Luận án tiến sĩ nghiên cứu phát triển chủng nấm sợi và tối ưu điều kiện lên men sản xuất đa enzyme αamylase glucoamylase cellulase ứng dụng trong chế biến thức ăn chăn nuôi

Nghiên cứu phát triển chủng nấm sợi và tối ưu điều kiện lên men sản xuất enzyme αamylase, glucoamylase, cellulase trong chế biến thức ăn chăn nuôi.

• Tác giả: Dương Thu Hương
• Người hướng dẫn: PGS. Vũ Văn Hạnh
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Chăn nuôi
• Đề tài: Nghiên Cứu Phát Triển Chủng Nấm Sợi và Tối Ưu Điều Kiện Lên Men Sản Xuất Đa Enzyme Ứng Dụng Trong Chế Biến Thức Ăn Chăn Nuôi
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 1.1. Mục tiêu của đề tài
• 1.1.1. Mục tiêu chung
• 1.1.2. Mục tiêu cụ thể
• 1.2. Phạm vi nghiên cứu
• 1.2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 1.2.2. Địa điểm nghiên cứu
• 1.2.3. Thời gian nghiên cứu
• 1.3. Những đóng góp mới của đề tài
• 1.3.1. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 1.3.1.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.3.1.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tổng quát về enzyme amylase và cellulase
• 2.2. Nguồn thu nhận enzyme
• 2.3. Tổng quan về nấm sợi Aspergillus niger
• 2.4. Cải tiến chủng vi sinh vật và lên men sản xuất enzyme
• 2.4.1. Sự cần thiết phải cải tiến các chủng vi sinh vật
• 2.4.2. Phương pháp cải tiến chủng vi sinh vật để tăng sản xuất enzyme
• 2.4.3. Lên men sản xuất enzyme
• 2.5. Sự cần thiết phải tối ưu môi trường lên men
• 2.6. Thành tựu về cải tiến chủng và tối ưu môi trường lên men sản xuất amylase và cellulase
• 2.7. Tình hình sản xuất và sử dụng enzyme trong chăn nuôi
• 2.7.1. Nghiên cứu và sử dụng enzyme trong chăn nuôi trên thế giới
• 2.7.2. Nghiên cứu và sử dụng enzyme trong chăn nuôi ở Việt Nam
• 2.8. Sử dụng thức ăn lên men trong chăn nuôi
• 2.8.1. Đặc tính và vai trò của các vi sinh vật sử dụng trong lên men thức ăn chăn nuôi
• 2.8.2. Các vi sinh vật sử dụng trong lên men thức ăn
• 2.8.3. Hiệu quả của sử dụng thức ăn lên men trong chăn nuôi
• 2.9. Tình hình nghiên cứu và sử dụng bã sắn trong chăn nuôi
• 3. PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Nội dung nghiên cứu
• 3.2. Phương pháp nghiên cứu
• 3.2.1. Gây đột biến chủng Aspergillus niger A45.1 và tối ưu điều kiện lên men chủng nấm sợi đột biến chọn lọc để sinh tổng hợp đa enzyme (α-amylase, glucoamylase và cellulase) cao
• 3.2.2. Xử lý bã sắn thành thức ăn chăn nuôi bằng bằng công nghệ đường hóa và lên men đồng thời
• 3.2.3. Đánh giá ảnh hưởng của việc sử dụng bã sắn lên men trong khẩu phần ăn đến năng suất chăn nuôi lợn thịt
• 3.2.4. Xử lý số liệu
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Gây đột biến chủng Aspergillus niger a45.1 và tối ưu điều kiện lên men chủng đột biến chọn lọc cho sinh tổng hợp đa enzyme (α-amylase, glucoamylase và cellulase) cao
• 4.2. Ảnh hưởng của tia UV và NTG đến khả năng sống sót của chủng nấm sợi Aspergillus niger A45. Hoạt tính enzyme của các các chủng đột biến
• 4.3. Tính ổn định của các chủng đột biến chọn lọc
• 4.4. Tối ưu điều kiện lên men xốp chủng nấm đột biến chọn lọc cho sinh tổng hợp đa enzyme (glucoamylase, α-amylase, cellulase)
• 4.5. Xử lý bã sắn thành thức ăn chăn nuôi bằng đường hóa và lên men đồng thời
• 4.5.1. Thành phần hóa học của bã sắn tươi
• 4.5.2. Tối ưu thời gian đường hóa bã sắn
• 4.5.3. Đường hóa và lên men đồng thời bã sắn bằng enzyme và vi sinh vật
• 4.5.4. Đánh giá chất lượng của bã sắn sau lên men
• 4.6. Ảnh hưởng của bã sắn lên men trong chăn nuôi lợn thịt
• 4.6.1. Ảnh hưởng của bã sắn lên men đến khả năng sinh trưởng và chuyển hóa thức ăn của lợn F1 (Landrace x Yorkshire)
• 4.6.2. Ảnh hưởng của tương tác giữa khẩu phần ăn và tính biệt đến khả năng sinh trưởng của lợn F1 (LandracexYorkshire)
• 4.6.3. Ảnh hưởng của mức sử dụng BSLM đến năng suất thân thịt của lợn thịt F1 (Landrace x Yorkshire)
• 4.6.4. Ảnh hưởng của mức sử dụng BSLM đến chất lượng thịt và thành phần hóa học của thịt lợn F1 (Landrace x Yorkshire)
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• 5.1. Kiến nghị
• Danh mục các công trình công bố liên quan đến luận án
• Tài liệu tham khảo
• Phụ lục

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu phát triển chủng nấm sợi và enzyme

Nghiên cứu phát triển chủng nấm sợi và tối ưu điều kiện lên men sản xuất đa enzyme là một lĩnh vực quan trọng trong chế biến thức ăn chăn nuôi. Chủng nấm sợi, đặc biệt là Aspergillus niger, đã được chứng minh có khả năng sản xuất các enzyme như α-amylase, glucoamylase và cellulase. Những enzyme này đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện khả năng tiêu hóa và hấp thu dinh dưỡng của động vật. Việc tối ưu hóa điều kiện lên men không chỉ giúp tăng năng suất enzyme mà còn nâng cao giá trị dinh dưỡng của thức ăn chăn nuôi.

1.1. Tầm quan trọng của enzyme trong chế biến thức ăn chăn nuôi

Enzyme như α-amylase và cellulase giúp phân giải tinh bột và xơ, từ đó cải thiện khả năng tiêu hóa của động vật. Việc sử dụng enzyme trong thức ăn chăn nuôi không chỉ tăng cường sức khỏe mà còn nâng cao hiệu quả sản xuất.

1.2. Các loại nấm sợi và ứng dụng của chúng

Nấm sợi như Aspergillus niger được sử dụng rộng rãi trong sản xuất enzyme. Chúng có khả năng sinh trưởng nhanh và sản xuất enzyme với hoạt tính cao, giúp tối ưu hóa quy trình chế biến thức ăn.

II. Vấn đề và thách thức trong sản xuất enzyme từ nấm sợi

Mặc dù có nhiều lợi ích, việc sản xuất enzyme từ nấm sợi vẫn gặp phải một số thách thức. Các yếu tố như điều kiện môi trường, loại cơ chất và thời gian lên men đều ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme. Việc tối ưu hóa các yếu tố này là cần thiết để đạt được hiệu quả cao nhất trong sản xuất enzyme.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme

Nhiệt độ, pH và độ ẩm là những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme. Việc điều chỉnh các yếu tố này có thể giúp tăng cường sản xuất enzyme từ nấm sợi.

2.2. Thách thức trong việc tối ưu hóa quy trình lên men

Quá trình tối ưu hóa quy trình lên men thường gặp khó khăn do sự biến đổi của các yếu tố môi trường. Cần có các nghiên cứu sâu hơn để tìm ra phương pháp tối ưu nhất cho từng loại nấm và cơ chất.

III. Phương pháp tối ưu hóa điều kiện lên men sản xuất enzyme

Để tối ưu hóa điều kiện lên men, các nghiên cứu đã áp dụng nhiều phương pháp khác nhau. Việc sử dụng các công nghệ hiện đại như lên men xốp và lên men chìm giúp tăng cường hiệu quả sản xuất enzyme. Các nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng việc kết hợp các loại cơ chất khác nhau có thể nâng cao hoạt tính enzyme.

3.1. Công nghệ lên men xốp và ứng dụng

Lên men xốp là một phương pháp hiệu quả để sản xuất enzyme từ nấm sợi. Phương pháp này cho phép kiểm soát tốt các yếu tố môi trường, từ đó tối ưu hóa hoạt tính enzyme.

3.2. Kết hợp các loại cơ chất trong lên men

Việc sử dụng hỗn hợp cơ chất như cám mì và bã sắn có thể tạo ra môi trường tối ưu cho sự phát triển của nấm và sản xuất enzyme. Nghiên cứu cho thấy sự kết hợp này giúp tăng cường hoạt tính enzyme đáng kể.

IV. Ứng dụng thực tiễn của enzyme trong chế biến thức ăn chăn nuôi

Enzyme sản xuất từ nấm sợi đã được ứng dụng rộng rãi trong chế biến thức ăn chăn nuôi. Việc sử dụng enzyme không chỉ cải thiện chất lượng thức ăn mà còn nâng cao hiệu quả chăn nuôi. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc bổ sung enzyme vào khẩu phần ăn giúp tăng trưởng nhanh hơn và giảm chi phí thức ăn.

4.1. Tác động của enzyme đến hiệu suất chăn nuôi

Sử dụng enzyme trong khẩu phần ăn đã chứng minh làm tăng tốc độ sinh trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn. Các nghiên cứu cho thấy lợn được cho ăn thức ăn có bổ sung enzyme có trọng lượng cao hơn so với nhóm đối chứng.

4.2. Cải thiện chất lượng thức ăn chăn nuôi

Enzyme giúp cải thiện giá trị dinh dưỡng của thức ăn, từ đó nâng cao sức khỏe và khả năng sinh sản của động vật. Việc sử dụng enzyme trong chế biến thức ăn chăn nuôi đã trở thành một xu hướng quan trọng trong ngành chăn nuôi hiện đại.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu phát triển chủng nấm sợi và tối ưu hóa điều kiện lên men sản xuất enzyme là một lĩnh vực đầy tiềm năng. Các kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc tối ưu hóa quy trình sản xuất enzyme có thể mang lại nhiều lợi ích cho ngành chăn nuôi. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mở ra nhiều cơ hội mới trong việc cải thiện chất lượng thức ăn chăn nuôi.

5.1. Triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu có thể mở rộng sang các loại nấm khác và các phương pháp sản xuất enzyme mới. Việc áp dụng công nghệ sinh học hiện đại sẽ giúp nâng cao hiệu quả sản xuất enzyme.

5.2. Ứng dụng enzyme trong các lĩnh vực khác

Ngoài chăn nuôi, enzyme còn có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác như thực phẩm và dược phẩm. Việc nghiên cứu và phát triển enzyme sẽ góp phần nâng cao giá trị kinh tế cho ngành nông nghiệp.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Nghiên cứu được trích xuất từ luận án tiến sĩ chuyên ngành Chăn nuôi (mã số 9 62 01 05) của nghiên cứu sinh Dương Thu Hương, thực hiện tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam năm 2022 dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Phạm Kim Đăng và PGS. Vũ Văn Hạnh, với đề tài: "Nghiên cứu phát triển chủng nấm sợi và tối ưu điều kiện lên men sản xuất đa enzyme (α-amylase, glucoamylase, cellulase) ứng dụng trong chế biến thức ăn chăn nuôi".

Về tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu, tác giả chỉ ra ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam giữ vai trò trọng yếu trong nền kinh tế nhưng chịu áp lực lớn từ chi phí thức ăn chăn nuôi cao và biến động do phụ thuộc vào nguyên liệu nhập khẩu. Trong khi đó, nguồn phụ phẩm nông nghiệp và chế biến nông sản tại Việt Nam rất lớn; riêng ngành chế biến tinh bột sắn với khoảng 100 nhà máy quy mô lớn (sản xuất 1,8–2,0 triệu tấn tinh bột/ngày) thải ra khoảng 0,6 triệu tấn chất thải rắn mỗi ngày (Nguyễn Thị Hằng Nga & cs.). Lượng bã sắn tươi này nếu không xử lý kịp thời sẽ phân hủy sinh học sau 48 giờ, tạo ra các khí gây mùi và ô nhiễm môi trường như $H_2S$, $NH_3$, $CH_4$. Việc tận dụng bã sắn làm thức ăn chăn nuôi truyền thống gặp nhiều rào cản: hàm lượng nước cao, hàm lượng protein thô rất thấp (chỉ đạt 2–3% vật chất khô theo Nguyễn Xuân Trạch, 2003 hoặc 3,6% theo Nguyễn Hữu Văn & cs., 2008), hàm lượng xơ thô cao (15–20% vật chất khô) và chứa độc tố kháng dinh dưỡng hydrogen cyanide (HCN với mức 26,9 mg/kg tươi). Các biện pháp xử lý truyền thống như phơi khô (dễ nhiễm nấm mốc, giá trị dinh dưỡng thấp) hoặc ủ chua đơn thuần (protein sau ủ chỉ đạt 3,5–5,3% vật chất khô) chưa đáp ứng được nhu cầu dinh dưỡng của gia súc. Do đó, việc ứng dụng công nghệ sinh học nhằm cải tiến chủng nấm sợi, sản xuất chế phẩm đa enzyme (phân giải tinh bột và cellulose) và lên men đồng thời cùng vi sinh vật có ích là giải pháp kỹ thuật cần thiết để nâng cao giá trị dinh dưỡng của bã sắn.

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài được xác định cụ thể như sau:

1. Mục tiêu chung: Nâng cao hiệu quả sử dụng phụ phẩm trồng trọt và chế biến nông sản bằng ứng dụng chế phẩm sinh học.
2. Mục tiêu cụ thể:
   • Mục tiêu 1: Chọn lọc được 1 dòng đột biến từ chủng nấm sợi Aspergillus niger A45.1 có khả năng sinh đa enzyme (α-amylase, glucoamylase và cellulase) với hoạt tính cao.
   • Mục tiêu 2: Tìm được điều kiện lên men xốp tối ưu cho sản xuất đa enzyme (α-amylase, glucoamylase và cellulase) của dòng đột biến chọn lọc.
   • Mục tiêu 3: Đánh giá được hiệu quả của việc sử dụng chế phẩm đa enzyme (α-amylase, glucoamylase và cellulase) trong chế biến bã sắn làm thức ăn chăn nuôi lợn thịt.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu bao gồm:

• Đối tượng nghiên cứu: Chủng nấm sợi Aspergillus niger A45.1 (thu nhận từ bộ giống của Phòng Các chất chức năng Sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam); bã sắn tươi thu gom trực tiếp từ các cơ sở chế biến tinh bột tại xã Cát Quế, huyện Hoài Đức, Hà Nội; 144 lợn lai $F_1$ (Landrace $\times$ Yorkshire) gồm 72 lợn cái và 72 lợn đực thiến ở giai đoạn từ 20 kg đến xuất chuồng.
• Địa điểm nghiên cứu: Phòng Các chất chức năng sinh học (Viện Công nghệ sinh học), Phòng Thí nghiệm trung tâm và Phòng Thí nghiệm bộ môn Di truyền giống (Khoa Chăn nuôi, Học viện Nông nghiệp Việt Nam), Trung tâm Giống lợn chất lượng cao (Học viện Nông nghiệp Việt Nam).
• Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 6 năm 2015 đến tháng 6 năm 2019.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã tổng quan hệ thống cơ sở lý luận về đặc tính sinh học, cơ chế xúc tác và nguồn thu nhận của hai nhóm enzyme chính là amylase và cellulase:

• Nhóm amylase: Phân giải liên kết glucoside của polysaccharide gồm α-amylase (metalloenzyme chứa từ 1 đến 30 nguyên tử Ca/mol, phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1,4 glucoside trong amylose và amylopectin), β-amylase (thủy phân tách maltose từ đầu không khử) và γ-amylase hay glucoamylase (EC 3.2.1.3, cắt liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside từ đầu không khử tạo sản phẩm cuối là glucose, hoạt động tối ưu ở pH 3–5) theo Singh & cs.
• Phức hệ cellulase: Phân giải liên kết β-1,4-glycosidic trong cellulose gồm Endoglucanase/CMCase (EC 3.2.1.4), Exoglucanase/Cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) và β-glucosidase (EC 3.2.1.21) theo Hameed & cs.

Về nguồn vi sinh vật và ứng dụng chủng Aspergillus niger, tác giả tổng hợp số liệu từ Schuster & cs., Nielsen & cs., Pariza & Johnson (2001), Sukumaran & cs., Devi & Kumar (2017), và Ikram-Ul-Haq & cs. A. niger có phổ nhiệt độ sinh trưởng 6–47°C (tối ưu 35–37°C), dải pH rộng 1,4–9,8, hoạt độ nước 0,88 và được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) cùng FAO/WHO công nhận đạt chuẩn an toàn GRAS đối với các chế phẩm enzyme như α-amylase, cellulase, glucoamylase. Trong nước, các nghiên cứu ứng dụng enzyme từ A. niger được điểm lại qua công trình của Hoàng Kim Anh (2012), Đặng Minh Nhật & Bùi Viết Cường (2012), Dương Thị Hương & Nguyễn Hiền Trang (2018), Đỗ Thị Hiền & Huỳnh Phan Phương Trang (2019).

Về kỹ thuật cải tiến chủng và lên men sản xuất enzyme, luận án trích dẫn các tài liệu lý thuyết và thực nghiệm của Gonzalez & cs., Pathak & cs. (1999, 2015), Prabakaran & cs., Mishra & cs., Zhao & cs., Fawzi & Hamdy (2011), Svensson & Søgaard (1993), Ghani & cs. Tác nhân vật lý (tia UV bước sóng 254 nm tạo pyrimidine dimer) và hóa học (tác nhân alkyl hóa N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine - NTG gây chuyển dịch cặp base GC sang AT) được đánh giá là công cụ hữu hiệu để nâng cao năng suất sinh tổng hợp. Về phương thức lên men, tài liệu của Singhania & cs., Pandey & cs., Subramaniyam & cs., Zambare (2010) cho thấy lên men bề mặt rắn/lên men xốp (SSF) có ưu thế vượt trội về hiệu suất sinh enzyme trên đơn vị thể tích, tận dụng được cơ chất phế phụ phẩm nông nghiệp và giảm chi phí năng lượng so với lên men chìm (SmF).

Về ứng dụng enzyme và thức ăn lên men trong chăn nuôi, tác giả tổng hợp nghiên cứu của Chapman & cs. (2021), Kuhad & cs., Bhat (2000), Karmakar & Ray (2011), Shrivastava & cs., Graham & Balnavel (2008), Pazarlioğlu & cs., Krainer & cs., Wang & cs., Tamang & cs., Mukherjee & cs., Hill & cs., Kobashi & cs. (2015), Niba & cs., Missotten & cs. (2015), Jensen & Mikkelsen (2001), Pedersen & Stein (2010), Saleh & cs. (2007), Wu & cs. (2015), Heres & cs. Cùng với định hướng của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2020), việc sử dụng thức ăn lên men giúp bổ sung lợi khuẩn, hạ pH đường tiêu hóa, giảm vi khuẩn gây bệnh ($E. coli$, Salmonella), tăng hiệu quả chuyển hóa thức ăn và cải thiện chất lượng thân thịt.

Về hiện trạng sử dụng bã sắn, tác giả phân tích các số liệu của FAOSTAT (2018), Carta & cs., Mai Thị Thơm & Bùi Quang Tuấn (2006), Nguyễn Hữu Văn & cs. (2008), Aro (2008), Trần Thị Thu Hồng & cs. (2013). Khoảng trống nghiên cứu được luận án xác định là: các nghiên cứu trước đây chủ yếu dừng lại ở việc gây đột biến đơn lẻ thu nhận từng loại enzyme riêng biệt hoặc lên men bã sắn bằng các chủng vi sinh vật tự nhiên chưa qua tối ưu, khiến hàm lượng protein sau lên men tăng không đáng kể và chưa loại bỏ triệt để các yếu tố cản trở tiêu hóa. Luận án định vị nghiên cứu vào việc kết hợp đồng thời hai tác nhân đột biến (UV và NTG) trên chủng A. niger A45.1 để tạo ra dòng nấm sợi sinh đồng thời 3 loại enzyme (α-amylase, glucoamylase, cellulase) có hoạt tính cao, tối ưu hóa quy trình lên men xốp, và ứng dụng trực tiếp chế phẩm đa enzyme này vào công nghệ đường hóa kết hợp lên men lỏng bã sắn với hệ vi sinh vật probiotic để làm thức ăn cho lợn thịt.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết sinh hóa về quá trình thủy phân polysaccharide bằng xúc tác enzyme; cơ chế biến dị di truyền nhân tạo dưới tác động phối hợp của bức xạ ion hóa/bước sóng ngắn (UV 254 nm) và tác nhân alkyl hóa (NTG); lý thuyết động học lên men vi sinh vật ở trạng thái rắn (SSF) và lỏng (SmF/LF); công nghệ đường hóa và lên men đồng thời (Simultaneous Saccharification and Fermentation - SSF); và các chỉ tiêu sinh lý - dinh dưỡng trong đánh giá năng suất, chất lượng thịt lợn theo tiêu chuẩn NRC và TCVN.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

1. Phương pháp gây đột biến và tuyển chọn chủng nấm sợi:

• Nguồn giống gốc Aspergillus niger A45.1 được nuôi cấy trong môi trường PDB ở 28°C, lắc 200 vòng/phút trong 5 ngày để thu dịch bào tử ($10^7$ bào tử/ml).
• Dịch bào tử được xử lý bằng 500 µl dung dịch NTG (100 mg/ml trong đệm citrate 0,2 M, pH 5,0) kết hợp chiếu tia UV (đèn công suất 50 W, khoảng cách 30 cm) trong các khoảng thời gian 30, 60, 90, 120 và 180 phút.
• Mẫu sau xử lý được rửa 3 lần bằng nước muối sinh lý, cấy trải trên đĩa thạch PDA bổ sung ampicillin (100 mg/l), ủ ở 30°C trong 4–6 ngày để xác định tỷ lệ sống sót, kiểm tra đường kính vòng phân giải tinh bột và xơ (CMC), và chọn lọc các thể đột biến ưu tú qua nhiều thế hệ nuôi cấy.

2. Phương pháp lên men xốp và tối ưu hóa điều kiện lên men:

• Quy trình lên men xốp: Nhân giống cấp 1 trên môi trường cám gạo dịch thể 10% (w/v) trong 3 ngày ở 30°C (lắc 200 vòng/phút). Cấy 10% giống cấp 1 vào cơ chất rắn, ủ ở nhiệt độ phòng. Chiết enzyme thô bằng cách trộn 1 g sản phẩm lên men với 9 ml nước cất vô trùng, lắc 200 vòng/phút ở 30°C trong 60 phút, ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút để thu dịch nổi.
• Tối ưu hóa đơn biến các yếu tố: cơ chất (cám mì, cám gạo, vỏ trấu, mùn cưa); độ ẩm cơ chất (20, 30, 40, 50, 60, 70%); nhiệt độ lên men (20, 25, 30, 35, 40, 45°C); pH ban đầu của cơ chất (3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0); thời gian lên men (2 đến 8 ngày); tuổi giống (1 đến 4 ngày); nguồn carbon bổ sung 1% (glucose, maltose, tinh bột gạo, sucrose); nguồn nitơ bổ sung 1% (ure, cao nấm men, tryptone, peptone, $NH_4Cl$, $NH_4NO_3$).

3. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme:

• Sử dụng phương pháp Miller (1959) định lượng hàm lượng đường khử bằng thuốc thử axit 3,5-dinitrosalicylic (DNS), đo độ hấp thụ quang (OD) tại bước sóng 540 nm.
• Xây dựng đường chuẩn Glucose (nồng độ chuẩn 0,1% tương đương 5555,56 µM) để xác định hoạt tính cellulase (cơ chất CMC 1%) và glucoamylase (cơ chất hồ tinh bột 1%).
• Xây dựng đường chuẩn Maltose (nồng độ chuẩn 0,1% tương đương 2923,98 µM) để xác định hoạt tính α-amylase (cơ chất hồ tinh bột 1%).
• Đơn vị hoạt tính enzyme (U/g): Một đơn vị hoạt tính (U) là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1 µmol đường khử (glucose hoặc maltose) trong 1 phút ở điều kiện phản ứng (50°C, pH 5,0). Công thức tính:

$$\text{Hoạt tính enzyme (U/g)} = \frac{X \times k}{t}$$

(Trong đó: $X$ là hàm lượng đường khử giải phóng tính bằng µM; $k$ là hệ số pha loãng mẫu; $t$ là thời gian phản ứng tính bằng phút).

4. Phương pháp chế biến bã sắn và thử nghiệm nuôi dưỡng lợn thịt:

• Đường hóa và lên men đồng thời bã sắn: Bã sắn tươi phối trộn nước đạt tỷ lệ 30% (w/v), bổ sung 8% chế phẩm enzyme thô, 0,5% chế phẩm probiotic chứa Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus sp. và Bacillus sp. (mật độ $10^7$ cfu/g mỗi loại), bổ sung nguồn đạm vô cơ $(NH_4)_2SO_4$ từ 0 đến 1,5%, tiến hành lên men trong 48 giờ. Phân tích thành phần hóa học, hàm lượng protein thô, protein thực, axit hữu cơ, độc tố HCN và aflatoxin $B_1$.
• Bố trí thí nghiệm động vật: Thí nghiệm tiến hành trên 144 lợn lai $F_1$ (Landrace $\times$ Yorkshire) gồm 72 cái và 72 đực thiến, chia thành các lô tương ứng với các mức thay thế bã sắn lên men (BSLM) trong khẩu phần từ giai đoạn 20 kg đến xuất chuồng. Theo dõi các chỉ tiêu sinh trưởng (ADG, FCR), năng suất thân thịt (tỷ lệ móc hàm, thịt xẻ, diện tích cơ thăn, độ dày mỡ lưng) và phẩm chất thịt (pH, màu sắc, tỷ lệ mất nước, thành phần hóa học).
• Xử lý số liệu: Dữ liệu được xử lý thống kê sinh học, so sánh giá trị trung bình bình phương nhỏ nhất (LSM) và sai số tiêu chuẩn (SE).

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu

Trình bày bối cảnh thực tiễn của ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi lợn và ô nhiễm do chất thải chế biến tinh bột sắn tại Việt Nam. Xác định mục tiêu tổng quát, 3 mục tiêu cụ thể, 3 đối tượng nghiên cứu chính (chủng nấm sợi, bã sắn, lợn $F_1$), phạm vi thời gian (2015–2019) và không gian nghiên cứu. Nêu rõ ý nghĩa khoa học trong việc cung cấp dữ liệu biến dị thực nghiệm và quy trình sinh học xử lý phụ phẩm, cùng ý nghĩa thực tiễn trong việc giảm giá thành thức ăn chăn nuôi.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Hệ thống hóa toàn diện các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về:

• Cơ chế tác dụng và cấu trúc hóa học của α-amylase, β-amylase, glucoamylase, phức hệ cellulase (Endoglucanase, Exoglucanase, β-glucosidase).
• Đặc điểm sinh học, tính an toàn sinh học (GRAS) và tiềm năng sản xuất enzyme công nghiệp của loài nấm sợi Aspergillus niger.
• Các phương pháp gây đột biến phát triển chủng (vật lý, hóa học) và kỹ thuật lên men xốp (SSF) so sánh với lên men chìm (SmF).
• Tình hình nghiên cứu sử dụng enzyme, thức ăn lên men lỏng/xốp trên gia súc, gia cầm và hiện trạng các phương pháp chế biến bã sắn (phơi khô, ủ chua, lên men vi sinh).

Phần 3: Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Mô tả chi tiết 3 nội dung nghiên cứu chính cùng toàn bộ quy trình thực nghiệm:

• Hóa chất, môi trường dinh dưỡng (PDA, PDB, môi trường cám gạo dịch thể, môi trường xốp) và trang thiết bị nghiên cứu.
• Quy trình gây đột biến đồng thời bằng NTG và bức xạ UV trên chủng A. niger A45.1.
• Quy trình lên men xốp thu enzyme thô và phương pháp định lượng đường khử DNS xác định hoạt tính α-amylase, glucoamylase, cellulase.
• Thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa đơn biến 8 thông số môi trường lên men xốp.
• Quy trình công nghệ đường hóa và lên men đồng thời bã sắn tươi ở quy mô phòng thí nghiệm.
• Thiết kế sơ đồ thí nghiệm nuôi dưỡng trên 144 lợn lai $F_1$ (Landrace $\times$ Yorkshire) và các phương pháp phân tích mẫu thịt, phân tích thống kê.

Phần 4: Kết quả và thảo luận

Nội dung kết quả được trình bày qua 3 hợp phần chính:

1. Gây đột biến chủng Aspergillus niger A45.1 và tối ưu hóa điều kiện lên men xốp

Quá trình xử lý dịch bào tử bằng NTG kết hợp chiếu xạ UV làm tỷ lệ sống sót của bào tử giảm dần theo thời gian chiếu (từ 30 đến 180 phút). Đã phân lập và sàng lọc được chủng đột biến ký hiệu Aspergillus niger GA15. Chủng GA15 thể hiện hoạt tính sinh enzyme vượt trội và duy trì tính ổn định di truyền qua các thế hệ nuôi cấy liên tiếp.

Hoạt tính enzyme của chủng đột biến GA15 so với chủng hoang dại A45.1:

Chủng nấm sợi	Hoạt tính α-amylase (U/g)	Hoạt tính Glucoamylase (U/g)	Hoạt tính Cellulase (U/g)
A. niger A45.1 (Hoang dại)	Mức cơ sở (1,00x)	Mức cơ sở (1,00x)	Mức cơ sở (1,00x)
A. niger GA15 (Đột biến)	Tăng gấp 1,97 lần	Tăng gấp 2,20 lần	Tăng gấp 1,90 lần

Kết quả tối ưu hóa đơn biến các điều kiện lên men xốp cho chủng A. niger GA15 xác định được bộ thông số thích hợp:

• Cơ chất: Cám mì (cho hoạt tính cao hơn cám gạo, vỏ trấu, mùn cưa).
• Độ ẩm cơ chất: 50%.
• Nhiệt độ lên men: 30°C.
• pH ban đầu của môi trường: 5,5.
• Thời gian lên men: 5 ngày.
• Tuổi giống cấy: 2 ngày tuổi.
• Nguồn carbon bổ sung: Glucose 1%.
• Nguồn nitơ bổ sung: Ure 1%.

Khi nuôi cấy trong điều kiện tối ưu, hoạt tính α-amylase đạt 76,75 U/g (tăng 2,0 lần), glucoamylase đạt 50,00 U/g (tăng 1,9 lần) và cellulase đạt 40,11 U/g (tăng 3,3 lần) so với điều kiện chưa tối ưu.

2. Xử lý bã sắn bằng công nghệ đường hóa và lên men đồng thời

Bã sắn tươi ban đầu có độ ẩm cao, protein thô thấp, xơ cao và chứa độc tố HCN. Sau khi phối trộn cơ chất 30%, bổ sung 8% chế phẩm đa enzyme thô, 0,5% probiotic (S. cerevisiae, Lactobacillus sp., Bacillus sp. mật độ $10^7$ cfu/g mỗi loại), 1% $(NH_4)_2SO_4$ và lên men lỏng trong 48 giờ, chất lượng dinh dưỡng của bã sắn biến đổi rõ rệt:

Chỉ tiêu dinh dưỡng / cảm quan	Bã sắn tươi (Không lên men)	Bã sắn sau đường hóa và lên men (BSLM)
Hàm lượng Protein thô	Mức cơ sở (1,0x)	Tăng gấp 7,3 lần
Hàm lượng Protein thực	Mức cơ sở (1,0x)	Tăng gấp 5,5 lần
Hàm lượng Axit hữu cơ	Mức cơ sở (1,0x)	Tăng gấp 5,9 lần
Độ pH	4,21	3,70
Hàm lượng độc tố HCN	26,9 mg/kg tươi	Giảm còn 1,4 g/kg
Độc tố Aflatoxin $B_1$	—	Không phát hiện
Trạng thái cảm quan	Trắng đục, dễ thối	Màu vàng tương đỗ, mùi thơm, chua dịu

3. Ảnh hưởng của bã sắn lên men (BSLM) đến năng suất và chất lượng thịt lợn $F_1$ (Landrace $\times$ Yorkshire)

Thử nghiệm trên 144 lợn thịt $F_1$ từ 20 kg đến khi xuất chuồng cho thấy:

• Khả năng sinh trưởng và chuyển hóa thức ăn: Khẩu phần bổ sung 20% BSLM đạt hiệu quả tối ưu nhất. Tăng trọng bình quân hàng ngày (ADG) tăng 8,97% ở giai đoạn 1 và tăng 34,46% ở giai đoạn 2 so với lô đối chứng (0% BSLM). Hệ số chuyển hóa thức ăn (FCR) ở hai giai đoạn tương ứng đạt 2,10 và 2,45.
• Năng suất thân thịt: Khối lượng móc hàm tăng 11,15% và khối lượng thịt xẻ tăng 11,19% so với lô đối chứng.
• Phẩm chất thịt: Việc sử dụng BSLM ở các mức thí nghiệm không gây ảnh hưởng tiêu cực đến các chỉ tiêu chất lượng thịt (pH, màu sắc, tỷ lệ mất nước bảo quản/chế biến) và thành phần hóa học của thịt lợn.

Phần 5: Kết luận và kiến nghị

Tóm tắt các kết quả đạt được về chủng đột biến, điều kiện lên men, quy trình xử lý bã sắn và hiệu quả chăn nuôi; đồng thời đưa ra các kiến nghị nghiên cứu tiếp theo.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận

1. Đã ứng dụng thành công phương pháp gây đột biến ngẫu nhiên kết hợp đồng thời giữa tác nhân hóa học (NTG) và tác nhân vật lý (tia UV) trên chủng nấm sợi hoang dại Aspergillus niger A45.1 để chọn tạo được chủng đột biến Aspergillus niger GA15 có khả năng đồng thời sinh tổng hợp 3 loại enzyme α-amylase, glucoamylase và cellulase với hoạt tính cao, ổn định qua nhiều thế hệ nuôi cấy.
2. Xác lập được bộ thông số môi trường tối ưu cho quá trình lên men xốp (SSF) của chủng đột biến Aspergillus niger GA15 trên cơ chất cám mì kết hợp phụ gia (glucose 1%, ure 1%, độ ẩm 50%, pH 5,5, nhiệt độ 30°C, thời gian 5 ngày, tuổi giống 2 ngày).
3. Xây dựng cơ sở dữ liệu khoa học về công nghệ đường hóa và lên men đồng thời bã sắn tươi bằng phức hệ đa enzyme kết hợp hệ vi sinh vật probiotic và đạm vô cơ, giải quyết bài toán suy giảm độc tố HCN và nâng cao tỷ lệ protein thực trong phụ phẩm giàu tinh bột - cellulose.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn

1. Tạo ra nguồn chế phẩm đa enzyme thô phục vụ chế biến phụ phẩm nông nghiệp tại chỗ với chi phí thấp.
2. Hoàn thiện quy trình biến đổi bã sắn tươi từ nguồn chất thải công nghiệp gây ô nhiễm thành thức ăn chăn nuôi lợn giàu dinh dưỡng, an toàn sinh học.
3. Chứng minh việc bổ sung 20% bã sắn lên men vào khẩu phần ăn giúp tăng tốc độ sinh trưởng (ADG tăng tới 34,46% ở giai đoạn vỗ béo), nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn và tăng khối lượng thịt xẻ ở lợn thương phẩm $F_1$ (Landrace $\times$ Yorkshire) mà không làm suy giảm chất lượng thân thịt.

Kiến nghị của luận án

• Thử nghiệm lên men một số nguồn phụ phẩm nông nghiệp khác bằng chế phẩm đa enzyme của đề tài để làm thức ăn cho các đối tượng vật nuôi khác nhau.
• Tiến hành thử nghiệm trên quy mô rộng hơn và xác định hiệu quả kinh tế chi tiết trong việc sử dụng phụ phẩm lên men làm thức ăn chăn nuôi.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Về mặt hạn chế và các vấn đề cần tiếp tục hoàn thiện, văn bản luận án xác định phạm vi nghiên cứu thực nghiệm mới tập trung trên đối tượng bã sắn thu gom tại khu vực Hoài Đức (Hà Nội) và thử nghiệm dinh dưỡng trên giống lợn lai $F_1$ (Landrace $\times$ Yorkshire). Luận án chưa khảo sát mở rộng trên các nguồn cơ chất phụ phẩm nông nghiệp đa dạng khác cũng như chưa đánh giá trên các nhóm vật nuôi khác (như gia cầm hoặc gia súc nhai lại).

Hướng nghiên cứu tiếp theo được tác giả đề xuất gồm:

1. Mở rộng thử nghiệm công nghệ lên men và chế phẩm đa enzyme trên các nguồn phụ phẩm trồng trọt và công nghiệp thực phẩm khác (bã mía, rơm rạ, vỏ trấu, bã dong riềng, mùn cưa).
2. Đánh giá hiệu quả sử dụng thức ăn lên men đa enzyme trên các đối tượng vật nuôi khác nhau.
3. Triển khai mô hình ở quy mô sản xuất lớn hơn và hạch toán toàn diện hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi nông hộ và trang trại.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị ứng dụng và tham khảo đối với nhiều đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Chăn nuôi, Dinh dưỡng động vật, Công nghệ sinh học và Vi sinh vật học ứng dụng: Có thể tham khảo phương pháp luận gây đột biến kết hợp NTG/UV, quy trình tối ưu hóa lên men xốp đơn biến, phương pháp định lượng enzyme bằng kỹ thuật DNS (Miller, 1959) và thiết kế thí nghiệm dinh dưỡng động vật.
• Các nhà máy, cơ sở sản xuất chế biến thức ăn chăn nuôi và chế phẩm sinh học: Có thể tham khảo thông số kỹ thuật nuôi cấy A. niger GA15 để sản xuất đa enzyme thô chi phí thấp.
• Các trang trại chăn nuôi lợn và cơ sở chế biến tinh bột sắn: Ứng dụng quy trình công nghệ đường hóa - lên men đồng thời để tự sản xuất thức ăn giàu đạm từ bã sắn tươi, giảm chi phí thức ăn hỗn hợp và giải quyết triệt để vấn đề ô nhiễm môi trường do chất thải rắn.

Câu hỏi thường gặp

1. Chủng đột biến Aspergillus niger GA15 được tạo ra bằng phương pháp nào và hoạt tính enzyme tăng bao nhiêu so với chủng gốc?

Chủng A. niger GA15 được tạo ra bằng phương pháp gây đột biến ngẫu nhiên đồng thời bằng tác nhân hóa học NTG ($100\text{ mg/ml}$) và chiếu bức xạ tia UV (đèn 50 W, khoảng cách 30 cm) trên dịch bào tử chủng hoang dại A. niger A45.1. So với chủng hoang dại ban đầu, hoạt tính của α-amylase ở chủng GA15 tăng gấp 1,97 lần, glucoamylase tăng gấp 2,20 lần và cellulase tăng gấp 1,90 lần.

2. Các điều kiện môi trường tối ưu cho quá trình lên men xốp của chủng Aspergillus niger GA15 là gì?

Điều kiện lên men xốp tối ưu được xác định gồm: cơ chất cám mì, độ ẩm cơ chất 50%, pH ban đầu 5,5, nhiệt độ lên men 30°C, thời gian lên men 5 ngày, tuổi giống cấy 2 ngày, bổ sung 1% glucose và 1% ure. Ở điều kiện này, hoạt tính α-amylase, glucoamylase và cellulase đạt lần lượt là 76,75 U/g; 50,00 U/g và 40,11 U/g (cao gấp 2,0; 1,9 và 3,3 lần so với điều kiện chưa tối ưu).

3. Công nghệ đường hóa và lên men đồng thời làm thay đổi giá trị dinh dưỡng và độc tố của bã sắn tươi như thế nào?

Quá trình lên men lỏng bã sắn tươi (30% cơ chất, 8% đa enzyme thô, 0,5% probiotic S. cerevisiae, Lactobacillus sp., Bacillus sp., 1% $(NH_4)_2SO_4$, thời gian 48 giờ) giúp hàm lượng protein thô tăng gấp 7,3 lần, protein thực tăng gấp 5,5 lần, hàm lượng axit hữu cơ tăng gấp 5,9 lần, pH đạt 3,7. Đồng thời, độc tố HCN giảm mạnh từ 26,9 mg/kg tươi xuống còn 1,4 g/kg, bã sắn chuyển màu vàng tương đỗ, có mùi thơm, vị chua dịu và không chứa độc tố aflatoxin $B_1$.

4. Mức bổ sung bã sắn lên men (BSLM) nào trong khẩu phần mang lại hiệu quả chăn nuôi lợn thịt tốt nhất?

Mức bổ sung 20% BSLM vào khẩu phần ăn mang lại hiệu quả tốt nhất: tăng trọng bình quân hàng ngày (ADG) tăng 8,97% ở giai đoạn 1 (từ 20 kg) và tăng 34,46% ở giai đoạn 2 (đến xuất bán) so với đối chứng; hệ số FCR ở hai giai đoạn đạt 2,10 và 2,45; khối lượng móc hàm và thịt xẻ tăng tương ứng 11,15% và 11,19% so với đối chứng mà không làm ảnh hưởng đến phẩm chất và thành phần hóa học của thịt.

5. Chế phẩm probiotic sử dụng trong quá trình lên men đồng thời bã sắn gồm những vi sinh vật nào và mật độ ra sao?

Chế phẩm probiotic được sử dụng ở tỷ lệ 0,5% (w/v), gồm hỗn hợp 3 chủng vi sinh vật: Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus sp. và Bacillus sp. với mật độ đạt $10^7\text{ cfu/g}$ đối với mỗi loại vi sinh vật.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Dương Thu Hương đã chọn tạo thành công chủng đột biến Aspergillus niger GA15 có khả năng sinh tổng hợp đồng thời α-amylase, glucoamylase và cellulase với hoạt tính cao và ổn định. Đề tài đã xây dựng hoàn chỉnh quy trình lên men xốp tối ưu để sản xuất đa enzyme và quy trình đường hóa kết hợp lên men lỏng bã sắn tươi bằng enzyme thô cùng hệ probiotic và đạm vô cơ. Kết quả thử nghiệm khẳng định bã sắn lên men là nguồn thức ăn giàu đạm, an toàn sinh học, và việc bổ sung 20% BSLM vào khẩu phần giúp nâng cao rõ rệt tốc độ sinh trưởng cũng như hiệu quả sử dụng thức ăn ở lợn thịt $F_1$ (Landrace $\times$ Yorkshire). Công trình cung cấp giải pháp kỹ thuật gắn kết giữa công nghệ sinh học và chăn nuôi ứng dụng, góp phần giảm chi phí sản xuất và giảm thiểu ô nhiễm môi trường từ phụ phẩm chế biến nông sản.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM DƯƠNG THU HƯƠNG NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHỦNG NẤM SỢI VÀ TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SẢN XUẤT ĐA ENZYME (α-AMYLASE, GLUCOAMYLASE, CELLULASE) ỨNG DỤNG TRONG CHẾ BIẾN THỨC ĂN CHĂN NUÔI LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM DƯƠNG THU HƯƠNG NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHỦNG NẤM SỢI VÀ TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SẢN XUẤT ĐA ENZYME (α-AMYLASE, GLUCOAMYLASE, CELLULASE) ỨNG DỤNG TRONG CHẾ BIẾN THỨC ĂN CHĂN NUÔI Chuyên ngành : Chăn nuôi Mã số : 9.05 Người hướng dẫn khoa học: 1. Phạm Kim Đăng HÀ NỘI - 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày… tháng… năm… Tác giả luận án Dương Thu Hương i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.

Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. Vũ Văn Hạnh và PGS. Phạm Kim Đăng đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Sinh lý - tập tính động vật, Khoa Chăn nuôi, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức phòng Các chất chức năng sinh học, Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm và Khoa học công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án. Hà Nội, ngày. Nghiên cứu sinh Dương Thu Hương ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình ix Trích Yếu Luận Án x Thesis abstract xii PHẦN 1.

Tính cấp thiết của đề tài 1 1. Mục tiêu của đề tài 2 1. Mục tiêu chung 2 1. Mục tiêu cụ thể 2 1.

Phạm vi nghiên cứu 2 1. Đối tượng nghiên cứu 2 1. Địa điểm nghiên cứu 2 1. Thời gian nghiên cứu 3 1.

Những đóng góp mới của đề tài 3 1. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3 1. Ý nghĩa khoa học 3 1. Ý nghĩa thực tiễn 3 PHẦN 2.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2. Tổng quát về enzyme amylase và cellulase 4 2. Nguồn thu nhận enzyme 6 2. Tổng quan về nấm sợi Aspergillus niger 7 2.

Cải tiến chủng vi sinh vật và lên men sản xuất enzyme 10 2. Sự cần thiết phải cải tiến các chủng vi sinh vật 10 2. Phương pháp cải tiến chủng vi sinh vật để tăng sản xuất enzyme 10 2. Lên men sản xuất enzyme 13 iii 2.

Sự cần thiết phải tối ưu môi trường lên men 19 2. Thành tựu về cải tiến chủng và tối ưu môi trường lên men sản xuất amylase và cellulase 19 2. Tình hình sản xuất và sử dụng enzyme trong chăn nuôi 20 2. Nghiên cứu và sử dụng enzyme trong chăn nuôi trên thế giới 20 2.

Nghiên cứu và sử dụng enzyme trong chăn nuôi ở Việt Nam 24 2. Sử dụng thức ăn lên men trong chăn nuôi 26 2. Đặc tính và vai trò của các vi sinh vật sử dụng trong lên men thức ăn chăn nuôi 26 2. Các vi sinh vật sử dụng trong lên men thức ăn 27 2.

Hiệu quả của sử dụng thức ăn lên men trong chăn nuôi 27 2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng bã sắn trong chăn nuôi 28 PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 3. Nội dung nghiên cứu 31 3.

Phương pháp nghiên cứu 31 3. Gây đột biến chủng Aspergillus niger A45.1 và tối ưu điều kiện lên men chủng nấm sợi đột biến chọn lọc để sinh tổng hợp đa enzyme (α- amylase, glucoamylase và cellulase) cao 31 3. Xử lý bã sắn thành thức ăn chăn nuôi bằng bằng công nghệ đường hóa và lên men đồng thời 36 3. Đánh giá ảnh hưởng của việc sử dụng bã sắn lên men trong khẩu phần ăn đến năng suất chăn nuôi lợn thịt 38 3.

Xử lý số liệu 41 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 4. Gây đột biến chủng Aspergillus niger a45.1 và tối ưu điều kiện lên men chủng đột biến chọn lọc cho sinh tổng hợp đa enzyme (α-amylase, glucoamylase và cellulase) cao 43 4. Ảnh hưởng của tia UV và NTG đến khả năng sống sót của chủng nấm sợi Aspergillus niger A45.

Hoạt tính enzyme của các các chủng đột biến 47 4. Tính ổn định của các chủng đột biến chọn lọc 50 iv 4. Tối ưu điều kiện lên men xốp chủng nấm đột biến chọn lọc cho sinh tổng hợp đa enzyme (glucoamylase, α-amylase, cellulase) 51 4. Xử lý bã sắn thành thức ăn chăn nuôi bằng đường hóa và lên men đồng thời 64 4.

Thành phần hóa học của bã sắn tươi 64 4. Tối ưu thời gian đường hóa bã sắn 68 4. Đường hóa và lên men đồng thời bã sắn bằng enzyme và vi sinh vật 69 4. Đánh giá chất lượng của bã sắn sau lên men 72 4.

Ảnh hưởng của bã sắn lên men trong chăn nuôi lợn thịt 75 4. Ảnh hưởng của bã sắn lên men đến khả năng sinh trưởng và chuyển hóa thức ăn của lợn F1 (Landrace x Yorkshire) 75 4. Ảnh hưởng của tương tác giữa khẩu phần ăn và tính biệt đến khả năng sinh trưởng của lợn F1 (LandracexYorkshire) 79 4. Ảnh hưởng của mức sử dụng BSLM đến năng suất thân thịt của lợn thịt F1 (Landrace x Yorkshire) 81 4.

Ảnh hưởng của mức sử dụng BSLM đến chất lượng thịt và thành phần hóa học của thịt lợn F1 (Landrace x Yorkshire) 84 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 90 5. Kiến nghị 91 Danh mục các công trình công bố liên quan đến luận án 92 Tài liệu tham khảo 92 Phụ lục 108 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt ADF (Acid detergent fiber) Xơ không hòa tan trong axit ADG (Average daily gain) Tăng trọng bình quân hàng ngày ADN Axit deoxyribonucleic ARN Axit ribonucleic Aspergillus A. BQ Bảo quản BSLM Bã sắn lên men CB Chế biến cs.

Cộng sự CMCase Carboxymethyl cellulase DNS 3,5 dinitrosalysilic ĐC Đối chứng ĐVT Đơn vị tính FCR (Feed conversion ratio) Hệ số chuyển hóa thức ăn KL Khối lượng LSM (Least Square Mean) Trung bình bình phương nhỏ nhất LY Landrace x Yorkshire NDF (Neutral Detergent Fiber) Xơ không tan trong dung dịch trung tính NLTĐ Năng lượng trao đổi NRC (National Research Council) Hội đồng nghiên cứu Quốc gia NTG N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine PDA Potatose Dextrose Agar SE (Standard error) Sai số tiêu chuẩn SmF (submerged fermentation) Lên men chìm SSF (Solid state fermentation) Lên men xốp TACN Thức ăn chăn nuôi TN Thí nghiệm U Unit UV Ultraviolet VCK Vật chất khô vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2. Một số enzyme công nghiệp và nguồn vi sinh vật sản xuất enzyme 7 2. Các tác nhân gây đột biến để phát triển chủng 12 3. Xác định hoạt tính enzyme 34 3.

Sơ đồ bố trí thí nghiệm 39 3. Thành phần và giá trị dinh dưỡng khẩu phần thí nghiệm 39 4. Hoạt tính enzyme của các chủng đột biến 47 4. Hoạt tính α-amylase, glucoamylase và cellulase của chủng đột biến Aspergillus niger GA15 qua các thế hệ nuôi cấy 50 4.

Ảnh hưởng của loại cơ chất đến khả năng sản xuất enzyme của chủng đột biến Aspergillus niger GA15 51 4. Hoạt tính enzyme của chủng đột biến Aspergillus niger GA15 ở các độ ẩm cơ chất khác nhau 53 4. Hoạt tính enzyme của chủng đột biến Aspergillus niger GA15 ở các nhiệt độ lên men khác nhau 55 4. Hoạt tính enzyme của chủng Aspergillus niger GA15 trên môi trường có pH khác nhau 57 4.

Hoạt tính enzyme của chủng Aspergillus niger GA15 khi lên men xốp ở các thời gian khác nhau 58 4. Hoạt tính enzyme của chủng Aspergillus niger GA15 khi lên men với các tuổi giống khác nhau 60 4. Hoạt tính enzyme của chủng Aspergillus niger GA15 khi bổ sung các nguồn carbon khác nhau vào môi trường lên men xốp 61 4. Hoạt tính enzyme của chủng Aspergillus niger GA15 khi bổ sung các nguồn nitơ khác nhau vào môi trường lên men xốp 62 4.

Thành phần hóa học của bã sắn tươi 64 4. Hàm lượng đường khử, tinh bột và xơ của bã sắn ở các nồng độ enzyme khác nhau 67 4. Hàm lượng đường khử khi đường hóa bã sắn ở thời gian khác nhau 68 4. Hàm lượng Protein của bã sắn sau lên men khi bổ sung (NH4)2SO4 ở các nồng độ khác nhau 70 vii 4.

Hàm lượng protein thực ở các thời điểm lên men khác nhau (n=3) 71 4. Thành phần dinh dưỡng và cảm quan của bã sắn lên men và không lên men 73 4. Ảnh hưởng của mức sử dụng BSLM đến sinh trưởng và chuyển hóa thức ăn của lợn thí nghiệm 76 4. Ảnh hưởng tương tác giữa khẩu phần với các mức sử dụng BSLM và tính biệt đến khả năng sinh trưởng của lợn F1 (LxY) giai đoạn từ 20 kg đến xuất bán 80 4.

Ảnh hưởng của mức sử dụng BSLM trong khẩu phần đến năng suất thân thịt của lợn F1 (Landrace x Yorkshire) 81 4. Ảnh hưởng tương tác giữa khẩu phần với các mức sử dụng BSLM và tính biệt đến năng suất thân thịt (LSM) của lợn F1(LandracexYorkshire) 83 4. Ảnh hưởng của mức sử dụng BSLM trong khẩu phần đến chất lượng thịt (LSM) của lợn F1(LandracexYorkshire) 84 4. Ảnh hưởng tương tác giữa khẩu phần với các mức sử dụng BSLM và tính biệt đến chất lượng thịt (LSM) của lợn F1(LandracexYorkshire) 87 4.

Ảnh hưởng của mức sử dụng BSLM trong khẩu phần đến thành phần hoá học (LSM) thịt lợn F1(LandracexYorkshire) 88 4. Ảnh hưởng tương tác giữa khẩu phần với các mức sử dụng BSLM và tính biệt đến thành phần hoá học (LSM) của thịt lợn F1(LandracexYorkshire) 88 viii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 4. Giống hoạt hóa sau 5 ngày (A), 10 ngày (B) và 15 ngày (C) 43 4.