Tổng quan nghiên cứu

Trên thế giới, khoảng 2 tỷ người nhiễm virus viêm gan B (HBV), trong đó có khoảng 350 triệu người mắc HBV mạn tính và 25% trong số này tiến triển thành các biến chứng nghiêm trọng như xơ gan và ung thư tế bào gan. Ở Việt Nam, theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), có khoảng 8 triệu người nhiễm HBV, với tỷ lệ mang kháng nguyên bề mặt HBV (HBsAg) dao động từ 11% đến 25% tùy vùng địa lý. Ung thư gan nguyên phát là nguyên nhân tử vong đứng thứ hai ở nam giới Việt Nam. Từ năm 1978 đến 1990, số người mắc viêm gan hàng năm khoảng 20.000, với tỷ lệ tử vong từ 0,7% đến 0,8%, trong đó tỷ lệ HBsAg dương tính chiếm 45-50%. Những con số này cho thấy Việt Nam là quốc gia có dịch tễ nhiễm HBV cao, đặt ra nhu cầu cấp thiết trong việc kiểm soát và điều trị bệnh.

Entecavir (ETV) là thuốc kháng virus viêm gan B được lựa chọn hàng đầu nhờ hiệu quả ức chế virus, đặc biệt với các chủng kháng lamivudin và adefovir, đồng thời có tính an toàn và khả năng dung nạp tốt. Liều dùng ETV thấp (1 mg/ngày) dẫn đến nồng độ thuốc trong huyết tương thấp (Cmax khoảng 8,2 ng/mL), đòi hỏi phương pháp định lượng có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Hiện tại, trên thị trường Việt Nam có 39 biệt dược chứa ETV được cấp phép lưu hành, tuy nhiên chưa có nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học (TĐSH) chính thức cho các chế phẩm này.

Mục tiêu nghiên cứu là xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng entecavir trong huyết tương người bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) với độ nhạy cao, đồng thời ứng dụng phương pháp này để đánh giá TĐSH của chế phẩm entecavir sản xuất trong nước. Nghiên cứu được thực hiện tại Trường Đại học Dược Hà Nội trong năm 2023, góp phần nâng cao chất lượng kiểm nghiệm thuốc và hỗ trợ phát triển dược phẩm trong nước.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

  • Dược động học và dược lực học của Entecavir: Entecavir là dẫn xuất nucleosid purin, hoạt động bằng cách ức chế DNA polymerase của HBV thông qua cạnh tranh với deoxyguanosin triphosphat, ngăn chặn quá trình sao chép virus. Thuốc hấp thu nhanh, đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương sau 30-90 phút, có thời gian bán thải khoảng 24 giờ, phân bố rộng rãi và đào thải chủ yếu qua thận.

  • Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS): Kỹ thuật kết hợp khả năng phân tách của sắc ký lỏng với độ nhạy và độ đặc hiệu cao của khối phổ tứ cực chập ba, sử dụng nguồn ion hóa phun sương điện tử (ESI) để chuyển đổi phân tử thuốc thành ion mang điện tích dương, cho phép định lượng chính xác các chất trong nền mẫu phức tạp như huyết tương.

  • Kỹ thuật xử lý mẫu dịch sinh học: Bao gồm tủa protein, chiết lỏng-lỏng và chiết pha rắn (SPE). Trong nghiên cứu này, ưu tiên sử dụng tủa protein với dung môi acetonitril để loại bỏ protein huyết tương, giảm nhiễu nền và bảo vệ thiết bị phân tích.

Các khái niệm chính bao gồm: ion mẹ và ion con trong phân tích MS/MS, giới hạn định lượng dưới (LLOQ), đường chuẩn tuyến tính, độ đúng và độ chính xác của phương pháp, tỷ lệ thu hồi và độ ổn định mẫu.

Phương pháp nghiên cứu

  • Nguồn dữ liệu: Mẫu huyết tương người tình nguyện uống viên nén entecavir 1 mg, cùng với mẫu huyết tương trắng dùng để tạo mẫu chuẩn và kiểm tra thẩm định phương pháp.

  • Phương pháp chọn mẫu: Lấy mẫu máu tĩnh mạch cẳng tay tại 19 thời điểm khác nhau từ 0 đến 72 giờ sau khi uống thuốc, mỗi lần lấy 5 mL máu, xử lý bằng chất chống đông Na2EDTA, ly tâm tách huyết tương và bảo quản ở -35°C.

  • Phương pháp phân tích: Xây dựng phương pháp LC-MS/MS với ion hóa ESI dương, sử dụng chuẩn nội đồng vị Entecavir-13C2,15N để tăng độ chính xác. Xử lý mẫu bằng tủa protein với acetonitril, cô bay hơi dung môi, hòa tan cắn trong nước trước khi tiêm vào hệ thống sắc ký. Sử dụng cột Luna C18(2)-HST (50 mm x 3 mm, 2,5 µm), pha động MeOH – amoni bicarbonat 10 mM (20:80), tốc độ dòng 0,3 mL/phút, thể tích tiêm 10 µL.

  • Timeline nghiên cứu: Tiến hành xây dựng và tối ưu điều kiện phân tích trong 3 tháng đầu, thẩm định phương pháp trong 2 tháng tiếp theo, ứng dụng phân tích mẫu huyết tương người tình nguyện trong 3 tháng cuối năm 2023.

  • Phân tích số liệu: Sử dụng phần mềm điều khiển thiết bị LC-MS/MS và Microsoft Excel để tính toán các thông số dược động học (Cmax, Tmax, AUC0-72h), đánh giá độ đúng, độ chính xác, độ ổn định và tỷ lệ thu hồi theo hướng dẫn của US-FDA và EMA.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Xây dựng điều kiện ion hóa và chọn ion mẹ-con: Ion mẹ của ETV được xác định tại m/z = 278,0 ([ETV+H]+), ion con đặc trưng m/z = 152,0 với năng lượng phân mảnh tối ưu 25 V, cho tín hiệu cao và ổn định. Chuẩn nội Entecavir-13C2,15N có ion mẹ m/z = 281,0 và ion con m/z = 155,0.

  2. Khảo sát điều kiện sắc ký: Hệ pha động MeOH – amoni bicarbonat 10 mM (20:80) cho pic sắc ký cân đối, đáp ứng tín hiệu cao và thời gian lưu hợp lý (khoảng 1,6 phút). Cột Luna C18(2)-HST (50 mm x 3 mm, 2,5 µm) được lựa chọn do cho pic sắc ký sắc nét và độ phân giải tốt. Tốc độ dòng 0,3 mL/phút và thể tích tiêm 10 µL tối ưu cho phân tích.

  3. Quy trình xử lý mẫu: Phương pháp tủa protein với acetonitril (tỷ lệ 4:1 so với huyết tương) kết hợp cô bay hơi dung môi và hòa tan cắn trong nước cho tỷ lệ thu hồi ETV đạt khoảng 89,9% ở nồng độ thấp (LQC) và 80,0% ở nồng độ cao (HQC). Phương pháp chiết lỏng-lỏng không hiệu quả do không thu được pic ETV rõ ràng.

  4. Thẩm định phương pháp: Phương pháp có giới hạn định lượng dưới (LLOQ) là 0,05 ng/mL, khoảng tuyến tính từ 0,05 đến 500 ng/mL với hệ số tương quan r ≥ 0,998. Độ đúng và độ chính xác trong ngày và khác ngày đều đạt yêu cầu với hệ số biến thiên (CV) dưới 15%. Độ ổn định của ETV trong huyết tương và dung dịch chuẩn được bảo đảm trong các điều kiện bảo quản và xử lý mẫu.

  5. Ứng dụng phân tích mẫu huyết tương người tình nguyện: Nồng độ Cmax trung bình của ETV trong huyết tương đạt khoảng 8,2 ng/mL sau khi uống liều 1 mg, Tmax khoảng 0,7 giờ, AUC0-72h đạt giá trị phù hợp với các nghiên cứu quốc tế. Đường cong nồng độ-thời gian được biểu diễn rõ ràng, cho phép đánh giá chính xác dược động học của thuốc.

Thảo luận kết quả

Phương pháp LC-MS/MS được xây dựng có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phù hợp với đặc điểm dược động học của entecavir là nồng độ thấp trong huyết tương. Việc lựa chọn ion mẹ và ion con đặc trưng giúp giảm thiểu nhiễu nền và tăng độ chính xác định lượng. Quy trình xử lý mẫu bằng tủa protein với acetonitril vừa đơn giản, tiết kiệm chi phí, vừa đảm bảo loại bỏ protein và các tạp chất gây nhiễu, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam.

So sánh với các nghiên cứu quốc tế, kết quả thẩm định phương pháp và thông số dược động học tương đồng, khẳng định tính tin cậy và khả năng ứng dụng rộng rãi của phương pháp. Biểu đồ sắc ký và đường cong nồng độ-thời gian có thể được trình bày để minh họa độ phân giải và độ nhạy của phương pháp, cũng như sự biến thiên nồng độ thuốc theo thời gian.

Phương pháp này góp phần quan trọng trong việc đánh giá tương đương sinh học các chế phẩm entecavir trong nước, hỗ trợ phát triển dược phẩm nội địa với giá thành hợp lý, đồng thời nâng cao chất lượng điều trị bệnh viêm gan B.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Triển khai áp dụng phương pháp LC-MS/MS trong các phòng kiểm nghiệm thuốc: Đào tạo kỹ thuật viên về quy trình xử lý mẫu và vận hành thiết bị LC-MS/MS để nâng cao năng lực phân tích định lượng entecavir, đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy trong kiểm nghiệm.

  2. Đánh giá tương đương sinh học các chế phẩm entecavir sản xuất trong nước: Sử dụng phương pháp đã xây dựng để thực hiện các nghiên cứu TĐSH, giúp xác định hiệu quả và an toàn của thuốc nội địa so với thuốc gốc, từ đó hỗ trợ cơ quan quản lý trong việc cấp phép lưu hành.

  3. Phát triển các nghiên cứu dược động học mở rộng: Mở rộng nghiên cứu trên các nhóm bệnh nhân khác nhau, bao gồm bệnh nhân viêm gan B mạn tính, để đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố sinh học và lâm sàng đến dược động học của entecavir.

  4. Cải tiến quy trình xử lý mẫu và phân tích: Nghiên cứu kết hợp kỹ thuật tủa protein với các phương pháp làm sạch mẫu khác như chiết pha rắn để nâng cao độ thu hồi và giảm thiểu nhiễu nền, đồng thời rút ngắn thời gian phân tích.

  5. Xây dựng cơ sở dữ liệu dược động học entecavir tại Việt Nam: Thu thập và tổng hợp dữ liệu từ các nghiên cứu TĐSH và dược động học để hỗ trợ các quyết định điều trị và phát triển chính sách y tế phù hợp.

Các giải pháp trên nên được thực hiện trong vòng 1-2 năm tới, phối hợp giữa các cơ sở đào tạo, viện kiểm nghiệm và các đơn vị sản xuất dược phẩm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Dược học, Hóa phân tích: Luận văn cung cấp kiến thức chuyên sâu về phương pháp LC-MS/MS, kỹ thuật xử lý mẫu và thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học, hỗ trợ nghiên cứu và học tập.

  2. Phòng kiểm nghiệm thuốc và các cơ quan quản lý dược: Tham khảo để áp dụng phương pháp phân tích định lượng entecavir, phục vụ kiểm soát chất lượng thuốc và đánh giá tương đương sinh học các chế phẩm trên thị trường.

  3. Các công ty sản xuất và phát triển dược phẩm: Sử dụng kết quả nghiên cứu để thiết kế và thực hiện các nghiên cứu TĐSH, nâng cao chất lượng sản phẩm và đáp ứng yêu cầu cấp phép lưu hành.

  4. Bác sĩ và chuyên gia y tế trong lĩnh vực điều trị viêm gan B: Hiểu rõ hơn về dược động học của entecavir, từ đó tư vấn và điều chỉnh phác đồ điều trị phù hợp với từng bệnh nhân.

Câu hỏi thường gặp

  1. Tại sao cần xây dựng phương pháp định lượng entecavir bằng LC-MS/MS?
    Phương pháp LC-MS/MS có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phù hợp với nồng độ thấp của entecavir trong huyết tương (Cmax khoảng 8,2 ng/mL). Các kỹ thuật khác như HPLC với detector UV-Vis không đủ nhạy để phát hiện chính xác nồng độ thuốc.

  2. Phương pháp xử lý mẫu huyết tương nào được sử dụng trong nghiên cứu?
    Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật tủa protein với dung môi acetonitril để loại bỏ protein huyết tương, kết hợp cô bay hơi dung môi và hòa tan cắn trong nước, giúp tăng tỷ lệ thu hồi và giảm nhiễu nền trong phân tích.

  3. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) của phương pháp là bao nhiêu?
    Phương pháp đạt LLOQ là 0,05 ng/mL, đủ nhạy để phát hiện và định lượng entecavir trong huyết tương người với nồng độ thấp.

  4. Phương pháp này có thể áp dụng để đánh giá tương đương sinh học các chế phẩm entecavir không?
    Có, phương pháp được thẩm định theo tiêu chuẩn US-FDA và EMA, đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy, phù hợp để đánh giá TĐSH các chế phẩm entecavir trong nước.

  5. Thời gian phân tích một mẫu bằng phương pháp LC-MS/MS là bao lâu?
    Thời gian phân tích một mẫu khoảng 2 phút, phù hợp để xử lý số lượng mẫu lớn trong các nghiên cứu dược động học và kiểm nghiệm thuốc.

Kết luận

  • Đã xây dựng thành công phương pháp định lượng entecavir trong huyết tương người bằng sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS với độ nhạy cao (LLOQ 0,05 ng/mL) và độ chính xác tốt.
  • Phương pháp sử dụng kỹ thuật tủa protein với acetonitril trong xử lý mẫu, đảm bảo tỷ lệ thu hồi cao và giảm thiểu nhiễu nền.
  • Ứng dụng phương pháp để phân tích mẫu huyết tương người tình nguyện uống entecavir, thu được các thông số dược động học phù hợp với nghiên cứu quốc tế.
  • Phương pháp có thể áp dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm thuốc và nghiên cứu đánh giá tương đương sinh học các chế phẩm entecavir tại Việt Nam.
  • Đề xuất triển khai áp dụng phương pháp trong các phòng kiểm nghiệm, đồng thời mở rộng nghiên cứu dược động học và đánh giá TĐSH trong các nhóm bệnh nhân khác nhau.

Hành động tiếp theo: Khuyến khích các cơ sở kiểm nghiệm và nghiên cứu dược phẩm áp dụng phương pháp này để nâng cao chất lượng kiểm nghiệm và hỗ trợ phát triển thuốc nội địa, góp phần cải thiện hiệu quả điều trị viêm gan B tại Việt Nam.