ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư biểu mô tế bào thận (RCC) là bệnh ác tính phổ biến thứ 12 trên toàn thế giới, chiếm khoảng 2,4% trong tổng số các ca ung thư ác tính ở người lớn, hơn 400 000 trường hợp mới được chuẩn đoán và khoảng 180.000 ca tử vong trên toàn thế giới vào năm 2020 theo dữ liệu của GLOBOCAN. Hiện nay việc phát hiện sớm các tổn thương RCC ngày càng tăng do việc sử dụng rộng rãi chụp cắt lớp vi tính (CT) và chụp cộng hưởng từ (MRI), tuy nhiên tỷ lệ sống sót sau 5 năm chỉ có 12% với bệnh nhân có RCC di căn và ít nhất một nửa trong số họ cần điều trị bằng thuốc [19]. Ban đầu liệu pháp miễn dịch đầu tiên với cytokin là phương pháp điều trị tiêu chuẩn nhưng cho hiệu quả kém. Sự ra đời của các chất ức chế tyrosin kinase, chủ yếu là chất ức chế thụ thể yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF) đã góp phần cải thiện tiên lượng của các ca RCC di căn [13], [19].
Pazopanib hydroclorid là một chất ức chế đa tyrosin kinase đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ phê duyệt vào tháng 10 năm 2009 và Cơ quan Dược phẩm Châu Âu phê duyệt vào tháng 6 năm 2010 để điều trị RCC di căn [20]. Theo dự kiến, bằng sáng chế của pazopanib tại Châu Âu sẽ hết hạn vào tháng 6 năm 2025 [28], vì vậy, cần nghiên cứu và cải tiến các phương pháp tổng hợp pazopanib để đưa thuốc ra thị trường khi hết hạn độc quyền. Tinh chế là một bước quan trọng để đảm bảo độ tinh khiết của chế phẩm. Do đó, tinh chế pazopanib hydroclorid là một bước không thể thiếu sau mỗi quá trình tổng hợp.
Tuy nhiên, trên thế giới, việc tinh chế pazopanib hydroclorid chỉ được đề cập một cách sơ sài, chưa đầy đủ đồng thời quy trình định lượng pazopanib hydroclorid chưa được công bố trong các chuyên luận dược điển. Do đó, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu một số phương pháp tinh chế pazopanib hydroclorid” với mục tiêu: - Xây dựng được phương pháp định lượng pazopanib hydroclorid để đánh giá chất lượng sản phẩm trước và sau tinh chế. - Lựa chọn được phương pháp tinh chế pazopanib hydroclorid từ một số phương pháp đã khảo sát. Tổng quan về pazopanib hydroclorid 1.
Đặc điểm cấu trúc, danh pháp • Công thức cấu tạo (Hình 1. Công thức cấu tạo của pazopanib hydroclorid • Tên khoa học: 5-((4-((2,3-dimethyl-2H-indazol-6-yl)(methyl)amino)pyrimidin- 2-yl)amino)-2-methylbenzensulfonamid hydroclorid [26]. • Biệt dược: Votrient. • Công thức phân tử: C21H14ClN7O2S [26].
• Phân tử khối: 473,99 đvC [26]. • Thành phần khối lượng các nguyên tố (Bảng 1. Phần trăm khối lượng các nguyên tố trong phân tử pazopanib hydroclorid Nguyên tố C H N O S Cl % (m) 53,17 5,06 20,68 6,75 6,75 7,59 1. Tính chất lý hóa • Cảm quan: chất rắn dạng bột, màu trắng hoặc trắng ngà [30], [31].
• Độ tan: hòa tan trong DMSO (17mg/mL ở 25°C), nước (< 1mg/mL ở 25°C), ethanol (< 1mg/mL ở 25°C) và 30% PEG400/ 0,5% Tween80/ 5% propylen glycol (30mg/mL ở 25°C) [30]; độ hòa tan phụ thuộc vào pH, tan tốt ở pH 1,2 và thực tế không tan ở pH trên 6,8 [12]. • Nhiệt độ nóng chảy: 300-304°C [32]. • Phân loại sinh dược học (BCS): nhóm II (độ tan thấp, tính thấm cao) [12], [16]. Cơ chế tác dụng Pazopanib là một chất ức chế thụ thể tyrosin kinase thông qua việc ức chế cạnh tranh với adenosin triphosphat (ATP), có tác dụng ức chế 3 VEGFR là VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3 và 2 PDGFR là PDGFR-α và PDGFR-β, do đó làm giảm tăng sinh tế bào, ức chế các còn đường truyền tín hiệu của tế bào ung thư và ức chế sự hình thành mạch máu nuôi dưỡng tế bào ung thư [9], [17], [20].
Bản chất của quá trình ức chế cạnh tranh này là do cấu trúc phân tử pazopanib có phần indazol tương tự với phần adenin 2 của ATP nên có khả năng tạo liên kết hydro với các thụ thể tyrosin kinase, ngăn ATP gắn vào thụ thể làm ức chế kých hoạt chuỗi phản ứng nội bào do ATP gây ra [17]. Chỉ định Pazopanib hydroclorid được chỉ định để điều trị ung thư biểu mô tế bào thận tiến triền và sarcoma mô mềm tiến triển đã dùng hóa trị để điều trị di căn trước đó [17], [20], [25] 1. Các phương pháp tổng hợp pazopanib hydroclorid Theo các phượng pháp đã được công bố, pazopanib hydroclorid đều được tổng hợp từ 3 hợp phần vòng thơm (indazol, pyrimidin, benzensulfonamid) và 1 hợp phần methyl được mô tả như Hình 1.Trong đó pyrimidin là hợp phần cầu nối với 3 hợp phần còn lại [2]. Các hợp phần của pazopanib Theo cách gắn vòng thơm, có 2 cách chính để tổng hợp pazopanib hydroclorid được thể hiện qua Hình 1.
Các phương pháp tổng hợp pazopanib hydroclorid • Cách 1: Gắn hợp phần indazol vào hợp phần pyrimidin trước, sau đó cho sản phẩm phản ứng tiếp với hợp phần sulfonamid. Có 3 quy trình thực hiện tổng hợp pazopanib theo phương pháp này, đó là quy trình của Boloor, của Mei và của Liu 3 Haidong. Hợp phần pyrimidin trong phương pháp của Boloor và Mei có nguồn gốc từ 2,4-dicloropyrimidin, còn của Liu Haidong có nguồn gốc từ 2,4-dicloro- 5-nitropyrimidin [5-8]. • Cách 2: Gắn hợp phần sulfonamid vào hợp phần pyrimidin trước, sau đó gắn thêm hợp phần indazol.
Hiện nay mới chỉ có quy trình của Reddy và cộng sự thực hiện tổng hợp pazopanib theo phương pháp này, trong đó hợp phần pyrimidin có nguồn gốc từ 2,4-dicloropyrimidin [21]. Tạp chất Một số nghiên cứu về pazopanib đã chỉ ra, nhiều tạp chất xuất hiện là do tính chọn lọc trong quy trình tổng hợp. Trong đó, hầu hết phương pháp tổng hợp pazopanib hydroclorid đã công bố được thực hiện bằng cách gắn hợp phần indazol và hợp phần sulfonamid vào 2,4-dicloropyrimidin hoặc 2,4-dicloro-5-nitropyrimidin. Tuy nhiên việc định hướng phản ứng thế vào vị trí số 2 hay vị trí số 4 của vòng pyrimidin là không chọn lọc, thể hiện ở 2 phương pháp của Boloor và Reddy.
Boloor thực hiện phản ứng thế hợp phần indazol vào vị trí số 4, còn Reddy lại thực hiện thế hợp phần sulfonamid vào vị trí số 2 [5-8], [21], [22]. Vì vậy, các tạp chất có thể sinh ra do sự không chọn lọc trong quá trình phản ứng (Bảng 1. Một số tạp chất sinh ra trong quá trình tổng hợp pazopanib hydroclorid Tài liệu Tạp chất Tên khoa học tham khảo N2-(2,3-dimethyl-2H- [11], indazol-6-yl)-N4-(2,3- [23], dimethyl-2H-indol-6-yl) [29] pyrimidin-2,4-diamin N2-(2-chloropyrimidin- 4-yl)-N4-(2,3-dimethyl- 2H-indazol-5-yl)-N2- (2,3-dimethyl-2H- [23] indazol-6-yl)-N4- methylpyrimidin-2,4- diamin 4 5-((2,3-dimethyl-2H- indazol-6-yl) (methyl) amino) pyrimidin-4-yl) [29] amino)-2- methylbenzensulfonami d N2, N4-bis(2,3-dimethyl- 2H-indazol-6-yl)-N2, N4- [29] dimethylpyrimidin-2,4- diamin N-(4-cloropyrimidin-2- [18],[23 yl)-2,3-dimethyl-2H- ] indazol-6-amin N-(2-cloro-4- pyrimidinyl)-N-(3- [11] methyl-1H-indazol-6-yl) amin N-(2-cloropyrimidin-4- yl)-N,3-dimethyl-1H- [11] indazol-6-amin N-(2-cloropyrimidin-4- yl)-3-methyl-1H- [11] indazol-6-amin 5-((4-((1,3-dimethyl-1H- indazol-6-yl) amino) pyrimidin-2-yl) amino)- [11] 2- methylbenzensulfonami d 5-((4-((1,3-dimethyl-1H- indazol-6-yl) (methyl) amino) pyrimidin-2-yl) [11] amino)-2- methylbenzensulfonami d 5 1. Các phương pháp tinh chế 1.
Tổng quan về các phương pháp tinh chế Tinh chế là quá trình kĩ thuật làm sạch, loại các tạp chất khỏi một hợp chất nào đó để thu được một chất dưới dạng tinh khiết cao. Sau quá trình tổng hợp hóa học thì thường thu được hỗn hợp gồm nhiều chất khác nhau bên cạnh chất chính như dung môi, các nguyên liệu ban đầu, các xúc tác còn dư, các sản phẩm phụ sinh ra trong quá trình phản ứng. Vì vậy, quá trình tinh chế để thu được sản phẩm chính có độ tinh khiết cao là yêu cầu bắt buộc trong quá trình tổng hợp một chất hóa học. Các phương pháp tinh chế hay dùng với chất hữu cơ là chưng cất, chiết, kết tinh và sắc ký.
[1] • Phương pháp chưng cất: phương pháp này sử dụng sự chênh lệch trong nhiệt độ sôi của các thành phần trong hỗn hợp để tách chúng ra khỏi nhau. • Phương pháp chiết: là phương pháp dùng một dung môi thích hợp hòa tan chất cần tách thành pha lỏng (gọi là dịch chiết) để phân tách khỏi pha lỏng hoặc pha rắn chứa hỗn hợp các chất còn lại. Dung môi thường dùng là ete, benzen, hexan… • Phương pháp kết tinh: Nguyên lý của quá trình kết tinh là tạo ra dung dịch quá bão hòa ở nhiệt độ cao hơn sau đó làm lạnh, thành phần nào đạt được nồng độ bão hòa trước thì kết tinh được còn thành phần nào chưa đạt tới nồng độ bão hòa thì không thể kết tinh và nằm trong dung dịch. • Phương pháp sắc ký: cơ sở của phương pháp này là dựa trên sự khác biệt về tốc độ di chuyển của các chất trong pha động khi tiếp xúc với pha tĩnh.
Một số kiểu sắc ký phổ biến như sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí… 1. Kỹ thuật tinh chế bằng kết tinh 1. Chọn dung môi kết tinh Đây là việc quan trọng nhất khi chuẩn bị kết tinh. Các tiêu chí lựa chọn dung môi bao gồm [3]: • Dung môi cần phải hòa tan tốt chất cần kết tinh ở nhiệt độ cao và tủa ra từ dung dịch khi giảm nhiệt độ.
• Dung môi dùng kết tinh không làm phân hủy thành phần chất đem kết tinh, không làm biến đổi về mặt hóa học chất kết tinh • Nếu có nhiều dung môi đáp ứng yêu cầu trên thì ưu tiên chọn dung môi dễ thao tác, ít độc, không gây cháy nổ và rẻ tiền. Hạn chế tối đa sử dụng ether trong kết tinh vì dễ cháy và rất dễ bay hơi ngay cả điều kiện thường. Quy trình kết tinh Sau khi chọn được dung môi kết tinh, thực hiện quy trình kết tinh thông thường gồm các bước được thể hiện qua Sơ đồ 1. Hòa tan chất rắn Tẩy sạch, lọc nóng Để kết tinh Phân lập tinh thể Sấy khô Sơ đồ 1.
Các bước trong quy trình kết tinh 1. Các phương pháp kết tinh Một vài phương pháp kết tinh thường được ứng dụng để tinh chế các sản phẩm trong tổng hợp hóa dược [24]: • Kết tinh bằng phương pháp làm lạnh Nguyên lý của quá trình kết tinh làm lạnh là dựa trên sự thay đổi nhiệt độ. Hòa tan hỗn hợp cần tinh chế vào dung môi thích hợp sau đó hạ nhiệt độ thì độ tan của sản phẩm sẽ thường giảm theo nhiệt độ và khi nồng độ của chất đó vượt quá điểm bão hòa thì tinh thể sẽ hình thành. Quy trình của phương pháp này được mô tả đơn giản qua Sơ đồ 1.
Chất rắn Nhiệt độ Hòa tan tạo dung dịch Dung môi Làm lạnh dung dịch Lọc chất kết tinh Sấy thu sản phẩm Sơ đồ 1. Kết tinh bằng phương pháp làm lạnh 7 • Kết tinh bằng phương pháp cô đặc dung dịch Nguyên lý của phương pháp này là dựa trên sự bay hơi dung môi, làm nồng độ của chất cần tinh chế vượt quá điểm bão hòa, do đó tinh thể sẽ được hình thành. Quy trình của phương pháp này được mô tả như Sơ đồ 1.