ĐẶT VẤN ĐỀ Trên thế giới có khoảng 2 tỷ người nhiễm virus viêm gan B (HBV), trong đó có 350 triệu người nhiễm HBV mạn tính (CHB) và khoảng 25% người nhiễm HBV mạn tính tiến triển các biến chứng nghiêm trọng như xơ gan và ung thư tế bào gan. Tỷ lệ người mang kháng nguyên bề mặt của HBV (HBsAg) ở người khỏe mạnh từ 11% đến 25% tùy theo từng vùng địa lý. Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) thì Việt Nam có khoảng 8 triệu người nhiễm HBV và ung thư gan nguyên phát là nguyên nhân thứ hai gây tử vong ở nam giới. Theo thông báo của Bộ Y tế Việt Nam, tính từ 1978 đến 1990, số người mắc viêm gan trong 1 năm có khoảng 20 000 người, tỷ lệ tử vong từ 0,7 -0,8%.
Tỷ lệ HBsAg dương tính trong số người bệnh viêm gan từ 45 - 50%. Như vậy Việt Nam là nước có dịch tễ nhiễm virus viêm gan B lưu hành cao (từ 11 - 25%) [1] Entecavir (ETV) là thuốc tổng hợp tương tự nucleosid purin dẫn xuất từ guanin, có hoạt tính kháng virus viêm gan B ở người. Khi điều trị vius viêm gan B, ETV là một trong những thuốc được lựa chọn đầu tiên vì hiệu quả ức chế vius viêm gan B (cả các chủng virus viêm gan B kháng lamivudin và adefovir), ít kháng thuốc, tính an toàn và khả năng dung nạp tốt [2]. Hiện nay, trên thị trường Việt Nam giá của thuốc gốc - Baraclude (viên nén bao phim entecavir 0,5 mg) khoảng 85 -100 nghìn đồng/ 01viên; thuốc biệt dược có giá bằng khoảng 25% - 50% giá thuốc gốc nhưng vẫn cao so với thu nhập của đại đa số người dân.
Theo công bố chính thức của trang thông tin điện tử Cục quản lý dược Việt Nam, tính đến thời điểm tháng 04 năm 2023, ở Việt Nam có 39 biệt dược chứa ETV được cấp số đăng ký lưu hành trên thị trường. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu đánh giá TĐSH của chế phẩm chứa ETV nào trong nước chính thức được công bố. Vì vậy, để thúc đẩy sản xuất trong nước và giúp cho bệnh nhân sử dụng thuốc với giá cả phù hợp thì đánh giá chất lượng cũng như hiệu quả điều trị trong lâm sàng của các thuốc (đánh giá TĐSH) là cần thiết. 1 Đối với các nghiên cứu đánh giá TĐSH, một trong những nội dung quan trọng là phải xây dựng được một phương pháp định lượng đủ độ nhạy và đủ độ tin cậy.
ETV là một thuốc có liều dùng thấp (ngày uống 1mg) nên nồng độ ETV trong dịch sinh học cũng tương đối ít (Cmax là 8,2 ng/mL) [1]. Bên cạnh đó, dịch sinh học (huyết tương) có thành phần phức tạp nên không định lượng ETV được bằng các kỹ thuật thông dụng như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector UV- Vis, ECD,. vì những detector này thường không đủ độ nhạy và độ đặc hiệu. Do đó, phải lựa chọn một một phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
Thực tế nhiều nghiên cứu cho thấy, trong phân tích dịch sinh học thì kỹ thuật sắc ký lỏng ghép nối đầu dò khối phổ (LC-MS/MS) có nhiều ưu điểm như: độ nhạy và tính đặc hiệu cao, thời gian phân tích nhanh và đặc biệt là phù hợp với điều kiện trang thiết bị, kinh tế của Việt Nam [3]. Do đó, để định lượng ETV trong mẫu huyết tương thì phương pháp định lượng sử dụng kỹ thuật LC-MS/MS là lựa chọn phù hợp. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng entecavir trong huyết tương người bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS)” với mục tiêu cụ thể như sau: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng entecavir trong huyết tương người bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS); 2.
Ứng dụng phương pháp để định lượng entecavir trong mẫu huyết tương người uống chế phẩm entecavir phục vụ nghiên cứu TĐSH. TỔNG QUAN VỀ ENTECAVIR 1. Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa của entecavir 1. Công thức cấu tạo Hình 1.
Công thức cấu tạo của Entecavir - Công thức phân tử: C12H 15N5O3 - Khối lượng phân tử: 277,28 g/mol - Tên khoa học: 2-amino-1,9-dihydro-9-[(1S,3R,4S)-4-hydroxy3-(hydroxymethyl)- 2-methylenecyclopentyl]-6H-purin-6one) [6] 1. Tính chất lý hóa - Entecavir ở dạng bột kết tinh màu trắng hoặc trắng ngà - Tan ít trong nước (2,4 mg/mL ở pH 7,9; 25o C), không tan trong ethanol - Có tính base yếu pH = 7,9 trong dung dịch bão hòa nước ở 25o C - Hệ số phân bố: log P = - 0,8 - Hằng số phân ly: pKa = 8 - Góc quay cực riêng: +35o ở 25°C [6] 3 1. Các đặc tính dược lực học, dược động học của Entecavir 1. Đặc tính dược lực học của Entecavir Entecavir là một thuốc tổng hợp tương tự nucleosid purin dẫn xuất từ guanin có hoạt tính kháng virus viêm gan B ở người (HBV).
Thuốc được các enzym trong tế bào phosphoryl hóa để tạo thành một chất chuyển hóa có hoạt tính, là entecavir triphosphat. Bằng cách cạnh tranh với cơ chất tự nhiên deoxyguanosin triphosphat, entecavir triphosphat ức chế DNA polymerase (enzym phiên mã ngược) của virus viêm gan B ở người, do đó đã ngăn chặn được mọi giai đoạn hoạt tính của enzym [1]. Phổ tác dụng: Entecavir có hoạt tính in vitro và in vivo chống lại HBV, bao gồm cả một số chủng HBV kháng lamivudin. Thuốc cũng có tác dụng hạn chế in vitro chống một số virus ơ người, bao gồm virus Herpes simplex typ 1 và 2 (HSV-1 và HSV-2), virus Varicella zoster và cytomegalovirus nhưng thuốc không chứng tỏ có hiệu quả trong lâm sàng.
Entecavir có một vài tác dụng đối với HIV-1 (nồng độ entecavir cần thiết để ức chế virus sao chép khoảng 50% [EC50] đối với HIV-1 dao động từ 0,026 tới lớn hơn 10 µM) [1]. Kháng thuốc: Khi điều trị lâu dài ở một số người bệnh, một số chứng cứ cho thấy HBV chậm giảm nhạy cảm với entecavir. Ở người bệnh từ trước chưa dùng thuốc nucleosid, cho dùng entecavir tới 96 tuần, virus trở lại gây bệnh nặng lên do kháng thuốc xảy ra dưới 1% người bệnh. Ở người bệnh kháng lamivudin, virus bùng phát trở lại do kháng entecavir xảy ra 0,1% người bệnh sau năm đầu điều trị và 0,9% người bệnh trong năm thứ hai điều trị.
Kháng entecavir xảy ra trong quá trình 2 bước, ban đầu là đột biến M204V/I tiếp theo là thay thế amino-acid rtI169, rtT184, stS202, hoặc rtM250. Đã có kháng chéo giữa một số thuốc tương tự nucleosid có tác dụngchống HBV. HBV kháng lamivudin và kháng telbivudin đã thấy giảm nhạy cảm với entecavir in vitro. HBV kháng adefovir cũng thay đổi nhạy cảm với entecavir đã thấy in vitro.
Entecavir ức chế virus viêm gan B, ức chế cả các chủng virus viêm gan B kháng lamivudin và adefovir [5]. Đặc tính dược động học của Entecavir Hấp thu: Entecavir hấp thu nhanh qua đường tiêu hóa sau khi uống. Nồng độ đỉnh đạt được trong vòng 30 đến 90 phút sau khi uống một liều và đạt được nồng độ ổn định sau 6 đến 10 ngày điều trị. Ở người khỏe mạnh, khi uống liều 0,5 mg, C max đạt khoảng 4,2 ng/ml; uống liều 1 mg, Cmax đạt khoảng 8,2 ng/mL.
Với một liều trong 1 ngày, thời gian bán thải khoảng 24 giờ. Thức ăn làm chậm và giảm hấp thu. Phải uống entecavir lúc đói (ít nhất 2 giờ sau hoặc 2 giờ trước bữa ăn) [1]. Phân bố: Dựa trên dược động học của entecavir, thể tích phân bố biểu kiến ước lượng vượt toàn bộ nước cơ thể, cho thấy entecavir phân bố rộng rãi trong các mô.
SKD của thuốc viên bằng SKD của dung dịch uống nên hai thuốc có thể thay thế nhau. Entecavir gắn vào protein huyết tương khoảng 13% in vitro [1]. Chuyển hóa và đào thải: Entecavir không bị hệ thống cytochrom P450 chuyển hóa. Thuốc đào thải chủ yếu qua thận nhờ lọc cầu thận và tiết tích cực qua ống thận.
Nửa đời đào thải cuối là 128 – 149 giờ. Một lượng nhỏ các chất liên hợp glucoronid và sulfat được tạo thành. Thẩm phân máu có thể loại bỏ được một phần entecavir [1]. Một số nghiên cứu định lượng Entecavir trong dịch sinh học Khi phân tích thuốc trong dịch sinh học, mẫu máu thường được sử dụng phổ biến hơn so với các mẫu khác như nước tiểu, nước bọt, dịch não tủy.do thao tác lấy mẫu thường dễ dàng và chủ động hơn.
Các mẫu máu sau khi lấy được chuyển vào các ống nghiệm có chứa chất chống đông Na2EDTA, ly tâm tách lấy phần huyết tương và bảo quản ở nhiệt độ quy định cho đến khi được phân tích. Các thuốc chứa ETV đào thải chủ yếu qua thận khoảng 70% liều dùng. Thời gian bán thải sau khi uống khoảng 24 giờ và không phụ thuộc vào liều dùng. Do vậy, nồng độ ETV trong nước tiểu thường thấp hơn nhiều so với nồng độ ETV trong huyết tương.
Chính vì vậy, đa số các nghiên cứu định lượng ETV trong dịch sinh học được tiến hành trên mẫu huyết tương. Nghiên cứu của tác giả Challa BR và cộng sự [8]. Phương pháp nghiên cứu được mô tả và ứng dụng để xác định nồng độ EV trong huyết tương sau khi dùng đường uống của 26 5 NTN khỏe mạnh. Mỗi NTN khỏe mạnh được uống một viên nén liều 0,5 mg với 240 ml nước uống.
Sản phẩm tham chiếu (Viên nén Baraclude, 0,5 mg, Bristol – Myers Squibb) và sản phẩm thử nghiệm (viên nén entecavir, 0,5 mg, APL Research Pvt. Ltd) đã được sử dụng. Các công thức thử nghiệm và tham chiếu được sử dụng cho 26 NTN trong điều kiện nhịn ăn với 02 giai đoạn cách 06 ngày giữa hai lần dùng theo quy trình đã được phê duyệt. Các mẫu máu được thu thập dưới dạng liều trước (0 giờ) (5 phút trước khi dùng thuốc) sau đó là các mẫu tiếp theo ở 0,167, 0,333, 0,5, 0,667, 0,833, 1,0, 1,25, 1,5, 2,0, 3, 4, 6, 8, 12, 18, 24, 36, 48 và 72 giờ.
Sau khi uống thuốc, 5 ml máu được lấy tại mỗi thời điểm lấy mẫu cho riêng vào bình hút có chứa K2EDTA. Tổng số 40 mẫu thu được bao gồm các mẫu thử nghiệm và mẫu đối chứng được thu thập từ 20 mốc thời gian mỗi mẫu. Tất cả các mẫu được ly tâm ở tốc độ 3200 vòng / phút ở 10 0C trong 10 phút và tách riêng lớp HT, bảo quản trong ống polypropylene dưới - 30 0C cho tới khi phân tích mẫu. Mẫu được xử lý trước khi phân phân tích.
Lấy 500 µL trong các ống polypropylene và trộn với 100 µL IS (50,0 ng / ml). Các mẫu được nạp vào hộp chiết pha rắn (nước Oasis HLB 1 cm3, 30 mg) đã được điều hòa trước bằng 1 ml metanol sau đó là 1 mL nước. Sau đó, các hộp mực SPE được rửa hai lần với 2 mL nước (mỗi lần 1 mL) và làm khô.