Luận văn nghiên cứu đặc tính sinh học, phân tử virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 - Học viện Nông nghiệp

Nghiên cứu đặc tính sinh học của virus kty prrs 01 và kty prrs 02, cung cấp thông tin quan trọng cho việc phòng ngừa và điều trị bệnh.

• Tác giả: Nguyễn Thị Ngọc
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thị Lan
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Thú y
• Đề tài: Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. Lời cam đoan
• 1.2. Mục lục
• 1.3. Danh mục chữ viết tắt
• 1.4. Danh mục bảng
• 1.5. Danh mục hình
• 1.6. Trích yếu luận văn
• 1.7. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
• 1.8. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
• 1.8.1. Mục tiêu chung
• 1.8.2. Mục tiêu cụ thể
• 1.9. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
• 1.9.1. Đối tượng nghiên cứu
• 1.9.2. Phạm vi nghiên cứu
• 1.10. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
• 1.11. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
• 1.11.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
• 1.11.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
• 1.12. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.12.1. TÌNH HÌNH VỀ PRRS TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
• 1.12.1.1. Lịch sử và tình hình dịch PRRS trên thế giới
• 1.12.1.2. Lịch sử và tình hình dịch PRRS tại Việt Nam
• 1.12.2. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ VIRUS PRRS
• 1.12.2.1. Cấu trúc virus PRRS
• 1.12.2.2. Một số nghiên cứu về đặc tính sinh học của virus PRRS
• 1.12.2.3. Một số nghiên cứu về đặc tính sinh học phân tử của virus PRRS
• 1.13. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.13.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
• 1.13.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
• 1.13.3. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
• 1.14. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• 1.14.1. Nghiên cứu đặc tính sinh học chủ yếu của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02
• 1.14.2. Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02
• 1.15. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.15.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào
• 1.15.2. Phương pháp gây nhiễm virus PRRS trên tế bào
• 1.15.3. Phương pháp xác định TCID50
• 1.15.4. Phương pháp xác định sự nhân lên của virus
• 1.15.5. Phương pháp RT – PCR
• 1.15.6. Phương pháp giải trình tự gene
• 1.15.7. Phương pháp tinh chế kháng nguyên virus và định lượng protein
• 1.15.8. Phương pháp gây tối miễn dịch cho chuột lang và thỏ
• 1.15.9. Phương pháp IPMA
• 1.15.10. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu bằng phần mềm
• 1.16. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 1.16.1. NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA 02 CHỦNG VIRUS KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02 PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM
• 1.16.1.1. Kết quả nghiên cứu xác định khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02
• 1.16.1.2. Kết quả nghiên cứu xác định hiệu giá (TCID50) của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02
• 1.16.1.3. Kết quả nghiên cứu xác định sự nhân lên của 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02
• 1.16.1.4. Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của động vật thí nghiệm với các chủng virus KTY – PRRS-01 và KTY-PRRS-02
• 1.16.2. NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA 02 CHỦNG VIRUS KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02
• 1.16.2.1. Kết quả phản ứng RT-PCR
• 1.16.2.2. Kết quả giải trình tự gene của các chủng virus PRRS nghiên cứu
• 1.16.2.3. Kết quả truy cập ngân hàng gene
• 1.16.2.4. So sánh mức độ tương đồng về trình tự nucleotide giữa các chủng virus nghiên cứu
• 1.16.2.5. So sánh mức độ tương đồng về trình tự amino acid giữa các chủng virus nghiên cứu
• 1.16.2.6. Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử của các chủng virus nghiên cứu
• 1.17. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Virus PRRS KTY PRRS 01 KTY PRRS 02

Nghiên cứu về virus PRRS (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus) đang trở thành một vấn đề cấp thiết trong ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam. Bệnh tai xanh, do virus PRRS gây ra, gây thiệt hại kinh tế lớn cho người chăn nuôi. Các chủng KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 được phân lập tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam từ những lợn có triệu chứng lâm sàng điển hình của bệnh PRRS. Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định các đặc tính sinh học virus và đặc tính sinh học phân tử của hai chủng virus này, nhằm cung cấp thông tin quan trọng cho việc phát triển các biện pháp phòng và kiểm soát bệnh hiệu quả hơn. Các kết quả nghiên cứu sẽ góp phần làm sáng tỏ sự khác biệt giữa các chủng virus PRRS đang lưu hành tại Việt Nam so với các chủng cổ điển trên thế giới, từ đó giải thích tại sao việc sử dụng vắc-xin hiện tại chưa mang lại hiệu quả tối ưu.

1.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu virus PRRS tại Việt Nam

Ngành chăn nuôi lợn ở Việt Nam đang phát triển mạnh mẽ, nhưng cũng đối mặt với nhiều thách thức từ các dịch bệnh nguy hiểm, đặc biệt là bệnh tai xanh do virus PRRS gây ra. Dịch bệnh này gây ra những tổn thất lớn về kinh tế, ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng sản phẩm chăn nuôi. Việc nghiên cứu sâu về virus PRRS, bao gồm cả đặc tính sinh học virus và đặc tính sinh học phân tử, là rất quan trọng để có thể đưa ra các biện pháp phòng chống dịch bệnh hiệu quả, phù hợp với tình hình thực tế tại Việt Nam. Các nghiên cứu này giúp xác định các chủng virus PRRS đang lưu hành, đánh giá mức độ biến đổi của chúng, và từ đó phát triển các loại vắc-xin và phương pháp chẩn đoán phù hợp.

1.2. Giới thiệu về chủng virus KTY PRRS 01 và KTY PRRS 02

Hai chủng virus PRRS, KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02, được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm của lợn có triệu chứng lâm sàng điển hình của bệnh tai xanh. Các chủng virus này được phân lập và nuôi cấy tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định các đặc tính sinh học virus như khả năng gây bệnh tích tế bào, hiệu giá virus, và khả năng nhân lên của virus. Đồng thời, các đặc tính sinh học phân tử như trình tự gene và mức độ tương đồng với các chủng virus khác cũng được nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin quan trọng để đánh giá mức độ nguy hiểm của hai chủng virus này và so sánh chúng với các chủng virus khác đang lưu hành tại Việt Nam và trên thế giới.

II. Thách Thức Kiểm Soát Virus PRRS Nghiên Cứu Tại Học Viện

Mặc dù vắc-xin PRRS đã được sử dụng rộng rãi, dịch bệnh vẫn thường xuyên xảy ra, đặt ra câu hỏi về hiệu quả thực sự của các loại vắc-xin hiện tại. Một trong những nguyên nhân chính là sự đa dạng về di truyền và kháng nguyên của các chủng virus PRRS. Các chủng virus PRRS liên tục biến đổi, tạo ra các biến chủng mới có khả năng né tránh hệ miễn dịch do vắc-xin tạo ra. Nghiên cứu này nhằm mục đích xác định các đặc điểm di truyền và kháng nguyên của các chủng KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02, từ đó đánh giá khả năng bảo vệ của các loại vắc-xin hiện tại đối với các chủng virus này. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển các loại vắc-xin mới có khả năng bảo vệ rộng hơn đối với các chủng virus PRRS đang lưu hành tại Việt Nam.

2.1. Sự biến đổi của virus PRRS và ảnh hưởng đến hiệu quả vắc xin

Sự biến đổi liên tục của virus PRRS là một thách thức lớn trong việc kiểm soát dịch bệnh. Các chủng virus PRRS có khả năng đột biến và tái tổ hợp, tạo ra các biến chủng mới có đặc tính di truyền và kháng nguyên khác biệt so với các chủng virus ban đầu. Điều này có thể làm giảm hiệu quả của các loại vắc-xin hiện tại, vì vắc-xin thường được thiết kế dựa trên các chủng virus đã biết. Việc theo dõi và nghiên cứu sự biến đổi của virus PRRS là rất quan trọng để có thể cập nhật và cải tiến các loại vắc-xin, đảm bảo chúng có khả năng bảo vệ chống lại các chủng virus mới.

2.2. Đánh giá hiệu quả của vắc xin hiện tại đối với chủng KTY PRRS

Nghiên cứu này sẽ đánh giá hiệu quả của các loại vắc-xin PRRS hiện tại đối với các chủng KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02. Các thí nghiệm sẽ được thực hiện để xác định khả năng của vắc-xin trong việc tạo ra kháng thể trung hòa và bảo vệ lợn khỏi sự nhiễm bệnh của các chủng virus này. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin quan trọng để đánh giá liệu các loại vắc-xin hiện tại có đủ khả năng bảo vệ chống lại các chủng virus PRRS đang lưu hành tại Việt Nam hay không. Nếu hiệu quả bảo vệ không cao, cần phải nghiên cứu và phát triển các loại vắc-xin mới có khả năng bảo vệ tốt hơn.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Virus KTY PRRS 01 02

Nghiên cứu này sử dụng một loạt các phương pháp sinh học và sinh học phân tử để xác định các đặc tính sinh học virus của chủng KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02. Các phương pháp bao gồm nuôi cấy tế bào, xác định hiệu giá virus (TCID50), nghiên cứu sự nhân lên của virus, và đánh giá khả năng gây miễn dịch của virus trên động vật thí nghiệm. Các phương pháp này cho phép đánh giá khả năng gây bệnh của virus, tốc độ nhân lên của virus, và khả năng kích thích hệ miễn dịch của cơ thể. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin quan trọng để so sánh các đặc tính sinh học virus của hai chủng virus này với các chủng virus khác, từ đó đánh giá mức độ nguy hiểm của chúng.

3.1. Nuôi cấy tế bào và xác định hiệu giá virus TCID50

Phương pháp nuôi cấy tế bào được sử dụng để nhân giống virus PRRS trong môi trường phòng thí nghiệm. Tế bào Marc-145 là loại tế bào thường được sử dụng để nuôi cấy virus PRRS. Sau khi virus được nhân giống, hiệu giá virus (TCID50) được xác định để đo lường số lượng virus có khả năng gây nhiễm trong một đơn vị thể tích. Hiệu giá virus là một chỉ số quan trọng để đánh giá khả năng gây bệnh của virus.

3.2. Nghiên cứu sự nhân lên của virus trên tế bào Marc 145

Nghiên cứu sự nhân lên của virus PRRS trên tế bào Marc-145 được thực hiện để xác định tốc độ nhân lên của virus trong môi trường tế bào. Các mẫu tế bào được thu thập tại các thời điểm khác nhau sau khi nhiễm virus, và số lượng virus trong mỗi mẫu được đo lường bằng phương pháp RT-PCR. Kết quả nghiên cứu sẽ cho biết tốc độ nhân lên của virus, thời điểm virus đạt hiệu giá cao nhất, và thời gian virus tồn tại trong tế bào.

3.3. Đánh giá khả năng gây miễn dịch của virus trên động vật

Khả năng gây miễn dịch của virus PRRS được đánh giá bằng cách tiêm virus vào động vật thí nghiệm (chuột lang và thỏ) và theo dõi sự phát triển của kháng thể kháng virus trong máu của chúng. Mức độ kháng thể được đo lường bằng phương pháp IPMA (Immunoperoxidase Monolayer Assay). Kết quả nghiên cứu sẽ cho biết liệu virus có khả năng kích thích hệ miễn dịch của cơ thể hay không, và mức độ kháng thể được tạo ra sau khi nhiễm virus.

IV. Phân Tích Sinh Học Phân Tử Virus PRRS KTY PRRS 01 KTY PRRS 02

Nghiên cứu này cũng sử dụng các phương pháp sinh học phân tử để xác định các đặc tính sinh học phân tử của chủng KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02. Các phương pháp bao gồm RT-PCR, giải trình tự gene, và phân tích phylogenetic. Các phương pháp này cho phép xác định trình tự gene của virus, so sánh trình tự gene của các chủng virus khác nhau, và xây dựng cây phả hệ để xác định mối quan hệ tiến hóa giữa các chủng virus. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin quan trọng để xác định nguồn gốc của các chủng virus này, đánh giá mức độ biến đổi của chúng, và so sánh chúng với các chủng virus khác đang lưu hành tại Việt Nam và trên thế giới.

4.1. RT PCR và giải trình tự gene ORF5 và ORF7 của virus PRRS

Phương pháp RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) được sử dụng để khuếch đại các đoạn gene ORF5 và ORF7 của virus PRRS. Các đoạn gene này mã hóa cho các protein quan trọng của virus, bao gồm Glycoprotein 5 (GP5) và protein N. Sau khi các đoạn gene được khuếch đại, chúng được giải trình tự để xác định trình tự nucleotide của chúng. Trình tự nucleotide là thông tin quan trọng để xác định các đặc tính sinh học phân tử của virus.

4.2. Phân tích phylogenetic và so sánh trình tự gene virus

Phân tích phylogenetic được sử dụng để xây dựng cây phả hệ, cho thấy mối quan hệ tiến hóa giữa các chủng virus PRRS khác nhau. Cây phả hệ được xây dựng dựa trên sự so sánh trình tự gene của các chủng virus. Các chủng virus có trình tự gene tương đồng sẽ nằm gần nhau trên cây phả hệ. So sánh trình tự gene cũng cho phép xác định các vị trí đột biến trong gene của virus, và đánh giá mức độ biến đổi của virus.

4.3. Truy cập ngân hàng gene và so sánh với các chủng virus khác

Trình tự gene của các chủng KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 được tải lên ngân hàng gene để so sánh với trình tự gene của các chủng virus PRRS khác đã được công bố trên toàn thế giới. Việc so sánh này cho phép xác định mức độ tương đồng và khác biệt giữa các chủng virus, và xác định nguồn gốc của các chủng virus này.

V. Kết Quả Nghiên Cứu Đặc Tính Sinh Học Virus KTY PRRS 01 02

Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 có khả năng gây bệnh tích tế bào trên tế bào Marc-145. Hiệu giá virus của hai chủng này tương đối cao, cho thấy khả năng nhân lên mạnh mẽ của chúng. Cả hai chủng virus đều có khả năng gây miễn dịch cho động vật thí nghiệm. Phân tích sinh học phân tử cho thấy hai chủng virus này có trình tự gene tương đồng với các chủng virus PRRS thuộc genotype 2 (Bắc Mỹ). Tuy nhiên, cũng có một số khác biệt về trình tự gene giữa hai chủng virus này và các chủng virus khác, cho thấy sự biến đổi của virus PRRS tại Việt Nam.

5.1. Khả năng gây bệnh tích tế bào và hiệu giá virus của KTY PRRS

Nghiên cứu cho thấy cả hai chủng KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 đều có khả năng gây bệnh tích tế bào trên tế bào Marc-145. Bệnh tích tế bào được biểu hiện bằng sự co cụm và bong tróc của tế bào. Hiệu giá virus của hai chủng này tương đối cao, cho thấy khả năng nhân lên mạnh mẽ của chúng. Điều này cho thấy hai chủng virus này có khả năng gây bệnh cao.

5.2. Đáp ứng miễn dịch của động vật thí nghiệm với virus KTY PRRS

Nghiên cứu cho thấy cả hai chủng KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 đều có khả năng gây miễn dịch cho động vật thí nghiệm. Sau khi tiêm virus vào động vật, hệ miễn dịch của chúng tạo ra kháng thể kháng virus. Mức độ kháng thể được đo lường bằng phương pháp IPMA. Kết quả cho thấy hai chủng virus này có khả năng kích thích hệ miễn dịch của cơ thể.

VI. Kết Luận Ứng Dụng Nghiên Cứu Virus PRRS Tại Học Viện

Nghiên cứu này đã cung cấp thông tin quan trọng về các đặc tính sinh học virus và đặc tính sinh học phân tử của chủng KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02. Kết quả nghiên cứu có thể được sử dụng để phát triển các biện pháp phòng và kiểm soát bệnh PRRS hiệu quả hơn tại Việt Nam. Các thông tin về trình tự gene của virus có thể được sử dụng để thiết kế các loại vắc-xin mới có khả năng bảo vệ rộng hơn đối với các chủng virus PRRS đang lưu hành. Ngoài ra, các thông tin về khả năng gây bệnh và khả năng gây miễn dịch của virus có thể được sử dụng để đánh giá hiệu quả của các loại vắc-xin hiện tại.

6.1. Ứng dụng kết quả nghiên cứu trong phát triển vắc xin PRRS

Thông tin về trình tự gene của các chủng KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 có thể được sử dụng để thiết kế các loại vắc-xin mới có khả năng bảo vệ rộng hơn đối với các chủng virus PRRS đang lưu hành tại Việt Nam. Các vắc-xin này có thể được thiết kế dựa trên các protein quan trọng của virus, như Glycoprotein 5 (GP5) và protein N.

6.2. Đề xuất các biện pháp kiểm soát dịch bệnh PRRS hiệu quả

Dựa trên kết quả nghiên cứu, có thể đề xuất các biện pháp kiểm soát dịch bệnh PRRS hiệu quả hơn tại Việt Nam. Các biện pháp này có thể bao gồm việc sử dụng vắc-xin mới có khả năng bảo vệ rộng hơn, tăng cường công tác giám sát dịch bệnh, và áp dụng các biện pháp an toàn sinh học trong chăn nuôi.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS), thường gọi là bệnh tai xanh, là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm hàng đầu gây thiệt hại kinh tế đặc biệt nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn toàn cầu. Theo các báo cáo kinh tế dịch tễ, căn bệnh này ước tính tiêu tốn của ngành công nghiệp chăn nuôi lợn tại Mỹ khoảng 560 triệu USD mỗi năm. Tại Việt Nam, kể từ khi xuất hiện các ổ dịch lớn từ năm 2007, dịch bệnh đã bùng phát dữ dội tại nhiều địa phương; điển hình như đợt dịch năm 2010 đã ghi nhận hơn 717.830 con lợn mắc bệnh với 413.000 con bị tiêu hủy. Sự đa dạng di truyền và tốc độ đột biến nhanh của virus PRRS (PRRSV) khiến các loại vắc-xin hiện hành đôi khi không mang lại hiệu quả bảo hộ tuyệt đối, dẫn đến hiện tượng dịch tái bùng phát liên tục.

Trước bối cảnh cấp thiết đó, đề tài tập trung nghiên cứu toàn diện một số đặc tính sinh học và sinh học phân tử của 02 chủng virus PRRS thực địa bao gồm KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02. Mục tiêu cụ thể của công trình là xác định khả năng nhân lên, đánh giá hiệu giá gây nhiễm tế bào, phân tích tính sinh miễn dịch trên động vật thí nghiệm, đồng thời giải mã trình tự các đoạn gene cấu trúc quan trọng (ORF5 và ORF7) để xác định phả hệ tiến hóa. Phạm vi nghiên cứu được thực hiện trên 02 chủng virus phân lập từ phổi và hạch phổi của lợn nái mang thai mắc bệnh tại tỉnh Thái Bình và Nghệ An vào năm 2013. Toàn bộ các nội dung thực nghiệm được triển khai từ tháng 9/2016 đến tháng 5/2017 tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y thuộc Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Kết quả của luận văn mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn sâu sắc, cung cấp nguồn dữ liệu gene quý giá phục vụ công tác giám sát dịch tễ, đồng thời tạo tiền đề tuyển chọn chủng giống chuẩn để sản xuất vắc-xin và chế phẩm sinh học đạt hiệu quả bảo hộ cao tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên nền tảng thuyết tiến hóa phân tử và hệ thống phân loại virus học hiện đại đối với giống Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirales. Hệ gene của PRRSV là một phân tử RNA sợi đơn dương có kích thước xấp xỉ 15 kilobase (kb), bao gồm 9 khung đọc mở (ORF). Về mặt phát sinh loài, virus PRRS trên thế giới được chia thành hai kiểu gene chính: Type 1 (dòng Châu Âu, đại diện là chủng Lelystad) và Type 2 (dòng Bắc Mỹ, đại diện là chủng VR-2332). Mức độ tương đồng giữa hai kiểu gene này tương đối thấp, chỉ đạt khoảng 55% đến 70% về trình tự nucleotide và từ 50% đến 80% về trình tự amino acid.

Trong cấu trúc của virion, gene ORF5 mã hóa cho Glycoprotein 5 (GP5 có khối lượng 25 kDa), đóng vai trò then chốt trong quá trình nhận diện thụ thể tế bào chủ và chứa các epitope quan trọng kích thích sinh kháng thể trung hòa. Bên cạnh đó, gene ORF7 mã hóa cho protein màng nhân Nucleocapsid (protein N có khối lượng 15 kDa), chiếm từ 20% đến 40% tổng hàm lượng protein của hạt virus và mang tính kháng nguyên bảo tồn cao, thường được dùng trong chẩn đoán huyết thanh học. Mô hình nghiên cứu vận dụng lý thuyết tương tác kháng nguyên - thụ thể trên dòng tế bào cảm thụ Marc-145 và động học sinh miễn dịch dịch thể trên mô hình động vật thí nghiệm.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng nguồn vật liệu là 02 chủng virus PRRS thực địa (KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02). Phương pháp chọn mẫu có chủ đích được áp dụng để lấy mẫu từ các cá thể lợn nái mang thai biểu hiện bệnh tích tai xanh điển hình tại hai vùng chăn nuôi trọng điểm là Thái Bình và Nghệ An. Đối với thử nghiệm khả năng sinh kháng thể, cỡ mẫu động vật bao gồm 25 cá thể chuột lang (chia thành 2 lô thí nghiệm mỗi lô 10 con và 1 lô đối chứng 5 con) cùng 20 cá thể thỏ khỏe mạnh (chia thành 2 lô thí nghiệm mỗi lô 8 con và 1 lô đối chứng 4 con) không mang kháng thể PRRS trước đó.

Dòng tế bào thận khỉ Marc-145 được lựa chọn làm hệ thống nuôi cấy chính do tính ổn định cao và độ nhạy cảm tối ưu đối với các chủng PRRSV dòng Bắc Mỹ lưu hành tại Việt Nam. Tế bào được gây nhiễm ở tỷ lệ MOI = 0,1 để theo dõi bệnh tích tế bào (CPE). Hiệu giá virus được chuẩn độ theo phương pháp vi pha loãng trên đĩa 96 giếng và tính toán chỉ số TCID50 bằng công thức chuẩn Spearman-Karber. Kỹ thuật RT-PCR được thực hiện với cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại phân đoạn ORF5 (720 bp) và ORF7 (372 bp). Trình tự nucleotide được giải mã tự động bằng hệ thống Beckman Coulter CEQ 8000 theo nguyên lý Sanger. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng bằng phần mềm MEGA6 theo phương pháp Neighbor-Joining với hệ số lặp lại bootstrap 1000 đơn vị, đảm bảo tính chuẩn xác và tin cậy cao của kết quả phân tích phả hệ. Đáp ứng miễn dịch của thỏ và chuột lang được đánh giá thông qua phản ứng miễn dịch gắn men trên tế bào một lớp (IPMA) sau các mũi tiêm kháng nguyên tinh chế 20 µg.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã ghi nhận bốn phát hiện khoa học mang tính đột phá về đặc tính sinh học và sinh học phân tử của 02 chủng virus khảo sát:

Thứ nhất, về khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) trên dòng Marc-145, cả hai chủng virus đều biểu hiện sự hủy hoại tế bào rất sớm, bắt đầu quan sát thấy từ 36 giờ sau gây nhiễm với mức độ 10% bề mặt. Tế bào bị nhiễm co cụm tròn lại và chồi lên khỏi đáy bình nuôi cấy. Chủng KTY-PRRS-02 có tốc độ hủy hoại tế bào nhanh hơn, đạt 100% CPE ở thời điểm 72 giờ, trong khi chủng KTY-PRRS-01 đạt 100% CPE tại thời điểm 84 giờ sau gây nhiễm.

Thứ hai, hiệu giá lây nhiễm của virus đạt mức rất cao. Hiệu giá của chủng KTY-PRRS-01 đạt 1,74 x 10^6 TCID50/25µl, trong khi chủng KTY-PRRS-02 đạt tới 3,16 x 10^6 TCID50/25µl (cao hơn khoảng 81,6% so với chủng KTY-PRRS-01). Động học nhân lên cho thấy hàm lượng virus tự do giải phóng ra ngoài môi trường luôn cao hơn lượng virus tồn tại bên trong tế bào; đỉnh sao chép mạnh nhất tập trung trong khoảng từ 60 giờ đến 84 giờ sau gây nhiễm.

Thứ ba, phân tích sinh học phân tử xác định đoạn gene ORF5 có độ dài 603 bp mã hóa cho 200 amino acid của protein GP5; đoạn gene ORF7 có độ dài 372 bp mã hóa cho 123 amino acid của protein N. Mức độ tương đồng về trình tự nucleotide giữa hai chủng KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 đạt tỷ lệ rất cao: 98,03% đối với ORF5 và 98,58% đối với ORF7; mức độ tương đồng amino acid tương ứng lần lượt là 95,04% và 96,32%.

Thứ tư, khi so sánh với các chủng tham chiếu quốc tế, độ tương đồng nucleotide của 02 chủng nghiên cứu đạt từ 85,12% đến 99,42% ở gene ORF5 và từ 92,93% đến 99,65% ở gene ORF7. Phân tích cây sinh học phân tử khẳng định cả hai chủng KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 đều thuộc kiểu gene Type 2 (dòng Bắc Mỹ) và nằm cùng phân nhóm với các chủng virus PRRS độc lực cao có nguồn gốc từ Trung Quốc (như JXA1 và GD).

Thảo luận kết quả

Đặc tính gây bệnh tích tế bào nhanh và hiệu giá TCID50 đạt trên ngưỡng 10^6 cho thấy hai chủng phân lập có khả năng thích ứng và nhân lên tuyệt vời trên môi trường nuôi cấy nhân tạo. Hiện tượng hàm lượng virus ngoài môi trường cao hơn nội bào chứng minh cơ chế nảy chồi và giải phóng hạt virus diễn ra mạnh mẽ trước khi tế bào chủ bị ly giải hoàn toàn.

Dữ liệu nghiên cứu có thể được trực quan hóa thông qua biểu đồ đường cong sinh trưởng thể hiện sự biến thiên logarit TCID50 theo các mốc thời gian từ 12 đến 96 giờ, kết hợp cùng bảng ma trận đối sánh tỷ lệ tương đồng nucleotide và amino acid. Khi đối chiếu với các công trình nghiên cứu dịch tễ tại Việt Nam trong giai đoạn 2011-2016, kết quả này hoàn toàn nhất quán với nhận định rằng các chủng PRRSV độc lực cao dòng Bắc Mỹ vẫn đang là tác nhân gây bệnh chiếm ưu thế tại các tỉnh phía Bắc. Mức độ sai khác từ 0,58% đến 14,88% ở phân đoạn ORF5 so với các chủng vắc-xin cổ điển giải thích nguyên nhân vì sao việc tiêm phòng các loại vắc-xin nhập khẩu đôi khi không tạo được miễn dịch đồng nhất, củng cố tầm quan trọng của việc phát triển vắc-xin đặc hiệu từ chủng bản địa.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả thực nghiệm chuẩn xác, luận văn đưa ra bốn nhóm khuyến nghị hành động thiết thực:

1. Chuẩn hóa quy trình nuôi cấy và bảo tồn nguồn giống virus: Giao Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y chủ trì tối ưu hóa các thông số nhân nuôi chủng KTY-PRRS-02 trên tế bào Marc-145 nhằm duy trì hiệu giá đạt tối thiểu 3,0 x 10^6 TCID50/25µl, hoàn thành lưu trữ nguồn giống chuẩn vào ngân hàng gene quốc gia trong thời gian 6 tháng.
2. Nghiên cứu phát triển vắc-xin thế hệ mới: Khuyến nghị các viện nghiên cứu thú y phối hợp cùng các doanh nghiệp sản xuất sinh dược sử dụng chủng KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 làm chủng hạt giống hoặc chủng công cường độc để đánh giá hiệu lực bảo hộ của vắc-xin nhược độc và vô hoạt nội địa, hướng tới mục tiêu đạt tỷ lệ bảo hộ thực địa trên 85% trong lộ trình 2 đến 3 năm tới.
3. Mở rộng giám sát dịch tễ học phân tử định kỳ: Đề nghị Cục Thú y và Chi cục Chăn nuôi Thú y các địa phương thực hiện lấy mẫu định kỳ tại các ổ dịch mới, áp dụng quy trình RT-PCR giải trình tự gene ORF5 trên tối thiểu 80% các ca bệnh nghi ngờ để kịp thời phát hiện các biến chủng trôi dạt di truyền.
4. Ứng dụng chế phẩm kháng nguyên trong chẩn đoán nhanh: Triển khai sản xuất bộ sinh phẩm chẩn đoán kháng thể kháng PRRSV bằng kỹ thuật IPMA chuẩn hóa từ nguồn kháng nguyên tinh chế của đề tài, rút ngắn thời gian xét nghiệm xuống dưới 4 giờ với độ nhạy đạt trên 95% trong vòng 12 tháng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu mang lại giá trị học thuật và ứng dụng chuyên sâu cho bốn nhóm đối tượng chính:

• Giảng viên, nghiên cứu viên chuyên ngành Thú y và Công nghệ sinh học: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình thao tác chuẩn trên tế bào Marc-145, kỹ thuật tinh chế kháng nguyên bằng siêu ly tâm thang nồng độ sucrose, và phân tích tin sinh học phả hệ virus.
• Chuyên gia nghiên cứu và phát triển (R&D) tại các công ty sản xuất vắc-xin thú y: Khai thác các dữ liệu về độc lực, thời gian đạt đỉnh sao chép (60-84 giờ), và đặc tính sinh miễn dịch để thiết kế quy trình sản xuất vắc-xin tương thích với chủng virus thực địa lưu hành tại Việt Nam.
• Cán bộ quản lý dịch tễ và bác sĩ thú y thực địa: Nắm bắt sâu sắc về nguồn gốc phân tử, mức độ tương đồng di truyền của các chủng virus tai xanh Bắc Mỹ độc lực cao, từ đó xây dựng các kịch bản kiểm soát an toàn sinh học và khoanh vùng dập dịch hiệu quả.
• Học viên cao học và sinh viên đại học khối ngành Nông nghiệp: Học hỏi phương pháp luận nghiên cứu khoa học bài bản, từ khâu thiết kế thí nghiệm in vitro, chuẩn độ virus theo Spearman-Karber cho đến kỹ thuật gây tối miễn dịch trên thỏ và chuột lang.

Câu hỏi thường gặp

1. Hai chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 thuộc kiểu gene nào và có quan hệ di truyền ra sao? Cả hai chủng virus nghiên cứu đều thuộc kiểu gene Type 2 (dòng Bắc Mỹ). Kết quả phân tích cây phả hệ dựa trên gene ORF5 và ORF7 cho thấy hai chủng này có quan hệ di truyền rất gần gũi với các chủng virus PRRS độc lực cao của Trung Quốc (nhánh JXA1 và GD), với độ tương đồng nucleotide đạt trên 98%.

2. Hiệu giá lây nhiễm của hai chủng virus trên tế bào Marc-145 đạt mức bao nhiêu? Hiệu giá virus đo lường được ở mức rất cao, trong đó chủng KTY-PRRS-01 đạt 1,74 x 10^6 TCID50/25µl và chủng KTY-PRRS-02 đạt 3,16 x 10^6 TCID50/25µl. Thời điểm hiệu giá đạt đỉnh cao nhất rơi vào khoảng từ 60 giờ đến 84 giờ sau khi gây nhiễm tế bào.

3. Bệnh tích tế bào (CPE) do hai chủng virus này gây ra xuất hiện và diễn tiến như thế nào? Bệnh tích tế bào bắt đầu xuất hiện sớm từ 36 giờ sau gây nhiễm với biểu hiện tế bào co cụm, tròn lại và trồi lên khỏi đáy bình. Chủng KTY-PRRS-02 phá hủy 100% tế bào ở thời điểm 72 giờ, trong khi chủng KTY-PRRS-01 làm bong tróc hoàn toàn tế bào sau 84 giờ.

4. Mức độ tương đồng về trình tự gene ORF5 và ORF7 giữa hai chủng nghiên cứu là bao nhiêu? Đoạn gene ORF5 (603 bp) có độ tương đồng 98,03% về nucleotide và 95,04% về amino acid. Đoạn gene ORF7 (372 bp) có độ tương đồng 98,58% về nucleotide và 96,32% về amino acid, cho thấy tính bảo tồn cấu trúc màng nhân rất cao giữa các chủng thực địa.

5. Nghiên cứu sử dụng phương pháp nào để kiểm tra khả năng sinh kháng thể trên động vật thí nghiệm? Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật IPMA (miễn dịch gắn men trên tế bào một lớp) để định lượng kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh của thỏ và chuột lang sau 14 ngày tiêm nhắc lại mũi thứ hai với liều 20 µg kháng nguyên virus tinh chế.

Kết luận

• Luận văn đã xác định thành công các đặc tính sinh học chủ yếu của 02 chủng virus PRRS thực địa KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 phân lập tại Thái Bình và Nghệ An trên hệ thống tế bào Marc-145.
• Động học sao chép cho thấy hiệu giá virus đạt mức rất cao (1,74 x 10^6 và 3,16 x 10^6 TCID50/25µl), đạt đỉnh giải phóng tự do ngoài môi trường tế bào trong khoảng 60 đến 84 giờ sau gây nhiễm.
• Giải mã trình tự gene ORF5 (603 bp) và ORF7 (372 bp) chứng minh cả hai chủng đều thuộc kiểu gene Type 2 dòng Bắc Mỹ, có quan hệ tiến hóa gần gũi với nhóm virus PRRS độc lực cao.
• Thử nghiệm trên mô hình động vật khẳng định kháng nguyên tinh chế từ hai chủng virus kích thích đáp ứng sinh kháng thể đặc hiệu mạnh mẽ qua phản ứng IPMA.
• Các cơ quan quản lý và đơn vị sản xuất vắc-xin cần sớm ứng dụng nguồn chủng tiềm năng này vào công tác tuyển chọn giống sản xuất chế phẩm sinh học nội địa trong giai đoạn tiếp theo để chủ động bảo vệ ngành chăn nuôi lợn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ NGỌC NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC, SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CHỦNG VIRUS KTY-PRRS-01 VÀ KTY-PRRS-02 Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS. Nguyễn Thị Lan NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu riêng của bản thân. Các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng bảo vệ để lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Ngọc i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tác giả đã nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện của rất nhiều người, sau đây là lời cảm ơn chân thành của tác giả: Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. Nguyễn Thị Lan người đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Nhờ có sự hướng dẫn nhiệt tình và những ý kiến đóng góp quý báu của cô mà luận văn của tôi đã được hoàn thành. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo, Chủ nhiệm khoa Thú y, Bộ môn Bệnh lý học Thú y, Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y, cùng toàn thể các thầy, cô giáo và cán bộ của Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã trang bị cho tôi những kiến thức quý báu và giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu luận văn.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn tới bạn bè, đồng nghiệp, người thân trong gia đình và cơ quan đang công tác đã tạo điều kiện về thời gian, động viên, chia sẻ tinh thần, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Ngọc ii MỤC LỤC Lời cam đoan. ii Mục lục…. iii Danh mục chữ viết tắt.

v Danh mục bảng. vi Danh mục hình .vii Trích yếu luận văn .viii Thesis Abstract. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI.

Mục tiêu chung. Mục tiêu cụ thể. PHẠM VI NGHIÊN CỨU. Đối tượng nghiên cứu.

Phạm vi nghiên cứu. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI. Ý nghĩa khoa học của đề tài.

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. TÌNH HÌNH VỀ PRRS TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM. Lịch sử và tình hình dịch PRRS trên thế giới.

Lịch sử và tình hình dịch PRRS tại Việt Nam. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ VIRUS PRRS. Cấu trúc virus PRRS. Một số nghiên cứu về đặc tính sinh học của virus PRRS.

Một số nghiên cứu về đặc tính sinh học phân tử của virus PRRS. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU.

VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU. Nghiên cứu đặc tính sinh học chủ yếu của 02 chủng virus KTY-PRRS- 01, KTY-PRRS-02. Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus KTY-PRRS- 01, KTY-PRRS-02.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Phương pháp nuôi cấy tế bào. Phương pháp gây nhiễm virus PRRS trên tế bào. Phương pháp xác định TCID50.

Phương pháp xác định sự nhân lên của virus. Phương pháp RT – PCR. Phương pháp giải trình tự gene. Phương pháp tinh chế kháng nguyên virus và định lượng protein.

Phương pháp gây tối miễn dịch cho chuột lang và thỏ. Phương pháp IPMA. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu bằng phần mềm. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA 02 CHỦNG VIRUS KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02 PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM. Kết quả nghiên cứu xác định khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02. Kết quả nghiên cứu xác định hiệu giá (TCID50) của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02. Kết quả nghiên cứu xác định sự nhân lên của 02 chủng virus KTY- PRRS-01 và KTY-PRRS-02.

Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của động vật thí nghiệm với các chủng virus KTY – PRRS-01 và KTY-PRRS-02. NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA 02 CHỦNG VIRUS KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02. Kết quả phản ứng RT-PCR. Kết quả giải trình tự gene của các chủng virus PRRS nghiên cứu.

Kết quả truy cập ngân hàng gene. So sánh mức độ tương đồng về trình tự nucleotide giữa các chủng virus nghiên cứu. So sánh mức độ tương đồng về trình tự amino acid giữa các chủng virus nghiên cứu. Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử của các chủng virus nghiên cứu.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 73 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa Tiếng Việt CPE Cytophathogenic Effect (Bệnh tích tế bào) DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Môi trường nuôi cấy tế bào) DNA Deoxyribonucleic acid (gen sợi kép) EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid (Dung dịch đệm) ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Phản ứng miễn dịch gắn enzym) FBS Fetal Bovine Serum (Huyết thanh thai bò) IPMA Immunoperoxidase monolayer Assay (Phản ứng miễn dịch có gắn men trên tế bào một lớp) KKT Kháng kháng thể MARC 145 Tế bào thận khỉ MLV Modifier Live Vacine (Vắc xin nhược độc) MOI Multiplicity Of Infection (Tỷ lệ giữa số lượng virus và số lượng tế bào) NSP Non structural protein (Protein phi cấu trúc) ORF Open Reading Frame (Khung đọc mở trong hệ gen) PAM Porcine Alveolar Macrophage (đại thực bào phế nang lợn) PBS Photphat Buffer Saline (Dung dịch đệm) PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn) PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (Virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn) RNA Ribonucleic acid RT- PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp có dùng enzym phiên mã ngược) SP Structural protein (Protein cấu trúc) TCID50 50% Tissue Culture Infective Dose (Liều gây nhiễm 50% mô nuôi cấy) TPB Triptose phosphas broth (Dung dịch đệm) v DANH MỤC BẢNG Bảng 2. Protein cấu trúc của PRRSV.

Thông tin về nguồn gốc 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY- PRRS-02. Khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02. Kết quả xác định hiệu giá của 03 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY- PRRS-02 và chủng virus vắc-xin. Kết quả tinh chế kháng nguyên virus PRRS.

Kết quả của phản ứng IPMA kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng PRRSV ở thời điểm 14 ngày sau khi tiêm kháng nguyên PRRS lần 2. Kết quả phản ứng IPMA kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng PRRSV của chuột và thỏ thí nghiệm. Các vị trí sai khác nucleotide đoạn gene ORF7 giữa các chủngvirus nghiên cứu với chủng virus tham chiếu. Các vị trí sai khác nucleotide đoạn gene ORF5 giữa các chủng virus nghiên cứu với chủng virus tham chiếu.

Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene ORF7 giữa 2 chủng virus PRRS nghiên cứu và chủng virus tham chiếu. Các vị trí sai khác amino acid mã hóa từ gene ORF5 giữa 2 chủng virus PRRS nghiên cứu và chủng virus tham chiếu. Sự tương đồng về trình tự nucleotide của gene ORF7 giữa các chủng virus PRRS nghiên cứu với mẫu virus tham chiếu (%). Sự tương đồng về trình tự nucleotide của gene ORF5 giữa các chủng virus PRRS nghiên cứu với mẫu virus tham chiếu (%).

Sự tương đồng về amino acid mã hóa từ gene ORF7 giữa các chủng virus PRRS nghiên cứu với chủng virus tham chiếu (%). Sự tương đồng về amino acid mã hóa từ gene ORF5 giữa các chủng virus PRRS nghiên cứu với chủng tham chiếu (%). 60 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2. Hình thái virus PRRS.

Hình ảnh cấu trúc hệ gene của virus PRRS. Tế bào Marc 145 không gây nhiễm virus. Bệnh tích tế bào sau 36 giờ gây nhiễm chủng KTY-PRRS-01. Bệnh tích tế bào sau 48 giờ gây nhiễm chủng KTY-PRRS-01.

Bệnh tích tế bào sau 60 giờ gây nhiễm chủng KTY-PRRS-02. Bệnh tích tế bào sau 72 giờ gây nhiễm chủng KTY-PRRS-02. Bệnh tích tế bào sau 84 giờ gây nhiễm chủng KTY-PRRS-01. Hình biểu diễn sự nhân lên của chủng virus KTY-PRRS-01.

Hình biểu diễn sự nhân lên của chủng virus KTY-PRRS-02. Đối chứng tế bào. Phản ứng IPMA dương tính. Kết quả phản ứng RT- PCR với mồi ORF7 (hình A) và ORF5 (hình B).

Kết quả so sánh trình tự gene ORF7 của các chủng virus PRRS nghiên cứu. Kết quả so sánh trình tự gene ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu. So sánh trình tự amino acid mã hóa từ đoạn gene ORF7 của 2 chủng virus PRRS nghiên cứu và các chủng tham chiếu. So sánh trình tự amino acid mã hóa từ đoạn gene ORF5 của 2 chủng virus PRRS nghiên cứu và các chủng tham chiếu.

Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotide gene ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu. Cây sinh học phân tử dựa trên trình tự nucleotide gene ORF7 của các chủng virus PRRS nghiên cứu. 64 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Ngọc Tên Luận văn: “Nghiên cứu một số đặc tính sinh học, sinh học phân tử của chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02”. Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60.01 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: Mục đích của luận văn nhằm chọn ra chủng virus PRRS tiềm năng có đặc tính sinh học, sinh học phân tử điển hình để làm phong phú nguồn quỹ gene nhằm phục vụ các nghiên cứu chuyên sâu như:sản xuất vắc-xin phù hợp có hiệu quả bảo hộ cao; chế kháng thể đạt chuẩn dùng trong phòng, trị PRRS; công cường độc để đánh giá hiệu quả của vắc-xin; gây bệnh thí nghiệm để nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm bệnh lý PRRS; sử dụng làm chủng tham chiếu để nghiên cứu các virus mới phân lập và các biến chủng dùng trong dịch tễ học phân tử.

Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu đặc tính sinh học chủ yếu của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY- PRRS-02. Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02. Máy PCR, thiết bị điện di, máy giải trình tự gene. Môi trường nuôi cấy tế bào, tế bào Marc 145, bộ kít tách chiết RNA, bộ kít RT-PCR, bộ kít giải trình tự gene, kit BCA.