Luận văn thạc sĩ sinh học: Nghiên cứu virus đậu tương và biện pháp phòng trừ

Nghiên cứu đặc điểm đoạn gen mã hóa protein vỏ từ virus đậu nành, cung cấp thông tin quan trọng cho lĩnh vực sinh học phân tử và nông nghiệp.

• Tác giả: Hoàng Thị Hải Yến
• Người hướng dẫn: GS. Chu Hoàng Mậu
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên cứu về virus đậu tương và biện pháp phòng trừ
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• Trang phụ bìa
• Lời cam đoan
• Danh mục các chữ viết tắt
• Danh mục các bảng
• Danh mục các hình
• MỞ ĐẦU
• Lý do chọn đề tài
• Mục tiêu nghiên cứu
• Nội dung nghiên cứu
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Đặc điểm sinh học của cây đậu tương
• 1.2. Giá trị kinh tế của cây đậu tương
• 1.3. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và ở Việt Nam
• 1.4. Soybean mosaic virus (SMV)
• 1.4.1. Bệnh virus hại
• 1.4.2. Kí chủ, phương thức truyền bệnh
• 1.4.3. Triệu chứng của bệnh
• 1.4.4. Biện pháp phòng trừ
• 1.4.5. Protein vỏ (CP) và gen mã hóa protein vỏ của SMV
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ
• 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.1.2. Hóa chất và thiết bị
• 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu
• 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.2.1. Phương pháp thu mẫu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. KẾT QUẢ THU THẬP MẪU
• 3.2. SỰ ĐA DẠNG CỦA CÁC DÒNG SMV
• 3.3. Đa dạng về trình tự amino acid suy diễn từ CP
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về virus đậu tương và tác động của chúng

Virus đậu tương, đặc biệt là Soybean mosaic virus (SMV), là một trong những mối đe dọa lớn nhất đối với cây đậu tương. Chúng gây ra nhiều triệu chứng nghiêm trọng, ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng hạt. Việc hiểu rõ về virus này là rất cần thiết để có biện pháp phòng trừ hiệu quả.

1.1. Đặc điểm sinh học của virus đậu tương

Virus đậu tương thuộc nhóm virus RNA, có khả năng lây lan nhanh chóng qua các phương tiện như côn trùng và hạt giống. Chúng có thể tồn tại trong môi trường và gây hại cho cây trồng trong thời gian dài.

1.2. Tác động của virus đậu tương đến năng suất

Nhiễm virus đậu tương có thể làm giảm năng suất cây trồng từ 20% đến 50%. Các triệu chứng như lá vàng, khảm và giảm khả năng sinh trưởng là những dấu hiệu điển hình của sự nhiễm virus.

II. Vấn đề và thách thức trong việc phòng trừ virus đậu tương

Việc phòng trừ virus đậu tương gặp nhiều khó khăn do tính chất lây lan nhanh và khả năng tồn tại lâu dài của virus trong môi trường. Các biện pháp hiện tại chưa đủ hiệu quả để kiểm soát sự lây lan của virus.

2.1. Nguyên nhân gây ra sự lây lan của virus

Sự lây lan của virus đậu tương chủ yếu do côn trùng như rệp và môi trường canh tác không đảm bảo. Việc sử dụng giống cây không kháng virus cũng là một nguyên nhân chính.

2.2. Thách thức trong việc phát hiện và kiểm soát virus

Việc phát hiện virus đậu tương thường khó khăn do triệu chứng không rõ ràng ở giai đoạn đầu. Điều này dẫn đến việc không kịp thời áp dụng biện pháp phòng trừ.

III. Phương pháp nghiên cứu virus đậu tương hiệu quả

Nghiên cứu về virus đậu tương cần áp dụng các phương pháp hiện đại như phân tích gen và công nghệ sinh học. Những phương pháp này giúp xác định chính xác loại virus và tìm ra biện pháp phòng trừ hiệu quả.

3.1. Phân tích gen virus đậu tương

Phân tích gen giúp xác định cấu trúc và đặc điểm của virus, từ đó phát triển các giống cây kháng virus. Nghiên cứu này cũng cung cấp thông tin quan trọng cho việc phát triển thuốc trừ virus.

3.2. Ứng dụng công nghệ sinh học trong phòng trừ virus

Công nghệ sinh học có thể giúp tạo ra các giống đậu tương kháng virus, giảm thiểu thiệt hại do virus gây ra. Việc ứng dụng này đang được nghiên cứu và phát triển tại nhiều cơ sở nghiên cứu.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu về virus đậu tương đã cho thấy nhiều kết quả khả quan trong việc phát triển giống cây kháng virus. Những ứng dụng này không chỉ giúp tăng năng suất mà còn cải thiện chất lượng hạt đậu tương.

4.1. Kết quả từ các nghiên cứu thực địa

Các nghiên cứu thực địa cho thấy giống đậu tương kháng virus có khả năng sinh trưởng tốt hơn và năng suất cao hơn so với giống truyền thống. Điều này chứng tỏ hiệu quả của việc áp dụng công nghệ sinh học.

4.2. Ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

Việc áp dụng các giống đậu tương kháng virus trong sản xuất nông nghiệp đã giúp nông dân giảm thiểu thiệt hại và tăng thu nhập. Đây là một bước tiến quan trọng trong việc phát triển bền vững ngành nông nghiệp.

V. Kết luận và triển vọng tương lai trong nghiên cứu virus đậu tương

Nghiên cứu về virus đậu tương cần tiếp tục được đẩy mạnh để tìm ra các biện pháp phòng trừ hiệu quả hơn. Tương lai của ngành nông nghiệp phụ thuộc vào khả năng kiểm soát virus và phát triển giống cây kháng virus.

5.1. Tương lai của nghiên cứu virus đậu tương

Nghiên cứu sẽ tiếp tục tập trung vào việc phát triển các giống cây kháng virus và cải thiện kỹ thuật canh tác. Điều này sẽ giúp nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm.

5.2. Định hướng phát triển bền vững

Định hướng phát triển bền vững trong sản xuất đậu tương sẽ bao gồm việc áp dụng công nghệ sinh học và các biện pháp canh tác thân thiện với môi trường. Điều này không chỉ bảo vệ cây trồng mà còn bảo vệ hệ sinh thái.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Cây đậu tương (Glycine max) giữ vị trí chiến lược trong nền nông nghiệp toàn cầu và an ninh lương thực nhờ hàm lượng dinh dưỡng vượt trội, chứa 30% đến 45% protein thực vật và 19% đến 25% lipit. Tại Việt Nam, đậu tương được canh tác trên cả 7 vùng sinh thái nông nghiệp nhằm giải quyết nhu cầu đạm cho người, vật nuôi và cải tạo độ phì của đất. Tuy nhiên, năng suất đậu tương nội địa chỉ đạt từ 1,39 đến 1,51 tấn/ha, chỉ tương đương 50% đến 70% mức bình quân thế giới. Đặc biệt, sản lượng năm 2012 từng sụt giảm mạnh 34,3% xuống còn 175,3 nghìn tấn do tác động nghiêm trọng của sâu bệnh và biến đổi khí hậu.

Trong số các tác nhân sinh học gây hại, Soybean mosaic virus (SMV) thuộc chi Potyvirus là nguyên nhân hàng đầu gây nên bệnh khảm lá. Virus này làm suy giảm từ 40% đến 94% năng suất cá thể và khiến trên 91% hạt thu hoạch bị loang lổ mất phẩm chất nếu cây nhiễm bệnh ở giai đoạn sớm. Việc phòng trừ bằng hóa chất hầu như không mang lại hiệu quả do virus cư trú sâu trong hệ mạch dẫn và lan truyền nhanh qua hơn 32 loài rệp môi giới.

Đề tài tập trung phân lập, tách dòng và giải mã đặc điểm phân tử của gen mã hóa protein vỏ (Coat Protein - CP) từ mẫu virus SMV gây hại tại hai vùng trọng điểm là Thái Nguyên và Sơn La trong giai đoạn 2013 - 2014. Việc làm rõ cấu trúc di truyền gen CP cung cấp dữ liệu chuẩn hóa cấp độ phân tử, đặt nền tảng vững chắc cho công tác thiết kế cấu trúc can thiệp RNA (RNAi) nhằm phục vụ chọn tạo giống đậu tương chuyển gen kháng bệnh bền vững.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết di truyền phân tử virus thực vật và cơ chế gây bệnh của họ Potyviridae. Hệ gen của virus SMV là một sợi đơn RNA dương dài khoảng 9600 nucleotide, mã hóa cho một chuỗi polyprotein gồm 3066 amino acid, sau đó được phân cắt thành 10 chuỗi polypeptide chức năng. Trong cấu trúc virion hình que dài 750 nm, vỏ protein (capsid) được tạo thành từ khoảng 2000 tiểu phần protein vỏ CP với trọng lượng phân tử dao động từ 30 đến 36 kDa.

Lý thuyết can thiệp RNA (RNAi) đóng vai trò định hướng ứng dụng, xác định gen CP là đích chuyển gen lý tưởng nhờ tính bảo thủ cao và chức năng sinh học cốt lõi trong bảo vệ hệ gen, vận chuyển nội bào cũng như truyền lan qua côn trùng. Các khái niệm trung tâm gồm: vùng nhận diện Poty-coat, phân tử cDNA phiên mã ngược, vector tách dòng pBT và cơ chế biến nạp gen trong hệ thống vi sinh vật.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu bắt nguồn từ việc điều tra và thu thập mẫu lá đậu tương có triệu chứng khảm, xoăn ngọn điển hình tại các vùng chuyên canh thuộc tỉnh Thái Nguyên và Sơn La. Phương pháp chọn mẫu chủ đích được áp dụng, thu thập 100 mg mô lá non có mật độ virus cao để bảo quản ngay trong nitơ lỏng hoặc nhiệt độ âm sâu từ -30°C đến -85°C.

Quy trình phân tích phân tử được thiết kế chặt chẽ qua các giai đoạn kỹ thuật:

• Tách chiết RNA tổng số bằng bộ kit GeneJET Plant RNA Purification nhằm loại bỏ triệt để ribonuclease tạp nhiễm.
• Tổng hợp cDNA sợi một qua phản ứng phiên mã ngược với enzyme RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase tại 42°C trong 60 phút.
• Nhân bản đoạn gen đích bằng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi chuyên biệt SMVCP-F và SMVCP-R qua 35 chu kỳ nhiệt.
• Tinh sạch phân tử DNA bằng bộ kit QIAquick DNA Gel Extraction, gắn vào vector tách dòng pBT bằng enzyme T4 DNA Ligase và biến nạp sốc nhiệt vào tế bào khả biến Escherichia coli chủng DH5α.
• Sàng lọc khuẩn lạc tái tổ hợp bằng Colony-PCR qua 30 chu kỳ nhiệt với cặp mồi pUC18-F và pUC18-R trên gel agarose 1%.
• Giải trình tự nucleotide tự động trên hệ thống ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer và xử lý dữ liệu phát sinh chủng loại bằng phần mềm chuyên dụng BioEdit kết hợp DNASTAR.

Phương pháp sinh học phân tử này được lựa chọn vì mang lại độ chính xác tuyệt đối, loại trừ hoàn toàn các nhầm lẫn hình thái học ngoài đồng ruộng.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình phân tích thực nghiệm đã đạt được các kết quả định lượng chuẩn xác:

• Đoạn gen mã hóa protein vỏ CP từ dòng SMV thu thập tại Sơn La (ký hiệu dòng SL3) được nhân bản thành công qua kỹ thuật RT-PCR, cho một băng điện di duy nhất có kích thước khoảng 0,7 kb (720 bp). Sản phẩm kiểm tra khuẩn lạc tái tổ hợp Colony-PCR đạt kích thước chuẩn khoảng 0,9 kb do chứa thêm đoạn liên kết trên vector pBT.
• Trình tự đoạn gen CP của dòng SL3 gồm chính xác 720 nucleotide. Khi đối sánh với trình tự quốc tế mang mã số X63771 trên GenBank, mức độ tương đồng đạt tới 99,4% (716/720 nucleotide trùng khớp). Sự sai khác chỉ xuất hiện tại 4 vị trí nucleotide: nucleotide số 11 (G chuyển thành T), 278 (A chuyển thành T), 708 (G chuyển thành C) và 712 (A chuyển thành T).
• Chuỗi polypeptide suy diễn từ gen CP dòng SL3 gồm 240 amino acid, trong đó chứa vùng Poty-coat đặc trưng kéo dài 208 amino acid (từ vị trí 33 đến 240). Mức độ tương đồng amino acid giữa dòng SL3 và chuỗi chuẩn CAA45307 đạt 98,75%, chỉ sai khác tại 3 vị trí: amino acid số 4 (Glycine đổi thành Valine), số 93 (Tyrosine đổi thành Phenylalanine) và số 238 (Isoleucine đổi thành Phenylalanine).
• Toàn bộ vùng Poty-coat của dòng SL3 thể hiện mức độ bảo thủ vượt trội trên 99% khi chỉ sai khác 2 vị trí amino acid so với chủng đối chiếu.

Thảo luận kết quả

Sự biến dị 4 nucleotide trên tổng số 720 vị trí thể hiện tính ổn định di truyền cao của dòng virus SMV lưu hành tại vùng núi phía Bắc Việt Nam. Đáng chú ý, đột biến tại vị trí nucleotide thứ 708 (G thay bằng C) là một đột biến đồng nghĩa, hoàn toàn không làm thay đổi cấu trúc chuỗi polypeptide suy diễn. Hai đột biến thay thế amino acid còn lại nằm ở các đoạn không thuộc trung tâm hoạt động, đảm bảo chức năng sinh học bình thường của capsid virus.

Khi so sánh đa dòng với 9 trình tự gen CP công bố từ Mỹ, Nhật Bản, Hàn Quốc và Trung Quốc, hệ số tương đồng nucleotide duy trì trong khoảng 98% đến 99,5%. Dữ liệu cấu trúc phân tử này được trực quan hóa rõ nét thông qua biểu đồ điện di agarose, bảng ma trận khoảng cách di truyền và sơ đồ cây phát sinh chủng loại xây dựng theo phương pháp Neighbor-Joining. Kết quả khẳng định phân đoạn 713 bp bảo thủ (từ nucleotide số 7 đến 719) là nguồn vật liệu tối ưu để thiết kế các cấu trúc can thiệp RNA.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm ứng dụng hiệu quả kết quả nghiên cứu vào thực tiễn sản xuất nông nghiệp, 4 giải pháp trọng tâm được kiến nghị:

• Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen hairpin RNAi chứa đoạn gen bảo thủ 713 bp của gen CP, đặt mục tiêu nâng cao tỷ lệ kháng virus SMV đạt từ 85% đến 90% trên các dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T1 trong giai đoạn 2026 - 2027, do Viện Công nghệ Sinh học và Viện Di truyền Nông nghiệp chủ trì thực hiện.
• Ứng dụng quy trình RT-PCR và Colony-PCR đã chuẩn hóa vào hệ thống kiểm định bệnh thực vật cấp quốc gia, hướng tới mục tiêu giảm tỷ lệ hạt giống nhiễm virus lưu hành từ trên 30% xuống dưới 5% từ quý I/2026, do Trung tâm Khảo kiểm nghiệm Giống và Cây trồng Quốc gia triển khai.
• Xây dựng bản đồ dịch tễ học phân tử giám sát các chủng biến thể SMV tại 7 vùng nông nghiệp sinh thái, đảm bảo cập nhật định kỳ 100% dữ liệu trình tự gen đột biến trong giai đoạn 2026 - 2028, do Cục Bảo vệ Thực vật phối hợp với các Sở Nông nghiệp địa phương thực hiện.
• Hoàn thiện gói kỹ thuật canh tác tích hợp, đẩy mạnh kiểm soát quần thể hơn 32 loài rệp môi giới truyền bệnh thông qua bẫy dính sinh học và luân canh cây trồng, phấn đấu cắt giảm từ 40% đến 50% thiệt hại do dịch bệnh virus trên đồng ruộng từ vụ Đông 2026, do hệ thống Khuyến nông các tỉnh phía Bắc phụ trách.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu mang lại giá trị học thuật và thực tiễn phong phú cho 4 nhóm đối tượng:

• Các nhà nghiên cứu và nghiên cứu sinh chuyên ngành Di truyền học, Vi sinh vật học và Công nghệ sinh học: Khai thác quy trình kỹ thuật tách chiết RNA, nhân bản RT-PCR và tách dòng gen virus thực vật làm tài liệu tham khảo chuẩn mực cho các đề tài tương đương.
• Chuyên gia chọn tạo giống tại các Viện nghiên cứu cây trồng: Sử dụng dữ liệu trình tự 720 nucleotide của gen CP làm vật liệu di truyền nền tảng để thiết kế vector chuyển gen kháng bệnh cho các giống đậu tương chủ lực.
• Cán bộ kỹ thuật kiểm dịch và bảo vệ thực vật tại các cơ quan quản lý: Ứng dụng bộ mồi đặc hiệu SMVCP-F/R trong công tác chẩn đoán phân tử nhanh, giúp phân loại chính xác các mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm tại cửa khẩu và đồng ruộng.
• Giảng viên và sinh viên các trường đại học khối Nông - Lâm - Sinh: Sử dụng làm học liệu minh họa sinh động cho các học phần Di truyền phân tử, Bệnh học thực vật và Kỹ thuật thao tác gen.

Câu hỏi thường gặp

• Virus SMV gây thiệt hại như thế nào đối với sản xuất đậu tương? Soybean mosaic virus làm suy giảm từ 40% đến 94% năng suất cây trồng và khiến 91% hạt có đốm vỏ. Virus này ký sinh bắt buộc trong hệ mạch dẫn, gây rối loạn quang hợp khiến lá xoăn khảm, làm cây còi cọc và thoái hóa giống nghiêm trọng.

• Đoạn gen CP của dòng SMV-SL3 có những điểm đặc trưng gì? Đoạn gen CP phân lập từ dòng SL3 gồm 720 nucleotide, mã hóa 240 amino acid với vùng Poty-coat dài 208 amino acid. Trình tự này đạt mức độ tương đồng 99,4% về nucleotide và 98,75% về amino acid so với chủng chuẩn quốc tế X63771.

• Vì sao phương pháp RT-PCR vượt trội hơn chẩn đoán hình thái học truyền thống? Triệu chứng khảm lá ngoài đồng ruộng rất dễ nhầm lẫn giữa 27 loài virus khác nhau gây hại trên cây đậu tương. Phương pháp RT-PCR khuếch đại trực tiếp đoạn cDNA đặc hiệu 0,7 kb, cho kết quả chẩn đoán chính xác tuyệt đối ở cấp độ phân tử.

• Ý nghĩa của vùng trình tự bảo thủ 713 bp trong công nghệ can thiệp RNA là gì? Vùng bảo thủ 713 bp giữ nguyên cấu trúc qua nhiều thế hệ tiến hóa của virus. Việc tạo vector RNAi dựa trên đoạn trình tự này giúp kích hoạt cơ chế phân hủy mRNA mục tiêu, tạo khả năng kháng bền vững chống lại nhiều chủng SMV khác nhau.

• Biện pháp nào kiểm soát sự lây lan của virus SMV trên đồng ruộng hiệu quả nhất? Biện pháp tối ưu là kết hợp sử dụng nguồn hạt giống sạch bệnh đã qua kiểm nghiệm RT-PCR với việc tiêu diệt triệt để hơn 32 loài rệp môi giới truyền bệnh họ Aphididae bằng bẫy dính sinh học và chế phẩm sinh học an toàn.

Kết luận

• Luận văn đã phân lập và nhân bản thành công đoạn gen CP dài 720 nucleotide mã hóa protein vỏ của dòng virus SMV-SL3 thu thập tại Sơn La.
• Kết quả giải trình tự khẳng định độ tương đồng cao đạt 99,4% về nucleotide và 98,75% về amino acid so với chủng virus chuẩn quốc tế công bố trên GenBank.
• Nghiên cứu đã xác định chuỗi polypeptide gồm 240 amino acid, trong đó chứa vùng đặc trưng Poty-coat gồm 208 amino acid với độ bảo thủ vượt trội trên 99%.
• Làm sáng tỏ các biến dị phân tử cục bộ tại 4 vị trí nucleotide và 3 vị trí amino acid, phản ánh đặc điểm tiến hóa thích nghi của virus tại vùng sinh thái miền núi phía Bắc.
• Cung cấp đoạn trình tự bảo thủ 713 bp làm nguyên liệu di truyền quý giá phục vụ chế tạo vector chuyển gen RNAi trong giai đoạn 2026 - 2028.

Các cơ sở nghiên cứu và đơn vị chọn giống cần nhanh chóng ứng dụng bộ dữ liệu trình tự phân tử này vào quy trình tạo giống đậu tương chuyển gen kháng virus nhằm chủ động bảo vệ mùa màng và nâng cao năng suất nông nghiệp bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế và hàm lƣợng dinh dƣỡng cao. Tỉ lệ khối lƣợng các chất khô trong hạt đậu tƣơng có đến 30 - 45% protein với đầy đủ và cân đối các loại axit amin cần thiết, 19 - 25% lipit, 20% gluxit, 4 - 5% chất khoáng và các vitamin (B1, B2, C, D, E, K. Hạt đậu tƣơng cung cấp nguồn dinh dƣỡng phong phú cho con ngƣời và động vật.

Rễ đậu tƣơng có nốt sần chứa vi khuẩn có khả năng cố định nitơ không khí, vì vậy trồng đậu tƣơng góp phần cải tạo đất và bảo vệ môi trƣờng. Với những giá trị to lớn đó, cây đậu tƣơng đƣợc đánh giá là cây trồng quan trọng trong sản xuất nông nghiệp và đời sống xã hội nhiều nƣớc trên thế giới. Hiện nay ở Việt Nam, cây đậu tƣơng chiếm một vị trí rất quan trọng trong cơ cấu cây trồng nông nghiệp, đƣợc gieo trồng ở cả 7 vùng nông nghiệp trên cả nƣớc với mục đích giải quyết vấn đề thiếu protein cho ngƣời và gia súc, xuất khẩu và cải tạo đất. Những năm gần đây, năng suất đậu tƣơng bình quân của thế giới và của nƣớc ta bị giảm sút đáng kể do nhiều nguyên nhân nhƣ tác động xấu của môi trƣờng, sâu bệnh, chất lƣợng hạt giống, kỹ thuật canh tác… Trong những nguyên nhân trên, các bệnh do nhiễm virus đã gây tổn thất lớn về năng suất, chất lƣợng đậu tƣơng và hiện nay vẫn chƣa có biện pháp hiệu quả để phòng trừ.

Đậu tƣơng là cây trồng dễ bị nhiễm nhiều loại virus, nhƣ bệnh khảm (Soybean mosaic virus - SMV), bệnh khảm vàng (Bean yellow mosaic virus - BYMV), bệnh xoăn lá và một số bệnh virus khác. Soybean mosaic virus (SMV) là một trong những loại virus gây bệnh nghiêm trọng nhất ở cây đậu tƣơng. Sau khi nhiễm SMV, đậu tƣơng sẽ suy giảm khả năng sinh trƣởng, phát triển, giảm năng suất và chất lƣợng hạt. Nghiên cứu hệ gen của SMV sẽ cung cấp những gợi ý để xác định các yếu tố quyết định đến Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ triệu chứng bệnh khảm lá ở cây đậu tƣơng, từ đó nghiên cứu tạo cây đậu tƣơng kháng virus phục vụ công tác chọn tạo giống đậu tƣơng sạch bệnh.

Xuất phát từ lí do trên, chúng tôi lựa chọn và tiến hành đề tài: “Đặc điểm của gen mã hóa protein vỏ Soybean mosaic virus”. Mục tiêu nghiên cứu Xác định đƣợc đặc điểm trình tự -coat CP phân lập từ SMV gây bệnh khảm lá ở cây đậu tƣơng. Nội dung nghiên cứu 3. Thu thập mẫu lá đậu tƣơng nhiễm SMV từ vùng trồng đậu tƣơng hai tỉnh Sơn La và Thái Nguyên.

Tách chiết RNA tổng số, tạo cDNA và nhân bản gen CP từ hệ gen của SMV. Tách dòng và xác định trình tự gen CP mã hóa protein vỏ của SMV. So sánh trình tự nucleotide của gen CP; trình tự amino acid poty-coat trong protein do đoạn gen CP mã hóa đƣợc với trên GenBank. trình tự nucleotide của gen CP; trình tự amino acid -coat trong protein do gen CP mã hóa.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TƢƠNG Cây đậu tƣơng (Glycine max L. Merill) là một trong những loài cây trồng đƣợc biết đến rất sớm. Đậu tƣơng đƣợc thuần hoá đầu tiên ở Trung Quốc vào khoảng thế kỉ XVII trƣớc công nguyên.

Từ Trung Quốc, đậu tƣơng đƣợc đƣa đến Triều Tiên, Nhật Bản, Nga sang Nam Á và Đông Nam Á qua con đƣờng tơ lụa. Ở Việt Nam, đậu tƣơng đƣợc trồng từ lâu đời, sớm nhất là các tỉnh thuộc khu vực trung du, miền núi phía Bắc và miền Đông Nam Bộ [1], [2]. Về phân loại thực vật học, cây đậu tƣơng hay còn gọi là đậu nành, tên khoa học Glycine max (L. Các giống đậu tƣơng trồng ở Việt Nam thuộc loài Glycine max (L.) Merill (2n= 40) trong giống phụ G.Soya, giống Glycine thuộc họ đậu (Lengunoceace) họ phụ cánh bƣớm (Papilinoideae)[1].

Đối với đậu tƣơng trồng có thể phân loại theo đặc điểm thực vật học, dựa theo thời gian sinh trƣởng, theo thời vụ. Đặc điểm sinh học của cây đậu tƣơng Đậu tƣơng là loại cây trồng cạn thu hạt, gồm các bộ phận chính nhƣ: rễ, thân, cành, lá, hoa, quả, hạt. Rễ đậu tƣơng là rễ cọc gồm rễ cái và rễ bên. Rễ cái thƣờng phát triển ăn sâu 20 - 30cm, xung quanh mọc ra các rễ bên.

Trên rễ có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum có khả năng cố định đạm của không khí tạo thành đạm dễ tiêu. Khi mới hình thành thì nốt sần có màu trắng sữa, khi phát triển tốt nhất nó có màu hồng, số lƣợng và chất lƣợng nốt sần có ảnh hƣởng đến sinh trƣởng và năng suất của đậu tƣơng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ Đậu tƣơng là cây thân thảo, ít phân cành dạng bụi. Thân đậu tƣơng có hình trụ, nhiều lông, mang nhiều đốt, thân thƣờng đứng, có khi bò hay nửa bò.

Mỗi cây có khoảng 8 - 14 đốt tuỳ theo loại hình sinh trƣởng, chiều dài các đốt cũng thay đổi tuỳ theo giống, thời vụ, mật độ cây, đất đai, phân bón… Cành mọc ra từ các đốt trên thân. Đốt đầu tiên của thân chính mang hai lá mầm, đốt thứ hai mang hai lá đơn đối nhau, từ đốt thứ ba trở lên mỗi đốt mang một lá kép. Lá đậu tƣơng là lá kép với ba lá chét nhƣng cá biệt cũng có lúc có 4 đến 5 lá chét. Lá có hình dạng khác nhau: tròn, hẹp, bầu dục, lƣỡi mác hoặc hình thoi… nhƣng thƣờng quy thành hai loại là lá rộng và lá hẹp.

Hoa có màu trắng hoặc màu tím mọc ở ngọn hay nách lá. Thời kỳ cây ra hoa sớm hay muộn, thời gian dài hay ngắn tuỳ thuộc vào giống và thời vụ gieo do chịu ảnh hƣởng phối hợp của ánh sáng và nhiệt độ. Quả đậu tƣơng thuộc loại quả ráp, đa số ngoài vỏ có lông bao phủ, khi chín có màu vàng hoặc xám đen. Mỗi quả trung bình có từ 2 – 3 hạt.

Hạt đậu tƣơng có hình dạng tròn hay bầu dục, tròn dài, tròn dẹt, vỏ hạt thƣờng nhẵn và có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu đen… nhƣng phổ biến là hạt màu vàng. Đậu tƣơng là cây trồng tƣơng đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh và sâu bệnh [5]. Giá trị kinh tế của cây đậu tƣơng Đậu tƣơng là cây công nghiệp ngắn ngày và có tác dụng nhiều mặt. Sản phẩm của nó làm thức ăn cho con ngƣời, gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp, là mặt hàng xuất khẩu và là cây cải tạo đất tốt.

Về mặt thực phẩm, hạt đậu tƣơng có thành phần dinh dƣỡng cao. Protein của đậu tƣơng đƣợc coi là một nguồn cung cấp protein hoàn chỉnh vì chứa một lƣợng đáng kể các amino acid không thay thế cần thiết cho cơ thể, dễ tiêu hoá và không có các thành phần tạo thành cholesteron. Ngoài ra, lipit của đậu tƣơng chứa tỉ lệ lớn các axit béo chƣa no, có hệ số đồng hoá lớn (98%), chỉ số Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ iot cao (120 - 137) có tác dụng phòng chống bệnh bƣớu cổ cho con ngƣời đặc biệt đối với trung du và miền núi). Hiện nay, từ hạt đậu tƣơng ngƣời ta đã chế biến ra đƣợc trên 600 sản phẩm khác nhau, trong đó có nhiều loại làm thực phẩm nhƣ đậu phụ, tƣơng, xì dầu, cà phê đậu tƣơng, bánh kẹo.

Về mặt công nghiệp, đậu tƣơng là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp nhƣ chế biến thực phẩm, công nghiệp ép dầu…Hiện nay, trên thế giới đậu tƣơng là cây đứng đầu về cung cấp nguyên liệu cho ép dầu. Dầu đậu tƣơng chiếm 30 - 35% tổng lƣợng dầu thực vật. Từ dầu đậu tƣơng ngƣời ta chế biến ra hàng trăm sản phẩm công nghiệp khác nhƣ nến, xà phòng… Trong chăn nuôi, đậu tƣơng là nguồn thức ăn tốt cho gia súc. 1kg hạt đậu tƣơng tƣơng đƣơng với 1,38 đơn vị thức ăn chăn nuôi.

Toàn cây đậu tƣơng có hàm lƣợng đạm khá cao nên các sản phẩm phụ nhƣ thân lá tƣơi có thể sử dụng làm thức ăn cho gia súc. Đậu tƣơng còn là cây cải tạo đất tốt. Trong hệ thống luân canh, nếu bố trí cây đậu tƣơng vào cơ cấu cây trồng hợp lý sẽ có tác dụng tốt đối với cây trồng vụ sau [5]. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và ở Việt Nam Cây đậu tƣơng đƣợc xem là một loại cây trồng chiến lƣợc của nhiều quốc gia trên thế giới, với vị trí đứng thứ tƣ chỉ sau lúa, ngô và lúa mì.

Khả năng thích nghi với điều kiện khí hậu và sinh thái của đậu tƣơng là khá rộng nên chúng đƣợc trồng rộng rãi trên cả năm châu lục, đặc biệt nhiều nhất là ở châu Mỹ, tiếp đến là châu Á. Trong đó, 4 nƣớc sản xuất đậu tƣơng nhiều nhất là Mỹ, Brazil, Argentina và Trung Quốc, chiếm khoảng 90 - 95% tổng sản lƣợng đậu tƣơng trên thế giới. Thống kê của FAO (Tổ chức Lƣơng thực và Nông nghiệp Liên hợp quốc) cho thấy trong 4 năm (2009 - 2012), diện tích gieo trồng đậu tƣơng trên thế giới tăng khoảng 5,7 triệu ha (năm 2009 là 99,3 triệu ha và năm 2012 là 105 triệu ha). Trong đó, Mỹ vẫn là quốc gia đứng đầu về diện tích gieo trồng 30,80 triệu ha trong khi đó Việt Nam chỉ chiếm một con số khiêm tốn là 0,12 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ triệu ha.

Mặc dù diện tích gieo trồng tăng đáng kể nhƣng sản lƣợng đậu tƣơng của toàn thế giới lại có nhiều biến động cụ thể, năm 2009 tổng sản lƣợng trên thế giới đạt 223,4 triệu tấn, năm 2010 tăng lên đáng kể đạt 265,25 triệu tấn, năm 2011 sản lƣợng giảm chút ít còn 262,35 triệu tấn, nhƣng đến năm 2012 thì chỉ còn là 241,84 triệu tấn. Tƣơng ứng với sự biến động về sản lƣợng là sự biến động về năng suất đậu tƣơng. Cũng theo FAO, trong vòng 4 năm (2009 - 2012), năng suất đậu tƣơng bình quân của toàn thế giới đạt cao nhất vào năm 2010 đạt 25,85 tạ/ha, nhƣng đến năm 2012 chỉ là 23,03 tạ/ha. Trong nhiều nguyên nhân làm năng suất và sản lƣợng đậu tƣơng thế giới có sự giao động và sụt giảm đáng kể là do bệnh virus.

Bệnh virus ở đậu tƣơng gây thiệt hại rất lớn không những làm giảm năng suất, giảm phẩm chất hạt, mà còn gây thoái hoá giống. Vì vậy, phòng trừ bệnh virus đang là vấn đề đƣợc trú trọng ở nhiều quốc gia nhằm thúc đẩy năng suất, sản lƣợng và nâng cao chất lƣợng đậu tƣơng. Ở Việt Nam, đậu tƣơng đƣợc trồng từ rất lâu, trƣớc cây đậu xanh và các cây họ đậu khác.