Chương 1. Tổng Quan Tên IUPAC: 6-Fluoro -1- ( 4- fluorophenyl ) -4- oxo-7-( 1-piperazinyl )-1,4- dihydro-3-quinolinecarboxylic axit. Khối lượng phân tử: 385,364 g/mol. Điểm nóng chảy: 329,58oC.
Điểm sôi: 621,353 °C at 760 mmHg. Độ hòa tan trong nước ở 20oC : 100 mg/l. Hằng số axit- bazơ: pKa1= 6,0. Tác dụng sinh hóa của Sarafloxacin Sarafloxacin là một fluoroquinolone thuốc kháng khuẩn đã được phê duyệt trong năm 1996 trong Hoa Kỳ dùng trong thú y để kiểm soát bệnh tật và tỷ lệ tử vong liên quan đến cúm gia cầm colibacillosis nhiễm trùng [34].
Nó thì thực sự hiệu nghiệm cho phép chữa bằng tác nhân hóa học đã từng được dùng cho một dải rộng cho cả vi khuẩn gram âm và gram dương. Như fluoroquinolones khác, nó hoạt động bằng cách ức chế tác dụng của enzyme DAN gyrase làm cho hai mạch đơn của DAN không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của DAN. [48] Các tác dụng phụ khi quá liều có thể xảy ra như ảnh hưởng đến chức năng tiêu hóa, nhức đầu, buồn ngủ, một số trường hợp khác còn có thể dẫn đến như tiêu cơ vân, viêm gân, mê sảng, hạ đường huyết gây tử vong, ngoài ra một số sản phẩm còn gây ra sự tăng men gan và rối loạn chức năng của gan. Tác hại của kháng sinh nhóm fluoroquinolone được cho là có nguy cơ gây đột biến gen, gây sẩy thai khi sử dụng cho động vật mang thai.
Do đó, khuyến cáo là không nên dụng kháng sinh nhóm fluoroquinolone cho động vật mang thai, động vật sinh sản và làm giống. Bên cạnh đó, sự tồn lưu thời gian dài sau khi sử dụng thuốc kháng sinh nhóm fluoroquinolone cũng là nguyên nhân dẫn đến việc hạn chế và cấm sử dụng những kháng sinh thuộc nhóm này. Ở Mỹ, cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm của Mỹ (FDA: Food and Drug Administration) đã không chấp nhận sự tồn lưu kháng sinh nhóm fluoroquinolone trong sản phẩm thủy sản. Ở châu Âu, EU đã thiết lập giới hạn lớn nhất (MRLs) đối với dư lượng thuốc trong thực phẩm cung cấp cho con người vào 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chương 1.
Tổng Quan những năm 1990. Trong “Council directive 96/23/EC in 1996” đã quy định rõ là enrofloxacin trong cơ, gan, thận của bò, lợn, gia cầm (gà, vịt) là 30µg/kg; trong sữa bò là 100 µg/kg. Các phƣơng pháp phân tích định lƣợng thuốc kháng sinh Sarafloxacin 1. Phƣơng pháp đo quang Phương pháp phân tích trắc quang do có độ nhạy, độ chính xác và độ chọn lọc khá cao nên dung để xác định hàm lượng nhỏ, hàm lượng trung bình và hàm lượng lớn các nguyên tố trong nhiều đối tượng phân tích, phương pháp này được thực hiện nhanh thuận lợi, thiết bị đơn giản và dễ tự động hóa nên được dùng rộng rãi trong nhiều thí nghiệm nghiên cứu khoa học, phòng thí nghiệm ở nhà máy.
Dùng một số ion kim loại như Fe(III), Cu(II), Cd(II), Mn(II)…để tạo phức với nhóm quionlone. Đo cường độ bước sóng của phức tạo thành bằng máy trắc quang. Lập đồ thị biểu diễn cường độ hấp thu của chất tại bước sóng đó theo những nồng độ khác nhau. Ưu điểm: Phương pháp này sử dụng thiết bị đơn giản, dễ vận hành, chi phí thấp nên được dùng để kiểm tra độ tinh khiết của chất hữu cơ.
Nhược điểm: Độ chọn lọc không cao, độ nhạy kém, phân tích các chất ở nồng độ cao. Phƣơng pháp điện hóa Một số phương pháp điện hóa đã được sử dụng để phân tích Sarafloxacin nhưng không phổ biến nhiều. Rodríguez Cáceres,A. Martínez Cañas với nghiên cứu “Simultaneous determination of quinolones for veterinary use by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection’’ đã dùng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao với đầu dò điện hóa (HPLC-ECD) đã cho phép xác định đồng thời ba fluoroquinolone (FQS), cụ thể là Danofloxacin, Difloxacin và Sarafloxacin.
Các FQS được phân tách trên cột Novapack C-18 và phát hiện bằng thiết bị amperometric cell, hiệu điện thế giữa hai điện cực được thiết lập là +0,8V. Chiết pha rắn đã được sử dụng để tách các chất 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chương 1. Tổng Quan phân tích trong mẫu thực. Các nồng độ được khảo sát từ 10-150ng/g đối với Danofloxacin, 25-100ng/g cho Sarafloxacin và 50-315ng/g đối với Difloxacin.
Giới hạn phát hiện dưới 10ng/g và hiệu suất thu hồi khoảng 90% cho cả ba chất. Phƣơng pháp ELISA ELISA (enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme Immuno Assay) là một kĩ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học. Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và gồm các bước cơ bản như sau: (1)Kháng nguyên - antigen chưa biết được gắn trên một bề mặt.
(2) Kháng thể - antibody biết trước được "rửa" qua bề mặt đó. Kháng thể này được gắn kết với enzyme. (3) Thêm vào một cơ chất, enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được. Tuy nhiên, phương pháp ELISA chỉ là một phương pháp bán định lượng và có độ chọn lọc và độ nhạy thấp.
Sử dụng phương pháp ELISA trong xác định dư lượng kháng sinh chỉ mang tính định tính, xác định có hay không dư lượng kháng sinh trong mẫu. Một số ứng dụng của ELISA như: - Xác định nồng độ của kháng thể trong huyết thanh. - Kiểm tra sự có mặt của kháng nguyên. - Phát hiện các yếu tố có khả năng gây dị ứng trong thực phẩm.
- Xác định sự có mặt của dược phẩm. - Xác định hoạt tính của một hợp chất sinh học… Phạm Kim Đăng và cộng sự đã nghiên cứu “ Ứng dụng phương pháp Elisa để phân tích tồn dư kháng sinh nhóm Quinolone trong tôm tại một số tỉnh ven biển khu vực phía Bắc.”Việc nghiên cứu chuẩn hoá kít được thực hiện theo tiêu chuẩn và yêu cầu của Quyết định số 2002/657/EC do Ủy ban Châu Âu thiết lập cho phương pháp 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chương 1. Tổng Quan bán định lượng. Tình hình tồn dư quinolone trong tôm trên thị trường phía Bắc đã được đánh giá thông qua việc phân tích 90 mẫu tôm được lấy ở 4 địa phương đại diện (Hà Nội, Quảng Ninh, Nam Định, Nghệ An) bằng phương pháp Elisa và được kiểm chứng bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS).
Kết quả cho thấy kít rất ổn định để phân tích các quinolone được thử và trong tôm với giới hạn nồng độ phát hiện là 0,7 ppb cho Sarafloxacin. Phƣơng pháp điện di mao quản Phương pháp điện di mao quản được sử dụng với một số tính chất ưu việt như hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Phương pháp đã được áp dụng để tách và xác định kháng sinh Sarafloxacin trong một số đối tượng mẫu khác nhau. Lara và cộng sự trong nghiên cứu “Multiresidue Method for the Determination of Quinolone Antibiotics in Bovine Raw Milk by Capillary Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry” đã sử dụng phương pháp phân tích mới dựa trên điện di mao quản vùng kết hợp với khối phổ hai lần (CZE-MS/MS) cho việc xác định và định lượng đồng thời tám quinolone dùng trong thú y có trong sữa bò.
Các thông số khác nhau (ví dụ thành phần đệm tách và các điều kiện) đã được tối ưu hóa để có được một hệ thống tách đầy đủ và độ nhạy cao. Kết quả khả quan thu được về độ tuyến tính (r2 nằm giữa 0,989 và 0,992) và độ chính xác (RSD dưới 18%). Giới hạn phát hiện (LOD) và định lượng (LOQ) cho Sarafloxacin tương ứng là 6 và 24 ppb, thấp hơn dư lượng tối đa cho phép các chất này trong sữa, hiệu suất thu hồi 81- 110% cho thấy tiềm năng của CZE-MS/MS để phân tích các kháng sinh quinolone quy định về chất lượng thực phẩm và các khu vực kiểm soát an toàn [37]. Piotr Kowalski và Alina Plenis đã nghiên cứu ” Simultaneous determination of six quinolone antibiotics in poultry and porcine samples by capillary electrophoresis”.
Trong nghiên cứu này phương pháp điện di mao quản (CE) đã được dùng để xác định dư lượng của 6 quinolone (enrofloxacin, ciprofloxacin, ofloxacin, lomefloxacin, norfloxacin, cinoxacin) trong thịt gà và cơ lợn. Các mẫu được chiết pha rắn và cho qua cột C-18 trước khi phân tích bằng CE với đầu dò UV. 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chương 1. Tổng Quan Phương pháp này xác nhận về độ chọn lọc, độ tuyến tính, độ chính xác, hiệu suất thu hồi và sự ổn định.
Các đường tuyến tính của các quinolone với r2> 0,999, CC, CC cho các chất phân tích khoảng 3,2-16,9ng/g và 3,5-20,3 ng/g tương ứng [42]. Phƣơng pháp HPLC Để có thể xác định riêng biệt Sarafloxacin và các sản phẩm phụ cần phải sử dụng phương pháp tách trước khi xác định do đó trong nghiên cứu này chúng tôi đã chọn phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC/PDA để định lượng thuốc kháng sinh. Phương pháp này có độ chọn lọc cao, độ nhạy cao và có thể phân tích hàng loạt mẫu nên rất thuận lợi cho việc xác định Sarafloxacin trong nghiên cứu sự phân hủy của thuốc kháng sinh. Mặt khác nó cũng là phương pháp hiện đại và đang phát triển mạnh trong các phòng thí nghiệm phân tích của các nước đang phát triển trên thế giới.
Đã có một số công trình nghiên cứu về kháng sinh Sarafloxacin được công bố như sau: Trong nghiên cứu được thực hiện do Robert J. Maxwell , Evjatar Cohen , and Dan J. Donoghue “Determination of Sarafloxacin Residues in Fortified and Incurred Eggs Using On-Line Microdialysis and HPLC/Programmable Fluorescence Detection” đã tách chiết được Sarafloxacin từ trứng gà bằng phương pháp chiết lỏng lỏng kết hợp chương trình làm giàu tự động ASTED và xác định hàm lượng bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao với đầu dò huỳnh quang. Hiệu suất thu hồi đạt được từ 87-102%.
Các giá trị độ lệch chuẩn tương đối dao động từ 22-26%. giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng lần lượt là 0,2ng/g và 1ng/g. Theo nghiên cứu của B. Hurtaud-Pessel và P.
Sanders, “Simultaneous determination of six quinolones in pig muscle byliquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionisation mass spectrometry” ,nghiên cứu này sử dụng phương pháp LC - MS để xác định dư lượng của 6 loại kháng sinh thuộc nhóm quinolone trong cơ lợn ở mức 7,5 g/kg. Ion hóa học áp suất khí quyển (APCI) đã được sử dụng để kết hợp với LC-MS. 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chương 1.