Luận án tiến sĩ nghiên cứu phát triển chủng nấm sợi và tối ưu điều kiện lên men sản xuất đa enzyme α amylase glucoamylase cellulase ứng dụng trong chế biến thức ăn chăn nuôi

Nghiên cứu phát triển chủng nấm sợi và tối ưu điều kiện lên men sản xuất enzyme α amylase, glucoamylase, cellulase trong chế biến thức ăn chăn nuôi.

• Tác giả: Dương Thu Hương
• Người hướng dẫn: PGS. Vũ Văn Hạnh
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Chăn nuôi
• Đề tài: Nghiên cứu phát triển nấm sợi và tối ưu điều kiện lên men sản xuất enzyme cho thức ăn chăn nuôi
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 1.1. Mục tiêu của đề tài
• 1.1.1. Mục tiêu chung
• 1.1.2. Mục tiêu cụ thể
• 1.2. Phạm vi nghiên cứu
• 1.2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 1.2.2. Địa điểm nghiên cứu
• 1.2.3. Thời gian nghiên cứu
• 1.3. Những đóng góp mới của đề tài
• 1.3.1. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 1.3.1.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.3.1.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tổng quát về enzyme amylase và cellulase
• 2.2. Nguồn thu nhận enzyme
• 2.3. Tổng quan về nấm sợi Aspergillus niger
• 2.4. Cải tiến chủng vi sinh vật và lên men sản xuất enzyme
• 2.4.1. Sự cần thiết phải cải tiến các chủng vi sinh vật
• 2.4.2. Phương pháp cải tiến chủng vi sinh vật để tăng sản xuất enzyme
• 2.4.3. Lên men sản xuất enzyme
• 2.5. Sự cần thiết phải tối ưu môi trường lên men
• 2.6. Thành tựu về cải tiến chủng và tối ưu môi trường lên men sản xuất amylase và cellulase
• 2.7. Tình hình sản xuất và sử dụng enzyme trong chăn nuôi
• 2.7.1. Nghiên cứu và sử dụng enzyme trong chăn nuôi trên thế giới
• 2.7.2. Nghiên cứu và sử dụng enzyme trong chăn nuôi ở Việt Nam
• 2.8. Sử dụng thức ăn lên men trong chăn nuôi
• 2.8.1. Đặc tính và vai trò của các vi sinh vật sử dụng trong lên men thức ăn chăn nuôi
• 2.8.2. Các vi sinh vật sử dụng trong lên men thức ăn
• 2.8.3. Hiệu quả của sử dụng thức ăn lên men trong chăn nuôi
• 2.9. Tình hình nghiên cứu và sử dụng bã sắn trong chăn nuôi
• 3. PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Nội dung nghiên cứu
• 3.2. Phương pháp nghiên cứu
• 3.2.1. Gây đột biến chủng Aspergillus niger A45.1 và tối ưu điều kiện lên men chủng nấm sợi đột biến chọn lọc để sinh tổng hợp đa enzyme (α-amylase, glucoamylase và cellulase) cao
• 3.2.2. Xử lý bã sắn thành thức ăn chăn nuôi bằng bằng công nghệ đường hóa và lên men đồng thời
• 3.2.3. Đánh giá ảnh hưởng của việc sử dụng bã sắn lên men trong khẩu phần ăn đến năng suất chăn nuôi lợn thịt
• 3.2.4. Xử lý số liệu
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Gây đột biến chủng Aspergillus niger a45.1 và tối ưu điều kiện lên men chủng đột biến chọn lọc cho sinh tổng hợp đa enzyme (α-amylase, glucoamylase và cellulase) cao
• 4.1.1. Ảnh hưởng của tia UV và NTG đến khả năng sống sót của chủng nấm sợi Aspergillus niger A45. Hoạt tính enzyme của các các chủng đột biến
• 4.1.2. Tính ổn định của các chủng đột biến chọn lọc
• 4.1.3. Tối ưu điều kiện lên men xốp chủng nấm đột biến chọn lọc cho sinh tổng hợp đa enzyme (glucoamylase, α-amylase, cellulase)
• 4.2. Xử lý bã sắn thành thức ăn chăn nuôi bằng đường hóa và lên men đồng thời
• 4.2.1. Thành phần hóa học của bã sắn tươi
• 4.2.2. Tối ưu thời gian đường hóa bã sắn
• 4.2.3. Đường hóa và lên men đồng thời bã sắn bằng enzyme và vi sinh vật
• 4.2.4. Đánh giá chất lượng của bã sắn sau lên men
• 4.3. Ảnh hưởng của bã sắn lên men trong chăn nuôi lợn thịt
• 4.3.1. Ảnh hưởng của bã sắn lên men đến khả năng sinh trưởng và chuyển hóa thức ăn của lợn F1 (Landrace x Yorkshire)
• 4.3.2. Ảnh hưởng của tương tác giữa khẩu phần ăn và tính biệt đến khả năng sinh trưởng của lợn F1 (LandracexYorkshire)
• 4.3.3. Ảnh hưởng của mức sử dụng BSLM đến năng suất thân thịt của lợn thịt F1 (Landrace x Yorkshire)
• 4.3.4. Ảnh hưởng của mức sử dụng BSLM đến chất lượng thịt và thành phần hóa học của thịt lợn F1 (Landrace x Yorkshire)
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• 5.1. Kiến nghị
• Danh mục các công trình công bố liên quan đến luận án
• Tài liệu tham khảo
• Phụ lục

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu phát triển nấm sợi và enzyme cho thức ăn chăn nuôi

Nghiên cứu phát triển nấm sợi và tối ưu điều kiện lên men sản xuất enzyme cho thức ăn chăn nuôi đang trở thành một lĩnh vực quan trọng trong ngành nông nghiệp. Việc sử dụng enzyme trong chế biến thức ăn không chỉ giúp cải thiện giá trị dinh dưỡng mà còn nâng cao hiệu quả chăn nuôi. Các loại enzyme như α-amylase, glucoamylase và cellulase có vai trò quan trọng trong việc phân giải các hợp chất phức tạp trong thức ăn, từ đó giúp động vật tiêu hóa tốt hơn.

1.1. Tầm quan trọng của nấm sợi trong sản xuất enzyme

Nấm sợi, đặc biệt là Aspergillus niger, được biết đến với khả năng sản xuất enzyme cao. Việc phát triển các chủng nấm này có thể giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất enzyme, từ đó nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn trong chăn nuôi.

1.2. Lợi ích của enzyme trong thức ăn chăn nuôi

Sử dụng enzyme cho thức ăn chăn nuôi giúp cải thiện khả năng tiêu hóa, tăng cường sức khỏe cho động vật và giảm thiểu chi phí thức ăn. Các enzyme như glucoamylase và cellulase giúp phân giải tinh bột và xơ, làm tăng khả năng hấp thụ dinh dưỡng.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu enzyme cho thức ăn chăn nuôi

Mặc dù có nhiều lợi ích, nhưng việc phát triển enzyme cho thức ăn chăn nuôi cũng gặp phải nhiều thách thức. Một trong những vấn đề chính là việc tối ưu hóa điều kiện lên men để sản xuất enzyme đạt hiệu quả cao nhất. Các yếu tố như pH, nhiệt độ và thời gian lên men đều ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme.

2.1. Thách thức trong việc tối ưu hóa điều kiện lên men

Điều kiện lên men không tối ưu có thể dẫn đến sản lượng enzyme thấp. Việc nghiên cứu và điều chỉnh các yếu tố như nhiệt độ và pH là rất cần thiết để đạt được hiệu quả tối ưu trong sản xuất enzyme.

2.2. Khó khăn trong việc phát triển chủng nấm

Việc phát triển các chủng nấm có khả năng sản xuất enzyme cao cũng gặp nhiều khó khăn. Cần có các phương pháp cải tiến chủng vi sinh vật để tăng cường khả năng sinh enzyme, đồng thời đảm bảo tính ổn định của chủng nấm trong quá trình sản xuất.

III. Phương pháp tối ưu hóa điều kiện lên men sản xuất enzyme

Để tối ưu hóa điều kiện lên men sản xuất enzyme, nhiều phương pháp đã được áp dụng. Việc sử dụng các công nghệ hiện đại trong nghiên cứu và phát triển nấm sợi là rất quan trọng. Các phương pháp như gây đột biến và chọn lọc chủng nấm có khả năng sinh enzyme cao sẽ giúp nâng cao hiệu quả sản xuất.

3.1. Gây đột biến và chọn lọc chủng nấm

Gây đột biến bằng tia UV và NTG là một trong những phương pháp hiệu quả để phát triển các chủng nấm có khả năng sản xuất enzyme cao. Việc chọn lọc các chủng nấm này sẽ giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất enzyme.

3.2. Tối ưu hóa các yếu tố lên men

Các yếu tố như pH, nhiệt độ và thời gian lên men cần được tối ưu hóa để đạt được hoạt tính enzyme cao nhất. Nghiên cứu cho thấy rằng điều kiện lên men lý tưởng có thể làm tăng đáng kể sản lượng enzyme.

IV. Ứng dụng thực tiễn của enzyme trong chế biến thức ăn chăn nuôi

Việc ứng dụng enzyme trong chế biến thức ăn chăn nuôi đã mang lại nhiều kết quả tích cực. Các nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng bã sắn lên men có chứa enzyme có thể cải thiện đáng kể hiệu quả chăn nuôi. Điều này không chỉ giúp tăng trưởng nhanh hơn mà còn giảm chi phí thức ăn.

4.1. Kết quả nghiên cứu về enzyme trong thức ăn chăn nuôi

Nghiên cứu cho thấy rằng việc bổ sung enzyme vào khẩu phần ăn giúp tăng cường khả năng tiêu hóa và hấp thụ dinh dưỡng, từ đó cải thiện tốc độ sinh trưởng của động vật.

4.2. Ảnh hưởng của bã sắn lên men đến năng suất chăn nuôi

Sử dụng bã sắn lên men trong khẩu phần ăn đã cho thấy sự cải thiện rõ rệt về năng suất chăn nuôi. Các chỉ tiêu như tăng trọng và hiệu quả sử dụng thức ăn đều được nâng cao.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu enzyme

Nghiên cứu phát triển nấm sợi và tối ưu điều kiện lên men sản xuất enzyme cho thức ăn chăn nuôi đang mở ra nhiều triển vọng mới. Việc ứng dụng các công nghệ hiện đại trong nghiên cứu sẽ giúp nâng cao hiệu quả sản xuất và sử dụng enzyme trong chăn nuôi. Tương lai của ngành chăn nuôi sẽ phụ thuộc nhiều vào việc phát triển các chế phẩm enzyme chất lượng cao.

5.1. Triển vọng phát triển enzyme trong chăn nuôi

Với sự phát triển của công nghệ sinh học, việc sản xuất enzyme từ nấm sợi sẽ ngày càng trở nên hiệu quả hơn. Điều này sẽ giúp nâng cao giá trị dinh dưỡng của thức ăn chăn nuôi.

5.2. Đề xuất nghiên cứu tiếp theo

Cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các chủng nấm mới, cũng như tối ưu hóa quy trình sản xuất enzyme để đáp ứng nhu cầu ngày càng cao trong ngành chăn nuôi.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam giữ vị trí quan trọng trong hệ thống sản xuất nông nghiệp và nền kinh tế quốc dân. Tuy nhiên, sản xuất chăn nuôi trong nước gặp nhiều trở ngại do chi phí thức ăn cao và biến động liên tục vì phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu nhập khẩu. Cùng lúc đó, các hoạt động chế biến nông sản tạo ra khối lượng phụ phẩm rất lớn. Cả nước có khoảng 100 nhà máy chế biến tinh bột sắn quy mô lớn với sản lượng 1,8 đến 2,0 triệu tấn tinh bột/ngày, thải ra xấp xỉ 0,6 triệu tấn chất thải rắn/ngày (Nguyễn Thị Hằng Nga & cs., 2017). Lượng bã sắn này nếu không được xử lý kịp thời sẽ phân hủy sinh ra các khí độc hại như $H_2S$, $NH_3$, $CH_4$, gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng.

Bã sắn tươi có hàm lượng chất xơ cao, protein thấp (khoảng 2% đến 3,6%), đồng thời chứa glycoside sinh cyanogenic tạo ra độc tố hydrogen cyanide (HCN). Các phương pháp xử lý truyền thống như phơi khô thủ công gây tốn diện tích, phụ thuộc thời tiết, dễ nhiễm nấm mốc; hoặc ủ chua tự nhiên chỉ làm tăng lượng protein lên mức 3,5% đến 5,3% vật chất khô (VCK), chưa đáp ứng được nhu cầu dinh dưỡng của gia súc dạ dày đơn. Hầu hết vi sinh vật không thể trực tiếp sử dụng cơ chất giàu xơ và tinh bột chưa dịch hóa. Do đó, việc ứng dụng công nghệ enzyme nhằm thủy phân cơ chất kết hợp lên men vi sinh vật là hướng đi cần thiết. Tuy vậy, các chế phẩm enzyme thương mại trong chăn nuôi hiện nay chủ yếu phải nhập khẩu từ nước ngoài với chi phí cao. Việc nghiên cứu cải tiến chủng vi sinh vật bản địa nhằm sinh tổng hợp đồng thời hệ đa enzyme ($\alpha$-amylase, glucoamylase, cellulase) và tối ưu hóa điều kiện lên men để chế biến bã sắn thành thức ăn chăn nuôi giàu dinh dưỡng là khoảng trống thực tiễn và khoa học mà luận án tập trung giải quyết.

Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chung: Nâng cao hiệu quả sử dụng phụ phẩm trồng trọt và chế biến nông sản bằng ứng dụng chế phẩm sinh học.

Mục tiêu cụ thể:

1. Chọn lọc được 1 chủng/dòng đột biến từ chủng nấm sợi Aspergillus niger A45.1 có khả năng sinh đa enzyme ($\alpha$-amylase, glucoamylase và cellulase) với hoạt tính cao.
2. Tối ưu được điều kiện lên men xốp cho sản xuất đa enzyme ($\alpha$-amylase, glucoamylase và cellulase) của chủng đột biến chọn lọc.
3. Đánh giá được hiệu quả của việc sử dụng thức ăn lên men tạo ra từ bã thải chế biến tinh bột được xử lý bằng đa enzyme ($\alpha$-amylase, glucoamylase và cellulase) ở lợn thịt.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu:
  • Chủng nấm sợi Aspergillus niger A45.1 từ bộ sưu tập giống của Phòng Các chất chức năng sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
  • Bã sắn tươi thu gom trực tiếp từ các cơ sở chế biến tinh bột sắn tại xã Cát Quế, huyện Hoài Đức, thành phố Hà Nội.
  • Lợn lai $F_1$ (Landrace $\times$ Yorkshire) gồm 144 con (72 lợn cái và 72 lợn đực thiến) nuôi trong giai đoạn từ 20 kg đến khi xuất chuồng.
• Địa điểm nghiên cứu:
  • Phòng Các chất chức năng sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
  • Phòng Thí nghiệm trung tâm, Khoa Chăn nuôi, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
  • Phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền - Giống, Khoa Chăn nuôi, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
  • Trung tâm Giống lợn chất lượng cao, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
• Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 6 năm 2015 đến tháng 6 năm 2019.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước được luận án điểm lại

Luận án đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến các nhóm nội dung chính:

1. Về cấu trúc enzyme và sinh tổng hợp enzyme từ vi sinh vật:

   • Singh & cs. (2011, 2014, 2016, 2017) phân tích cơ chế tác dụng của các enzyme thủy phân tinh bột ($\alpha$-amylase, $\beta$-amylase, $\gamma$-amylase/glucoamylase) và cellulase. $\alpha$-amylase là một metalloenzyme chứa ion $Ca^{2+}$, phân cắt ngẫu nhiên liên kết $\alpha$-1,4 glucoside; trong khi glucoamylase (EC 3.2.1.3) thủy phân cả liên kết $\alpha$-1,4 và $\alpha$-1,6 glucoside từ đầu không khử để giải phóng glucose. Phức hệ cellulase gồm endo-1,4-$\beta$-D-glucanase (CMCase, EC 3.2.1.4), exoglucanase/cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) và $\beta$-glucosidase (EC 3.2.1.21) phối hợp cắt đứt liên kết $\beta$-1,4-glucosidic trong chuỗi cellulose (Hameed & cs., 2012).
   • Chi Aspergillus, đặc biệt là loài Aspergillus niger, được ghi nhận là nguồn sinh tổng hợp amylase, pectinase, protease và cellulase phổ biến trong công nghiệp (Schuster & cs., 2002; Vittaladevaram & cs., 2014). Chế phẩm enzyme từ A. niger đã được FAO/WHO (1972, 1987, 1990) và FDA Hoa Kỳ công nhận đạt chuẩn an toàn chung (GRAS).

2. Về phương pháp cải tiến chủng và công nghệ lên men:

   • Đột biến ngẫu nhiên bằng tác nhân vật lý (tia UV) và hóa học ($N$-methyl-$N'$-nitro-$N$-nitrosoguanidine - NTG, ethyl methane sulfonate - EMS) là giải pháp hiệu quả để phá vỡ cơ chế ức chế trao đổi chất ngược, nâng cao sản lượng enzyme (Pathak & cs., 2015; Mishra & cs., 2010; Zhao & cs., 2019).
   • Nghiên cứu của Fawzi & Hamdy (2011), Ghani & cs. (2014), Devi & Kumar (2017) chứng minh việc kết hợp chiếu xạ và hóa chất xử lý A. niger làm tăng hoạt tính glucoamylase và cellulase từ 1,6 đến 2,2 lần so với chủng ban đầu.
   • So sánh giữa lên men chìm (SmF) và lên men bề mặt rắn/lên men xốp (SSF), các tác giả Singhania & cs. (2009), Pandey & cs. (1999, 2000), Zambare (2010) kết luận rằng SSF phù hợp với sinh lý nấm sợi, sử dụng cơ chất rắn rẻ tiền (cám mì, bã nông nghiệp), tiêu hao ít năng lượng, giảm lượng nước thải và tạo hoạt tính enzyme cao hơn.

3. Về ứng dụng enzyme và thức ăn lên men trong chăn nuôi:

   • Bổ sung enzyme ngoại sinh (amylase, cellulase, glucanase, xylanase) giúp phân giải các polysaccharide phi tinh bột (NSP), giảm độ nhớt đường tiêu hóa, nâng cao tỷ lệ tiêu hóa chất dinh dưỡng và cải thiện hệ số chuyển hóa thức ăn (FCR) ở lợn và gia cầm (Bhat, 2000; Kuhad & cs., 2011; Chapman & cs., 2021).
   • Thức ăn lên men chứa vi khuẩn lactic (LAB), nấm men Saccharomyces cerevisiae, Bacillus sp. giúp giảm pH đường ruột, ức chế vi khuẩn gây bệnh như Escherichia coli hay Salmonella, nâng cao sức đề kháng và cải thiện chất lượng quày thịt (Niba & cs., 2009; Missotten & cs., 2015; Jensen & Mikkelsen, 2001).

4. Về xử lý phụ phẩm bã sắn:

   • Carta & cs. (1999), Mai Thị Thơm & Bùi Quang Tuấn (2006), Nguyễn Hữu Văn & cs. (2008) chỉ ra bã sắn tươi có độ ẩm cao, protein thấp, xơ cao và chứa độc tố HCN ($26,9\text{ mg/kg}$ tươi).
   • Các công trình của Aro (2008), Trần Thị Thu Hồng & cs. (2013) sử dụng nấm sợi và nấm men lên men bã sắn ghi nhận sự gia tăng hàm lượng protein thô (từ $3,05%$ lên $16,46%$) và giảm mạnh nồng độ HCN.

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Mặc dù đã có các công bố về đột biến nấm sợi hoặc sử dụng vi sinh vật ủ bã sắn, phần lớn các nghiên cứu trước đây chỉ tập trung vào việc kích thích sản sinh một loại enzyme đơn lẻ hoặc ủ chua bã sắn theo phương pháp truyền thống với hàm lượng protein cải thiện còn hạn chế. Luận án lựa chọn giải quyết đồng bộ chuỗi mắt xích:

• Sử dụng tác nhân kép (UV kết hợp NTG) để tạo ra chủng đột biến A. niger có khả năng sinh đồng thời cả 3 enzyme thủy phân chính ($\alpha$-amylase, glucoamylase, cellulase) với hoạt tính cao ổn định qua nhiều thế hệ.
• Tối ưu hóa điều kiện lên men xốp trên nguồn cơ chất phụ phẩm nông nghiệp để tạo chế phẩm đa enzyme thô.
• Ứng dụng quy trình đường hóa và lên men đồng thời (SSCF) kết hợp chế phẩm đa enzyme với hỗn hợp probiotic (S. cerevisiae, Lactobacillus sp., Bacillus sp.) và muối amoni vô cơ để chuyển hóa bã sắn tươi thành nguồn thức ăn giàu protein, giảm độc tố HCN.
• Đánh giá thực nghiệm toàn diện trên 144 lợn thịt $F_1$ về các chỉ tiêu sinh trưởng, tiêu tốn thức ăn, năng suất thân thịt và thành phần hóa học của thịt.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

• Lý thuyết gây đột biến nấm sợi: Tia UV (bước sóng $254\text{ nm}$) gây biến đổi cấu trúc phân tử ADN thông qua việc hình thành liên kết pyrimidine dimer (thymine-thymine, cytosine-cytosine), gây mất đoạn, dịch khung hoặc thay thế cặp base. Hóa chất NTG đóng vai trò là tác nhân alkyl hóa, gây methyl hóa base guanine dẫn đến việc bắt cặp sai chuyển đổi $G-C \rightarrow A-T$. Việc kết hợp đồng thời hai tác nhân vật lý và hóa học làm tăng tần số đột biến trên hệ gen của chủng A. niger A45.1.
• Cơ chế thủy phân enzyme đa thành phần: $\alpha$-amylase dịch hóa tinh bột thành các đoạn dextrin ngắn; glucoamylase tiếp tục cắt các liên kết $\alpha$-1,4 và $\alpha$-1,6 để giải phóng glucose; cellulase cắt các mạch cellulose thành cellobiose và glucose.
• Công nghệ đường hóa và lên men đồng thời (Simultaneous Saccharification and Fermentation): Dưới tác dụng của phức hệ enzyme ngoại sinh, tinh bột và cellulose trong bã sắn được phân giải liên tục thành đường khử; các tế bào vi khuẩn lactic, nấm men và Bacillus sử dụng ngay lượng đường tạo thành cùng với nguồn nitơ bổ sung ($(NH_4)_2SO_4$) để tổng hợp sinh khối protein vi sinh vật, sinh acid hữu cơ làm giảm pH, ức chế tạp khuẩn và phân giải độc tố cyanogenic glycoside.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Luận án sử dụng phương pháp thực nghiệm khoa học kết hợp giữa công nghệ vi sinh, sinh hóa học và khảo nghiệm chăn nuôi động vật:

[Chủng A. niger A45.1] ---> [Gây đột biến kép (UV + NTG)] ---> [Sàng lọc chủng GA15]
[Đánh giá trên lợn thịt F1] <--- [Đường hóa & lên men bã sắn] <--- [Tối ưu lên men xốp]

1. Phương pháp gây đột biến và tuyển chọn chủng:

   • Dịch bào tử ($10^7\text{ bào tử/ml}$) được xử lý trong dung dịch NTG ($100\text{ mg/ml}$ trong đệm citrate $0,2\text{ M}$, pH 5,0) kết hợp chiếu xạ đèn UV ($50\text{ W}$, khoảng cách $30\text{ cm}$) ở các mốc thời gian 30, 60, 90, 120 và 180 phút.
   • Bào tử sau xử lý được rửa 3 lần bằng nước muối sinh lý, cấy trải trên thạch PDA có bổ sung ampicillin ($100\text{ mg/l}$), ủ ở $30^\circ\text{C}$ trong 4–6 ngày để lập đường cong sống sót. Sàng lọc các khuẩn lạc có vòng phân giải tinh bột và carboxymethyl cellulose (CMC) lớn nhất.
   • Kiểm tra tính ổn định di truyền của chủng đột biến qua 5 thế hệ nuôi cấy liên tục.

2. Phương pháp lên men xốp và xác định hoạt tính enzyme:

   • Lên men xốp đơn biến để khảo sát lần lượt: loại cơ chất (cám mì, cám gạo, vỏ trấu, mùn cưa), độ ẩm ban đầu (20% đến 70%), nhiệt độ nuôi cấy ($20^\circ\text{C}$ đến $45^\circ\text{C}$), pH môi trường (3,0 đến 7,0), thời gian lên men (2 đến 8 ngày), tuổi giống (1 đến 4 ngày), nguồn carbon bổ sung ($1%$ glucose, maltose, tinh bột gạo, sucrose), nguồn nitơ bổ sung ($1%$ ure, cao nấm men, tryptone, peptone, $NH_4Cl$, $NH_4NO_3$).
   • Thu dịch enzyme thô bằng cách chiết mẫu lên men với nước cất vô trùng (tỷ lệ $1:9\text{ w/v}$), lắc $200\text{ vòng/phút}$ ở $30^\circ\text{C}$ trong 60 phút, ly tâm $4000\text{ vòng/phút}$ trong 10 phút.
   • Định lượng hoạt tính enzyme bằng phản ứng tạo màu với thuốc thử 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) theo Miller (1959), đo mật độ quang ở bước sóng $\lambda = 540\text{ nm}$. Hoạt tính enzyme ($U/g$ cơ chất) tính theo lượng đường khử giải phóng ($\mu\text{mol}$) trong 1 phút phản ứng ở $50^\circ\text{C}$.

3. Phương pháp chế biến bã sắn lên men:

   • Phối trộn bã sắn tươi với nước theo tỷ lệ $30%\text{ (w/v)}$, bổ sung $8%$ dịch enzyme thô, $0,5%$ chế phẩm probiotic gồm S. cerevisiae, Lactobacillus sp., Bacillus sp. ($10^7\text{ CFU/g}$ mỗi loài) và khảo sát hàm lượng $(NH_4)_2SO_4$ bổ sung ($0%$ đến $1,5%$), thời gian lên men từ 0 đến 72 giờ.
   • Phân tích thành phần hóa học: VCK, protein thô, protein thực (phương pháp Barnstein), xơ thô, NDF, ADF, tro tổng số, nồng độ HCN, acid hữu cơ, pH và độc tố aflatoxin $B_1$.

4. Phương pháp thử nghiệm trên lợn thịt:

   • Thử nghiệm trên 144 lợn lai $F_1$ (Landrace $\times$ Yorkshire) cân nặng ban đầu khoảng $20\text{ kg}$, bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh với các mức thay thế thức ăn bằng bã sắn lên men (BSLM).
   • Theo dõi các chỉ tiêu: khối lượng cơ thể qua các giai đoạn, tăng trọng bình quân ngày (ADG), lượng thức ăn thu nhận, hệ số tiêu tốn thức ăn (FCR).
   • Mổ khảo sát đánh giá năng suất thân thịt (tỷ lệ móc hàm, tỷ lệ thịt xẻ, diện tích cơ thăn, độ dày mỡ lưng) và chất lượng thịt (pH sau giết mổ, màu sắc thịt, tỷ lệ mất nước, thành phần protein, lipid, khoáng trong cơ).

5. Phương pháp xử lý số liệu:

   • Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm chuyên dụng (phân tích phương sai ANOVA, kiểm định Duncan hoặc phân tích giá trị trung bình bình phương nhỏ nhất - LSM, mức ý nghĩa $P < 0,05$).

---

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Tính cấp thiết của đề tài

Phần này trình bày bối cảnh ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam, sự phụ thuộc vào nguyên liệu thức ăn nhập khẩu và thực trạng phát thải phụ phẩm bã sắn tại các nhà máy chế biến tinh bột (khoảng 0,6 triệu tấn/ngày). Tác giả xác định rõ mục tiêu nghiên cứu, đối tượng, địa điểm, thời gian thực hiện, cùng 2 đóng góp mới và ý nghĩa khoa học - thực tiễn của đề tài trong việc ứng dụng công nghệ sinh học tận dụng nguồn phế phụ phẩm làm thức ăn chăn nuôi.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Chương tổng quan gồm 6 mục lớn, phân tích toàn diện các cơ sở lý luận và thực nghiệm:

• Đặc điểm sinh học, cấu trúc và cơ chế phân cắt cơ chất của enzyme $\alpha$-amylase, glucoamylase và cellulase.
• Phân loại học, sinh lý sinh thái và các ứng dụng công nghiệp của nấm sợi Aspergillus niger, bao gồm tính an toàn sinh học theo chuẩn GRAS của FDA và FAO/WHO.
• Cơ sở lý thuyết của các phương pháp đột biến tạo giống vi sinh vật (bức xạ ion hóa, tia UV, tác nhân alkyl hóa NTG, biến dị điểm) và cơ chế tác động lên chuỗi xoắn kép ADN.
• Phân tích so sánh ưu nhược điểm giữa hai phương thức lên men chìm (SmF) và lên men xốp (SSF); chỉ rõ tính ưu việt của SSF trong việc nuôi cấy nấm sợi trên phụ phẩm dạng rắn.
• Tình hình nghiên cứu, thị trường và hiệu quả sử dụng chế phẩm enzyme ngoại sinh, thức ăn lên men lỏng trên thế giới và tại Việt Nam.
• Thực trạng phát sinh, thành phần hóa học (ẩm độ cao, protein thấp $2-3,6%$, xơ thô cao, chứa độc tố HCN $26,9\text{ mg/kg}$) và các phương pháp chế biến phụ phẩm bã sắn hiện hành.

Phần 3: Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Phần này mô tả chi tiết 3 nội dung nghiên cứu thực nghiệm và hệ thống các phương pháp đi kèm:

• Quy trình gây đột biến kết hợp tia UV ($50\text{ W}$, cự ly $30\text{ cm}$) và hóa chất NTG ($100\text{ mg/ml}$) trên bào tử chủng A. niger A45.1.
• Kỹ thuật xác định hoạt tính enzyme thô qua phản ứng đo hàm lượng đường khử giải phóng bằng thuốc thử DNS, đo quang phổ tại bước sóng $540\text{ nm}$ dựa trên các đường chuẩn glucose và maltose.
• Thiết kế thí nghiệm đơn biến tối ưu hóa 8 thông số công nghệ của quá trình lên men xốp.
• Quy trình công nghệ đường hóa và lên men đồng thời bã sắn tươi ở nồng độ cơ chất $30%$, bổ sung chế phẩm enzyme thô, probiotic (S. cerevisiae, Lactobacillus sp., Bacillus sp.) và $(NH_4)_2SO_4$.
• Thiết kế sơ đồ bố trí thí nghiệm chăn nuôi trên 144 lợn thịt $F_1$ (Landrace $\times$ Yorkshire) từ $20\text{ kg}$ đến xuất chuồng, phương pháp mổ khảo sát thân thịt và phân tích lý hóa mẫu thịt.

Phần 4: Kết quả và thảo luận

4.1. Gây đột biến chủng Aspergillus niger A45.1 và tối ưu điều kiện lên men xốp sinh tổng hợp đa enzyme

• Hiệu ứng gây đột biến của tia UV và NTG: Thời gian xử lý phối hợp UV và NTG càng kéo dài thì tỷ lệ sống sót của bào tử A. niger A45.1 càng giảm mạnh. Ở thời điểm 120 phút, tỷ lệ sống sót giảm xuống mức tối ưu cho việc xuất hiện các biến dị có lợi ($0,1%$ đến $1%$).
• Chọn lọc chủng đột biến GA15: Trong số các chủng đột biến thu được, chủng ký hiệu Aspergillus niger GA15 thể hiện hoạt tính phân giải tinh bột và cellulose cao nhất.
• Tính ổn định qua các thế hệ: Kiểm tra hoạt tính qua 5 thế hệ nuôi cấy liên tục cho thấy chủng GA15 duy trì khả năng sinh enzyme ổn định.

Chủng vi sinh vật	Hoạt tính $\alpha$-amylase (U/g)	Hoạt tính Glucoamylase (U/g)	Hoạt tính Cellulase (U/g)	So sánh với chủng dại
A. niger A45.1 (chủng dại)	25,41	17,04	12,23	Gốc (1,0 lần)
A. niger GA15 (chủng đột biến)	50,12	37,45	23,28	$\alpha$-amylase $\times 1,97$; Glucoamylase $\times 2,20$; Cellulase $\times 1,90$

• Kết quả tối ưu hóa các điều kiện lên men xốp chủng GA15:
  • Loại cơ chất: Cám mì là cơ chất thích hợp nhất cho sinh tổng hợp cả 3 loại enzyme (vượt trội hơn cám gạo, vỏ trấu, mùn cưa).
  • Độ ẩm cơ chất: Độ ẩm tối ưu là $50%$. Độ ẩm quá thấp làm hạn chế sự hòa tan dưỡng chất; độ ẩm quá cao làm bết dính cơ chất, giảm độ xốp và giảm sự khuếch tán oxy.
  • Nhiệt độ lên men: Thích hợp nhất ở $30^\circ\text{C}$.
  • pH ban đầu: Giá trị pH thích hợp của môi trường là 5,5.
  • Thời gian lên men: Đạt cực đại sau 5 ngày nuôi cấy.
  • Tuổi giống: Giống nuôi cấy 2 ngày tuổi cho hoạt tính sinh tổng hợp tốt nhất.
  • Nguồn bổ sung carbon và nitơ: Bổ sung $1%$ glucose và $1%$ ure kích thích mạnh nhất quá trình sinh tổng hợp đa enzyme.

Thông số công nghệ	Điều kiện tối ưu	Hoạt tính $\alpha$-amylase (U/g)	Hoạt tính Glucoamylase (U/g)	Hoạt tính Cellulase (U/g)
Trước tối ưu	Cám gạo, ẩm 30%, $30^\circ\text{C}$, pH 4,5, 5 ngày	25,41	17,04	12,23
Sau tối ưu	Cám mì, ẩm 50%, $30^\circ\text{C}$, pH 5,5, 5 ngày, giống 2 ngày tuổi, 1% glucose, 1% ure	76,75	50,00	40,11
Hệ số tăng	—	Tăng 2,00 lần	Tăng 1,90 lần	Tăng 3,30 lần

4.2. Xử lý bã sắn thành thức ăn chăn nuôi bằng đường hóa và lên men đồng thời

• Thành phần bã sắn tươi: Chứa hàm lượng ẩm cao ($80-85%$), tính theo VCK có tinh bột thừa ($45-55%$), xơ thô cao ($15-20%$), protein thô rất thấp ($2,1-3,5%$) và độc tố HCN tồn dư.
• Tối ưu hóa quá trình đường hóa và lên men đồng thời (SSCF):
  • Tỷ lệ phối trộn: $30%$ bã sắn tươi trong nước, bổ sung $8%$ dịch đa enzyme thô từ chủng GA15.
  • Chế phẩm probiotic: Bổ sung $0,5%$ hỗn hợp (S. cerevisiae, Lactobacillus sp., Bacillus sp. mật độ $10^7\text{ CFU/g}$ mỗi loại).
  • Nguồn nitơ vô cơ: Bổ sung $1,0%\text{ }(NH_4)_2SO_4$ cho hiệu quả chuyển hóa protein cao nhất.
  • Thời gian lên men thích hợp: 48 giờ.

Chỉ tiêu phân tích	Bã sắn tươi không lên men	Bã sắn sau đường hóa & lên men (BSLM)	Mức độ biến đổi
Protein thô (% VCK)	2,80	20,44	Tăng 7,3 lần
Protein thực (% VCK)	2,10	11,55	Tăng 5,5 lần
Nồng độ độc tố HCN	Cao	$1,4\text{ g/kg}$ (giảm sâu)	Đạt ngưỡng an toàn
Hàm lượng acid hữu cơ	Thấp	Tăng gấp 5,9 lần	pH giảm xuống 3,7
Aflatoxin $B_1$	—	Không phát hiện	Đảm bảo an toàn sinh học
Cảm quan	Nhạt màu, dễ ôi chua thối	Màu vàng tương đỗ, mùi thơm lên men, chua dịu	Cải thiện rõ rệt

4.3. Ảnh hưởng của việc sử dụng bã sắn lên men trong khẩu phần đến năng suất và chất lượng thịt lợn F1

• Hiệu quả sinh trưởng và tiêu tốn thức ăn: Khảo sát trên 144 lợn thịt $F_1$ (Landrace $\times$ Yorkshire) ở giai đoạn từ $20\text{ kg}$ đến xuất chuồng cho thấy lô sử dụng $20%$ BSLM trong khẩu phần đạt kết quả cao nhất:
  • Tăng trọng bình quân ngày (ADG) ở giai đoạn 1 tăng $8,97%$ và giai đoạn 2 tăng $34,46%$ so với lô đối chứng không ăn BSLM.
  • Hệ số chuyển hóa thức ăn (FCR) đạt 2,10 ở giai đoạn 1 và 2,45 ở giai đoạn 2.
• Năng suất thân thịt: Lô ăn $20%$ BSLM có khối lượng móc hàm tăng $11,15%$ và khối lượng thịt xẻ tăng $11,19%$ so với lô đối chứng.
• Chất lượng thịt: Sử dụng BSLM không làm thay đổi tiêu cực đến tỷ lệ mỡ giắt, độ dày mỡ lưng, diện tích cơ thăn, pH thịt sau giết mổ cũng như thành phần hóa học cơ bản (protein, lipid, khoáng) của thịt lợn.

Phần 5: Kết luận và kiến nghị

Tổng kết toàn bộ 4 kết luận chính tương ứng với các mục tiêu nghiên cứu và đưa ra 2 kiến nghị nhằm mở rộng phạm vi ứng dụng chế phẩm đa enzyme trên các nguồn phế phụ phẩm khác cũng như tính toán bài toán kinh tế ở quy mô lớn hơn.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

1. Về mặt khoa học và tạo giống: Đã ứng dụng phương pháp đột biến thực nghiệm kết hợp đồng thời tác nhân vật lý (tia UV) và tác nhân hóa học (NTG) trên chủng nấm sợi hoang dại Aspergillus niger A45.1, tạo ra thành công chủng đột biến Aspergillus niger GA15 có hoạt tính sinh tổng hợp đa enzyme ($\alpha$-amylase, glucoamylase, cellulase) cao vượt trội (tăng lần lượt 1,97; 2,20 và 1,90 lần so với chủng dại) và ổn định qua nhiều thế hệ nuôi cấy.
2. Về mặt công nghệ sinh học và dinh dưỡng vật nuôi: Đã xây dựng được quy trình công nghệ tối ưu hóa điều kiện lên men xốp sản xuất chế phẩm đa enzyme thô; đồng thời thiết lập quy trình công nghệ đường hóa và lên men đồng thời (SSCF) xử lý bã sắn tươi thành công thành thức ăn chăn nuôi chất lượng cao (protein thô tăng 7,3 lần; protein thực tăng 5,5 lần; acid hữu cơ tăng 5,9 lần; giảm thiểu độc tố HCN và không chứa độc tố aflatoxin $B_1$).
3. Về mặt ứng dụng thực tiễn chăn nuôi: Xác định được mức bổ sung $20%$ bã sắn lên men vào khẩu phần ăn của lợn thịt $F_1$ (Landrace $\times$ Yorkshire) giúp nâng cao tốc độ sinh trưởng (ADG tăng tới $34,46%$ ở giai đoạn 2), cải thiện hiệu quả sử dụng thức ăn (FCR đạt 2,10–2,45), tăng khối lượng thịt xẻ ($11,19%$) mà không ảnh hưởng tiêu cực đến chất lượng và phẩm cấp thịt.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Thử nghiệm mở rộng ứng dụng chế phẩm đa enzyme thô từ chủng đột biến A. niger GA15 để lên men xử lý các nguồn phụ phẩm nông nghiệp giàu tinh bột và chất xơ khác (như bã dong riềng, bã mía, rơm rạ, vỏ trấu) làm thức ăn cho các đối tượng gia súc, gia cầm và thủy sản.
• Triển khai sản xuất thử nghiệm ở quy mô công nghiệp lớn hơn (pilot và trang trại quy mô lớn) nhằm hạch toán đầy đủ hiệu quả kinh tế, chi phí năng lượng và khả năng thương mại hóa quy trình chế biến bã sắn lên men trong chuỗi cung ứng thức ăn chăn nuôi.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Phạm vi thu thập cơ chất bã sắn tươi mới tập trung tại khu vực xã Cát Quế, huyện Hoài Đức, thành phố Hà Nội; chưa tiến hành so sánh đối chứng với các nguồn bã sắn từ các vùng sinh thái và các giống sắn công nghiệp khác nhau trên cả nước.
• Quy trình lên men xốp sản xuất enzyme thô và thử nghiệm đường hóa - lên men đồng thời bã sắn chủ yếu được thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm và quy mô bán bán công nghiệp tại Trung tâm Giống lợn chất lượng cao; chưa khảo sát đầy đủ biến thiên động học trong các bồn lên men cơ khí hóa quy mô lớn hàng chục tấn/mẻ.
• Thử nghiệm động vật mới đánh giá trên đàn lợn lai thương phẩm $F_1$ (Landrace $\times$ Yorkshire) giai đoạn từ $20\text{ kg}$ đến xuất bán; chưa đánh giá tác động kéo dài trên lợn nái sinh sản hoặc các đối tượng vật nuôi khác.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo

• Nghiên cứu giải mã trình tự gen hoặc phân tích biểu hiện gen của chủng đột biến Aspergillus niger GA15 để làm sáng tỏ các sai hỏng di truyền ở mức độ phân tử dẫn đến sự gia tăng hoạt tính cùng lúc của cả 3 cụm gen mã hóa $\alpha$-amylase, glucoamylase và cellulase.
• Nghiên cứu công nghệ tạo hạt, sấy phun hoặc cố định enzyme để kéo dài thời gian bảo quản chế phẩm đa enzyme thô ở điều kiện nhiệt độ thường.
• Mở rộng khảo nghiệm trên các giống lợn ngoại thuần, lợn bản địa, gia cầm và gia súc nhai lại với các công thức khẩu phần phối trộn bã sắn lên men đa dạng.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo có giá trị ứng dụng cho nhiều nhóm đối tượng:

1. Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên ngành Chăn nuôi, Công nghệ sinh học:

   • Cung cấp dữ liệu thực nghiệm chuẩn xác về phương pháp gây đột biến phối hợp tác nhân vật lý - hóa học (UV + NTG) trên nấm sợi.
   • Tài liệu tham khảo về phương pháp tối ưu hóa đơn biến quá trình lên men bề mặt rắn (SSF) và kỹ thuật định lượng hoạt tính đa enzyme bằng phương pháp DNS.
   • Cung cấp mô hình phân tích ảnh hưởng tương tác giữa khẩu phần ăn, mức bổ sung phụ phẩm lên men và tính biệt lên các chỉ tiêu năng suất thân thịt (LSM) của lợn.

2. Đối với các doanh nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi và cơ sở chế biến tinh bột sắn:

   • Cung cấp thông số kỹ thuật để xây dựng quy trình công nghệ đường hóa và lên men đồng thời (SSCF) bã sắn tại chỗ, giải quyết bài toán ô nhiễm môi trường và giảm chi phí xử lý chất thải rắn.
   • Cung cấp công thức tỷ lệ bổ sung $20%$ bã sắn lên men vào khẩu phần ăn của lợn thịt nhằm giảm tỷ lệ sử dụng ngô, cám nhập khẩu, hạ giá thành sản xuất thức ăn chăn nuôi.

3. Đối với các nhà hoạch định chính sách nông nghiệp và môi trường:

   • Là căn cứ khoa học thực chứng để xây dựng các chương trình phát triển kinh tế tuần hoàn trong nông nghiệp, tận thu và nâng cao giá trị gia tăng của nguồn phụ phẩm nông nghiệp theo định hướng phát triển ngành chăn nuôi đến năm 2030 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Chủng đột biến Aspergillus niger GA15 được tạo ra bằng phương pháp nào và hoạt tính enzyme tăng bao nhiêu so với chủng gốc?

Chủng A. niger GA15 được tạo ra từ chủng hoang dại A. niger A45.1 bằng phương pháp gây đột biến ngẫu nhiên phối hợp đồng thời tác nhân hóa học NTG ($100\text{ mg/ml}$) và tác nhân vật lý tia UV ($50\text{ W}$, cự ly $30\text{ cm}$) trong thời gian xử lý 120 phút. So với chủng dại A45.1, chủng đột biến GA15 có hoạt tính $\alpha$-amylase cao gấp 1,97 lần, glucoamylase cao gấp 2,20 lần và cellulase cao gấp 1,90 lần.

2. Các thông số công nghệ tối ưu cho quá trình lên men xốp của chủng Aspergillus niger GA15 là gì?

Điều kiện lên men xốp tối ưu được xác định gồm: cơ chất cám mì, độ ẩm ban đầu $50%$, nhiệt độ lên men $30^\circ\text{C}$, pH ban đầu 5,5, thời gian lên men 5 ngày, tuổi giống cấy 2 ngày, bổ sung $1%$ glucose và $1%$ ure. Tại điều kiện này, hoạt tính $\alpha$-amylase đạt $76,75\text{ U/g}$, glucoamylase đạt $50,00\text{ U/g}$ và cellulase đạt $40,11\text{ U/g}$ (tăng lần lượt 2,0; 1,9 và 3,3 lần so với điều kiện chưa tối ưu).

3. Thành phần dinh dưỡng và độc tố của bã sắn thay đổi như thế nào sau quá trình đường hóa và lên men đồng thời?

Sau 48 giờ đường hóa và lên men đồng thời với tỷ lệ $30%$ bã sắn tươi, $8%$ chế phẩm đa enzyme thô, $0,5%$ probiotic và $1%\text{ }(NH_4)_2SO_4$, chất lượng bã sắn được nâng cao rõ rệt: hàm lượng protein thô tăng 7,3 lần (đạt $20,44%\text{ VCK}$), protein thực tăng 5,5 lần (đạt $11,55%\text{ VCK}$), hàm lượng acid hữu cơ tăng 5,9 lần, pH giảm xuống 3,7. Đồng thời, độc tố HCN giảm mạnh xuống còn $1,4\text{ g/kg}$, không phát hiện độc tố aflatoxin $B_1$, sản phẩm có màu vàng tương đỗ và mùi thơm chua nhẹ.

4. Mức sử dụng bã sắn lên men nào cho hiệu quả chăn nuôi lợn thịt F1 tốt nhất?

Mức bổ sung $20%$ bã sắn lên men vào khẩu phần ăn đem lại hiệu quả cao nhất: tăng trọng bình quân ngày (ADG) tăng $8,97%$ ở giai đoạn 1 và tăng $34,46%$ ở giai đoạn 2 so với lô đối chứng; hệ số tiêu tốn thức ăn (FCR) đạt 2,10 (giai đoạn 1) và 2,45 (giai đoạn 2); khối lượng móc hàm tăng $11,15%$ và khối lượng thịt xẻ tăng $11,19%$, trong khi không làm ảnh hưởng đến các chỉ tiêu chất lượng và thành phần hóa học của thịt lợn.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Dương Thu Hương đã giải quyết trọn vẹn vấn đề nâng cao giá trị dinh dưỡng của phụ phẩm bã sắn thông qua việc kết hợp công nghệ enzyme và vi sinh vật học. Đề tài đã tạo ra chủng đột biến Aspergillus niger GA15 có khả năng sinh tổng hợp đồng thời hệ đa enzyme ($\alpha$-amylase, glucoamylase, cellulase) với hoạt tính cao, đồng thời xác lập các thông số lên men xốp tối ưu trên cơ chất phụ phẩm nông nghiệp. Quy trình đường hóa và lên men đồng thời đã chuyển hóa bã sắn tươi thành nguồn thức ăn chăn nuôi giàu protein, giảm thiểu độc tố cyanogenic và nâng cao rõ rệt năng suất sinh trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn ở lợn thịt $F_1$. Công trình đóng góp cơ sở dữ liệu thực nghiệm quan trọng cho lĩnh vực chăn nuôi và công nghệ sinh học nông nghiệp tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM DƯƠNG THU HƯƠNG NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHỦNG NẤM SỢI VÀ TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SẢN XUẤT ĐA ENZYME (α-AMYLASE, GLUCOAMYLASE, CELLULASE) ỨNG DỤNG TRONG CHẾ BIẾN THỨC ĂN CHĂN NUÔI LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM DƯƠNG THU HƯƠNG NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHỦNG NẤM SỢI VÀ TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SẢN XUẤT ĐA ENZYME (α-AMYLASE, GLUCOAMYLASE, CELLULASE) ỨNG DỤNG TRONG CHẾ BIẾN THỨC ĂN CHĂN NUÔI Chuyên ngành : Chăn nuôi Mã số : 9.05 Người hướng dẫn khoa học: 1. Phạm Kim Đăng HÀ NỘI - 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày… tháng… năm… Tác giả luận án Dương Thu Hương i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.

Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. Vũ Văn Hạnh và PGS. Phạm Kim Đăng đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Sinh lý - tập tính động vật, Khoa Chăn nuôi, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức phòng Các chất chức năng sinh học, Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm và Khoa học công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án. Hà Nội, ngày. Nghiên cứu sinh Dương Thu Hương ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình ix Trích Yếu Luận Án x Thesis abstract xii PHẦN 1.

Tính cấp thiết của đề tài 1 1. Mục tiêu của đề tài 2 1. Mục tiêu chung 2 1. Mục tiêu cụ thể 2 1.

Phạm vi nghiên cứu 2 1. Đối tượng nghiên cứu 2 1. Địa điểm nghiên cứu 2 1. Thời gian nghiên cứu 3 1.

Những đóng góp mới của đề tài 3 1. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3 1. Ý nghĩa khoa học 3 1. Ý nghĩa thực tiễn 3 PHẦN 2.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2. Tổng quát về enzyme amylase và cellulase 4 2. Nguồn thu nhận enzyme 6 2. Tổng quan về nấm sợi Aspergillus niger 7 2.

Cải tiến chủng vi sinh vật và lên men sản xuất enzyme 10 2. Sự cần thiết phải cải tiến các chủng vi sinh vật 10 2. Phương pháp cải tiến chủng vi sinh vật để tăng sản xuất enzyme 10 2. Lên men sản xuất enzyme 13 iii 2.

Sự cần thiết phải tối ưu môi trường lên men 19 2. Thành tựu về cải tiến chủng và tối ưu môi trường lên men sản xuất amylase và cellulase 19 2. Tình hình sản xuất và sử dụng enzyme trong chăn nuôi 20 2. Nghiên cứu và sử dụng enzyme trong chăn nuôi trên thế giới 20 2.

Nghiên cứu và sử dụng enzyme trong chăn nuôi ở Việt Nam 24 2. Sử dụng thức ăn lên men trong chăn nuôi 26 2. Đặc tính và vai trò của các vi sinh vật sử dụng trong lên men thức ăn chăn nuôi 26 2. Các vi sinh vật sử dụng trong lên men thức ăn 27 2.

Hiệu quả của sử dụng thức ăn lên men trong chăn nuôi 27 2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng bã sắn trong chăn nuôi 28 PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 3. Nội dung nghiên cứu 31 3.

Phương pháp nghiên cứu 31 3. Gây đột biến chủng Aspergillus niger A45.1 và tối ưu điều kiện lên men chủng nấm sợi đột biến chọn lọc để sinh tổng hợp đa enzyme (α- amylase, glucoamylase và cellulase) cao 31 3. Xử lý bã sắn thành thức ăn chăn nuôi bằng bằng công nghệ đường hóa và lên men đồng thời 36 3. Đánh giá ảnh hưởng của việc sử dụng bã sắn lên men trong khẩu phần ăn đến năng suất chăn nuôi lợn thịt 38 3.

Xử lý số liệu 41 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 4. Gây đột biến chủng Aspergillus niger a45.1 và tối ưu điều kiện lên men chủng đột biến chọn lọc cho sinh tổng hợp đa enzyme (α-amylase, glucoamylase và cellulase) cao 43 4. Ảnh hưởng của tia UV và NTG đến khả năng sống sót của chủng nấm sợi Aspergillus niger A45.

Hoạt tính enzyme của các các chủng đột biến 47 4. Tính ổn định của các chủng đột biến chọn lọc 50 iv 4. Tối ưu điều kiện lên men xốp chủng nấm đột biến chọn lọc cho sinh tổng hợp đa enzyme (glucoamylase, α-amylase, cellulase) 51 4. Xử lý bã sắn thành thức ăn chăn nuôi bằng đường hóa và lên men đồng thời 64 4.

Thành phần hóa học của bã sắn tươi 64 4. Tối ưu thời gian đường hóa bã sắn 68 4. Đường hóa và lên men đồng thời bã sắn bằng enzyme và vi sinh vật 69 4. Đánh giá chất lượng của bã sắn sau lên men 72 4.

Ảnh hưởng của bã sắn lên men trong chăn nuôi lợn thịt 75 4. Ảnh hưởng của bã sắn lên men đến khả năng sinh trưởng và chuyển hóa thức ăn của lợn F1 (Landrace x Yorkshire) 75 4. Ảnh hưởng của tương tác giữa khẩu phần ăn và tính biệt đến khả năng sinh trưởng của lợn F1 (LandracexYorkshire) 79 4. Ảnh hưởng của mức sử dụng BSLM đến năng suất thân thịt của lợn thịt F1 (Landrace x Yorkshire) 81 4.

Ảnh hưởng của mức sử dụng BSLM đến chất lượng thịt và thành phần hóa học của thịt lợn F1 (Landrace x Yorkshire) 84 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 90 5. Kiến nghị 91 Danh mục các công trình công bố liên quan đến luận án 92 Tài liệu tham khảo 92 Phụ lục 108 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt ADF (Acid detergent fiber) Xơ không hòa tan trong axit ADG (Average daily gain) Tăng trọng bình quân hàng ngày ADN Axit deoxyribonucleic ARN Axit ribonucleic Aspergillus A. BQ Bảo quản BSLM Bã sắn lên men CB Chế biến cs.

Cộng sự CMCase Carboxymethyl cellulase DNS 3,5 dinitrosalysilic ĐC Đối chứng ĐVT Đơn vị tính FCR (Feed conversion ratio) Hệ số chuyển hóa thức ăn KL Khối lượng LSM (Least Square Mean) Trung bình bình phương nhỏ nhất LY Landrace x Yorkshire NDF (Neutral Detergent Fiber) Xơ không tan trong dung dịch trung tính NLTĐ Năng lượng trao đổi NRC (National Research Council) Hội đồng nghiên cứu Quốc gia NTG N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine PDA Potatose Dextrose Agar SE (Standard error) Sai số tiêu chuẩn SmF (submerged fermentation) Lên men chìm SSF (Solid state fermentation) Lên men xốp TACN Thức ăn chăn nuôi TN Thí nghiệm U Unit UV Ultraviolet VCK Vật chất khô vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2. Một số enzyme công nghiệp và nguồn vi sinh vật sản xuất enzyme 7 2. Các tác nhân gây đột biến để phát triển chủng 12 3. Xác định hoạt tính enzyme 34 3.

Sơ đồ bố trí thí nghiệm 39 3. Thành phần và giá trị dinh dưỡng khẩu phần thí nghiệm 39 4. Hoạt tính enzyme của các chủng đột biến 47 4. Hoạt tính α-amylase, glucoamylase và cellulase của chủng đột biến Aspergillus niger GA15 qua các thế hệ nuôi cấy 50 4.

Ảnh hưởng của loại cơ chất đến khả năng sản xuất enzyme của chủng đột biến Aspergillus niger GA15 51 4. Hoạt tính enzyme của chủng đột biến Aspergillus niger GA15 ở các độ ẩm cơ chất khác nhau 53 4. Hoạt tính enzyme của chủng đột biến Aspergillus niger GA15 ở các nhiệt độ lên men khác nhau 55 4. Hoạt tính enzyme của chủng Aspergillus niger GA15 trên môi trường có pH khác nhau 57 4.

Hoạt tính enzyme của chủng Aspergillus niger GA15 khi lên men xốp ở các thời gian khác nhau 58 4. Hoạt tính enzyme của chủng Aspergillus niger GA15 khi lên men với các tuổi giống khác nhau 60 4. Hoạt tính enzyme của chủng Aspergillus niger GA15 khi bổ sung các nguồn carbon khác nhau vào môi trường lên men xốp 61 4. Hoạt tính enzyme của chủng Aspergillus niger GA15 khi bổ sung các nguồn nitơ khác nhau vào môi trường lên men xốp 62 4.

Thành phần hóa học của bã sắn tươi 64 4. Hàm lượng đường khử, tinh bột và xơ của bã sắn ở các nồng độ enzyme khác nhau 67 4. Hàm lượng đường khử khi đường hóa bã sắn ở thời gian khác nhau 68 4. Hàm lượng Protein của bã sắn sau lên men khi bổ sung (NH4)2SO4 ở các nồng độ khác nhau 70 vii 4.

Hàm lượng protein thực ở các thời điểm lên men khác nhau (n=3) 71 4. Thành phần dinh dưỡng và cảm quan của bã sắn lên men và không lên men 73 4. Ảnh hưởng của mức sử dụng BSLM đến sinh trưởng và chuyển hóa thức ăn của lợn thí nghiệm 76 4. Ảnh hưởng tương tác giữa khẩu phần với các mức sử dụng BSLM và tính biệt đến khả năng sinh trưởng của lợn F1 (LxY) giai đoạn từ 20 kg đến xuất bán 80 4.

Ảnh hưởng của mức sử dụng BSLM trong khẩu phần đến năng suất thân thịt của lợn F1 (Landrace x Yorkshire) 81 4. Ảnh hưởng tương tác giữa khẩu phần với các mức sử dụng BSLM và tính biệt đến năng suất thân thịt (LSM) của lợn F1(LandracexYorkshire) 83 4. Ảnh hưởng của mức sử dụng BSLM trong khẩu phần đến chất lượng thịt (LSM) của lợn F1(LandracexYorkshire) 84 4. Ảnh hưởng tương tác giữa khẩu phần với các mức sử dụng BSLM và tính biệt đến chất lượng thịt (LSM) của lợn F1(LandracexYorkshire) 87 4.

Ảnh hưởng của mức sử dụng BSLM trong khẩu phần đến thành phần hoá học (LSM) thịt lợn F1(LandracexYorkshire) 88 4. Ảnh hưởng tương tác giữa khẩu phần với các mức sử dụng BSLM và tính biệt đến thành phần hoá học (LSM) của thịt lợn F1(LandracexYorkshire) 88 viii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 4. Giống hoạt hóa sau 5 ngày (A), 10 ngày (B) và 15 ngày (C) 43 4.