Luận án tiến sĩ nghiên cứu đặc tính và hiệu quả phòng trừ của nucleopolyhedrosis virus npv trên sâu ăn tạp spodoptera litura fabr và sâu xanh da láng spodoptera exigua hubn tại đồng bằng sông cửu long

Chuyên khảo Hiệu quả của virus nucleopolyhedrosis trên sâu spodoptera tại đồng bằn phân tích chuyên sâu các khía cạnh quan trọng trong lĩnh vực

• Tác giả: Trịnh Thị Xuân
• Người hướng dẫn: Pgs. Trần Văn Hai
• Trường học: Trường Đại Học Cần Thơ
• Chuyên ngành: Bảo Vệ Thực Vật
• Đề tài: Nghiên cứu đặc tính và hiệu quả phòng trừ của Nucleopolyhedrosis virus (NPV) trên sâu ăn tạp (Spodoptera litura Fabr.) và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua Hubn.) tại Đồng bằng sông Cửu Long
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Cần Thơ

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT
• SUMMARY
• MỤC LỤC
• Danh sách bảng
• Danh sách hình
• Danh mục từ viết tắt
• 1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
• 1.1. Tính cấp thiết của luận án
• 1.2. Mục tiêu của luận án
• 1.3. Nội dung nghiên cứu
• 1.4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 1.4.1. Đối tượng nghiên cứu
• 1.4.2. Phạm vi nghiên cứu
• 1.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
• 1.5.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 1.5.3. Những đóng góp mới của luận án
• 2. CHƯƠNG 2: Tổng quan tài liệu
• 2.1. Khái quát chung về virus gây bệnh côn trùng
• 2.2. Lịch sử nghiên cứu virus gây bệnh côn trùng
• 2.3. Cấu trúc và hình thái của virus ký sinh côn trùng
• 2.4. Phân loại và đặc điểm của virus ký sinh côn trùng
• 2.2. Những tổng quan về Baculoviruses (BVs, họ Baculoviridae)
• 2.2.1. Các đặc trưng của Baculoviridae
• 2.2.2. Sự đa dạng trong họ Baculoviridae
• 2.2.3. Sinh học phân tử của Baculoviridae
• 2.2.4. Virus nhân đa diện Nucleopolyhedrosis virus (NPV)
• 2.3. Phương pháp chẩn đoán và định danh virus gây bệnh côn trùng
• 2.3.1. Chẩn đoán căn cứ vào triệu chứng gây bệnh
• 2.3.2. Chẩn đoán qua kính hiển vi điện tử
• 2.4. Các kết quả về nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm virus
• 2.4.1. Nghiên cứu hình thái học và khảo sát tiến triển sử dụng virus Nucleopolyhedrosis virus
• 2.4.2. Nghiên cứu về sự mẫn cảm của sâu đối với virus Nucleopolyhedrosis virus gây bệnh côn trùng
• 2.4.3. Nghiên cứu về yếu tố ảnh hưởng đến hiệu lực Nucleopolyhedrosis virus và giải pháp hạn chế
• 2.4.4. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành sinh khối virus trong quá trình sản xuất chế phẩm Nucleopolyhedrosis virus
• 2.4.5. Ưu và nhược điểm của việc sử dụng chế phẩm Nucleopolyhedrosis virus trong phòng trừ dịch hại
• 2.5. Sâu ăn tạp Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae)
• 2.5.1. Sự phân bố
• 2.5.3. Đặc điểm hình thái và sinh học của sâu ăn tạp
• 2.5.4. Tập quán sinh sống và cách gây hại
• 2.5.5. Biện pháp phòng trị sâu ăn tạp
• 2.6. Sâu xanh da láng Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae)
• 2.6.1. Sự phân bố
• 2.6.3. Đặc điểm hình thái và sinh học của sâu xanh da láng
• 2.6.4. Tập quán sinh sống và cách gây hại
• 2.6.5. Biện pháp quản lý tổng hợp sâu xanh da láng
• 2.7. Các chất phụ gia
• 2.7.1. Chất phụ gia Tinopal UNPA-GX
• 2.7.2. Chất phụ gia acid boric
• 2.8. Một số loại thuốc bảo vệ thực vật sử dụng trong nghiên cứu
• 2.8.1. Thuốc Nazomi 5WG
• 2.8.2. Thuốc Radiant 60SC
• 2.8.3. Thuốc Ohayo 100SC
• 3. CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 3.1. Nội dung nghiên cứu
• 3.2. Phương tiện nghiên cứu
• 3.2.1. Thời gian nghiên cứu và địa điểm nghiên cứu
• 3.2.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
• 3.2.3. Hóa chất thí nghiệm
• 3.2.4. Vật liệu thí nghiệm
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Thu thập định danh virus NPV (Nucleopolyhedrosis virus) gây bệnh trên sâu ăn tạp (S. litura) và sâu xanh da láng (S.
• 3.3.2. Xác định tính độc của virus SpltNPV đối với sâu ăn tạp (S. litura) và virus SeNPV đối với sâu xanh da láng (S. exigua) trong điều kiện phòng thí nghiệm
• 3.3.3. Xác định chất phụ gia khi phối trộn với virus NPV
• 3.3.4. Đánh giá hiệu quả của chế phẩm virus NPV đối với sâu hại trong điều kiện nhà lưới
• 3.3.5. Đánh giá hiệu quả của chế phẩm virus NPV đối với sâu hại trong điều kiện ngoài đồng
• 3.4. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả thu thập và định danh virus Nucleopolyhedrovirus
• 4.1.1. Kết quả thu thập mẫu virus
• 4.1.2. Đặc điểm triệu chứng của sâu bị nhiễm Nucleopolyhedrosis virus
• 4.1.3. Hình thái của thể vùi virus NPV dưới kính hiển vi huỳnh quang và kính hiển vi điện tử
• 4.1.4. Kết quả xác định bằng thực hiện phản ứng khuếch đại PCR
• 4.2. Hiệu quả và khả năng gây bệnh của các chủng virus SpltNPV trên sâu ăn tạp (Spodoptera litura)
• 4.3. Hiệu quả và khả năng gây bệnh của các chủng virus SeNPV trên sâu xanh da láng (Spodoptera exigua)
• 4.4. Đánh giá hiệu lực chéo của virus SpltNPV và SeNPV trong điều kiện phòng thí nghiệm
• 4.5. Kết quả xác định chất phụ gia lên hiệu lực của SpltNPV, SeNPV đố i với sâu ăn ta ̣p và sâu xanh da láng
• 4.5.1. Hiệu quả của chất phụ gia trong kết hợp với virus SpltNPV đối với sâu ăn tạp trong điều kiện phòng thí nghiệm
• 4.5.2. Hiệu quả của chất phụ gia trong kết hợp với virus SeNPV đối với sâu xanh da láng trong điều kiện phòng thí nghiệm
• 4.5.3. Hiệu quả của chế phẩm virus SpltNPV và SeNPV ở các điều kiện tồn trữ trên sâu ăn tạp, sâu xanh da láng tuổi 2 trong điều kiện phòng thí nghiệm theo thời gian bảo quản
• 4.6. Hiệu quả của chế phẩm virus SpltNPV và SeNPV trong điều kiện nhà lưới
• 4.6.1. Hiệu quả của chế phẩm SpltNPV đối với sâu ăn tạp trong điều kiện nhà lưới
• 4.6.2. Hiệu quả của chế phẩm SeNPV đối với sâu xanh da láng trong điều kiện nhà lưới
• 4.7. Khả năng quản lý sâu ăn tạp và sâu xanh da láng của chế phẩm virus NPV ngoài đồng
• 4.7.1. Hiệu quả của chế phẩm virus SpltNPV đối với sâu ăn tạp gây hại trên cải làm dưa tại xã Đông Phước A, H. Châu Thành, tỉnh Hậu Giang, 2014
• 4.7.2. Hiệu quả của virus SpltNPV để quản lý sâu ăn tạp gây hại cải bắp trong điều kiện ngoài đồng tại huyện Phụng Hiệp, tỉnh Hậu Giang, 2015
• 4.7.3. Hiêụ quả của virus SeNPV trong quản lý sâu xanh da láng gây hại hành tím tại thị xã Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng, 2014
• 4.7.4. Hiệu quả của chế phẩm SeNPV đối với SXDL gây hại trên hành lá tại huyện Bình Tân – tỉnh Vĩnh Long, 2015
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• 5.2. Đề nghị
• Danh mục các công trình đã công bố
• Tài liệu tham khảo
• Phụ lục

Tóm tắt

I. Nghiên cứu virus nucleopolyhedrosis

Nghiên cứu hiệu quả của virus nucleopolyhedrosis (NPV) trên sâu Spodoptera tại Đồng bằng sông Cửu Long đã chỉ ra rằng NPV là một phương pháp sinh học hiệu quả để kiểm soát sâu hại. Đặc tính của virus này cho thấy khả năng gây bệnh cao, với tỷ lệ gây chết lên đến 100% trong các thử nghiệm. Việc thu thập và phân lập các chủng virus NPV từ sâu ăn tạp (Spodoptera litura) và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) đã cho thấy sự đa dạng của virus trong khu vực này. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng virus có thể được sử dụng như một biện pháp sinh học trong quản lý dịch hại, giảm thiểu việc sử dụng hóa chất độc hại trong nông nghiệp.

1.1 Đặc điểm sinh học của virus

Virus NPV có cấu trúc hình đa diện và thể vùi có kích thước trung bình từ 1,245 đến 1,459 μm. Các nghiên cứu về triệu chứng bệnh cho thấy sâu nhiễm virus có biểu hiện di chuyển chậm, ngừng ăn và thay đổi màu sắc. Kết quả PCR cho thấy tỷ lệ tương đồng cao với các chủng virus đã được ghi nhận trong ngân hàng GenBank, cho thấy tính đa dạng và khả năng thích ứng của virus trong môi trường tự nhiên.

1.2 Hiệu quả diệt sâu

Kết quả thí nghiệm cho thấy 9 chủng virus SpltNPV và 4 chủng SeNPV có hiệu lực cao, đạt tỷ lệ gây chết từ 82-100% sau 7 ngày xử lý. Virus SpltNPV không có khả năng lây nhiễm chéo cho sâu xanh da láng, điều này cho thấy tính chọn lọc của virus trong việc kiểm soát sâu hại. Việc ứng dụng virus trong thực địa cho thấy hiệu quả phòng trừ sâu ăn tạp và sâu xanh da láng đạt từ 70,9 đến 94,7% tùy thuộc vào số lần phun và loại cây trồng.

II. Biện pháp sinh học trong nông nghiệp

Việc sử dụng biện pháp sinh học như virus nucleopolyhedrosis trong quản lý sâu bệnh đang trở thành xu hướng trong nông nghiệp bền vững. Nghiên cứu đã phát triển quy trình sản xuất chế phẩm sinh học NPV, bao gồm cả dạng khô và lỏng, giúp dễ dàng ứng dụng trong thực tiễn. Các chế phẩm này không chỉ có hiệu quả cao mà còn thân thiện với môi trường, giảm thiểu tác động tiêu cực đến hệ sinh thái.

2.1 Quy trình sản xuất chế phẩm

Quy trình sản xuất chế phẩm sinh học NPV đã được tối ưu hóa với sự phối trộn của các chất phụ gia như acid boric, giúp tăng cường hiệu quả diệt sâu. Kết quả cho thấy chế phẩm có thể bảo quản hiệu quả trong điều kiện lạnh, duy trì hoạt lực diệt sâu trên 56% sau 8 tháng. Việc phát triển quy trình này không chỉ giúp nâng cao hiệu quả sản xuất mà còn tạo ra sản phẩm an toàn cho người tiêu dùng.

2.2 Ứng dụng thực tiễn

Kết quả thí nghiệm ngoài đồng cho thấy chế phẩm NPV có thể áp dụng hiệu quả trong quản lý sâu ăn tạp và sâu xanh da láng tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long. Việc phun chế phẩm ở dạng lỏng hoặc khô đã mang lại hiệu quả cao trong việc giảm thiểu thiệt hại cho cây trồng. Điều này khẳng định tính khả thi của việc ứng dụng virus NPV trong thực tiễn nông nghiệp, góp phần vào việc phát triển nông nghiệp bền vững.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Sự gia tăng quy mô và tính thâm canh hóa nông nghiệp tại vùng Đồng bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) với hơn 241.809 ha đất canh tác rau màu đã thúc đẩy áp lực dịch hại nghiêm trọng từ các loài sâu hại đa thực thuộc bộ Cánh vẩy (Lepidoptera), đặc biệt là sâu ăn tạp (Spodoptera litura Fabricius) và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua Hübner). Thực trạng lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) hóa học tại khu vực đã đạt mức báo động: nông dân phun từ 10–15 lần/vụ với liều lượng vượt khuyến cáo, đưa lượng hóa chất BVTV nhập khẩu của Việt Nam từ 6.000 tấn (trước năm 1985) lên hơn 70.000 tấn vào năm 2014, sở hữu danh mục 1.643 hoạt chất—cao gấp 2,5 đến 4,1 lần so với các quốc gia láng giềng như Thái Lan và Malaysia. Hậu quả là quần thể sâu hại hình thành tính kháng thuốc vượt trội; theo ghi nhận của Kerns et al. (1998), "mức độ kháng cao nhất của S. exigua đối với Methomyl lên đến 552 lần còn S. litura là 326 lần, đồng thời hình thành tính kháng chéo đối với hoạt chất Thiodicarb".

Trong bối cảnh yêu cầu tiêu chuẩn an toàn thực phẩm (VietGAP, GlobalGAP) ngày càng khắt khe, khoảng trống nghiên cứu (research gap) cốt lõi tại ĐBSCL là sự thiếu hụt một hệ thống dữ liệu toàn diện về các chủng virus nhân đa diện bản địa (Nucleopolyhedrovirus - NPV), cùng quy trình hoàn chỉnh từ phân lập, định danh phân tử, đánh giá độc tính sinh học cho đến sản xuất chế phẩm sinh học có khả năng ứng dụng thực địa ổn định.

Luận án tiến sĩ của nghiên cứu sinh Trịnh Thị Xuân (2018) thuộc chuyên ngành Bảo vệ Thực vật, Trường Đại học Cần Thơ, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Trần Văn Hai, đã giải quyết triệt để khoảng trống này thông qua việc thiết lập các câu hỏi nghiên cứu và giả thuyết khoa học cụ thể:

• Câu hỏi nghiên cứu 1 (RQ1): Các quần thể S. litura và S. exigua tại 9 tỉnh ĐBSCL có lưu hành các chủng NPV bản địa hay không và đặc tính hình thái, phân tử của chúng như thế nào?
• Câu hỏi nghiên cứu 2 (RQ2): Độc tính sinh học ($LC_{50}$, $LT_{50}$) và năng suất thu hồi thể vùi (OBs) của các chủng virus bản địa biến thiên ra sao theo tuổi sâu và nguồn gốc địa lý?
• Câu hỏi nghiên cứu 3 (RQ3): Virus SpltNPV và SeNPV có biểu hiện tính lây nhiễm chéo (cross-infection) hay duy trì tính chuyên biệt ký chủ tuyệt đối?
• Câu hỏi nghiên cứu 4 (RQ4): Loại chất phụ gia nào tối ưu hóa hiệu lực sinh học, khắc phục nhược điểm quang phân (photodegradation) và duy trì thời gian bảo quản của chế phẩm dạng khô và lỏng?
• Giả thuyết nghiên cứu 1 (H1): Tồn tại các chủng SpltNPV và SeNPV bản địa tại ĐBSCL mang độc lực cao tương đương hoặc vượt trội so với các chủng chuẩn quốc tế trên GenBank.
• Giả thuyết nghiên cứu 2 (H2): NPV bản địa duy trì tính chuyên biệt hẹp tuyệt đối, không gây nhiễm chéo giữa hai loài ký chủ đồng mục tiêu.
• Giả thuyết nghiên cứu 3 (H3): Việc bổ sung chất phụ gia tăng lực (acid boric/Tinopal UNPA-GX) ở nồng độ tối ưu sẽ tăng cường đáng kể tỷ lệ gây chết và kéo dài thời gian tồn trữ chế phẩm.

Nghiên cứu được đặt trên nền tảng khung lý thuyết bệnh lý học côn trùng (Insect Pathology) và sinh thái học mầm bệnh Baculovirus (Hunter-Fujita et al., 1998; Rohrmann, 2011). Luận án được triển khai trên phạm vi 9 tỉnh trọng điểm ĐBSCL (Đồng Tháp, Hậu Giang, Long An, Cần Thơ, An Giang, Vĩnh Long, Tiền Giang, Sóc Trăng, Trà Vinh) trong giai đoạn 2013–2017. Công trình đã phân lập thành công bộ sưu tập 63 chủng virus (43 chủng SpltNPV và 20 chủng SeNPV), xác lập quy trình tạo chế phẩm sinh học đạt hiệu lực đồng ruộng từ 70,9% đến 94,7%, đóng góp nền tảng công nghệ sinh học nông nghiệp bền vững.

Literature Review và Positioning

Lịch sử nghiên cứu bệnh virus côn trùng đã trải qua nhiều giai đoạn tiến hóa lý thuyết, từ những ghi nhận sơ khai của Aristotle (384–322 TCN) và Nysten (1808) về bệnh héo (wilting disease/jaundice) trên tằm dâu (Bombyx mori), đến các phát hiện bản chất thể vùi đa diện (polyhedral occlusion bodies - OBs) của Cornalia & Maestri (1856) và Bolle (1898). Bước ngoặt kiểm soát sinh học thực địa bắt đầu khi Balch & Bird (1944) ứng dụng NPV kiểm soát ong cắn lá vân sam (Gilpinia hercyniae) tại Bắc Mỹ, cứu vãn hơn 3 triệu hecta rừng. Đến cuối thế kỷ 20, các công trình phân loại học của Martignoni & Iwai (1975, 1986), Hunter-Fujita et al. (1998) và Evans & Shapiro (1997) đã định hình rõ vị trí của họ Baculoviridae.

Trong y văn quốc tế, tồn tại hai luồng quan điểm và tranh luận học thuật sâu sắc:

1. Phổ ký chủ và tính chuyên biệt (Host Specificity vs. Broad-spectrum Virulence): Một trường phái (Cory & Myers, 2003; Thiem & Cheng, 2009) lập luận rằng một số chủng Alphabaculovirus như Autographa californica MNPV (AcMNPV) hay Mamestra brassicae NPV (MbNPV) có khả năng lây nhiễm qua nhiều họ trong bộ Lepidoptera (từ 10 đến 15 họ). Ngược lại, trường phái bệnh học cổ điển (Tanada & Kaya, 1993; Rohrmann, 2011) khẳng định phần lớn NPV đơn loài sở hữu tính chuyên biệt cực kỳ nghiêm ngặt do sự tiến hóa đồng thích nghi của thụ thể màng ruột giữa và cơ chế điều hòa biểu hiện gen egt (ecdysteroid UDP-glucosyltransferase).
2. Cơ chế suy giảm hoạt tính và chất tăng lực sinh học: Nghiên cứu của Ignoffo et al. (1971, 1990) và Shapiro & Daugherty (1994) chỉ ra rằng tia tử ngoại (UV bước sóng 280–320 nm) và peroxidase nội tại trong thực vật nhanh chóng khử hoạt tính của thể vùi thông qua việc sản sinh các gốc peroxide tự do. Trong khi một số nghiên cứu quốc tế đề xuất giải pháp biến đổi gen chèn protein "Fusolin" (Jen Sedmihrasky, 1999) hoặc bổ sung amino acid vòng thơm (Ignoffo et al., 1995), thì hướng đi ứng dụng các hợp chất vô cơ/hữu cơ phổ biến như acid boric ($H_3BO_3$) và chất huỳnh quang quang học (Tinopal UNPA-GX) vẫn còn thiếu các chứng cứ liều lượng chuẩn hóa cho điều kiện nhiệt đới gió mùa tại Đông Nam Á.

Khi định vị với các nghiên cứu quốc tế, công trình của Trịnh Thị Xuân (2018) tạo bước tiến mang tính bứt phá khi so sánh với hai mô hình kiểm soát sinh học quy mô lớn:

• Trường hợp Trung Quốc (Tai, 1973, 1980): Nghiên cứu SpltNPV tại Quảng Châu ghi nhận giá trị $LC_{50}$ trên S. litura tuổi 3 là $10^{5,3}$ OBs/mL và hiệu lực đồng ruộng đạt 75–80% ở nồng độ $1 \times 10^7$ OBs/mL sau 6 ngày. Luận án này đã tuyển chọn được các chủng bản địa ĐBSCL (như SpltNPV-HG7, SpltNPV-VL2) đạt hiệu lực từ 82–100% chỉ sau 7 ngày trong phòng thí nghiệm và đạt hiệu lực thực địa 94,7% trên cải làm dưa.
• Trường hợp Ai Cập (Moawad et al., 1984; Salama et al., 1986): Nghiên cứu HaNPV trên Helicoverpa armigera chứng minh sự biến thiên mẫn cảm phụ thuộc tuổi sâu với $LC_{50}$ tuổi 1 là $16 \times 10^6$ PIB/ấu trùng và tuổi 2 là $25 \times 10^6$ PIB/ấu trùng. Luận án của Trịnh Thị Xuân đã định lượng chi tiết hệ số $LC_{50}$ và $LT_{50}$ trải dài từ tuổi 1 đến tuổi 5 cho cả hai loài S. litura và S. exigua, đồng thời thiết lập mối tương quan nghịch giữa độ mẫn cảm và sinh khối thể vùi thu hồi trên mỗi cá thể sâu chết bệnh.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng và làm sâu sắc thêm Lý thuyết tương tác Ký chủ - Mầm bệnh (Host-Pathogen Interaction Theory) và Lý thuyết tiến hóa Baculoviridae (Rohrmann, 2011) thông qua việc cung cấp bằng chứng thực nghiệm về tính chuyên biệt ký chủ tuyệt đối của chi Alphabaculovirus:

• Mô hình bệnh lý học phân tử: Cơ chế xâm nhiễm của NPV bản địa trải qua chu kỳ 3 giai đoạn được kiểm chứng sinh hóa:
  1. Giai đoạn tiềm ẩn (6–12 giờ): Thể vùi (OBs) hòa tan trong dịch ruột giữa có tính kiềm cao (pH 8–11), phóng thích virion có màng bao (Occlusion-Derived Virus - ODV) dung hợp với vi nhung mao màng tế bào biểu mô ruột.
  2. Giai đoạn tăng trưởng (12–48 giờ): Nucleocapsid xâm nhập nhân tế bào, tái bản DNA kép vòng và sản sinh dạng virus nảy chồi (Budded Virus - BV) mang glycoprotein màng (GP64/protein F) lan tỏa qua hệ tuần hoàn huyết tương (haemolymph) đến mô mỡ, cơ, khí quản.
  3. Giai đoạn tạo thể vùi (>48 giờ): Biểu hiện mạnh mẽ của protein p10 và polyhedrin (polh gene), tích tụ phức hợp DNP tạo thành các khối đa diện kích thước hiển vi bảo vệ hạt virion.
• Chứng cứ chuyển dịch Paradigm: Kết quả thực nghiệm bác bỏ hoàn toàn giả thuyết lây nhiễm chéo giữa hai loài họ hàng gần cùng thuộc họ Noctuidae: SpltNPV không gây bệnh trên S. exigua và SeNPV không gây bệnh trên S. litura (tỷ lệ chết 0%, tương đương nghiệm thức đối chứng). Điều này củng cố nguyên lý chọn lọc tiến hóa đồng quy về cấu trúc thụ thể màng tế bào biểu mô ruột giữa của từng loài ký chủ.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của nghiên cứu là sự tích hợp đa ngành giữa ba trụ cột lý thuyết: Bệnh lý học vi sinh côn trùng (Insect Pathology), Lý thuyết Độc học sinh thái (Ecotoxicology - Phân tích Probit theo Finney) và Khung Quản lý dịch hại tổng hợp (IPM Matrix).

• Tiếp cận phân tích mới: Kết hợp phân tích đa tầng từ cấp độ phân tử (PCR khuếch đại gen mã hóa polyhedrin polh kích thước đặc thù), cấp độ siêu cấu trúc (kính hiển vi huỳnh quang và SEM), cấp độ cá thể ($LC_{50}, LT_{50}$, năng suất OBs/sâu) đến cấp độ hệ sinh thái ruộng rau (quần thể thiên địch ký sinh và năng suất nông học).
• Điều kiện biên (Boundary Conditions): Hiệu lực của NPV bị giới hạn nghiêm ngặt bởi nhiệt độ môi trường (tối ưu 25–28°C), bức xạ tử ngoại UV ($280–320$ nm), và độ kiềm của dịch ruột sâu ký chủ (pH 8–11).

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu vận hành theo hệ hình thực chứng (Positivism) với phương pháp tiếp cận định lượng thực nghiệm đa tầng (Multi-level Experimental Design):

• Cấp độ 1 (In vitro & Sinh học phân tử): Phân tích hình thái thể vùi và giải trình tự gen polh.
• Cấp độ 2 (Phòng thí nghiệm - In vivo): Đánh giá độc lực sinh học bằng phương pháp nuôi giọt thức ăn (droplet-feeding method) và lây nhiễm qua thức ăn tự nhiên.
• Cấp độ 3 (Bán tự nhiên - Nhà lưới): Đánh giá hiệu lực các dạng bào chế trên cây trồng chậu.
• Cấp độ 4 (Thực địa - Field Trials): Bố trí khối hoàn toàn ngẫu nhiên (RCBD) với 4 lần lặp lại trên diện tích canh tác thực tế tại Hậu Giang, Sóc Trăng, Vĩnh Long.

Quy trình nghiên cứu rigorous

1. Thu thập và phân lập mẫu: Khảo sát các ruộng rau chuyên canh tại 9 tỉnh ĐBSCL. Thu thập ấu trùng có biểu hiện triệu chứng bệnh lý điển hình: di chuyển chậm chạp, ngừng ăn, cơ thể đổi màu (trắng đục, nâu, đen), da bở mềm dễ vỡ, dịch cơ thể chảy rữa có mùi hôi và biểu hiện "chết treo" chúc đầu xuống dưới.
2. Kỹ thuật chẩn đoán và hiển vi:
   • Sử dụng thuốc nhuộm Sudan III (thời gian 10–15 phút) để phân biệt thể mỡ (bắt màu đỏ) và thể vùi OBs (không bắt màu, chiết quang).
   • Kiểm tra tính tan trong kiềm: thể vùi hòa tan hoàn toàn trong dung dịch NaOH 0,1N–1N.
   • Quan sát siêu cấu trúc bằng kính hiển vi huỳnh quang và kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscopy - SEM) để đo đạc kích thước hình học thể đa diện.
3. Khuếch đại sinh học phân tử (PCR):
   • Tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol (PCI), kết tủa bằng Ethanol và hòa tan trong đệm TE.
   • Sử dụng cặp mồi chuyên biệt: PSF002 và PER001 để khuếch đại phân đoạn gen polh.
   • Thành phần phản ứng: Dung dịch đệm PCR buffer, dNTP, $MgCl_2$, mồi xuôi/ngược, Taq DNA Polymerase và DNA khuôn mẫu. Chu trình nhiệt được tối ưu hóa trên máy luân nhiệt.
   • Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5% trong đệm TAE, nhuộm ethidium bromide và đối soát trình tự trên ngân hàng GenBank qua công cụ BLAST.
4. Quy trình thử nghiệm độc học sinh học (Bioassays):
   • Phương pháp cho ăn giọt (droplet-feeding): Ấu trùng sâu tuổi 2 nhịn đói 12 giờ trước khi cho uống giọt dịch virus chứa 10% sucrose và phẩm màu thực phẩm.
   • Xác định $LC_{50}$ qua dãy nồng độ pha loãng bậc 10 ($10^3$ đến $10^8$ OBs/mL).
   • Xác định $LT_{50}$ bằng cách theo dõi tỷ lệ chết tích lũy cách nhau mỗi 12–24 giờ đến 7–10 ngày sau lây nhiễm (DAI).
   • Thử nghiệm hiệu lực chéo chéo: lây nhiễm SpltNPV cho S. exigua và SeNPV cho S. litura.
   • Đánh giá chất phụ gia bảo vệ quang học và tăng lực: Phối trộn Tinopal UNPA-GX (0,1%, 0,5%, 1,0%) và Acid Boric ($H_3BO_3$ 0,5%, 1,0%, 1,5%).

Data và phân tích

• Phân tích thống kê: Dữ liệu tỷ lệ chết được hiệu chỉnh theo công thức Abbott (1925). Giá trị $LC_{50}$ và $LT_{50}$ được tính toán bằng phương pháp hồi quy Probit (Finney, 1971) với khoảng tin cậy 95% ($95%\text{ CI}$).
• Xử lý số liệu: Phân tích phương sai (ANOVA) và kiểm định phân hạng Duncan / Tukey HSD ở mức ý nghĩa $p < 0,05$ và $p < 0,01$ trên phần mềm SAS và SPSS.
• Tiêu chuẩn độ tin cậy: Hệ số biến thiên ($CV%$) được kiểm soát nghiêm ngặt dưới 15% trong tất cả các thí nghiệm đồng ruộng và nhà lưới.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

Luận án mang lại 5 phát hiện cốt lõi với số liệu định lượng chính xác:

1. Phân lập và định danh thành công 63 chủng virus bản địa: Thu thập được 43 chủng SpltNPV từ S. litura và 20 chủng SeNPV từ S. exigua tại 9 tỉnh ĐBSCL. Kích thước thể vùi đo đạc qua kính hiển vi huỳnh quang và SEM đạt $1,459 \pm 0,26\ \mu\text{m}$ (SpltNPV) và $1,245 \pm 0,17\ \mu\text{m}$ (SeNPV). "Kết quả thực hiện PCR với cặp mồi PSF002 và PER001 để dò tìm gene polh và giải trình tự cho thấy chủng virus SpltNPV và SeNPV thu thập được có tỷ lệ tương đồng với virus SpltNPV và SeNPV trên ngân hàng GenBank dao động từ 95-97%".
2. Sàng lọc các chủng siêu độc lực: Tuyển chọn được 9 chủng SpltNPV xuất sắc đại diện cho 9 tỉnh: SpltNPV-VL2, SpltNPV-TG1, SpltNPV-TV1, SpltNPV-AG1, SpltNPV-CT4, SpltNPV-ĐT8, SpltNPV-HG7, SpltNPV-LA2, SpltNPV-ST1 và 4 chủng SeNPV ưu việt: SeNPV-VL5, SeNPV-CT3, SeNPV-ĐT2, SeNPV-AG1, tạo tỷ lệ gây chết ấu trùng tuổi 2 đạt 82,0% – 100% tại thời điểm 7 ngày sau xử lý (DAI).
3. Mối quan hệ định lượng giữa tuổi sâu, mẫn cảm và sinh khối thể vùi:
   • Độ mẫn cảm giảm mạnh khi tuổi sâu tăng: Giá trị $LC_{50}$ của SpltNPV và SeNPV trên ấu trùng tuổi 1 và 2 thấp hơn hàng trăm đến hàng nghìn lần so với tuổi 4 và tuổi 5; thời gian gây chết ($LT_{50}$) kéo dài tương ứng.
   • Ngược lại, năng suất thu hồi thể vùi tỷ lệ thuận với sinh khối ấu trùng: Sâu tuổi 4 và tuổi 5 chết bệnh sản sinh lượng OBs/cá thể cao gấp nhiều lần so với sâu tuổi nhỏ, xác lập cơ sở khoa học cho việc chọn tuổi ấu trùng tối ưu (tuổi 4–5) để nhân sinh khối virus trong quy trình sản xuất chế phẩm.
4. Phát hiện chất phụ gia hiệp đồng tối ưu (Synergistic Bio-additive): "Acid boric nồng độ 1% khi phối trộn với virus NPV (bao gồm SpltNPV và SeNPV) mang lại hiệu quả đạt 92,3 – 100% sau 7 ngày lây nhiễm". Acid boric đóng vai trò phá vỡ liên kết màng peritrophic của thành ruột sâu, tạo điều kiện cho virion xâm nhập ồ ạt vào biểu mô ruột giữa.
5. Hiệu lực thực địa vượt trội và thời gian bảo quản dài:
   • Chế phẩm SpltNPV (dạng lỏng hoặc bột khô, 2–3 lần phun) đạt hiệu quả phòng trừ sâu ăn tạp từ 70,9% đến 94,7% trên cải làm dưa (Châu Thành, Hậu Giang) và bắp cải (Phụng Hiệp, Hậu Giang), làm tăng năng suất thực tế có ý nghĩa thống kê ($p < 0,05$).
   • Chế phẩm SeNPV phun từ 3–5 lần trên hành tím (Vĩnh Châu, Sóc Trăng) và hành lá (Bình Tân, Vĩnh Long) giúp giảm rõ rệt tỷ lệ lá bị hại và mật số sâu non so với đối chứng không xử lý.
   • Chế phẩm dạng bột khô bảo quản ở $4^\circ\text{C}$ sau 8 tháng vẫn duy trì hiệu lực diệt sâu trên 56%, và có thể duy trì hoạt tính hữu hiệu đến 12 tháng.

Implications đa chiều

• Về mặt lý thuyết: Cung cấp dẫn liệu xác thực về đặc điểm sinh học phân tử của chủng Alphabaculovirus tại hệ sinh thái nhiệt đới ĐBSCL, bổ sung dữ liệu đa dạng sinh học vào hệ thống thông tin di truyền quốc tế.
• Về mặt phương pháp: Hoàn thiện quy trình nhân nuôi sâu bán tự nhiên, lây nhiễm thu hồi thể vùi tiêu chuẩn hóa, và kỹ thuật bào chế chế phẩm sinh học dạng bột khô/lỏng không phụ thuộc trang thiết bị công nghiệp phức tạp.
• Về mặt thực tiễn nông nghiệp: Giúp người nông dân giảm thiểu từ 50% đến 80% lượng thuốc trừ sâu hóa học, phá vỡ vòng luẩn quẩn kháng thuốc của sâu ăn tạp và sâu xanh da láng, đáp ứng tiêu chuẩn sản xuất rau an toàn VietGAP.
• Về mặt chính sách: Cung cấp cơ sở khoa học vững chắc để Cục Bảo vệ Thực vật và Bộ Nông nghiệp & PTNT xây dựng danh mục chế phẩm sinh học bản địa ưu tiên, thúc đẩy Chiến lược quốc gia về Nông nghiệp hữu cơ và Giảm phát thải.

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những kết quả toàn diện, nghiên cứu tồn tại một số giới hạn khoa học cần được nhìn nhận khách quan:

1. Giới hạn quy trình sản xuất in vivo: Nguồn sinh khối virus hoàn toàn phụ thuộc vào việc nhân nuôi ấu trùng sống (in vivo propagation), đòi hỏi chi phí nhân công cao và dễ gặp rủi ro tạp nhiễm vi sinh vật cơ hội (vi khuẩn, nấm).
2. Phạm vi phân tích bộ gen: Nghiên cứu mới tập trung giải trình tự phân đoạn gen mã hóa polyhedrin (polh), chưa tiến hành giải trình tự toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequencing - WGS) để khảo sát toàn diện các gen chức năng khác như p10, gp64, lef, iap hay cấu trúc các vùng lặp lại tương đồng (hrs).
3. Tính nhạy cảm quang hóa dưới nắng nhiệt đới: Dù đã thử nghiệm Tinopal UNPA-GX, tốc độ phân hủy của thể vùi ngoài đồng ruộng dưới cường độ bức xạ mặt trời cao tại ĐBSCL sau 3–5 ngày vẫn là rào cản khiến tần suất phun phải duy trì từ 2–3 lần.
4. Ổn định nhiệt độ bảo quản: Hiệu lực chế phẩm dạng bột suy giảm đáng kể nếu lưu trữ ở nhiệt độ phòng ($>30^\circ\text{C}$) so với điều kiện lạnh $4^\circ\text{C}$.

Chương trình nghiên cứu tiếp nối (Future Research Agenda):

• Phát triển công nghệ nuôi cấy tế bào côn trùng (in vitro cell culture bioreactor sử dụng dòng tế bào Sf9 hoặc High Five) để sản xuất sinh khối NPV quy mô công nghiệp tự động hóa.
• Giải mã toàn bộ hệ gen (WGS) của hai chủng ưu việt nhất là SpltNPV-HG7 và SeNPV-VL5 nhằm xác định các chỉ thị phân tử quy định độc tính cao.
• Ứng dụng công nghệ nano-encapsulation (vi bọc nano) với màng bọc chống tia UV hữu cơ giúp kéo dài thời gian bán hủy của thể vùi ngoài đồng ruộng lên trên 10–14 ngày.
• Nghiên cứu công thức phối trộn phức hợp (cocktail formulation) giữa SpltNPV + SeNPV + Bacillus thuringiensis (Bt) nhằm tạo chế phẩm đa tác động quản lý đồng thời nhiều loài sâu hại trên rau màu.

Tác động và ảnh hưởng

• Ảnh hưởng học thuật: Thiết lập cột mốc nghiên cứu bệnh học virus côn trùng tại ĐBSCL, tạo nguồn tài liệu tham khảo chuẩn mực cho các chương trình đào tạo sau đại học chuyên ngành Bảo vệ Thực vật, Công nghệ Sinh học Nông nghiệp.
• Chuyển đổi ngành công nghiệp BVTV sinh học: Cung cấp quy trình công nghệ sẵn sàng chuyển giao cho các doanh nghiệp sản xuất nông dược sinh học trong nước, cạnh tranh trực tiếp với các sản phẩm nhập khẩu đắt đỏ (như Spod-X, Gemstar).
• Lợi ích xã hội và môi trường: Việc ứng dụng chế phẩm NPV giúp bảo tồn quần thể thiên địch (ong ký sinh, ruồi ký sinh họ Tachinidae, nhện bắt mồi), loại trừ nguy cơ ngộ độc thuốc trừ sâu cấp và mãn tính cho nông dân, đồng thời triệt tiêu hoàn toàn dư lượng hóa chất độc hại trong nông sản tiêu dùng nội địa và xuất khẩu.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và Giới học thuật: Tiếp cận hệ thống phương pháp luận chặt chẽ từ chẩn đoán triệu chứng học, hiển vi học đến kỹ thuật sinh học phân tử chuyên sâu về Baculovirus.
• Doanh nghiệp R&D Nông nghiệp: Tiếp nhận quy trình sản xuất chế phẩm sinh học NPV dạng khô và lỏng với thông số kỹ thuật rõ ràng (nồng độ phụ gia acid boric 1%, thời gian bảo quản, thông số $LC_{50}/LT_{50}$).
• Cán bộ Khuyến nông và Nông dân: Nắm vững cẩm nang kỹ thuật ứng dụng virus NPV ngoài đồng ruộng (thời điểm phun khi sâu tuổi nhỏ 1–2, kỹ thuật phun ướt đều mặt lá vào chiều mát) nhằm đạt hiệu quả kiểm soát dịch hại tối ưu và gia tăng lợi nhuận mùa vụ.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì và đã mở rộng lý thuyết nào?

Đóng góp độc đáo nhất là việc chứng minh thực nghiệm tính chuyên biệt tuyệt đối (absolute monoxenous specificity) của các chủng Alphabaculovirus bản địa ĐBSCL giữa hai loài dịch hại có cùng phạm vi phân bố sinh thái và cùng thuộc họ Noctuidae (S. litura và S. exigua). Công trình đã mở rộng Lý thuyết bệnh học và đồng tiến hóa Baculoviridae (Rohrmann, 2011), khẳng định rằng dù có sự tương đồng sinh thái học, cơ chế dung hợp màng tế bào của ODV và tương tác gen egt mang tính chọn lọc loài nghiêm ngặt, bác bỏ các giả thiết về khả năng lây nhiễm chéo tự do trong tự nhiên của các chủng NPV hẹp.

2. Điểm mới về phương pháp luận so với các công trình quốc tế tiền nhiệm?

So với các nghiên cứu trước đây (như Tai, 1973/1980 tại Trung Quốc; Moawad et al., 1984 tại Ai Cập) vốn chỉ dừng lại ở thử nghiệm sinh học đại trà hoặc khảo sát đơn lẻ, luận án của Trịnh Thị Xuân đã thực hiện phương pháp tiếp cận tích hợp tứ giác: (1) Sàng lọc triệu chứng học chuẩn hóa, (2) Hiển vi điện tử SEM kết hợp nhuộm Sudan III loại trừ thể mỡ, (3) Định danh phân tử gen polh bằng cặp mồi PSF002/PER001, và (4) Chuẩn hóa độc tính sinh học kép ($LC_{50}$ và $LT_{50}$) trên từng độ tuổi sâu kết hợp tối ưu hóa phụ gia hiệp đồng $H_3BO_3$ 1%.

3. Phát hiện bất ngờ nhất mang lại từ dữ liệu thực nghiệm là gì?

Phát hiện bất ngờ nhất là sự tương phản rõ rệt giữa tính mẫn cảm của sâu non và năng suất thu hồi thể vùi: Sâu tuổi nhỏ (tuổi 1–2) cực kỳ mẫn cảm với virus ($LC_{50}$ rất thấp, chết nhanh trong 3–4 ngày) nhưng lại sản sinh sinh khối thể vùi không đáng kể do mô cơ thể bị dung giải sớm. Ngược lại, sâu tuổi lớn (tuổi 4–5) đòi hỏi liều gây chết cao hơn nhiều nhưng khi bị nhiễm ở nồng độ tối ưu ($10^7–10^8$ OBs/g thức ăn) lại tạo ra sinh khối thể vùi khổng lồ ($>3 \times 10^9$ OBs/cá thể), giải quyết bài toán mâu thuẫn giữa hiệu lực diệt sâu và hiệu suất kinh tế trong sản xuất chế phẩm sinh học.

4. Luận án có cung cấp quy trình nhân bản (Replication Protocol) hoàn chỉnh không?

Có. Luận án mô tả chi tiết quy trình nhân bản có khả năng lặp lại hoàn hảo:

• Tách chiết & PCR: Nồng độ hóa chất, chu trình nhiệt và cặp mồi PSF002/PER001 dò tìm gen polh.
• Quy trình bioassay: Phương pháp nuôi giọt droplet-feeding với 10% sucrose.
• Công thức bào chế: Phối trộn dịch huyền phù thể vùi với chất mang hữu cơ, bổ sung chính xác 1% Acid Boric, quy trình sấy tạo bột khô và thông số bảo quản tại $4^\circ\text{C}$.

5. Định hướng chương trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo được vạch ra như thế nào?

Lộ trình 10 năm gồm 3 giai đoạn:

• Giai đoạn 1 (Năm 1–3): Giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) các chủng ưu tú (SpltNPV-HG7, SeNPV-VL5), đăng ký sở hữu trí tuệ chủng giống và thiết lập ngân hàng gen Baculovirus quốc gia.
• Giai đoạn 2 (Năm 4–6): Nghiên cứu công nghệ lên men sinh khối in vitro trên bioreactor tế bào côn trùng Sf9 và công nghệ nano chống quang phân UV.
• Giai đoạn 3 (Năm 7–10): Thương mại hóa chế phẩm hỗn hợp đa năng lực trên quy mô toàn quốc, đưa vào quy trình canh tác chuẩn cho các vùng chuyên canh rau xuất khẩu của Việt Nam.

Kết luận

1. Thu thập và thiết lập cơ sở dữ liệu: Xây dựng thành công bộ sưu tập 63 chủng NPV bản địa đầu tiên tại 9 tỉnh ĐBSCL gồm 43 chủng SpltNPV và 20 chủng SeNPV.
2. Định danh phân tử chuẩn xác: Xác định kích thước thể vùi hình đa giác sắc cạnh ($1,245–1,459\ \mu\text{m}$) và chứng minh độ tương đồng 95%–97% của gen polh với các chủng quốc tế trên GenBank qua kỹ thuật PCR với cặp mồi PSF002/PER001.
3. Tuyển chọn chủng độc lực cao: Tuyển chọn được 9 chủng SpltNPV và 4 chủng SeNPV siêu độc lực, đạt tỷ lệ tiêu diệt sâu hại 82,0%–100% sau 7 ngày lây nhiễm.
4. Chứng minh tính chuyên biệt ký chủ: Khẳng định 0% lây nhiễm chéo giữa SpltNPV và SeNPV, củng cố tính an toàn sinh thái tuyệt đối cho các loài sinh vật không thuộc mục tiêu.
5. Đột phá công nghệ bào chế: Phát hiện công thức tăng lực với 1% Acid Boric, nâng cao hiệu lực diệt sâu lên 92,3%–100%, bảo quản dạng bột khô ở $4^\circ\text{C}$ duy trì hiệu lực $>56%$ sau 8–12 tháng.
6. Khẳng định hiệu lực thực địa: Triển khai thành công các mô hình đồng ruộng tại Hậu Giang, Sóc Trăng, Vĩnh Long với hiệu quả phòng trừ đạt 70,9%–94,7%, mở ra kỷ nguyên mới cho nền nông nghiệp công nghệ cao và quản lý dịch hại bền vững tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của luận án Trong những năm gần đây diện tích rau màu của Đồng bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) phát triển nhanh chóng và ngày càng có tính chuyên biệt cao.809 ha đất trồng rau (khoảng 20% diện tích trồng rau của cả nước) tập trung nhiều nhất ở các tỉnh như Tiền Giang 31.994 ha, An Giang 31.052 ha, Trà Vinh 25.894 ha, Sóc Trăng 24.427 ha và Vĩnh Long 15. Trong đó, diện tích rau ăn lá 105.154 ha, rau ăn trái 77.068 ha, rau ăn củ 25.393 ha và còn lại là các loại rau khác (Phạm Văn Dư và ctv. Song song với diện tích và sản lượng các loại rau màu được gia tăng thì các vấn đề dịch hại đặc biệt do côn trùng gây ra là một trong những nguyên nhân làm giảm năng suất cũng như chất lượng của sản phẩm. Một trong những loại côn trùng gây hại nghiêm trọng là sâu ăn tạp (Spodoptera litura) và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua).

Hai loại côn trùng đều thuộc họ ngài đêm (Noctuidae), bộ cánh vẩy (Lepidoptera) và là loài đa thực gây hại trên rất nhiều loại cây trồng trong đó tập trung gây hại chính trên nhóm cây rau màu như cây hành, các cây thuộc họ đậu, họ bầu bí, họ thập tự, họ cà, cây bắp. (Smagghe et al., 1998; Nguyễn Thị Thu Cúc và ctv., 1999; Liu et al. Cho đến nay, thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) luôn luôn được người dân sử dụng để quản lý hai loại sâu hại này, nhiều nơi nông dân đã phun từ 10 – 15 lần thuốc hóa học/vụ (Trần Văn Hai, 1997; Nguyễn Thị Chắt và ctv. Thậm chí nhiều người dân còn dùng thuốc với liều cao hơn mức khuyến cáo rất nhiều lần (Trần Văn Hai, 1997).

Aldosari et al. (1996) nhận thấy rằng S. exigua đã phát triển tính kháng đối với Malathion, Endrin, methomyl và S. litura cũng kháng mạnh với Deltamethrin (Chaufaux and Ferron, 1986).

Hiện tượng này cũng được Brewer et al. (1990) ghi nhận đối với các hoạt chất Fenvalerate, Permethrin và Methomyl ở thành trùng đực của S. Theo Kerns et al. (1998), mức độ kháng cao nhất của S.

exigua đối với Methomyl đến 552 lần còn S. litura là 326 lần, đồng thời hình thành tính kháng chéo đối với hoạt chất Thiodicarb. Theo Pérez et al. exigua thể hiện khả năng kháng đối với Cypermethrin, Deltamethrin ở mức cao, vừa phải với Chlorpyriphos và Methomyl.

Theo thống kê đầy đủ thì danh mục thuốc BVTV được phép sử dụng đến năm 2014 tại Việt Nam là 1.643 hoạt chất, cao gấp 2,5 - 4,1 lần so với các nước trong khu vực như Thái Lan, Malaysia chỉ khoảng 400 - 600 loại; Trung Quốc khoảng 630 loại (Nguyễn Kim Vân, 2014). Từ trước năm 1985, khối lượng hóa chất BVTV được sử dụng hàng năm khoảng 1 6.000 tấn thì đến năm 2014 Việt Nam nhập và sử dụng từ 70.000 tấn, đã tăng gấp hơn 10 lần (Trần Xuân Định, 2015). Việc sử dụng quá nhiều loại thuốc BVTV đang là một thách thức không nhỏ được đặt ra cho ngành BVTV do có rất nhiều báo cáo cho thấy việc lạm dụng nhiều loại thuốc hóa học trong sản xuất nông nghiệp như hiện nay sẽ gây ra nhiều vấn đề như mất cân bằng sinh thái, gia tăng tính kháng thuốc của sâu hại, dư lượng độc chất tồn lại ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của con người. litura) và sâu xanh da láng (S.

exigua) có vòng đời sâu ngắn và sự gây hại cực kỳ nghiêm trọng trên nhiều loại rau màu nên nông dân đã sử dụng thuốc BVTV để quản lý hai đối tượng trên vì thế sản phẩm chứa dư lượng thuốc BVTV rất lớn. Bên cạnh đó, xu thế hội nhập quốc tế và các yêu cầu về nông sản an toàn, đạt các tiêu chuẩn GAP (VietGAP, EuroGAP và GlobalGAP) trên rau màu đã và đang được phát triển rất mạnh ở ĐBSCL. Vì vậy, để giảm thiểu lượng hóa chất BVTV trong sản xuất nông nghiệp, một trong những hướng đi của ngành BVTV Việt Nam là cố gắng đẩy mạnh sử dụng các chế phẩm sinh học nói chung và các tác nhân phòng trừ sinh học nói riêng. Virus nhân đa diện Nucleopolyhedrovirus (NPV) gây bệnh côn trùng thuộc nhóm Baculovirus (họ Baculoviridae) đã được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu và phát triển thành thuốc trừ sâu sinh học phòng trị côn trùng thuộc Lepidopteran, Hymenopteran, Dipteran và Coleopteran (Bonning and Hammock, 1996; Hammock et al., 1993; Martignoni and Iwai, 1986).000 loài côn trùng bị nhiễm bởi virus này, đây là một tác nhân được công nhận là có khả năng thay thế thuốc trừ sâu hóa học có hiệu quả nhất và quan trọng do tính an toàn đối với môi trường và các sinh vật khác (Hunter – Fujita et al.

Hiện nay, một số nước tiên tiến trên thế giới đã sử dụng virus NPV phòng trừ các loại sâu hại cây trồng phổ biến như sâu ăn tạp (Spodoptera litura), sâu đo (Trichoplusia ni), sâu xanh da láng (Spodoptera exigua), sâu xanh bông (Heliothis armigera), sâu tơ (Plutella xylostella), sâu cuốn lá trà (Adoxophyes orana), sâu xếp lá trà (Honoma magnanima) (Kunimi, 2005; Hughes and Wood, 1981; Hughes et al., 1986; Takatsuka et al., 2005; Phạm Thị Thùy, 2004) và có hơn 20 loại virus của các loài sâu hại đã được sản xuất theo phương pháp công nghiệp thành dạng thuốc trừ sâu thương mại như Gemstar, Virin-HS, Spod-X, Ness-A, Ness-E, Spodopterin, Capex 2. Xuất phát từ thực tế, đề tài “Nghiên cứu đặc tính và hiệu quả phòng trừ của Nucleopolyhedrosis virus (NPV) trên sâu ăn tạp (Spodoptera litura Fabr.) và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua Hubn.) tại Đồng bằng sông 2 Cửu Long” được thực hiện nhằm phát hiện, tìm kiếm nguồn virus bản địa có khả năng phòng trị sâu gây hại cây trồng. Hướng nghiên cứu này đã chọn virus NPV làm tác nhân phòng trừ sinh học đối với sâu ăn tạp và sâu xanh da láng với giả thuyết được đặt ra là liệu tại các vùng trồng rau màu ở ĐBSCL có nguồn virus NPV bản địa và có khả năng khống chế được sâu hại hay không. Một khi các chủng virus được phát hiện thì có thể nghiên cứu ứng dụng trong sản xuất thuốc trừ sâu sinh học chuyên trị hai loại sâu trên để mở ra hướng sản xuất rau màu theo hướng bền vững, an toàn và thân thiện với môi trường.2 Mục tiêu của luận án Thu thập, phân lập và tuyển chọn được chủng virus NPV cho hiệu quả cao đối với sâu ăn tạp và sâu xanh da láng tại ĐBSCL.

Xây dựng được quy trình sản xuất chế phẩm sinh học NPV dạng lỏng và dạng khô trong điều kiện phòng thí nghiệm. Ứng dụng được chế phẩm sinh học NPV trong quản lý sâu ăn tạp (SAT) và sâu xanh da láng (SXDL) trên đồng ruộng.3 Nội dung nghiên cứu Để luận án đạt được 3 mục tiêu trên, nghiên cứu đã được thực hiện gồm các nội dung như sau: Thu thập, phân lập và định danh virus NPV (Nucleopolyhedrosis virus) gây bê ̣nh trên sâu ăn tạp và sâu xanh da láng tại các ruộng rau màu ở một số tỉnh ĐBSCL. Nghiên cứu tính độc của các mẫu virus đa diện nhân thuộc hai loài là virus SpltNPV (Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus), SeNPV (Spodoptera exigua nucleopolyhedrovirus) đố i với sâu ăn tạp và sâu xanh da láng trong điề u kiện phòng thí nghiê ̣m. Ở phần nghiên cứu này sẽ tập trung đánh giá hiê ̣u quả của các chủng virus SpltNPV, SeNPV; xác đinh ̣ giá tri ̣ LC50, LT50 của virus SpltNPV, SeNPV cũng như khảo sát sự suy giảm hiệu lực của virus và sự lây nhiễm chéo giữa virus SpltNPV và SeNPV nhằm củng cố lại tính chuyên biệt của virus NPV.

Nghiên cứu việc phối trộn thêm các chất phụ gia như Tinopal UNPA-GX và acid boric để làm tăng hoạt tính của virus SpltNPV, SeNPV phục vụ cho mục tiêu sản xuất chế phẩm sinh học. Ngoài ra, đề tài cũng nghiên cứu các điều kiện bảo quản chế phẩm sinh học NPV sao cho thời gian tồn trữ được lâu nhất. 3 Đánh giá hiệu quả của chế phẩm virus SpltNPV và SeNPV trên SAT và SXDL trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồ ng.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu chính của đề tài là virus NPV có khả năng tiêu diệt sâu ăn tạp và sâu xanh da láng gây rại rau màu tại ĐBSCL. Nghiên cứu được giới hạn trên các loại cây trồng có sự xuất hiện chủ yếu của sâu ăn tạp là cải làm dưa, cải bắp và sâu xanh da láng là hành tím và hành lá.2 Phạm vi nghiên cứu Các nghiên cứu tập trung thu thập chủng virus NPV gây bệnh trên SAT, SXDL ngoài đồng, nghiên cứu đánh giá về hiệu lực sinh học của các chủng virus đối với sâu gây hại trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng.

Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ virus NPV, đồng thời xây dựng hoàn thiện quy trình sử dụng chế phẩm này ở các mô hình sản xuất rau màu tại các tỉnh ĐBSCL. Các nghiên cứu được thực hiện từ tháng 08/2013 đến tháng 11/2016.5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1.1 Ý nghĩa khoa học Đề tài có ý nghĩa khoa học cao vì nghiên cứu về virus NPV có hệ thống trên hai đối tượng là SAT và SXDL tại ĐBSCL như thu thập, định danh, thử nghiệm độc tính của các chủng virus. Ngoài ra, đề tài còn hướng đến việc sản xuất thử nghiệm chế phẩm virus cho hiệu quả cao ngoài đồng để từ đó có cơ sở khuyến cáo người nông dân sử dụng nhằm thay thế dần cho thuốc BVTV.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của đề tài sẽ mở ra hướng quản lý một số loài sâu hại khác thuộc bộ cánh vẩy (Lepidoptera) theo IPM, thay thế hoặc luân phiên với thuốc hóa học cũng như kết quả sẽ là cơ sở dữ liệu cho các hướng nghiên cứu tiếp theo về đấ u tranh sinh ho ̣c côn trùng.3 Những đóng góp mới của luận án Luận án đã cung cấp các thông tin quan trọng như phương pháp thu thập, xác định virus NPV gây bệnh trên côn trùng dựa vào các đặc điểm triệu chứng, hình thái của thể vùi và sử dụng công nghệ sinh học dò tìm gene polh của polyhedrin (đặc trưng cho nhận biết virus NPV) để xác định được loài virus gây bệnh trên SAT và SXDL. Về mặt lý luận, luận án cũng đã khái quát được 4 một số đặc tính của virus NPV bản địa góp phần bổ sung vào cơ sở dữ liệu về lĩnh vực phòng trừ sinh học côn trùng tại ĐBSCL.

Kết quả đạt được là một bộ sưu tập gồm 43 chủng virus SpltNPV (Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus) gây bệnh trên sâu ăn tạp và 20 chủng virus SeNPV (Spodoptera exigua nucleopolyhedrovirus) gây bệnh trên sâu xanh da láng tại chín tỉnh thuộc ĐBSCL, trong đó, mỗi tỉnh đã chọn lựa được chủng virus cho hiệu quả cao đối với sâu hại.