắc bệnh ĐTĐ, nếu không được chăm sóc và điều trị đúng cách, sẽ gặp phải các bệnh và biến chứng nguy hiểm, lâu dài có thể dẫn đến tử vong. Một số biến chứng thường gặp của bệnh ĐTĐ có thể kể đến như: nhiễm toan ceton – nguyên nhân gây tử vong cao nhất trong các biến chứng cấp tính của ĐTĐ, hạ glucose huyết, hay các biến chứng mạn tính trên thận, mắt và tim mạch 14,6.

Đối với các biến chứng mạn tính, người bệnh cần được kiểm tra sức khoẻ thường xuyên. Bệnh thận do ĐTĐ nên được đánh giá albumin niệu và mức lọc cầu thận ít nhất mỗi năm một lần. Bệnh lý võng mạc do ĐTĐ cũng cần được khám mắt 3 Luan van toàn diện và đo thị lực định kỳ hàng năm, để có thể kiểm soát được tiến triển bệnh và giảm nguy cơ mù loà về sau 6. Nhìn chung, các biến chứng do bệnh ĐTĐ để lại sẽ ảnh hưởng một phần đến sức khoẻ và chất lượng cuộc sống của người bệnh, nếu không được điều trị tích cực sẽ gây ra hậu quả nặng nề.

Điều trị bệnh ĐTĐ 1. Điều trị ĐTĐ typ 1 Do cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 1 là tuỵ không còn khả năng bài tiết insulin để đáp ứng nhu cầu cơ thể, nên nguyên tắc điều trị chính là điều trị insulin thay thế suốt đời và phối hợp chế độ ăn uống khoa học, cũng như tập luyện thể lực một cách hợp lý 14. Hiện nay có rất nhiều dạng insulin khác nhau, như: insulin tác dụng nhanh, tác dụng trung gian, tác dụng kéo dài. Căn cứ vào từng trường hợp cụ thể mà bác sĩ sẽ đưa ra phác đồ điều trị phù hợp với từng bệnh nhân, để có được kết quả tốt nhất.

Điều trị ĐTĐ typ 2 Đối với người mắc bệnh ĐTĐ typ 2, nguyên tắc điều trị chung là thay đổi lối sống, có một chế độ tập luyện và ăn uống khoa học, kết hợp sử dụng thuốc điều trị ĐTĐ typ 2. Thuốc điều trị ĐTĐ typ 2 hiện nay rất đa dạng, mỗi loại thuốc có cơ chế tác dụng và tương tác khác nhau, đem lại nhiều thuận lợi trong việc lựa chọn thuốc cho bệnh nhân. Thuốc điều trị ĐTĐ typ 2 được chia làm 3 nhóm chính 14: - Nhóm thuốc kích thích bài tiết insulin: sulfonylurea, meglinid. - Nhóm thuốc làm tăng tác dụng insulin tại cơ quan đích và chống lại tình trạng kháng insulin: metformin, thiazolidindion.

- Nhóm thuốc ức chế hấp thu glucose tại ruột: acarbose, miglitol. Ngoài ra, bệnh nhân ĐTĐ typ 2 cần được điều trị hỗ trợ bằng insulin trong một số trường hợp sau 14: - Trong trường hợp cấp cứu: tiền hôn mê, hôn mê do biến chứng cấp tính của bệnh ĐTĐ. - Bệnh nhân sút cân nhiều, suy dinh dưỡng, có các bệnh nhiễm khuẩn cấp và mạn tính kèm theo. - Chuẩn bị can thiệp phẫu thuật, trong thời gian phẫu thuật và hậu phẫu.

- Có biến chứng nặng ĐTĐ: bệnh lý võng mạc, suy gan nặng, suy thận nặng, bệnh lý tim mạch nặng. - Khi dùng thuốc uống liều tối đa không có tác dụng, bệnh nhân thất bại thứ phát với thuốc uống hạ glucose huyết. 4 Luan van Một số yếu tố cần xem xét khi lựa chọn thuốc hạ đường huyết 6: - Hiệu quả giảm glucose huyết - Nguy cơ hạ glucose huyết: sulfonylurea, insulin - Tăng cân: Pioglitazon, insulin, sulfonylurea - Giảm cân: GLP-1 RA, ức chế kênh đồng vận chuyển natri-glucose (SGLT2i), ức chế enzym α-glucosidase (giảm cân ít) - Không ảnh hưởng nhiều lên cân nặng: ức chế enzym DPP-4, metformin - Giá thuốc: cân nhắc dựa trên chi phí và hiệu quả điều trị 1. Enzym 𝛂-glucosidase và chất ức chế enzym 𝛂-glucosidase 1.

Enzym 𝜶-glucosidase Enzym -glucosidase (E.20) là một nhóm các enzym, bao gồm một số enzym như maltase, glucoinvertase, glucosidosucrase, maltase-glucoamylase, α- glucopyranosidase, α-D-glucosidase, α-glucosid hydrolase, α1,4-glucosidase, α-D- glucosid glucohydrolase. Enzym -glucosidase là một exohydrolase điển hình xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết α-1,4-glycoside ở đầu tận cùng không khử của carbohydrate để giải phóng phân tử -D-glucose. Cơ chất đặc trưng của enzym này là oligosaccharide, disaccharide, các aryl- và akyl-α-glucopyranoside 15. Enzym α-glucosidase là một trong những enzym thuộc lớp glycoside hydrolase (GH), là một lớp các enzym thường tách các liên kết glycoside giữa 2 phân tử carbohydrate – một trong những liên kết mạnh nhất được tìm thấy ở các polymer tự nhiên.

Khả năng phân cắt các liên kết glycoside của enzym này nhanh hơn 10-17 lần so với phản ứng không có enzym xúc tác 16. Enzym α-glucosidase tồn tại trong hầu hết các sinh vật. Ở người, enzym α- glucosidase được tìm thấy trên màng bề mặt của đường ruột, tham gia trong bước cuối cùng của quá trình chuyển hóa carbohydrate 17. Cấu trúc của enzym 𝛼-glucosidase Các α-glucosidase (AGases) thuộc về glycoside họ hydrolase (GH) 13 và 31, GH13 và GH31 AGases thể hiện các đặc điểm về cấu trúc, chức năng đa dạng 15.

Cấu trúc tinh thể của cả hai các enzym được xác định bằng cách sử dụng các dạng tự do và liên kết với phối tử. GH13 có cấu trúc tương tự như oligo-1,6-glucosidase (EC 3.10; O16G) và dextran glucosidase (glucan 1,6- α-glucosidase; EC 3. 5 Luan van Hình 1. Cấu trúc không gian ba chiều của GH13 Agases 15 A.

Cấu trúc tổng thể của phức hợp Halomonas sp. a-glucosidase và maltose (PDB, 3WY4) B. Cấu trúc tổng thể của phức hợp Streptococcus mutans DG và isomaltotriose (PDB, 2ZID) Hình 1. Cấu trúc không gian 3D của GH31 Agases 15 A.

Mô hình cấu trúc của N-terminal maltase-glucoamylase B. Vùng hoạt động của N-terminal maltase-glucoamy 1. Cơ chế hoạt động của enzym 𝛼-glucosidase Carbohydrate là chất dinh dưỡng đa lượng chính trong chế độ ăn của con người chúng ta. Khi đưa thức ăn vào cơ thể, các phân tử carbohydrate sẽ được thủy phân 6 Luan van thành những phân tử đường đơn bởi hệ enzym ở ruột non.

Cụ thể, nguồn carbohydrate này sau khi vào cơ thể sẽ được enzym α-amylase ở tuỵ và enzym α-glucosidase ở ruột non tiết ra, tiếp tục thủy phân thành những phân tử glucose nhỏ hơn rồi thẩm thấu vào máu 15. Do vậy, bằng việc ức chế hoạt động của enzym α-glucosidase có thể làm giảm quá trình thủy phân carbohydrate và làm chậm sự thẩm thấu glucose vào máu 16. Chất ức chế enzym 𝜶-glucosidase Chất ức chế enzym α-glucosidase (α-glucosidase inhibitors-AGIs) là các chất làm chậm quá trình hấp thụ carbohydrate từ ruột non, do đó có tác dụng làm giảm lượng đường trong máu sau bữa ăn 18.