ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, enzym histon deacetylase (HDAC) đã được biết đến là một phân tử mục tiêu quan trọng trong quá trình nghiên cứu phát triển thuốc điều trị ung thư. Các chất ức chế HDAC được chứng minh có thể tạo ra nhiều tác dụng giúp ngăn chặn quá trình phát sinh và phát triển của tế bào ung thư [172]. Một số chất ức chế HDAC đang được dùng làm thuốc điều trị ung thư có thể kể đến như acid suberoylanilid hydroxamic (Zolinza®, 2006), depsipeptid (Romideps in ®, 2009), belinostat (Beleodaq ®, 2014), panobinostat (Farydak®, 2015). Bên cạnh đó, rất nhiều chất khác với tác dụng ức chế enzym HDAC nổi bật, cũng đang được nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng cho những kết quả ban đầu tương đối khả quan.
Về mặt cấu trúc, các chất ức chế HDAC có cấu trúc khá đa dạng và được phân loại thành một số nhóm chất chính gồm: acid hydroxamic, các benzamid, các peptid vòng, các ceton, các acid béo mạch ngắn và một số cấu trúc hỗn hợp khác. Trong đó, nhóm các acid hydroxamic ức chế HDAC là nhóm chất được nghiên cứu nhiều nhất do khả năng ức chế enzym mạnh. Nhờ sự phát triển của kỹ thuật chụp X-quang tinh thể, cơ chế tương tác của các chất với trung tâm hoạt động của enzym dần được làm sáng tỏ. Trên cơ sở đó, các nhà nghiên cứu đã xây dựng những mô hình 3D mô phỏng trung tâm hoạt động của các HDAC.
Những mô hình này có thể được sử dụng làm dữ liệu cho nghiên cứu docking nhằm dự đoán tương tác của các cấu trúc mới với enzym. Hội nhập cùng xu hướng chung của thế giới, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược, trường Đại học Dược Hà Nội đã thiết kế và tổng hợp được nhiều dãy acid hydroxamic mới có tác dụng ức chế HDAC. Trong đó, có thể kể đến các dẫn chất mang khung benzothiazol với tác dụng ức chế enzym cũng như độc tính tế bào tương đương với acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) [109]. Các kết quả nghiên cứu trong nước và trên thế giới đều cho thấy acid hydroxamic mang một hay nhiều khung cấu trúc giàu electron như phenyl, benzothiazol, indol, indolin.
có tiềm năng tạo ra tác dụng ức chế HDAC tốt. Khung indolin có mặt trong cấu tạo của nhiều chất mang hoạt tính kháng ung thư nhưng chưa có nhiều cấu trúc mang khung này được khảo sát về tác dụng ức chế HDAC. Trên cơ sở kế thừa và phát triển hướng nghiên cứu trong và ngoài nước, luận án “Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 2-oxoindolin” được tiến hành với 2 mục tiêu chính: 1. Tổng hợp được khoảng từ 30 đến 40 acid hydroxamic mới mang khung 2-oxoindolin.
Thử tác dụng ức chế enzym histon deacetylase và tác dụng kháng một số dòng tế bào ung thư của các dẫn chất tổng hợp được.1 Khái niệm Histon deacetylasse (HDAC) là một nhóm các enzym xúc tác cho quá trình loại bỏ nhóm ε-N-acetyl của lysin ở đầu N tận cùng của protein histon. Các HDAC tồn tại cả ở dạng protein đơn lẻ và phức hợp với các protein như mSin3, N-CoR và SMRT để tạo thành các phức hợp đồng kìm hãm phiên mã [132]. Những phức hợp này sau đó được vận chuyển đến những vùng genom xác định nhờ tương tác với các yếu tố có vị trí gắn đặc hiệu trên ADN bao gồm các yếu tố phiên mã, các thụ thể trong nhân, các gen điều chỉnh di truyền biểu sinh, cụ thể như protein gắn methyl (MDB), enzym ADN methyl transferase (DNMT) và enzym histon methyl transferase (HMT). Biến đổi cấu trúc của nhiễm sắc thể bởi hoạt động của enzym histon deacetylase là một trong những cơ chế của di truyền biểu sinh [161].
Quá trình acetyl hoá lys in của protein histon được khám phá ra bởi Allfrey V. và cộng sự từ khoảng năm thập kỷ trước [3]. Nhiều nghiên cứu sau đó cũng đã chỉ ra tầm quan trọng của sự acyl hoá nhóm ε-amino của phân tử lys in ở đầu N tận cùng của histon trong quá trình biểu hiện gen. Trên cơ sở đó, các nhà khoa học nhận định rằng sự cân bằng trong hoạt động của enzym HAT và HDAC là yếu tố ảnh hưởng đến sự hoạt hoá hay bất hoạt quá trình phiên mã [48].
Cơ chế deacetyl hoá lys in xúc tác bởi HDAC được minh hoạ trong hình dưới đây (Hình 1. Nhóm chức N-ε-acetyl trên lys in được gắn với ion kẽm ở trung tâm hoạt động của enzym. Enzym được hoạt hoá, nhóm chức acetyl bị tấn bởi một phân tử nước tạo ra sản phẩm là lysin ở dạng amoni không gắn nhóm acetyl và sản phẩm phụ là acid acetic ở dạng acetat.1: Hình biểu diễn cơ chế deacetyl hoá lysin của HDAC 2 HDAC được đặt tên theo protein histon do các nhà nghiên cứu khám phá ra chức năng của nhóm enzym này đầu tiên là loại bỏ nhóm acetyl của histon [46]. Tuy nhiên, sau này các nghiên cứu sâu hơn về hoạt động của nhóm enzym này cho thấy các enzym HDAC còn có khả năng deacetyl hoá rất nhiều protein không phải histon khác bao gồm các yếu tố phiên mã như RUNX3 [62], p53 [59], E2F [97], c- Myc [112], yếu tố kappa B của nhân (NF-ĸB) [21], yếu tố cảm ứng sự giảm oxi máu 1-alpha (HIF-1α) [70], thụ thể estrogen alpha (ERα) [41], thụ thể androgen (AR) [131], chaperon (HSP90) [7], nhân tố điều chỉnh tín hiệu Stat3 [166] và Smad7 [134], protein chỉnh sửa (Ku70) [26] và một yếu tố phiên mã quan trọng cho sự phát triển xương cũng được xác định là cơ chất của HDAC [60].
Phân loại Cho đến nay, 18 loại enzym HDAC đã được xác định và phân chia thành 4 nhóm căn cứ vào sự tương đồng của chúng với HDAC ở nấm men. Trong 4 nhóm này các enzym nhóm I, II và IV là những enzym phụ thuộc kim loại (metallo- enzym), trong quá trình hoạt động cần có sự phối hợp của ion kẽm nằm ở trung tâm xúc tác của các enzym [106]. Ngược lại, các enzym HDAC nhóm III (các sirtuin) được xác định là các enzym có hoạt động phụ thuộc NAD+. Và khái niệm các chất ức chế HDAC thường được đề cập đến là các chất có khả năng ức chế các HDAC nhóm I, II và IV.
Các HDAC có độ dài chuỗi amino acid không giống nhau, thay đổi từ 347 amino acid (HDAC11) đến 1215 amino acid (HDAC6). Tất cả các HDAC đều có vùng deacetyl được bảo tồn cao. Sự khác biệt lớn nhất giữa các enzym được tìm thấy ở vùng cửa vào của trung tâm hoạt động. Ngoài ra, các HDAC nhóm I cho thấy có thêm một khoang phụ nằm bên trong trung tâm hoạt động, được dự đoán là vị trí có vai trò đưa phân tử nước vào và loại bỏ sản phẩm phụ là acid acetic.
Khoang phụ này dường như không có mặt ở các HDAC nhóm II. Với các HDAC nhóm III, không có ion kẽm ở trung tâm hoạt động, các phân tử lys in mang nhóm acetyl được gắn với ADP-ribose. Vị trí phân bố trong tế bào của các HDAC không giống nhau, các HDAC nhóm I và IV có ở nhân tế bào, các HDAC nhóm IIb có ở bào tương, còn các HDAC nhóm IIa được tìm thấy ở cả nhân và bào tương. Chức năng và cơ chất của từng enzym trong nhóm cũng không hoàn toàn giống nhau.
Trong đó, đặc biệt nhất là nhóm I, tất cả các enzym nhóm này đều có chức năng sinh học liên quan đến quá trình sinh sản của tế bào [96]. Cấu trúc các enzym histon deacetylase nhóm I, II và IV 1. HDAC nhóm I HDAC1, HDAC2, HDAC3 và HDAC8 là các enzym thuộc nhóm I. HDAC1, HDAC2 và HDAC3 là hợp phần trong các phức hợp protein có liên quan đến quá trình ức chế phiên mã.
Mô hình cấu trúc được xây dựng dựa trên sự tương đồng của các biến thể HDAC1 khác nhau, vốn được dùng để giải thích những đột biến trên HDAC, cũng rất hữu ích cho việc phát triển các chất ức chế HDAC và xây dựng cấu trúc mang hoạt tính (pharmacophore) cho các chất này. Quá trình phân tách cấu trúc tinh thể bằng tia X của HDAC1 cho thấy cấu trúc của trung tâm hoạt động được tạo bởi một kênh kỵ nước kích thước 11Å với một ion kẽm có vai trò xúc tác và một khoang phụ thân nước có kích thước 14Å nằm ở đáy của kênh enzym. Khi không có phối tử, khoang phụ này tham gia vào quá trình xúc tác phản ứng deacetylase hoá, giúp cho sản phẩm phụ acetat được loại ra khỏi phản ứng thông qua những tương tác ưu tiên [37, 153]. Cấu trúc của các HDAC2 bao gồm 8 phiến gấp nếp β (β sheet) và 13 cấu trúc xoắn α (α helice) trong một domain α/β, với các phiến β kẹp giữa các xoắn α (Hình 1.
Kênh enzym kết nối bề mặt enzym với ion kẽm cũng có bản chất thân dầu, kích thước xấp xỉ 11Å, được bao phủ bởi các amino acid là Gly154, Phe155, Phe210 và His183 có khả năng tạo phức với ion kẽm. Từ vị trí liên kết với kẽm, khoang phụ có kích thước 14Å và bản chất thân nước có vị trí hướng về phần trung tâm của enzym. Các amino acid gồm Met35, Phe114 và Leu144 là những amino acid chính tạo nên khoang phụ [79, 152].2: Mô hình cấu trúc trung tâm hoạt động của HDAC2 Khoang phụ của HDAC8 được bộc lộ ra bên ngoài cho thấy sự linh động của kênh enzym trên bề mặt protein (Hình 1. Khoang phụ này chứa một số amino acid Arg được bảo tồn cao và phần cấu trúc quan trọng nhất là arginin trung tâm của 4 chuỗi bên R37.
Acid amin này được cho là giúp cải thiện cả hoạt tính xúc tác cùng với ái lực acetat của HDAC8, và có vai trò bảo vệ kênh enzym khi tham gia vào quá trình vận chuyển nước và acid acetic ra khỏi trung tâm hoạt động của enzym. Sự chuyển động của phân tử nước hoặc acid acetic bị ức chế bởi liên kết bền vững giữa G139 và G303. Do đó cần có sự sắp xếp lại cấu trúc của chuỗi bên R37 và vòng xoắn (loop) để mở rộng vị trí hoạt động để các phân tử này có thể di chuyển ra ngoài thông qua kênh enzym [50, 154, 155].3: Cấu trúc trung tâm hoạt động của HDAC8 Cho đến nay, theo dữ liệu cấu trúc trên Ngân hàng dữ liệu protein (PDB) có 7 enzym gồm HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC6, HDAC7 và HDAC8 ở người hoặc nấm men đã được công bố cấu trúc tinh thể kết tinh (có hoặc không kèm với chất ức chế có liên quan). So sánh cấu trúc của các HDAC nhóm I cho thấy cả 4 loại enzym đều có cấu trúc chuỗi polipeptid xương sống (backbone) gần như giống hệt nhau.