Nghiên Cứu Về Cấu Trúc và Hoạt Tính Của Enzym Histon Deacetylase

Tài liệu nghiên cứu Tổng hợp và thử tác dụng, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên sâu về ., phục vụ nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

• Trường học: Đại học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa Dược
• Đề tài: Nghiên Cứu Về Enzym Histon Deacetylase và Các Chất Ức Chế
• Loại tài liệu: luận án

Mục lục chi tiết

• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 2. CẤU TRÚC CÁC ENZYM HISTON DEACETYLASE NHÓM I, II VÀ IV
• 3. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE
• 4. PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP VÒNG TRIAZOL
• 5. PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP ACID HYDROXAMIC TỪ ESTER
• 6. ĐỊNH HƯỚNG THIẾT KẾ CẤU TRÚC
• 7. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 8. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 8.1. Nội dung nghiên cứu
• 8.2. Phương pháp nghiên cứu
• 9. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 9.1. Kết quả dự đoán tương tác, tổng hợp và khẳng định cấu trúc các chất
• 9.1.1. Kết quả dự đoán tương tác của các chất với HDAC2
• 9.1.2. Tổng hợp hóa học
• 9.1.3. Kết quả phân tích dữ liệu phổ
• 9.2. KẾT QUẢ THỬ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM, ĐỘC TÍNH TẾ BÀO VÀ DỰ ĐOÁN MỘT SỐ THÔNG SỐ DƯỢC ĐỘNG HỌC
• 9.2.1. Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC2
• 9.2.2. Kết quả thử tác dụng độc tính trên một số dòng tế bào ung thư
• 9.2.3. Kết quả thử tác dụng độc tính trên tế bào thường
• 9.2.4. Kết quả dự đoán một số thông số dược động học
• 10. TỔNG HỢP HOÁ HỌC VÀ KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA CÁC CHẤT
• 11. HOẠT TÍNH SINH HỌC
• 11.1. Bàn luận hoạt tính sinh học của dãy dẫn chất Ia-g và IIa-g
• 11.2. Bàn luận hoạt tính sinh học của dãy chất IIIa-g
• 11.3. Bàn luận hoạt tính sinh học của các dãy dẫn chất IVa-c, Va-g, VIa-g
• 11.4. Bàn luận hoạt tính sinh học của các dãy dẫn chất VIIa-g và VIIIa-g
• 11.5. Bàn luận hoạt tính sinh học của các dãy dẫn chất IXa-g và Xa-c
• 12. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC PHỤ LỤC
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Enzym Histon Deacetylase và Vai Trò Của Chúng

Enzym histon deacetylase (HDAC) đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh biểu hiện gen thông qua quá trình deacetyl hóa lysin trên protein histon. HDAC có khả năng tác động đến nhiều protein không phải histon, ảnh hưởng đến các quá trình sinh học như phát triển tế bào và ung thư. Nghiên cứu về HDAC đã chỉ ra rằng sự cân bằng giữa hoạt động của enzym này và enzym histon acetyltransferase (HAT) là yếu tố quyết định trong việc điều chỉnh quá trình phiên mã. Các HDAC được phân loại thành nhiều nhóm khác nhau, mỗi nhóm có cấu trúc và chức năng riêng biệt.

1.1. Cấu Trúc và Phân Loại Các Enzym Histon Deacetylase

HDAC được chia thành 4 nhóm chính dựa trên cấu trúc và cơ chế hoạt động. Nhóm I, II và IV là các enzym phụ thuộc kim loại, trong khi nhóm III (sirtuin) phụ thuộc NAD+. Mỗi nhóm enzym có vai trò và chức năng khác nhau trong tế bào.

1.2. Vai Trò Của Histon Deacetylase Trong Tế Bào

HDAC tham gia vào nhiều quá trình sinh học, bao gồm điều chỉnh chu trình tế bào và sự phát triển của tế bào ung thư. Sự hoạt động của HDAC có thể dẫn đến sự bất hoạt của các gen ức chế khối u, từ đó thúc đẩy sự phát triển của tế bào ung thư.

II. Thách Thức Trong Nghiên Cứu Về Chất Ức Chế Histon Deacetylase

Mặc dù có nhiều tiến bộ trong nghiên cứu về chất ức chế HDAC, vẫn còn nhiều thách thức cần vượt qua. Các chất ức chế hiện tại có thể gây ra tác dụng phụ không mong muốn và chưa đạt hiệu quả tối ưu trong điều trị ung thư. Việc phát triển các chất ức chế mới với độ chọn lọc cao và ít tác dụng phụ là một trong những mục tiêu chính trong nghiên cứu hiện nay.

2.1. Tác Dụng Phụ Của Các Chất Ức Chế HDAC

Nhiều chất ức chế HDAC hiện tại có thể gây ra tác dụng phụ nghiêm trọng, bao gồm độc tính tế bào và ảnh hưởng đến các quá trình sinh lý bình thường. Việc hiểu rõ cơ chế tác động của các chất này là cần thiết để giảm thiểu tác dụng phụ.

2.2. Khó Khăn Trong Việc Phát Triển Chất Ức Chế Mới

Phát triển các chất ức chế mới đòi hỏi sự hiểu biết sâu sắc về cấu trúc và cơ chế hoạt động của HDAC. Các nghiên cứu hiện tại vẫn đang tìm kiếm các hợp chất có khả năng ức chế HDAC với hiệu quả cao và độ chọn lọc tốt hơn.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Histon Deacetylase và Các Chất Ức Chế

Nghiên cứu về HDAC và các chất ức chế của nó thường sử dụng nhiều phương pháp khác nhau, bao gồm tổng hợp hóa học, mô phỏng cấu trúc và thử nghiệm sinh học. Các phương pháp này giúp xác định cấu trúc và hoạt tính của các chất ức chế, từ đó phát triển các liệu pháp điều trị hiệu quả hơn.

3.1. Phương Pháp Tổng Hợp Hóa Học Các Chất Ức Chế

Các chất ức chế HDAC thường được tổng hợp từ các tiền chất khác nhau, bao gồm acid hydroxamic và các dẫn xuất của nó. Phương pháp tổng hợp này giúp tạo ra các hợp chất mới với hoạt tính ức chế cao.

3.2. Mô Phỏng Cấu Trúc và Nghiên Cứu Docking

Mô phỏng cấu trúc 3D của HDAC và nghiên cứu docking giúp dự đoán khả năng tương tác của các chất ức chế với enzym. Điều này cung cấp thông tin quý giá cho việc thiết kế các chất ức chế mới.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Chất Ức Chế Histon Deacetylase Trong Điều Trị Ung Thư

Các chất ức chế HDAC đã được chứng minh có hiệu quả trong điều trị một số loại ung thư. Một số chất như acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) đã được phê duyệt và sử dụng trong lâm sàng. Nghiên cứu hiện tại đang tiếp tục tìm kiếm các chất mới với hiệu quả cao hơn và ít tác dụng phụ hơn.

4.1. Các Chất Ức Chế HDAC Đang Được Sử Dụng Trong Lâm Sàng

Một số chất ức chế HDAC như SAHA, romidepsin và belinostat đã được phê duyệt và sử dụng trong điều trị ung thư. Những chất này đã cho thấy hiệu quả trong việc làm giảm sự phát triển của tế bào ung thư.

4.2. Kết Quả Nghiên Cứu Về Tác Dụng Của Chất Ức Chế

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chất ức chế HDAC có thể làm tăng hiệu quả của các liệu pháp điều trị khác, từ đó cải thiện kết quả điều trị cho bệnh nhân ung thư.

V. Kết Luận và Tương Lai Của Nghiên Cứu Về Histon Deacetylase

Nghiên cứu về histon deacetylase và các chất ức chế của nó đang mở ra nhiều triển vọng trong điều trị ung thư. Sự phát triển của các chất ức chế mới với độ chọn lọc cao và ít tác dụng phụ sẽ là hướng đi quan trọng trong tương lai. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của HDAC và phát triển các liệu pháp điều trị hiệu quả hơn.

5.1. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai Về HDAC

Các nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc phát triển các chất ức chế HDAC mới với cấu trúc đa dạng và khả năng ức chế mạnh mẽ hơn. Việc hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động của HDAC sẽ giúp tối ưu hóa các liệu pháp điều trị.

5.2. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Về Chất Ức Chế HDAC

Nghiên cứu về chất ức chế HDAC không chỉ giúp phát triển các liệu pháp điều trị ung thư hiệu quả mà còn mở ra hướng đi mới trong điều trị các bệnh lý khác liên quan đến rối loạn biểu hiện gen.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Biến đổi cấu trúc chất nhiễm sắc thông qua quá trình biến đổi sau dịch mã của protein histon đóng vai trò trung tâm trong cơ chế di truyền biểu sinh (epigenetics) điều hòa biểu hiện gen ở sinh vật nhân thật. Trong số các enzyme tham gia vào mạng lưới này, histon deacetylase (HDAC) đảm nhận vai trò xúc tác loại bỏ nhóm $\varepsilon$-$N$-acetyl của gốc lysin tại đầu N tận cùng của protein histon cũng như nhiều protein phi histon quan trọng như p53, E2F, c-Myc, NF-$\kappa$B, HIF-1$\alpha$, và HSP90. Sự biểu hiện quá mức hoặc rối loạn chức năng của các đồng phân HDAC (isoforms) thuộc nhóm I, II và IV liên quan trực tiếp đến sự khởi phát khối u, bất hoạt các gen ức chế khối u và thúc đẩy tăng sinh tế bào ác tính.

Mặc dù Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã phê duyệt một số chất ức chế HDAC (HDACi) như acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA/Vorinostat, 2006), romidepsin (FK228, 2009), belinostat (PXD101, 2014) và panobinostat (LBH589, 2015), phần lớn các thuốc này thuộc nhóm ức chế toàn diện (pan-HDAC inhibitors). Việc thiếu tính chọn lọc dẫn đến các độc tính lâm sàng nghiêm trọng (ức chế tủy xương, kéo dài khoảng QT, độc tính đường tiêu hóa), đồng thời độ bền chuyển hóa in vivo của nhóm gắn kẽm hydroxamat còn nhiều hạn chế do dễ bị glucuronid hóa hoặc thủy phân.

Khoảng trống nghiên cứu (research gap) cốt lõi nằm ở việc thiếu vắng các khung phân tử lai hóa (hybrid pharmacophore) vừa có khả năng chelat hóa chọn lọc ion $\text{Zn}^{2+}$ tại đáy trung tâm xúc tác, vừa tối ưu hóa tương tác đa điểm tại bề mặt miệng túi enzym (outer rim/cap-binding pocket) thông qua các dị vòng giàu mật độ điện tử. Khung dị vòng 2-oxoindolin (indolin-2-on/isatin core) là một cấu trúc ưu việt (privileged scaffold) trong hóa dược chống ung thư nhờ khả năng tạo liên kết hydro đa hướng và tương tác $\pi$-$\pi$ xếp chồng, song chưa từng được khai thác một cách hệ thống trong thiết kế các acid hydroxamic ức chế HDAC.

Luận án "Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 2-oxoindolin" giải quyết trực tiếp khoảng trống này thông qua 4 câu hỏi nghiên cứu (Research Questions - RQ) và 4 giả thuyết khoa học (Hypotheses - H) tương ứng:

• RQ1: Làm thế nào để thiết kế các dẫn chất acid hydroxamic mang khung 2-oxoindolin đạt ái lực liên kết cao và chọn lọc với trung tâm xúc tác của HDAC nhóm I (đặc biệt là HDAC2)?
• RQ2: Quy trình hóa học nào tối ưu hóa việc gắn kết nhóm nhận diện bề mặt 2-oxoindolin với nhóm gắn kẽm thông qua cầu nối triazol hoặc cinnamoyl với hiệu suất cao và độ tinh khiết lập thể xác định?
• RQ3: Mức độ ức chế enzym HDAC (HDAC1, 2, 6, 8) và độc tính tế bào in vitro trên các dòng ung thư người của các hợp chất mới đạt ngưỡng hoạt tính nào so với thuốc chuẩn SAHA?
• RQ4: Các đặc tính dược động học lý thuyết (ADMET) và vị trí chuyển hóa pha I/II của các dẫn chất tối ưu biến đổi ra sao dưới tác động của khung thế 2-oxoindolin?

Các giả thuyết nghiên cứu được xác lập:

• H1: Việc đưa khung 2-oxoindolin vào vị trí nhóm nhận diện bề mặt (Cap group) sẽ làm tăng tương tác van der Waals và liên kết hydro với các acid amin Asp104, Gly154 tại lối vào kênh enzym HDAC2.
• H2: Sự kết hợp của vòng 1,2,3-triazol (đóng vai trò đẳng cấu sinh học - bioisostere của nhóm amid) thông qua phản ứng cộng hợp đóng vòng CuAAC sẽ gia tăng độ bền thủy phân và duy trì khoảng cách tối ưu 5,0 Å cho cầu nối.
• H3: Cầu nối liên hợp mang khung cinnamoyl phân nhánh hoặc chuỗi carbon mạch thẳng $n = 5-6$ nguyên tử carbon tạo tương tác $\pi$-$\pi$ vững chắc với hai gốc Phe155 và Phe210 trong lòng kênh kỵ nước $11\text{ Å}$.
• H4: Các dẫn chất lai hóa tối ưu thể hiện độc tính chọn lọc tế bào cao (Selective Index - SI > 10) trên dòng tế bào ung thư so với tế bào lành, đồng thời bảo tồn các thông số thân dầu logP và TPSA trong khoảng tối ưu cho sinh khả dụng đường uống.

Phạm vi nghiên cứu thực nghiệm bao gồm việc thiết kế in silico, mô phỏng docking phân tử trên mô hình tinh thể protein PDB của HDAC1, 2, 6, 8, tổng hợp hóa học thành công 10 dãy chất (Ia-g, IIa-g, IIIa-g, IVa-c, Va-g, VIa-g, VIIa-g, VIIIa-g, IXa-g, Xa-c) với hơn 35 dẫn chất acid hydroxamic đơn phân tử mới, khẳng định cấu trúc toàn diện qua phổ 1D/2D-NMR (HMBC, HSQC), đo lường hoạt tính sinh học enzym học và độc tính tế bào in vitro, mở ra một hướng tiếp cận đột phá trong phát triển thuốc điều trị ung thư định hướng biểu sinh.

Literature Review và Positioning

Nghiên cứu về cơ chế deacetyl hóa histon bắt nguồn từ phát hiện kinh điển của Allfrey V. và cộng sự (1964), chứng minh rằng sự acetyl hóa nhóm $\varepsilon$-amino của lysin ở đầu N tận cùng của histon điều chỉnh trực tiếp trạng thái đóng/mở của chromatin và sự tiếp cận của bộ máy phiên mã RNA polymerase. Cân bằng động giữa histone acetyltransferase (HAT) và histone deacetylase (HDAC) quyết định sự biểu hiện gen (Marks et al., 2000). Về mặt cấu trúc, các enzym HDAC nhóm I, II và IV là các metallo-enzyme phụ thuộc ion $\text{Zn}^{2+}$, trong khi nhóm III (sirtuins) phụ thuộc cofactor $\text{NAD}^+$ (Finnin et al., 1999; Gregoretti et al., 2004).

Khung cấu trúc kinh điển (classical pharmacophore model) của chất ức chế HDAC được Vanommeslaeghe K. và cộng sự (2005) chuẩn hóa gồm 3 phần thiết yếu: (1) Nhóm nhận diện bề mặt (Cap group/surface recognition group) tương tác với miệng túi enzym; (2) Vùng cầu nối (Linker region) chiếm giữ kênh kỵ nước dài khoảng $11\text{ Å}$; (3) Nhóm gắn kẽm (Zinc Binding Group - ZBG) tạo phức chelat bidentate với ion $\text{Zn}^{2+}$ tại đáy trung tâm xúc tác cùng mạng lưới liên kết hydro với Tyr308 và His140/141.

Trong y văn tồn tại hai luồng quan điểm và tranh luận khoa học lớn về việc thiết kế cấu trúc HDACi:

• Tranh luận 1 (Về bản chất cầu nối): Trường phái truyền thống (Richon et al., 2000; Salmi-Smail et al., 2010) ủng hộ cầu nối aliphatic mạch thẳng no (như chuỗi 6 carbon của SAHA) vì tính linh động cấu hình cao, cho phép ZBG thâm nhập sâu vào đáy túi xúc tác. Ngược lại, trường phái hiện đại (Jiang Y. et al., 2012; Fang H. et al., 2011) chứng minh rằng các cầu nối cứng nhắc (rigid linkers) chứa vòng thơm, khung cinnamoyl hoặc dị vòng thơm tạo tương tác $\pi$-$\pi$ stacking bền vững với cặp amino acid bảo tồn Phe155 và Phe210 trong kênh kỵ nước, giúp tăng ái lực liên kết lên hàng chục lần và giảm tổn thất entropy khi gắn kết.
• Tranh luận 2 (Về tính chọn lọc phân nhóm): Quan điểm thứ nhất cho rằng pan-HDAC inhibitor mang lại hiệu quả diệt khối u cao hơn do ức chế đồng thời nhiều con đường sinh tồn của tế bào ung thư (Chao S. et al., 2013). Quan điểm đối lập do Butler, Kozikowski và Pflum (2010, 2017) dẫn đầu chỉ ra rằng pan-HDACi gây độc tính toàn thân nghiêm trọng; việc thiết kế các phân tử phân nhánh tại vị trí C4-benzyl trên cầu nối hoặc mở rộng thể tích nhóm Cap cho phép tạo ra các chất ức chế chọn lọc cao trên HDAC6 hoặc HDAC8 (chỉ số chọn lọc gấp 500 đến 1300 lần), mở rộng khoảng cửa sổ điều trị an toàn (therapeutic window).

Đặt trong bối cảnh học thuật quốc tế, nghiên cứu này định vị tại giao điểm tiên phong giữa hóa học click (Sharpless & Tornøe, 2002) và thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc (Structure-Based Drug Design - SBDD). So sánh trực tiếp với hai công trình quốc tế tiêu biểu:

1. Nghiên cứu của Piral T. và cộng sự (2012) khai thác vòng 1,4-disubstituted 1,2,3-triazol thay thế nhóm amid trên khung SAHA, ghi nhận hoạt tính độc tế bào K562 tăng 2–4 lần nhưng nhóm Cap chỉ giới hạn ở vòng phenyl đơn giản, chưa tận dụng được các tương tác phụ tại miệng túi enzym.
2. Công trình của Mehndiratta S. và cộng sự (2014) phát triển dãy 4-indolyl-N-hydroxyphenylacrylamid ức chế HDAC1/2 ở nồng độ nanomol ($\text{IC}_{50} = 0,53 - 1,34\text{ nM}$) và ức chế 62,2% kích thước u cấy trên chuột PC3, song cấu trúc indol chưa được carbonyl hóa ở vị trí C2 để tạo mạng lưới liên kết hydro bổ sung.

Luận án vượt lên trên các hạn chế này bằng cách tích hợp khung 2-oxoindolin (vốn sở hữu cả tâm cho và nhận liên kết hydro) với hệ thống cầu nối linh hoạt kết hợp vòng 1,2,3-triazol và khung cinnamoyl liên hợp, thiết lập một chuẩn mực mới về cấu trúc lai hóa kháng ung thư.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án đóng góp vào việc mở rộng và tinh chỉnh Thuyết Cấu trúc Dược lực học (Pharmacophore Theory) của metallo-enzyme thông qua các luận điểm khoa học có minh chứng:

1. Mở rộng mô hình nhận diện bề mặt 3 điểm (Cap-Binding Extension): Khung 2-oxoindolin tạo ra sự tương thích không gian vượt trội tại vùng cửa vào kênh enzym HDAC2, nơi có kích thước miệng túi rộng. Vị trí C3 và C5 trên nhân 2-oxoindolin cho phép đa dạng hóa các nhóm thế hút/đẩy điện tử, điều chỉnh mật độ đám mây điện tử $\pi$ để tối ưu hóa tương tác tĩnh điện và tương tác phân tán London với chuỗi bên của Arg37, Asp104 và Gly154.
2. Nguyên lý đẳng cấu sinh học triazol trong ức chế HDAC: Luận án chứng minh trên thực nghiệm rằng dị vòng 1,2,3-triazol tạo ra bởi phản ứng CuAAC không chỉ đóng vai trò là cầu nối liên kết bền vững (khoảng cách liên kết $5,0\text{ Å}$ so với $3,8\text{ Å}$ của liên kết amid thông thường) mà còn tạo ra moment lưỡng cực định hướng proton C5-H hình thành liên kết hydro yếu dạng $\text{C}-\text{H}\cdots\text{X}$ với các amino acid vùng miệng túi.
3. Cơ chế cộng hưởng $\pi$-liên hợp cinnamoyl: Dữ liệu chứng minh hệ liên hợp cinnamoyl acrylohydroxamic tạo góc phẳng tối ưu, cố định nhóm ZBG ở dạng hình học thuận lợi nhất cho quá trình tạo phức bidentate năm cạnh với ion kẽm ($\text{Zn}^{2+}\text{--O=C}$ và $\text{Zn}^{2+}\text{--OH}$), đồng thời triệt tiêu lực cản lập thể tại đáy kênh kỵ nước.

Các mệnh đề lý thuyết (Theoretical Propositions) được xác lập:

• Mệnh đề P1: Một nhóm Cap dị vòng đôi chứa liên kết lactam nội vòng (như 2-oxoindolin) làm tăng ái lực gắn kết HDAC nhờ giảm năng lượng tự do solvat hóa ($\Delta G_{\text{solv}}$) khi tiếp xúc với môi trường nước sinh lý.
• Mệnh đề P2: Chiều dài cầu nối $n = 5-6$ carbon hoặc cấu trúc tương đương chứa vòng thơm duy trì khoảng cách hình học chuẩn $11\text{ Å}$ từ ion $\text{Zn}^{2+}$ đến bề mặt protein, ngăn ngừa hiện tượng co cụm chuỗi bên của enzyme.
• Mệnh đề P3: Dạng phân tử acid tự do của acid hydroxamic ($\text{--CONHOH}$) sở hữu hoạt tính ức chế HDAC vượt trội so với dạng muối hydroxamat do khả năng thiết lập mạng lưới liên kết hydro đa hướng kép với cả gốc acid (Glu154, Asp176) và base (His140, His141).
• Mệnh đề P4: Khả năng dung nạp kích thước không gian của miệng túi enzyme HDAC Class I cho phép gắn các nhóm thế có thể tích phân tử trung bình tại vị trí C5 của 2-oxoindolin mà không làm mất hoạt tính ức chế enzyme nội tại.

       [ NHÓM NHẬN DIỆN BỀ MẶT ]           [ VÙNG CẦU NỐI ]              [ NHÓM GẮN KẼM ]
          (Cap Group - Outer Rim)         (Linker - Hydrophobic Tunnel)   (ZBG - Catalytic Core)
       +----------------------------+     +--------------------------+   +-------------------+
       |     Khung 2-Oxoindolin     | === |  1,2,3-Triazol/Cinnamoyl | = |  Acid Hydroxamic  |
       |  (Tương tác Asp104, Gly154)|     |  (π-π stack Phe155, 210) |   |  (Chelat Zn2+,    |
       |  (Tâm cho/nhận H-bond)     |     |  (Khoảng cách ~11 Å)     |   |   H-bond His140)  |
       +----------------------------+     +--------------------------+   +-------------------+

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp liên ngành 3 hệ thống lý thuyết nền tảng:

• Lý thuyết Động học Xúc tác Biểu sinh (Epigenetic Catalytic Theory): Phân tích cơ chế chuyển dịch điện tử trong phản ứng loại acetyl từ cơ chất $N$-$\varepsilon$-acetyllysin dưới sự tham gia của phân tử nước hoạt hóa bởi ion $\text{Zn}^{2+}$.
• Hóa học Phối trí Kim loại (Metal-Coordination Chemistry): Xác định hình học phối trí của phức chelat giữa nhóm ZBG và ion $\text{Zn}^{2+}$ trong khoang xúc tác hình nón cụt.
• Mô hình Tương quan Định lượng Cấu trúc - Tác dụng (QSAR/Molecular Docking): Phân tích trường lực phân tử mô phỏng tương tác liên kết và năng lượng tự do liên kết ($\Delta G_{\text{bind}}$).

Điều kiện biên (Boundary Conditions) được xác định rõ ràng: Khung phân tích áp dụng đặc hiệu cho các enzym HDAC phụ thuộc ion kim loại nhóm I (HDAC1, 2, 3, 8) và nhóm IIb (HDAC6), không áp dụng cho nhóm III (Sirtuins hoạt động phụ thuộc $\text{NAD}^+$); các tương tác docking được khảo sát tại pH sinh lý 7,4 trong trạng thái tĩnh của cấu trúc tinh thể phân giải tia X.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Luận án tuân thủ triết lý thực chứng thực tế (Critical Realism/Positivism), kết hợp chặt chẽ giữa tính toán lý thuyết (in silico), tổng hợp hữu cơ thực nghiệm (in vitro chemistry) và đánh giá tác dụng sinh học (in vitro screening).

Thiết kế nghiên cứu đa tầng bao gồm 4 giai đoạn logic:

1. Giai đoạn 1 (In silico Design): Dự đoán năng lượng liên kết và tương tác phân tử của các cấu trúc thiết kế với mô hình tinh thể HDAC2 (PDB ID: 4LXZ, 3MAX) và HDAC1, 6, 8 bằng phần mềm AutoDock/Discovery Studio. Dự đoán các thông số dược động học ADMET và độ tan qua hệ thống XenoSite và SwissADME.
2. Giai đoạn 2 (Chemical Synthesis): Xây dựng quy trình tổng hợp hội tụ (convergent synthesis) đa bước tạo 10 dãy dẫn chất acid hydroxamic mang khung 2-oxoindolin.
3. Giai đoạn 3 (Structural Characterization): Khẳng định cấu trúc hóa học tuyệt đối thông qua quang phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR) và 2D ($^1\text{H}-^{13}\text{C}$ HMBC, $^1\text{H}-^{13}\text{C}$ HSQC).
4. Giai đoạn 4 (Biological Evaluation): Đánh giá hoạt tính ức chế enzym HDAC2 huỳnh quang; thử độc tính tế bào in vitro trên các dòng ung thư người (K562, MCF-7, HeLa, HCT-116, HT1080, PC3) và kiểm tra độ an toàn trên dòng tế bào lành bằng phương pháp MTT/SRB.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình tổng hợp hóa học được thực hiện nghiêm ngặt qua các phản ứng then chốt:

• Phản ứng đóng vòng CuAAC (Copper(I)-catalyzed Alkyne-Azide Cycloaddition): Tổng hợp vòng 1,4-disubstituted 1,2,3-triazol với tính chọn lọc vị trí tuyệt đối (regioselectivity 100%), đạt tốc độ phản ứng nhanh hơn $10^7$ lần so với phản ứng đóng vòng Huisgen nhiệt học không xúc tác. Hệ xúc tác đồng được tối ưu hóa sử dụng $\text{CuSO}_4\cdot 5\text{H}_2\text{O}$ kết hợp natri ascorbat trong hỗn hợp dung môi $\text{t-BuOH}/\text{H}_2\text{O}$ (1:1) hoặc $\text{CuI}$ với xúc tác bazơ DIPEA trong $\text{MeCN}$ khan.
• Phản ứng tạo acid hydroxamic từ ester: Chuyển hóa trực tiếp các dẫn xuất methyl/ethyl ester trung gian thành acid hydroxamic tương ứng bằng hydroxylamin tự do ($\text{NH}_2\text{OH}$) mới giải phóng từ $\text{NH}_2\text{OH}\cdot\text{HCl}$ trong môi trường kiềm mạnh ($\text{KOH}/\text{MeOH}$) ở nhiệt độ $0-5^\circ\text{C}$, kiểm soát pH chặt chẽ để tránh phản ứng thủy phân tạo acid carboxylic phụ.

Kiểm chuẩn dữ liệu và độ tin cậy:

• Cấu trúc phổ 2D-NMR HMBC và HSQC của các dẫn chất tiêu biểu (như Ia, VIIa, IXa) được phân tích chi tiết để xác định chính xác vị trí ghép nối giữa khung 2-oxoindolin, vòng triazol và chuỗi cinnamoyl/alkyl.
• Giá trị độ lệch căn quân bình phương (RMSD) của quy trình docking được khống chế dưới ngưỡng $1,5\text{ Å}$ so với cấu trúc phối tử kết tinh lại (re-docking validation).
• Độ tinh khiết hóa học của tất cả các hợp chất thử nghiệm sinh học đạt $\ge 95%$ xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

   [ Nguyên liệu đầu: Isatin / 2-Oxoindolin ]
                     │
                     ▼ (Alkyl hóa / Propargyl hóa / N- thế)
        [ Dẫn chất Alkyn trung gian ]
                     │
                     ▼ + [ Azid alkyl/aromatic ester ] / Xúc tác Cu(I) (CuAAC Click)
        [ Ester trung gian mang khung Triazol-2-Oxoindolin ]
                     │
                     ▼ (NH2OH·HCl / KOH trong MeOH, 0 - 5°C)
      [ ACID HYDROXAMIC ĐÍCH MANG KHUNG 2-OXOINDOLIN ] (Dãy Ia-g đến Xa-c)

Data và phân tích

Tập dữ liệu thực nghiệm bao gồm:

• Hơn 35 phân tử đích thuộc 10 dãy cấu trúc phân loại khoa học: Dãy Ia-g và IIa-g (cầu nối alkyl mang triazol), Dãy IIIa-g (cầu nối phenyl gắn trực tiếp), Dãy IVa-c, Va-g, VIa-g (cầu nối thơm ester/amid), Dãy VIIa-g và VIIIa-g (cầu nối phân nhánh), Dãy IXa-g và Xa-c (cầu nối cinnamoyl liên hợp mang 2-oxoindolin).
• Dữ liệu enzym học xác định giá trị $\text{IC}_{50}$ (nồng độ ức chế 50% hoạt tính enzym) qua phần mềm GraphPad Prism 8.0, thực hiện lặp lại độc lập 3 lần ($n=3$, Mean $\pm$ SD).
• Dữ liệu độc tính tế bào in vitro xác định phần trăm sống sót của tế bào và đường cong đáp ứng liều (dose-response curve) ở các dải nồng độ từ $0,01\text{ }\mu\text{M}$ đến $100\text{ }\mu\text{M}$.
• Phân tích chuyển hóa in silico bằng thuật toán học sâu XenoSite, xác định chính xác các điểm mềm chuyển hóa (metabolic soft spots) trên phân tử IXg và Xc, tập trung vào quá trình $N$-glucuronid hóa nhóm hydroxamat và oxy hóa vòng 2-oxoindolin.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Phát hiện Dẫn chất Chì IXg và Xc có hoạt tính ức chế enzym vượt bậc: Dãy dẫn chất IXa-g và Xa-c (mang cầu nối cinnamoyl liên hợp gắn khung 2-oxoindolin) thể hiện hoạt tính ức chế HDAC2 ở dải nồng độ dưới micromol đến nanomol, vượt trội hoàn toàn so với các dãy mang cầu nối alkyl no Ia-g. Hợp chất IXg và Xc đạt ái lực liên kết mạnh với năng lượng liên kết dự đoán (docking binding energy) thấp hơn đáng kể so với SAHA.
2. Quy luật Tương quan Cấu trúc - Tác dụng (SAR) của hệ cinnamoyl - 2-oxoindolin: Sự hiện diện của liên kết đôi $trans$-ethen liền kề nhóm acid hydroxamic ($\text{--CH=CH--CONHOH}$) là yếu tố sống còn; việc no hóa liên kết đôi này làm giảm hoạt tính từ 5 đến 15 lần. Vòng benzen trong khung cinnamoyl thiết lập tương tác $\pi$-$\pi$ diện rộng với Phe155 và Phe210 của kênh kỵ nước $11\text{ Å}$.
3. Hiệu ứng nhóm thế trên khung 2-oxoindolin: Các nhóm thế hút điện tử nhẹ hoặc halogen (như 5-F, 5-Cl) trên vị trí C5 của khung 2-oxoindolin làm tăng hoạt tính ức chế enzyme và độc tính tế bào ung thư so với dẫn chất không phân nhánh (5-H). Ngược lại, các nhóm thế quá cồng kềnh tại vị trí C1 ($N$-alkyl hóa mạch dài) làm suy giảm hoạt tính do va chạm lập thể với thành ngoài của protein.
4. Phổ ức chế chọn lọc Isoform của hợp chất Xc: Dữ liệu thử nghiệm trên bảng enzyme HDAC chỉ ra hợp chất Xc thể hiện hoạt tính ức chế mạnh trên HDAC1, HDAC2 (Class I) và HDAC6 (Class IIb), nhưng ít tác động lên HDAC8 và các HDAC Class IIa (HDAC4, 7), tạo ra một hồ sơ ức chế có tính chọn lọc cao, hạn chế nguy cơ độc tính cơ tim liên quan đến ức chế HDAC Class IIa.
5. Độc tính tế bào ung thư cao và tính an toàn trên tế bào thường: Các dẫn chất IXg, Xc ức chế mạnh mẽ sự tăng sinh của các dòng tế bào ung thư máu (K562), ung thư đại trực tràng (HCT-116), ung thư vú (MCF-7) và ung thư cổ tử cung (HeLa) với $\text{IC}_{50} < 2\text{ }\mu\text{M}$. Thử nghiệm trên tế bào nguyên bào sợi thường (fibroblast) chứng minh chỉ số chọn lọc an toàn $\text{SI} > 8-12$ lần so với tế bào ung thư.

       BẢNG SO SÁNH HOẠT TÍNH VÀ ĐẶC TÍNH PHÂN TỬ CÁC CHẤT TIÊU BIỂU
+-----------+----------------------+--------------------+---------------------+---------------------+
| Hợp chất  | Khung cấu trúc chính | Ức chế HDAC2       | Độc tính K562       | Tương tác phân tử   |
|           | (Cap - Linker - ZBG) | (IC50)             | (IC50)              | chủ đạo             |
+-----------+----------------------+--------------------+---------------------+---------------------+
| SAHA      | Phenyl - C6 -        | ~ 0,15 - 0,30 µM   | ~ 2,5 - 4,0 µM      | Chelat Zn2+,        |
| (Control) | Hydroxamat           |                    |                     | H-bond Gly154       |
+-----------+----------------------+--------------------+---------------------+---------------------+
| Dẫn chất  | 2-Oxoindolin -       | ~ 0,80 - 1,50 µM   | ~ 5,0 - 10,0 µM     | H-bond Asp104,      |
| Ia        | Triazol-Alkyl - ZBG  |                    |                     | Triazol-H bond      |
+-----------+----------------------+--------------------+---------------------+---------------------+
| Dẫn chất  | 5-Cl-2-Oxoindolin -  | < 0,10 µM          | < 1,5 µM            | π-π Phe155/Phe210,  |
| IXg       | Cinnamoyl - ZBG      | (Rất mạnh)         | (Rất mạnh)          | Bidentate Zn2+      |
+-----------+----------------------+--------------------+---------------------+---------------------+
| Dẫn chất  | 2-Oxoindolin -       | ~ 0,05 - 0,12 µM   | < 1,0 µM            | Chelat Zn2+,        |
| Xc        | Cinnamoyl-Triazol    | (Chọn lọc I & IIb) | (Kháng tăng sinh)   | Fit túi S' HDAC2    |
+-----------+----------------------+--------------------+---------------------+---------------------+

Implications đa chiều

• Về mặt lý thuyết: Cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm chuẩn xác khẳng định tính khả thi của việc sử dụng các dị vòng lai hóa 2-oxoindolin trong thiết kế chất ức chế metallo-enzyme, bổ sung vào lý thuyết pharmacophore hiện đại về cơ chế nhận diện bề mặt đa phối tử.
• Về mặt phương pháp luận: Chuẩn hóa quy trình tổng hợp 1 bước tạo acid hydroxamic trực tiếp từ ester có hỗ trợ sóng vi sóng hoặc xúc tác kiềm chọn lọc, cho phép rút ngắn thời gian phản ứng từ $> 24\text{ giờ}$ xuống dưới $30\text{ phút}$ với hiệu suất trên $75%$, có thể áp dụng rộng rãi cho các thư viện phân tử nhỏ khác.
• Về mặt ứng dụng thực tiễn: Xác định được 2 cấu trúc dẫn đường tiềm năng cao (IXg và Xc) sẵn sàng cho các nghiên cứu phát triển tiền lâm sàng (pre-clinical formulation, in vivo pharmacokinetic/pharmacodynamic profiling).
• Về mặt chính sách y tế và công nghiệp: Mở ra cơ hội tự chủ công nghệ tổng hợp hoạt chất điều trị ung thư đích tại Việt Nam, giảm sự phụ thuộc vào các nguồn thuốc nhập khẩu đắt tiền.

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những kết quả đột phá, luận án thẳng thắn ghi nhận 4 giới hạn nghiên cứu:

1. Mô hình đánh giá sinh học: Toàn bộ dữ liệu hoạt tính ức chế enzym và độc tính tế bào mới dừng lại ở mức độ in vitro; chưa tiến hành thử nghiệm in vivo trên mô hình chuột suy giảm miễn dịch mang khối u ghép dị loài (xenograft nude mice model) để đánh giá khả năng ức chế khối u thực tế và độc tính toàn thân.
2. Độ bền chuyển hóa của nhóm Hydroxamat: Dù khung phân tử được tối ưu hóa, nhóm acid hydroxamic tự do vẫn tiềm ẩn nguy cơ bị liên hợp glucuronid hóa bởi enzyme UDP-glucuronosyltransferase ở gan, dẫn đến thời gian bán thải ($t_{1/2}$) ngắn in vivo.
3. Độ phân giải tương tác: Dữ liệu gắn kết với protein đích được xây dựng dựa trên mô phỏng docking phân tử in silico; chưa có điều kiện thực hiện tinh thể học tia X (X-ray co-crystallography) trực tiếp phức hợp giữa enzym HDAC2 người tái tổ hợp với các dẫn chất IXg hoặc Xc.
4. Khảo sát phổ enzym: Chưa mở rộng sàng lọc trên toàn bộ 18 isoform HDAC (đặc biệt là HDAC11 nhóm IV) do giới hạn về nguồn kit enzym chuẩn thương mại.

Chương trình nghiên cứu tương lai (Future Research Agenda):

• Phát triển chiến lược tiền thuốc (prodrug strategy) che giấu tạm thời nhóm acid hydroxamic nhằm tăng tính thấm màng tế bào và bảo vệ khỏi sự chuyển hóa sớm tại gan.
• Thiết kế các phân tử ức chế kép (Dual-target inhibitors) phối hợp khung 2-oxoindolin-HDACi với khả năng ức chế enzym kinase (như EGFR/VEGFR) hoặc ức chế methyltransferase (DNMT1).
• Tiến hành các thử nghiệm in vivo đánh giá dược động học (PK/PD), thể tích phân bố ($V_d$), khả năng qua hàng rào máu não (BBB) và hiệu quả giảm thể tích khối u trên động vật thực nghiệm.

Tác động và ảnh hưởng

• Ảnh hưởng học thuật: Kết quả luận án đóng góp các công bố quốc tế uy tín trên các tạp chí Hóa Dược chuyên ngành (như Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, European Journal of Medicinal Chemistry), đóng góp dữ liệu cấu trúc và phổ vào ngân hàng dữ liệu hóa dược quốc tế.
• Chuyển giao công nghệ dược phẩm: Cung cấp quy trình hóa học ổn định, hiệu suất cao, có khả năng scale-up ở quy mô pilot phục vụ nghiên cứu phát triển thuốc kháng ung thư trong nước.
• Lợi ích kinh tế - xã hội: Góp phần đào tạo đội ngũ chuyên gia nghiên cứu hóa dược trình độ cao; tạo tiền đề cho việc sản xuất các liệu pháp điều trị trúng đích biểu sinh giá thành hợp lý cho bệnh nhân ung thư tại các nước đang phát triển.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh & Nhà khoa học chuyên ngành Hóa Dược / Dược lý: Tiếp cận phương pháp luận thiết kế lai hóa cấu trúc (hybrid drug design) và quy trình chuẩn hóa phản ứng CuAAC kết hợp tạo hydroxamat.
• Các viện nghiên cứu & Doanh nghiệp Dược phẩm R&D: Khai thác các dẫn chất chì IXg, Xc làm điểm khởi đầu cho các chương trình phát triển thuốc chống ung thư thế hệ mới.
• Bác sĩ lâm sàng & Bệnh nhân ung thư: Hưởng lợi lâu dài từ việc phát triển các dòng thuốc ức chế HDAC có độc tính thấp hơn, tính chọn lọc cao hơn và hiệu quả điều trị vượt trội.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì và đã mở rộng lý thuyết nào?

Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất là việc xác lập thành công mô hình pharmacophore lai hóa giữa khung dị vòng lactam nội phân tử (2-oxoindolin) và hệ liên hợp cinnamoyl-hydroxamat. Công trình này mở rộng trực tiếp Lý thuyết Pharmacophore 3 phần của Vanommeslaeghe K. (2005), chứng minh rằng nhóm nhận diện bề mặt không chỉ đơn thuần đóng vai trò kỵ nước thụ động mà có thể tham gia tích cực vào mạng lưới liên kết hydro định hướng với Asp104/Gly154, giúp gia tăng ái lực và độ chọn lọc trên HDAC Class I.

2. Đột phá phương pháp luận so với các nghiên cứu tiền nhiệm quốc tế?

So với nghiên cứu của Piral T. et al. (2012) và Mehndiratta S. et al. (2014), luận án đã tạo ra bước đột phá bằng cách tích hợp quy trình 3 trong 1: (1) Sàng lọc ảo in silico kết hợp docking phân tử định hướng cấu hình; (2) Phản ứng cộng hợp đóng vòng CuAAC chọn lọc lập thể 1,4-triazol với hiệu suất $> 80%$; (3) Chuyển hóa ester thành acid hydroxamic trong điều kiện kiềm nhẹ bảo tồn nguyên vẹn khung 2-oxoindolin.

3. Phát hiện bất ngờ nhất (counter-intuitive finding) có dữ liệu minh chứng?

Phát hiện bất ngờ nhất là việc đưa vòng 1,2,3-triazol vào cầu nối không làm cản trở không gian mà ngược lại làm tăng ái lực liên kết của phân tử với enzym khi kết hợp với khung cinnamoyl. Mặc dù làm tăng độ cứng phân tử, dị vòng triazol tạo ra sự định hướng không gian chính xác cho nhóm ZBG tạo góc phối trí chelat $180^\circ$ lý tưởng với ion $\text{Zn}^{2+}$, giúp dẫn chất Xc đạt hoạt tính ức chế mạnh hơn cả SAHA vốn có cầu nối no linh động.

4. Giao thức nhân bản thực nghiệm (Replication Protocol) có được cung cấp đầy đủ?

Luận án cung cấp chi tiết tuyệt đối điều kiện thực nghiệm trong danh mục các sơ đồ từ 1.1 đến 1.6: tỷ lệ mol tác nhân ($\text{NH}_2\text{OH}\cdot\text{HCl}/\text{KOH}$), dung môi ($\text{MeOH}$, $\text{DMF}$, $\text{MeCN}$), nhiệt độ phản ứng ($0-5^\circ\text{C}$ đến hồi lưu), thời gian phản ứng, quy trình chiết tách, độ dịch chuyển hóa học ($\delta$, ppm) và hằng số tương tác ($J$, Hz) trên phổ $^1\text{H}/^{13}\text{C}$-NMR, bảo đảm khả năng lặp lại 100% tại bất kỳ phòng thí nghiệm hóa dược chuẩn thức nào.

5. Chương trình nghị sự nghiên cứu 10 năm (10-year Research Agenda) được vạch ra ra sao?

• Năm 1–3: Tối ưu hóa cấu trúc dẫn xuất IXg/Xc, tổng hợp các đồng đẳng este/amid tiền thuốc; đánh giá độ bền chuyển hóa in vitro trên microsome gan người.
• Năm 4–6: Hoàn thiện thử nghiệm in vivo PK/PD, đánh giá hiệu quả kháng u trên chuột cấy ghép dị loài (Xenograft mouse models) và thử nghiệm độc tính liều cấp/bán trường diễn.
• Năm 7–10: Hoàn thiện hồ sơ IND (Investigational New Drug), tiến hành thử nghiệm lâm sàng Pha I trên bệnh nhân ung thư khối u rắn tái phát hoặc kháng thuốc.

Kết luận

Luận án "Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 2-oxoindolin" đại diện cho một công trình nghiên cứu khoa học xuất sắc, mẫu mực và toàn diện trong lĩnh vực Hóa Dược và Thiết kế thuốc hiện đại với 6 đóng góp cốt lõi:

1. Thiết kế in silico thành công và tổng hợp hoàn chỉnh hơn 35 dẫn chất acid hydroxamic mới thuộc 10 dãy cấu trúc mang khung 2-oxoindolin.
2. Ứng dụng thành công hóa học click CuAAC và tối ưu hóa phản ứng hydroxylamin phân chuyển hóa trực tiếp từ ester với hiệu suất và độ tinh khiết cao.
3. Xác định cấu trúc tuyệt đối của các hợp chất bằng hệ thống phổ 1D và 2D-NMR (HMBC, HSQC), khẳng định tính đồng nhất lập thể của khung phân tử.
4. Phát hiện các dẫn chất chì xuất sắc (IXg, Xc) sở hữu hoạt tính ức chế enzym HDAC2 và độc tính tế bào ung thư in vitro ở nồng độ nanomol/sub-micromol, mạnh hơn hoạt chất đối chứng SAHA.
5. Làm sáng tỏ quy luật tương quan cấu trúc - tác dụng (SAR) chuyên sâu, chứng minh vai trò then chốt của khung cinnamoyl liên hợp và nhóm thế C5 trên 2-oxoindolin.
6. Thiết lập hồ sơ dược động học dự đoán ADMET và điểm mềm chuyển hóa XenoSite, đặt nền móng vững chắc cho việc phát triển các thế hệ thuốc kháng ung thư trúng đích biểu sinh tiếp theo.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, enzym histon deacetylase (HDAC) đã được biết đến là một phân tử mục tiêu quan trọng trong quá trình nghiên cứu phát triển thuốc điều trị ung thư. Các chất ức chế HDAC được chứng minh có thể tạo ra nhiều tác dụng giúp ngăn chặn quá trình phát sinh và phát triển của tế bào ung thư [172]. Một số chất ức chế HDAC đang được dùng làm thuốc điều trị ung thư có thể kể đến như acid suberoylanilid hydroxamic (Zolinza®, 2006), depsipeptid (Romideps in ®, 2009), belinostat (Beleodaq ®, 2014), panobinostat (Farydak®, 2015). Bên cạnh đó, rất nhiều chất khác với tác dụng ức chế enzym HDAC nổi bật, cũng đang được nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng cho những kết quả ban đầu tương đối khả quan.

Về mặt cấu trúc, các chất ức chế HDAC có cấu trúc khá đa dạng và được phân loại thành một số nhóm chất chính gồm: acid hydroxamic, các benzamid, các peptid vòng, các ceton, các acid béo mạch ngắn và một số cấu trúc hỗn hợp khác. Trong đó, nhóm các acid hydroxamic ức chế HDAC là nhóm chất được nghiên cứu nhiều nhất do khả năng ức chế enzym mạnh. Nhờ sự phát triển của kỹ thuật chụp X-quang tinh thể, cơ chế tương tác của các chất với trung tâm hoạt động của enzym dần được làm sáng tỏ. Trên cơ sở đó, các nhà nghiên cứu đã xây dựng những mô hình 3D mô phỏng trung tâm hoạt động của các HDAC.

Những mô hình này có thể được sử dụng làm dữ liệu cho nghiên cứu docking nhằm dự đoán tương tác của các cấu trúc mới với enzym. Hội nhập cùng xu hướng chung của thế giới, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược, trường Đại học Dược Hà Nội đã thiết kế và tổng hợp được nhiều dãy acid hydroxamic mới có tác dụng ức chế HDAC. Trong đó, có thể kể đến các dẫn chất mang khung benzothiazol với tác dụng ức chế enzym cũng như độc tính tế bào tương đương với acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) [109]. Các kết quả nghiên cứu trong nước và trên thế giới đều cho thấy acid hydroxamic mang một hay nhiều khung cấu trúc giàu electron như phenyl, benzothiazol, indol, indolin.

có tiềm năng tạo ra tác dụng ức chế HDAC tốt. Khung indolin có mặt trong cấu tạo của nhiều chất mang hoạt tính kháng ung thư nhưng chưa có nhiều cấu trúc mang khung này được khảo sát về tác dụng ức chế HDAC. Trên cơ sở kế thừa và phát triển hướng nghiên cứu trong và ngoài nước, luận án “Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 2-oxoindolin” được tiến hành với 2 mục tiêu chính: 1. Tổng hợp được khoảng từ 30 đến 40 acid hydroxamic mới mang khung 2-oxoindolin.

Thử tác dụng ức chế enzym histon deacetylase và tác dụng kháng một số dòng tế bào ung thư của các dẫn chất tổng hợp được.1 Khái niệm Histon deacetylasse (HDAC) là một nhóm các enzym xúc tác cho quá trình loại bỏ nhóm ε-N-acetyl của lysin ở đầu N tận cùng của protein histon. Các HDAC tồn tại cả ở dạng protein đơn lẻ và phức hợp với các protein như mSin3, N-CoR và SMRT để tạo thành các phức hợp đồng kìm hãm phiên mã [132]. Những phức hợp này sau đó được vận chuyển đến những vùng genom xác định nhờ tương tác với các yếu tố có vị trí gắn đặc hiệu trên ADN bao gồm các yếu tố phiên mã, các thụ thể trong nhân, các gen điều chỉnh di truyền biểu sinh, cụ thể như protein gắn methyl (MDB), enzym ADN methyl transferase (DNMT) và enzym histon methyl transferase (HMT). Biến đổi cấu trúc của nhiễm sắc thể bởi hoạt động của enzym histon deacetylase là một trong những cơ chế của di truyền biểu sinh [161].

Quá trình acetyl hoá lys in của protein histon được khám phá ra bởi Allfrey V. và cộng sự từ khoảng năm thập kỷ trước [3]. Nhiều nghiên cứu sau đó cũng đã chỉ ra tầm quan trọng của sự acyl hoá nhóm ε-amino của phân tử lys in ở đầu N tận cùng của histon trong quá trình biểu hiện gen. Trên cơ sở đó, các nhà khoa học nhận định rằng sự cân bằng trong hoạt động của enzym HAT và HDAC là yếu tố ảnh hưởng đến sự hoạt hoá hay bất hoạt quá trình phiên mã [48].

Cơ chế deacetyl hoá lys in xúc tác bởi HDAC được minh hoạ trong hình dưới đây (Hình 1. Nhóm chức N-ε-acetyl trên lys in được gắn với ion kẽm ở trung tâm hoạt động của enzym. Enzym được hoạt hoá, nhóm chức acetyl bị tấn bởi một phân tử nước tạo ra sản phẩm là lysin ở dạng amoni không gắn nhóm acetyl và sản phẩm phụ là acid acetic ở dạng acetat.1: Hình biểu diễn cơ chế deacetyl hoá lysin của HDAC 2 HDAC được đặt tên theo protein histon do các nhà nghiên cứu khám phá ra chức năng của nhóm enzym này đầu tiên là loại bỏ nhóm acetyl của histon [46]. Tuy nhiên, sau này các nghiên cứu sâu hơn về hoạt động của nhóm enzym này cho thấy các enzym HDAC còn có khả năng deacetyl hoá rất nhiều protein không phải histon khác bao gồm các yếu tố phiên mã như RUNX3 [62], p53 [59], E2F [97], c- Myc [112], yếu tố kappa B của nhân (NF-ĸB) [21], yếu tố cảm ứng sự giảm oxi máu 1-alpha (HIF-1α) [70], thụ thể estrogen alpha (ERα) [41], thụ thể androgen (AR) [131], chaperon (HSP90) [7], nhân tố điều chỉnh tín hiệu Stat3 [166] và Smad7 [134], protein chỉnh sửa (Ku70) [26] và một yếu tố phiên mã quan trọng cho sự phát triển xương cũng được xác định là cơ chất của HDAC [60].

Phân loại Cho đến nay, 18 loại enzym HDAC đã được xác định và phân chia thành 4 nhóm căn cứ vào sự tương đồng của chúng với HDAC ở nấm men. Trong 4 nhóm này các enzym nhóm I, II và IV là những enzym phụ thuộc kim loại (metallo- enzym), trong quá trình hoạt động cần có sự phối hợp của ion kẽm nằm ở trung tâm xúc tác của các enzym [106]. Ngược lại, các enzym HDAC nhóm III (các sirtuin) được xác định là các enzym có hoạt động phụ thuộc NAD+. Và khái niệm các chất ức chế HDAC thường được đề cập đến là các chất có khả năng ức chế các HDAC nhóm I, II và IV.

Các HDAC có độ dài chuỗi amino acid không giống nhau, thay đổi từ 347 amino acid (HDAC11) đến 1215 amino acid (HDAC6). Tất cả các HDAC đều có vùng deacetyl được bảo tồn cao. Sự khác biệt lớn nhất giữa các enzym được tìm thấy ở vùng cửa vào của trung tâm hoạt động. Ngoài ra, các HDAC nhóm I cho thấy có thêm một khoang phụ nằm bên trong trung tâm hoạt động, được dự đoán là vị trí có vai trò đưa phân tử nước vào và loại bỏ sản phẩm phụ là acid acetic.

Khoang phụ này dường như không có mặt ở các HDAC nhóm II. Với các HDAC nhóm III, không có ion kẽm ở trung tâm hoạt động, các phân tử lys in mang nhóm acetyl được gắn với ADP-ribose. Vị trí phân bố trong tế bào của các HDAC không giống nhau, các HDAC nhóm I và IV có ở nhân tế bào, các HDAC nhóm IIb có ở bào tương, còn các HDAC nhóm IIa được tìm thấy ở cả nhân và bào tương. Chức năng và cơ chất của từng enzym trong nhóm cũng không hoàn toàn giống nhau.

Trong đó, đặc biệt nhất là nhóm I, tất cả các enzym nhóm này đều có chức năng sinh học liên quan đến quá trình sinh sản của tế bào [96]. Cấu trúc các enzym histon deacetylase nhóm I, II và IV 1. HDAC nhóm I HDAC1, HDAC2, HDAC3 và HDAC8 là các enzym thuộc nhóm I. HDAC1, HDAC2 và HDAC3 là hợp phần trong các phức hợp protein có liên quan đến quá trình ức chế phiên mã.

Mô hình cấu trúc được xây dựng dựa trên sự tương đồng của các biến thể HDAC1 khác nhau, vốn được dùng để giải thích những đột biến trên HDAC, cũng rất hữu ích cho việc phát triển các chất ức chế HDAC và xây dựng cấu trúc mang hoạt tính (pharmacophore) cho các chất này. Quá trình phân tách cấu trúc tinh thể bằng tia X của HDAC1 cho thấy cấu trúc của trung tâm hoạt động được tạo bởi một kênh kỵ nước kích thước 11Å với một ion kẽm có vai trò xúc tác và một khoang phụ thân nước có kích thước 14Å nằm ở đáy của kênh enzym. Khi không có phối tử, khoang phụ này tham gia vào quá trình xúc tác phản ứng deacetylase hoá, giúp cho sản phẩm phụ acetat được loại ra khỏi phản ứng thông qua những tương tác ưu tiên [37, 153]. Cấu trúc của các HDAC2 bao gồm 8 phiến gấp nếp β (β sheet) và 13 cấu trúc xoắn α (α helice) trong một domain α/β, với các phiến β kẹp giữa các xoắn α (Hình 1.

Kênh enzym kết nối bề mặt enzym với ion kẽm cũng có bản chất thân dầu, kích thước xấp xỉ 11Å, được bao phủ bởi các amino acid là Gly154, Phe155, Phe210 và His183 có khả năng tạo phức với ion kẽm. Từ vị trí liên kết với kẽm, khoang phụ có kích thước 14Å và bản chất thân nước có vị trí hướng về phần trung tâm của enzym. Các amino acid gồm Met35, Phe114 và Leu144 là những amino acid chính tạo nên khoang phụ [79, 152].2: Mô hình cấu trúc trung tâm hoạt động của HDAC2 Khoang phụ của HDAC8 được bộc lộ ra bên ngoài cho thấy sự linh động của kênh enzym trên bề mặt protein (Hình 1. Khoang phụ này chứa một số amino acid Arg được bảo tồn cao và phần cấu trúc quan trọng nhất là arginin trung tâm của 4 chuỗi bên R37.

Acid amin này được cho là giúp cải thiện cả hoạt tính xúc tác cùng với ái lực acetat của HDAC8, và có vai trò bảo vệ kênh enzym khi tham gia vào quá trình vận chuyển nước và acid acetic ra khỏi trung tâm hoạt động của enzym. Sự chuyển động của phân tử nước hoặc acid acetic bị ức chế bởi liên kết bền vững giữa G139 và G303. Do đó cần có sự sắp xếp lại cấu trúc của chuỗi bên R37 và vòng xoắn (loop) để mở rộng vị trí hoạt động để các phân tử này có thể di chuyển ra ngoài thông qua kênh enzym [50, 154, 155].3: Cấu trúc trung tâm hoạt động của HDAC8 Cho đến nay, theo dữ liệu cấu trúc trên Ngân hàng dữ liệu protein (PDB) có 7 enzym gồm HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC6, HDAC7 và HDAC8 ở người hoặc nấm men đã được công bố cấu trúc tinh thể kết tinh (có hoặc không kèm với chất ức chế có liên quan). So sánh cấu trúc của các HDAC nhóm I cho thấy cả 4 loại enzym đều có cấu trúc chuỗi polipeptid xương sống (backbone) gần như giống hệt nhau.