mở đầu cho một hướng mới của nuôi cấy mô tế bào thực vật, đó là vi nhân giống. -4- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ Từ những năm 1960, ngoài các hướng trên, nuôi cấy bao phấn và hạt phấn, nuôi cấy tế bào đơn và tế bào trần được phát triển mạnh. Các kỷ thuật lai soma bằng dung hợp tế bào trần và kỷ thuật chuyển gen được phát triển và thu được những thành tựu đáng kể. Chúng ta đang bước vào giai đoạn thứ 4 của nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Đó là giai đoạn nuôi cấy mô tế bào được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và vao nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao. Cơ sở lý luận của nuôi cấy mô tế bào thực vật Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào in vitro là học thuyết về tính toàn năng (totipotence) của tế bào. (1902), nhà thực vật người Đức, tất cả các tế bào của cây đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có khả năng tái sinh và phát triển thành cá thể hoàn chỉnh. Thực tế đã chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ.
Hàng trăm loài cây trồng đã được nhân giống trên qui mô thương mại bằng cách nuôi cấy trong môi trường nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống vô cùng lớn (Murashige, 1980). Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro thực vật thực chất là kết quả của các quá trình phân hóa và phản phân hóa. Tất cả các tế bào trong các cơ quan khác nhau của cơ thể thực vật đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh. Sự chuyển tế bào phôi sinh thành các tế bào chuyên hóa để đảm nhiệm các chức năng khác nhau được gọi là sự phân hóa tế bào.
Còn quá trình phản phân hóa thì ngược lại với quá trình phân hóa, có nghĩa là tế bào đã phân hóa thành mô chức năng không hoàn toàn mất đi khả năng phân chia mà ở điều kiện thích hợp chúng có thể trở về dạng phôi sinh và tái phân chia. Bản chất của quá trình này là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen. Trong quá trình phát triển cá thể, ở từng thời điểm nhất định đều có một số gen nhất định được hoạt hóa cho ta tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều -5- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử DNA của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa.
Mặt khác, khi nằm trong khối mô bình thường, tế bào luôn bị chi phối bởi các tế bào xung quanh. Khi tế bào được tách riêng rẽ, tác dụng ức chế của các tế bào xung quanh không còn nữa thì các gen được hoạt hóa và quá trình phân hóa sẽ xảy ra theo một quá trình định sẵn. Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục được nhiều trở ngại mà những phương pháp nhân giống khác thường gặp. Sau đây là những ưu điểm chính : - Cây con được trẻ hóa và sạch bệnh, vì vậy có tiềm năng sinh trưởng, phát triển và năng suất cao.
- Tạo cây con đồng nhất về mặt di truyền, bảo tồn được các tính trạng đã chọn lọc. - Tạo được dòng thuần của các cây tạp giao. - Tạo được cây có genotip mới (đa bội, đơn bội). - Bảo quản và lưu giữ tập đoàn gen.
- Có khả năng sản xuất quanh năm. - Có thể nhân nhanh nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh thái nhất định hoặc hạt nảy mầm kém. - Hệ số nhân giống cực kì cao (thường đạt được ở các loài cây khác nhau trong phạm vi từ 36 - 1012/năm), rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất đại trà. Trong công tác giống cây trồng, vấn đề được quan tâm hàng đầu là chất lượng và số lượng giống.
Bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã tạo ra được những giống cây hoàn toàn sạch virus. Limasset và Cornel (1945) đã chứng minh được rằng, nồng độ virus trong thực vật giảm dần ở bộ phận gần đỉnh sinh trưởng, riêng đỉnh sinh trưởng thì hoàn toàn sạch virus (Morel và Martin, 1952). Nguyên nhân của hiện tượng này là: -6- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ - Đỉnh sinh trưởng không có hệ mô dẫn, làm cho virus và vi sinh vật không có khả năng thâm nhập. - Đỉnh sinh trưởng là nơi sinh tổng hợp của auxin nên hàm lượng auxin khá cao, auxin có tác dụng ức chế sinh sản của virus.
- Quá trình phân chia của tế bào phôi sinh (ở đỉnh sinh trưởng) không kéo theo sự phân chia của virus. Về phương diện hệ số nhân, nhân giống in vitro là phương pháp không gì có thể so sánh kịp, kể cả phương pháp nhân giống bằng hạt. Nuôi cấy in vitro có thể coi là một cuộc cách mạng về hệ số nhân. Nhược điểm chính của phương pháp nuôi cấy in vitro là đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền và kỹ thuật cao nên chỉ có hiệu quả đối với những cây có giá trị cao hoặc khó nhân giống bằng phương pháp khác (Nickell, 1973).
Ngoài ra, phương pháp này còn có những bất lợi sau: - Mặc dù số lượng cây giống thu được có thể rất cao nhưng cây con có kích thước nhỏ, đòi hỏi phải có chế độ chăm sóc đặc biệt ở giai đoạn sau ống nghiệm. - Cây có thể có những đặc tính không mong muốn. - Khả năng tạo đột biến tăng. - Khả năng tái sinh có thể bị mất đi do cấy truyền callus hay huyền phù tế bào nhiều lần.
- Cây giống có thể bị nhiễm bệnh đồng loạt. Tuy vậy phương pháp nhân giống in vitro ngày càng được sử dụng rộng rãi để phục vụ cho những mục đích sau: - Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, cây rau, cây hoa, cây cảnh và cây dược liệu thuộc nhóm cây than thảo. - Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quí hiếm của giống cây lâm nghiệp và gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm than gỗ. - Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch virus.
-7- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ - Bảo quản và lưu giữ các tập đoàn giống nhân giống vô tính và các loài giao phấn trong ngân hàng gen. Kỹ thuật nuôi cấy in vitro Kỹ thuật nuôi cấy in vitro có thể chia thành các bước sau: - Lựa chọn đối tượng (cây trồng, giống, bộ phận cây) thích hợp. Nguyên liệu sử dụng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể là bất cứ bộ phận nào của cây: các đoạn của rễ, thân, các phần của lá (cuống lá, phiến lá…), các cấu trúc của phôi như lá mầm, trụ trên, trụ dưới lá mầm, hạt phấn, noãn… thậm chí cả mẫu thân ngầm hay cơ quan dự trữ dưới mặt đất (củ, căn hành…) cũng được dùng cho nuôi cấy. - Khử trùng mẫu và tiến hành nuôi cấy.
Nguyên liệu để nuôi cấy in vitro được chọn từ những cá thể ưu tú của loài, khỏe và sạch bệnh, nhưng ít nhiều đều có nhiễm vi sinh vật và nấm tùy thuộc vào sự tiếp xúc của chúng với môi trường xung quanh. Có một số bộ phận như phôi trong hạt, mô trong quả, dòng lúa non… ít bị nhiễm vi sinh vật hơn các bộ phận khác, ngược lại các bộ phận nằm dưới mặt đất như rễ, củ, thân ngầm, có lượng vi khuẩn và nấm rất cao. Phương pháp thông dụng nhất hiện nay để loại bỏ hệ vi sinh vật khỏi vật liệu nuôi cấy là sử dụng các hóa chất có hoạt tính diệt khuẩn và nấm. Khả năng tiêu diệt nấm và vi sinh vật của hóa chất khử trùng phụ thuộc vào nồng độ, thời gian xử lý và mức độ xâm nhập của chúng vào các ngõ ngách trên bề mặt của mô cấy.
Để làm tăng hiệu quả, người ta thường nhúng mẫu vào ethanol 70 - 80% trong 30 giây, sau đó mới xử lý bằng dung dịch diệt khuẩn. Đối với những mẫu có bề mặt được bao phủ lớp sáp, muốn đạt được kết quả tốt nhất cần cho them vào dung dịch khử trùng vài giọt Tween 20, Tween 80 hay teapol…vì các chất này làm tăng tính bám dính của hóa chất khử trùng. Với các mẫu quá bẩn phải rửa kỹ bằng nước xà phòng và để dưới vòi nước chảy từ 20 đến 30 phút sẽ có tác dụng làm giảm đáng kể hệ vi khuẩn khỏi mẫu cấy. Tác nhân khử trùng, ngoài tác dụng diệt vi sinh vật còn ảnh hưởng đến mô cấy vì vậy việc lực chọn loại hóa chất phải căn cứ vào mức độ nhiễm khuẩn và độ -8- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ mẫn cảm của từng mẫu.
Trong số các hóa chất hay được sử dụng để khử trùng thì Calcium hypoclorite và natri hypoclorite là hay được sử dụng hơn cả vì có tính độc thấp đối với mô được xử lý, không gây ức chế sinh trưởng và hiệu quả diệt khuẩn tốt. Nồng độ của Calcium hypoclorit và natri hypoclorit tương ứng thường là 5 - 15% và 0,5 - 2% trong thời gian 15 - 30 phút. Tuy nhiên, những chất này không bền nên trong thực tế HgCl2 cũng hay được dùng để thay thế. - Xác định điều kiện nuôi cấy (môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ, ánh sáng) để điều khiển quá trình phát triển nuôi cấy theo định hướng.
Thành công của phương pháp nuôi cấy in vitro phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy. Nhu cầu dinh dưỡng cho sự sinh trưởng và phát triển tối ưu của các loài là không giống nhau, ngay cả giữa các bộ phận trong cùng một cơ thể cũng ít nhiều khác nhau. Sự lựa chọn môi trường nuôi cấy bao gồm cả chất lượng và số lượng hóa chất sử dụng đóng vai trò quyết định đối với bản thân sự phân hóa và chiều hướng phân hóa của tế bào. Cho đến nay, đã có nhiều loại môi trường dinh dưỡng được tìm ra : môi trường Murashige và Skoog (1962), môi trường Linsmaer và Skoog (1963), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974)… Đây là những môi trường cơ bản và sẽ được cải tiến thành nhiều loại môi trường khác nhau phù hợp với mỗi đối tượng nghiên cứu và mục đích thí nghiệm.