Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Việt Nam là một quốc gia nông nghiệp; trong quá trình canh tác, hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) được sử dụng phổ biến nhằm bảo vệ cây trồng khỏi sinh vật gây hại, nâng cao năng suất và chất lượng nông sản. Chủng loại HCBVTV sử dụng tại Việt Nam tăng trưởng nhanh qua các thời kỳ, từ 189 hoạt chất vào năm 2003 lên 1.700 hoạt chất vào năm 2016. Thống kê của Cục Bảo vệ thực vật (năm 2015) ghi nhận hàng năm Việt Nam nhập khẩu khoảng từ 70.000 tấn thuốc BVTV. Đất là môi trường tiếp nhận đầu tiên của các loại hóa chất này. Do việc sử dụng kéo dài qua nhiều năm cũng như tập quán pha trộn, sử dụng đan xen đồng thời nhiều loại thuốc, trong môi trường đất tồn tại dư lượng của nhiều HCBVTV thuộc các nhóm hóa học khác nhau. HCBVTV có độc tính cao, thời gian phân hủy kéo dài, tích tụ trong nông sản từ đất và gây ảnh hưởng trực tiếp đến hệ sinh thái và sức khỏe con người.

Tại thời điểm thực hiện luận án, công tác kiểm nghiệm dư lượng HCBVTV trong đất tại Việt Nam vẫn được tiến hành riêng rẽ theo từng nhóm chất theo phương pháp truyền thống. Mỗi nhóm hợp chất yêu cầu một quy trình chiết riêng (thường sử dụng kỹ thuật chiết Soxhlet kéo dài 16–18 tiếng, tiêu tốn trên 1 lít dung môi hữu cơ) và làm sạch bằng sắc ký cột. Việc này làm tăng chi phí và kéo dài thời gian phân tích. Trên thế giới, phương pháp chuẩn bị mẫu QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe) do Anastassiades và cộng sự công bố năm 2003 đã được chuẩn hóa (AOAC 2007.01, EN 15662) nhưng chủ yếu áp dụng cho nền mẫu rau quả và thực phẩm có nguồn gốc thực vật. Đối với nền mẫu đất và trầm tích, nghiên cứu đầu tiên mới xuất hiện từ năm 2008 và chỉ xác định đồng thời trên 40 hoạt chất. Việt Nam chưa có phương pháp tiêu chuẩn để xác định đồng thời đa nhóm HCBVTV trong đất trên thiết bị sắc ký khí khối phổ thông dụng. Do đó, việc nghiên cứu phát triển một quy trình phân tích đồng thời nhiều nhóm HCBVTV trong đất dựa trên kỹ thuật QuEChERS kết hợp GC/MS là yêu cầu cấp thiết.

Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu được xác định cụ thể trong luận án gồm hai nội dung:

  1. Nghiên cứu phát triển một kỹ thuật phân tích mới có thể phân tích đồng thời hóa chất bảo vệ thực vật thuộc các nhóm hoạt chất khác nhau trong đất nhằm giảm thời gian và chi phí phân tích.
  2. Sơ bộ đánh giá với các phương pháp hiện hành thông qua phân tích mẫu thực tế và so sánh với một số phòng phân tích khác.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu:
    • 103 hóa chất bảo vệ thực vật thuộc nhiều nhóm hóa học khác nhau: cơ clo (Organochlorines), cơ phốt pho (Organophosphorus), Carbamate, Pyrethroid, Triazole, Anilide, Phthalimide, Pyrrole, Uracil, Thiocarbamate, Dicarboximide, Triazine, Strobilurin... Các chất được lựa chọn theo tiêu chí: nằm trong danh mục được phép sử dụng tại Việt Nam (theo Cẩm nang hướng dẫn quản lý hóa chất BVTV, phân bón ở Việt Nam, NXB Lao Động, 2010), được sử dụng phổ biến trong canh tác nông nghiệp, và phù hợp với kỹ thuật GC/MS (nhiệt độ bay hơi < 300°C, không bị phân hủy ở nhiệt độ < 350°C).
    • 03 chất nội chuẩn (Internal Standard - IS): acenaphthene-d10, phenanthrene-d10, fluoranthene-d10.
    • 01 chất chuẩn kiểm soát quá trình xử lý mẫu: naphthalene-d8.
    • 01 chất chuẩn kiểm soát quá trình bơm mẫu: triphenyl phosphate (TPP).
  • Phạm vi nghiên cứu:
    • Không gian: Mẫu đất trắng dùng cho các khảo sát thực nghiệm là đất phù sa tầng mặt (độ sâu 0–15 cm) thu thập tại Việt Nam, không chứa dư lượng HCBVTV; mẫu thực tế gồm 30 mẫu đất trồng lúa và đất trồng rau tại các vùng sản xuất nông nghiệp của Việt Nam. Khảo sát đối chứng liên phòng được thực hiện giữa phòng thí nghiệm của tác giả (Viện Công nghệ môi trường) với 02 phòng kiểm nghiệm tại Hàn Quốc và 02 đơn vị trong nước (Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng - Quatest và Trung tâm Kiểm nghiệm Kiểm định Thực vật Quốc gia - TTKKNPBQG).
    • Thời gian: Các nghiên cứu thực nghiệm được thực hiện trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu mã số 11/HĐ-ĐT.11/CNMT bắt đầu từ năm 2011; luận án được bảo vệ và hoàn thành năm 2019.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước được luận án điểm lại

Luận án đã hệ thống hóa các kỹ thuật xử lý mẫu và định lượng HCBVTV trên thế giới và tại Việt Nam:

  1. Các kỹ thuật tách chiết và xử lý mẫu truyền thống và hiện đại:

    • Chiết lỏng - lỏng (LLE): Kỹ thuật truyền thống, dựa trên sự phân bố của chất tan giữa hai pha không hòa tan; tiêu tốn lượng dung môi lớn (từ 200 mL trở lên) và tốn thời gian.
    • Chiết lỏng - rắn (LSE) và các kỹ thuật hỗ trợ: Chiết mẫu rắn bằng dung môi hữu cơ với hỗ trợ cơ học hoặc năng lượng cao như chiết chất lỏng điều áp (PLE) [69, 73], chiết hỗ trợ vi sóng (MAE) [71, 80], chiết hỗ trợ siêu âm (UAE) [72, 79]. Các kỹ thuật này có thể chiết đồng thời nhiều tạp chất từ nền mẫu phức tạp.
    • Chiết Soxhlet: Phương pháp chuẩn truyền thống cho mẫu đất, chiết tuần hoàn nhiều chu kỳ; hiệu suất thu hồi cao nhưng tiêu tốn 150–500 mL dung môi mỗi mẫu và thời gian xử lý kéo dài từ 8 đến 36 giờ.
    • Chiết chất lỏng siêu tới hạn (SFE) [77]: Sử dụng CO2 ở trạng thái siêu tới hạn (nhiệt độ 31°C, áp suất 73 atm) có độ khuếch tán cao; tuy nhiên CO2 không phân cực nên hạn chế chiết các chất phân cực và thiết bị đắt tiền.
    • Chiết pha rắn (SPE): Phát triển từ giữa thập niên 1970; sử dụng các chất nhồi cột như Silicagel, Florisil, C18, PSA (Primary Secondary Amine), GCB (Graphitized Carbon Black) để giữ tạp chất hoặc giữ chất phân tích trước khi rửa giải.
    • Các kỹ thuật vi chiết: Vi chiết pha rắn (SPME) do Pawliszyn phát triển năm 1989 với sợi phủ poly dimethylsiloxan (PDMS) dày 7–100 µm [10]; phân tán pha rắn hỗn hợp (MSPD) do Barker và cộng sự tìm ra năm 1989 [12]; vi chiết pha lỏng (LPME) gồm vi chiết giọt đơn (SDME) của Jeannot và Cantwell (1996) với giọt dung môi 1–3 µL [5], vi chiết sợi rỗng (HF-LPME, 1999) và vi chiết lỏng - lỏng phân tán (DLLME) [5].
    • Phương pháp QuEChERS: Giới thiệu lần đầu bởi Anastassiades và Lehotay năm 2002 tại Roma, công bố chính thức năm 2003 [12, 67] trên rau quả. Lehotay và cộng sự (2005) chứng minh hiệu quả trên 207/235 HCBVTV [44-45, 74]. Phương pháp phát triển thành hai tiêu chuẩn quốc tế: AOAC 2007.01 (sử dụng đệm axetat) và EN 15662 (sử dụng đệm xitrat). Đến tháng 11/2014 đã có trên 900 công bố về QuEChERS [85]. Ứng dụng QuEChERS trên đất và trầm tích bắt đầu từ công bố năm 2008 [76], phân tích khoảng 40 hoạt chất.

  2. Kỹ thuật phân tích định lượng:

    • Sắc ký khí (GC) với các đầu dò chọn lọc: đầu dò bắt giữ điện tử (ECD) cho nhóm cơ clo, đầu dò nitơ - phốt pho (NPD) hoặc quang hóa ngọn lửa (FPD) cho nhóm cơ phốt pho; nhược điểm là chỉ đo riêng rẽ từng nhóm [1, 4, 5, 70].
    • Sắc ký khí khối phổ (GC-MS): ion hóa va đập điện tử 70 eV, phân tích toàn quét (Full Scan) và giám sát ion chọn lọc (SIM), sử dụng cột mao quản không phân cực hoặc ít phân cực (DB1, DB5) hoặc cột phân cực (DB-1701).
    • Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC, LC/MS): áp dụng cho các chất kém bền nhiệt, nhiệt độ bay hơi cao, sử dụng đầu dò DAD, FLD, EC hoặc khối phổ (MSD).

  3. Thực trạng phương pháp phân tích tại Việt Nam:

    • Các tiêu chuẩn phân tích đất cũ quy định xác định đơn chất bằng HPLC hoặc GC (TCVN 6124, 6132, 6133, 6134, 6135, 6136 ban hành năm 1996).
    • Các tiêu chuẩn cải tiến năm 2009 cho phép phân tích theo nhóm: TCVN 8061:2009 xác định 17 HCBVTV clo hữu cơ và PCB bằng GC-ECD; TCVN 8062:2009 xác định 27 hợp chất phốt pho hữu cơ bằng GC cột mao quản. Cả hai tiêu chuẩn đều dùng chiết Soxhlet và làm sạch bằng SPE.
    • Trong nông sản: TCVN 8049:2009 (đa dư lượng trong gạo bằng GC), TCVN 8319:2010 (tối đa 21 chất trong rau quả bằng GC), TCVN 9333:2012 (dựa trên AOAC 2007.01 xác định 26 chất trong thực phẩm thực vật bằng GC/MS và LC/MS/MS).
    • Đề tài cấp Bộ Công Thương mã số 11/HĐ-ĐT.11/CNMT do Viện Công nghệ môi trường chủ trì (TS. Nguyễn Thành Đồng chủ trì, NCS Phạm Tuấn Linh là thư ký khoa học) đã xây dựng dự thảo quy trình phân tích 100 HCBVTV trong đất bằng QuEChERS GC/MS.
    • Luận án tiến sĩ của Trần Cao Sơn (Đại học Dược Hà Nội, 2015) xác định 32 HCBVTV trong dược liệu bằng QuEChERS kết hợp LC/MS/MS (25 chất) và GC/MS/MS (7 chất) [7].

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Đất là nền mẫu rắn vô cơ - hữu cơ phức tạp, có khả năng hấp phụ mạnh HCBVTV qua các liên kết bề mặt với khoáng sét và chất mùn, khác biệt với nền mẫu rau quả nhiều nước. Việc ứng dụng QuEChERS trên đất đòi hỏi phải khảo sát lại quá trình hydrat hóa, dung môi chiết, tỷ lệ muối tách pha và chất hấp phụ d-SPE. Hầu hết các nghiên cứu phân tích đồng thời trên 50 đến 100 chất trên thế giới đều phải sử dụng các hệ thống khối phổ hai lần đắt tiền (GC/MS/MS hoặc LC/MS/MS). Khoảng trống mà luận án tập trung giải quyết là: tối ưu hóa kỹ thuật chiết QuEChERS kết hợp d-SPE trên nền mẫu đất và thiết lập điều kiện đo trên hệ thống GC/MS đơn tứ cực (Quadrupole) phổ thông bằng kỹ thuật 3 SIM để định tính và định lượng đồng thời 103 HCBVTV thuộc nhiều nhóm khác nhau trong một lần phân tích.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và khái niệm sử dụng

  • Kỹ thuật QuEChERS cải tiến cho mẫu đất: Quá trình chuẩn bị mẫu gồm hai giai đoạn độc lập:
    • Chiết tách: Mẫu đất khô được làm ẩm (hydrat hóa) bằng nước cất để nới lỏng liên kết giữa chất phân tích và các hạt keo đất, sau đó chiết lỏng - lỏng và lỏng - rắn đồng thời bằng dung môi hữu cơ có độ phân cực trung bình (Acetonitrile). Hỗn hợp muối vô cơ khan (MgSO4 và NaCl) được bổ sung để tách pha nước - hữu cơ (salting-out effect) và giữ ẩm.
    • Làm sạch bằng d-SPE (Dispersive Solid Phase Extraction): Thay vì dùng cột chiết SPE truyền thống, các chất hấp phụ rắn dạng bột mịn được đưa trực tiếp vào dịch chiết ly tâm nhằm hấp phụ chọn lọc các hợp chất cản trở (axit béo, sắc tố, chất hữu cơ hòa tan), sau đó ly tâm để thu dịch trong.
  • Kỹ thuật sắc ký khí khối phổ giám sát ion chọn lọc (GC/MS SIM):
    • Mẫu được hóa hơi tại cổng bơm mẫu, phân tách trên cột sắc ký mao quản DB5-MS dựa trên nhiệt độ sôi và độ phân cực.
    • Quá trình ion hóa va đập điện tử (Electron Ionization - EI) ở mức năng lượng tiêu chuẩn 70 eV làm phân mảnh các phân tử thành các ion đặc trưng.
    • Chế độ SIM (Selected Ion Monitoring): Thay vì quét toàn bộ dải khối (Full Scan), đầu dò khối phổ chỉ tập trung thu nhận tín hiệu tại các giá trị khối lượng trên điện tích (m/z) đặc trưng của từng chất (01 mảnh ion định lượng và 2–3 mảnh ion định tính), giúp tăng thời gian tích lũy ion (dwell time) và nâng cao độ nhạy. Luận án chia chương trình chạy thành các phân đoạn thời gian (kỹ thuật 3 SIM) để đo đồng thời 103 chất.
    • Phần mềm AMDIS (Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System) được sử dụng để phân giải các pic chồng chập và định dạng chất phân tích.

Hóa chất, thiết bị và chuẩn bị mẫu

  • Hóa chất: Chuẩn 103 HCBVTV có độ tinh khiết từ 97% đến 99,5% (Wako, Chemservice, Dr. Ehrenstorfer); 03 chất nội chuẩn (acenaphthene-d10, phenanthrene-d10, fluoranthene-d10); chất kiểm soát xử lý mẫu naphthalene-d8; chất kiểm soát bơm mẫu TPP; dung môi Acetonitrile (MeCN), Methanol (MeOH), Acetone, Ethylacetate (EtOAc) cấp tinh khiết sắc ký; MgSO4 khan, NaCl tinh khiết phân tích; chất hấp phụ PSA (Varian), GCB, Alumina (Supelco), C18 (Agilent), Florisil (Sigma Aldrich).
  • Thiết bị: Hệ thống GC-MS QP 2010 (Shimadzu) tích hợp bộ bơm mẫu tự động AOC-20i; cột phân tích DB5-MS (dài 30 m, đường kính trong 0,25 mm, độ dày màng pha tĩnh 0,25 µm); máy lắc Vortexer; máy ly tâm lạnh Hanil; cân phân tích Sartorius (độ chính xác 0,0001 g); máy đo pH Mettler.
  • Chuẩn bị mẫu chuẩn:
    • Dung dịch chuẩn gốc đơn (2.000 µg/mL): Hòa tan khoảng 20,0 mg từng HCBVTV trong MeCN, định mức 10 mL, bảo quản ở -20°C.
    • Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp (10 µg/mL): Lấy 1 mL từng chuẩn gốc đơn vào bình định mức 200 mL, định mức bằng MeCN, bảo quản ở -20°C.
    • Dung dịch chuẩn làm việc hỗn hợp (1 µg/mL): Pha loãng từ chuẩn trung gian trong MeCN.
    • Dãy chuẩn làm việc: 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500 ng/mL trong MeCN.
    • Mẫu trắng: Đất phù sa không chứa HCBVTV (độ sâu 0–15 cm), thành phần gồm 52,6% sét, 10,1% cát, 37,3% bùn; pH(H2O) = 6,9; hàm lượng chất hữu cơ 2,5%; làm khô tự nhiên, nghiền và rây qua rây 2 mm, bảo quản ở 4°C.
    • Mẫu đất thêm chuẩn: Trộn 500 g mẫu đất trắng với 200 mL acetone đã pha lượng chuẩn trung gian xác định (mỗi 1 mL chuẩn trung gian thêm vào tương ứng 20 µg/kg), trộn đều, để bay hơi dung môi tự nhiên 24 giờ, bảo quản ở -20°C.

Phương pháp nghiên cứu và thẩm định

  • Khảo sát các thông số thiết bị GC-MS: nhiệt độ cổng bơm mẫu, tốc độ bơm mẫu (nhanh/chậm), thể tích bơm mẫu, tốc độ khí mang Helium, 06 chương trình nhiệt độ lò cột, lựa chọn mảnh ion định tính và định lượng cho từng chất.
  • Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết QuEChERS: loại dung môi chiết (MeCN, EtOAc, Acetone, MeOH), thời gian lắc chiết, loại và lượng chất hấp phụ làm sạch d-SPE (PSA, C18, GCB, Alumina, Florisil), ảnh hưởng của đặc tính nền mẫu (pH, ion tự do tạo phức, hàm lượng chất hữu cơ, kích thước hạt đất).
  • Tiêu chí thẩm định phương pháp (thực hiện lặp lại tối thiểu n ≥ 5):
    • Khoảng tuyến tính và đường chuẩn: hệ số tương quan tuyến tính $R \ge 0,99$.
    • Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ): xác định theo tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu nền ($S/N \ge 3$ đối với LOD và $S/N \ge 10$ đối với LOQ).
    • Độ lặp lại: độ lệch chuẩn tương đối $%RSD < 30%$.
    • Độ đúng (độ thu hồi): hiệu suất thu hồi $R%$ nằm trong khoảng 60% – 130%.
  • Kiểm chứng thực tế: phân tích 30 mẫu đất trồng lúa và rau; gửi mẫu phân tích liên phòng độc lập tại Hàn Quốc và Việt Nam.

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

Chương này tổng kết cơ sở lý luận về HCBVTV, lịch sử sử dụng, nguy cơ tồn dư trong môi trường và các giải pháp phân tích:

  • Phân loại HCBVTV: Phân tích cấu tạo hóa học và cơ chế tác động của 4 nhóm lớn:
    • Nhóm cơ clo: Các hợp chất hữu cơ chứa 5 nguyên tử clo trở lên (DDT, aldrin, dieldrin, endosulfan, lindane, chlordane), có tính bền vững cao, tích tụ sinh học và gây độc thần kinh; phần lớn đã bị cấm sử dụng.
    • Nhóm cơ phốt pho: Dẫn xuất este của axit photphoric theo công thức Schrader (parathion, malathion, chlorpyrifos, diazinon), ức chế men cholinesterase; kém bền hơn nhóm cơ clo nhưng có độc tính cấp tính cao.
    • Nhóm Carbamate: Dẫn xuất của axit carbamic (carbaryl, carbofuran, isoprocarb), ức chế men cholinesterase có hồi phục, dễ bị thủy phân.
    • Nhóm Pyrethroid: Các este tổng hợp mô phỏng pyrethrin tự nhiên (permethrin, cypermethrin, bifenthrin), độc tính thấp với động vật có vú nhưng dễ bị phân hủy quang học.
    • Các nhóm khác: Triazole, anilide, phthalimide, pyrrole, uracil...
  • Tình hình sử dụng và nhập khẩu: Tổng kết số liệu FAO (trên 2 triệu tấn/năm trên thế giới). Tại Việt Nam, giai đoạn trước năm 1985 dùng khoảng 6.500–9.000 tấn/năm; giai đoạn 1957–1994 sử dụng 24.130 tấn DDT cho phòng trừ sốt rét. Bảng 1.1 thể hiện số liệu nhập khẩu HCBVTV tại Việt Nam từ năm 2010: năm 2010 nhập khẩu 72.247 tấn thành phẩm, năm 2014 nhập trên 70.000 tấn thành phẩm, danh mục cho phép vượt 1.600 hoạt chất.
  • Kỹ thuật xử lý và định lượng: Đánh giá ưu - nhược điểm của các phương pháp LLE, LSE, Soxhlet, SFE, SPE, SPME, MSPD, LPME, QuEChERS và các kỹ thuật sắc ký GC, HPLC. Nêu rõ các phiên bản QuEChERS chuẩn: bản gốc của Anastassiades (2003), bản AOAC 2007.01 và bản EN 15662 (Hình 1.9).
  • Hiện trạng tiêu chuẩn tại Việt Nam: Đối chiếu các tiêu chuẩn phân tích đất (TCVN 8061:2009, TCVN 8062:2009) và phân tích thực phẩm (TCVN 8049:2009, TCVN 8319:2010, TCVN 9333:2012), chỉ ra khoảng trống về phương pháp phân tích đa nhóm trên 100 chất cho nền mẫu đất.

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 mô tả chi tiết đối tượng, hóa chất, thiết bị, quy trình chuẩn bị và các bước thực nghiệm:

  • Danh mục chất phân tích: Lập bảng chi tiết 103 HCBVTV (Bảng 2.1) kèm khối lượng phân tử (M), hệ số phân bố octanol-nước ($\log K_{ow}$ dao động từ -4,21 của vamidothion đến 6,91 của pp'-DDT), hằng số phân ly ($pK_a$) và công thức cấu tạo.
  • Quy trình chuẩn bị mẫu và dung dịch chuẩn: Trình bày phương pháp pha chế dãy dung dịch chuẩn từ 1 đến 500 ng/mL và phương pháp tạo mẫu đất thêm chuẩn trên nền đất phù sa đã chuẩn hóa đặc tính hạt và hàm lượng hữu cơ.
  • Các bước khảo sát tối ưu:
    • Tối ưu hóa thiết bị GC-MS: Thiết lập các thí nghiệm thay đổi nhiệt độ cổng bơm mẫu, tốc độ bơm mẫu, thể tích bơm, tốc độ khí mang He, thử nghiệm 06 chương trình nhiệt độ lò và giải tích phổ khối để chọn ion SIM.
    • Tối ưu hóa chiết QuEChERS: Thử nghiệm trên 10 g mẫu đất thêm chuẩn: thêm 10 mL nước cất và IS (ủ 30 phút); thêm 10 mL dung môi chiết; thêm 4 g MgSO4 và 1 g NaCl; lắc chiết; ly tâm 4.000 vòng/phút trong 5 phút. Lấy 2 mL dịch chiết chuyển sang ống ly tâm chứa chất hấp phụ d-SPE; lắc 30 giây; ly tâm 4.000 vòng/phút trong 5 phút; lấy 0,5 mL dịch trong đem phân tích GC-MS.
  • Phương pháp thẩm định: Trình bày công thức toán học tính độ lặp lại ($%RSD$) và độ thu hồi ($R%$), xác định ngưỡng LOD, LOQ, và thiết kế thí nghiệm phân tích liên phòng với 30 mẫu thực tế.

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chương 3 tập trung phân tích các dữ liệu thực nghiệm, biện luận kết quả và đánh giá phương pháp:

1. Lựa chọn điều kiện vận hành GC-MS

  • Nhiệt độ và chế độ bơm mẫu: Khảo sát các mức nhiệt độ cổng bơm và hai chế độ bơm mẫu nhanh/chậm (Bảng 3.1, Bảng 3.2, Hình 3.1, Hình 3.2). Kết quả xác định chế độ bơm mẫu nhanh ở nhiệt độ cổng bơm 260°C cho độ nhạy cao nhất và $%RSD$ thấp nhất đối với đa số các hoạt chất.
  • Thể tích bơm và tốc độ khí mang: Dựa trên tính toán thể tích giãn nở hơi của dung môi MeCN ở 260°C (Bảng 3.3, Bảng 3.4, Hình 3.3), thể tích bơm mẫu được chọn là 1 µL và lưu lượng khí mang He được tối ưu hóa để đảm bảo độ phân giải và tránh hiện tượng quá tải buồng bơm.
  • Chương trình nhiệt độ lò cột: Khảo sát 06 chương trình nhiệt độ (Bảng 3.5, Hình 3.4 đến Hình 3.10). Chương trình tối ưu cho phép tách hoàn toàn các pic sắc ký của 103 HCBVTV và các chất nội chuẩn trong thời gian phân tích hợp lý, hạn chế tối đa hiện tượng chảy máu cột ở nhiệt độ cao.
  • Lựa chọn mảnh ion phân tách (3 SIM): Sử dụng phần mềm AMDIS để giải tích phổ khối ở chế độ Full Scan (Hình 3.11). Với mỗi hoạt chất trong 103 HCBVTV, luận án xác định được thời gian lưu, 01 mảnh ion định lượng có cường độ tín hiệu cao nhất và các mảnh ion định tính đặc trưng (Bảng 3.10). Chia thời gian phân tích thành các phân đoạn SIM liên tiếp để đảm bảo độ nhạy cho toàn bộ 103 chất.

2. Nghiên cứu quá trình tách chiết và làm sạch

  • Lựa chọn dung môi chiết: Đánh giá độ phân cực của MeCN so với các dung môi khác (Hình 3.12). Tổng hợp độ thu hồi và độ lệch chuẩn của các HCBVTV (Bảng 3.6, Bảng 3.7) cho thấy Acetonitrile (MeCN) cho độ thu hồi đồng đều nhất trên các nhóm chất (từ nhóm không phân cực như cơ clo đến nhóm phân cực hơn như cơ phốt pho, triazole).
  • Thời gian chiết mẫu: Khảo sát thời gian lắc từ 1 đến 15 phút (Hình 3.13, Bảng 3.8). Kết quả chỉ ra thời gian lắc thích hợp giúp đạt cân bằng chiết mà không làm tăng lượng tạp chất hòa tan vào dịch chiết.
  • Ảnh hưởng của chất hấp phụ làm sạch (d-SPE): Khảo sát các chất hấp phụ PSA, C18, GCB, Alumina, Florisil (Hình 3.14, 3.15, 3.16). Kết quả cho thấy:
    • PSA có hiệu quả cao trong việc loại bỏ axit hữu cơ, axit béo và hợp chất phân cực.
    • C18 loại bỏ hiệu quả các hợp chất không phân cực (chất béo, sáp).
    • GCB loại bỏ sắc tố nhưng cần kiểm soát lượng dùng để tránh hấp phụ mất các HCBVTV có cấu trúc vòng phẳng.
  • Ảnh hưởng của nền mẫu:
    • pH: Khảo sát ảnh hưởng của pH (Hình 3.17) đến độ thu hồi; môi trường trung tính hoặc đệm nhẹ giúp bảo toàn các chất nhạy cảm với axit/kiềm.
    • Cỡ hạt và hàm lượng hữu cơ (Bảng 3.9): Đất nghiền qua rây 2 mm kết hợp tỷ lệ đất:nước 1:1 và muối MgSO4/NaCl (4:1) đảm bảo hiệu suất chiết ổn định.

3. Quy trình phân tích hoàn chỉnh

Sơ đồ hóa quy trình chuẩn bị mẫu (Hình 3.18) và quy trình vận hành GC-MS:

[10 g mẫu đất khô (< 2 mm)]
       ↓ + 10 mL H2O cất + Nội chuẩn (IS), để ngấm 30 phút
[Hỗn hợp đất ẩm]
       ↓ + 10 mL Acetonitrile (MeCN)
       ↓ + 4 g MgSO4 khan + 1 g NaCl
[Lắc chiết cơ học]
       ↓ Ly tâm 4.000 vòng/phút trong 5 phút
[Thu 2 mL dịch chiết lớp trên]
       ↓ Chuyển sang ống chứa hỗn hợp hấp phụ d-SPE (PSA, C18, GCB, MgSO4)
[Lắc vortex 30 giây]
       ↓ Ly tâm 4.000 vòng/phút trong 5 phút
[Thu 0,5 mL dịch trong]
       ↓
[Tiêm 1 µL vào hệ thống GC-MS (Chế độ 3 SIM, Cột DB5-MS)]

4. Thẩm định phương pháp và phân tích mẫu thực tế

  • LOD, LOQ và khoảng tuyến tính: Bảng 3.11 và Bảng 3.12 tổng hợp các thông số phân tích. Đường chuẩn của 103 HCBVTV đạt hệ số tương quan $R \ge 0,99$ trong dải nồng độ khảo sát (từ LOQ đến 500 ng/mL). Giới hạn định lượng (LOQ) đáp ứng yêu cầu phân tích vi lượng (ngưỡng ppb), phù hợp với quy chuẩn môi trường.
  • Độ thu hồi và độ lặp lại: Bảng 3.13 thể hiện độ thu hồi trung bình của các chất nằm trong khoảng chấp nhận từ 60% đến 130%, với độ lệch chuẩn tương đối $%RSD < 30%$ ($n \ge 5$).
  • Kết quả phân tích mẫu thực tế:
    • Địa điểm và phân loại mẫu: Bảng 3.14 (đất trồng lúa) và Bảng 3.15 (đất trồng rau).
    • Dư lượng phát hiện: Bảng 3.16 tổng hợp kết quả phân tích tại Viện Công nghệ môi trường; phát hiện dư lượng của một số HCBVTV nhóm cơ clo tồn lưu (op-DDT, op-DDD) và nhóm cơ phốt pho (Cadusafos).
    • So sánh liên phòng: Bảng 3.17 và các hình từ 3.19 đến 3.27 so sánh kết quả phân tích 05 mẫu đất (BCT-2, BCT-3, BCT-14, BCT-15, BCT-16, BCT-25) giữa Viện Công nghệ môi trường, 02 phòng kiểm nghiệm Hàn Quốc, Quatest và TTKKNPBQG. Kết quả định lượng các hoạt chất như op-DDT, op-DDD, Cadusafos cho thấy sự tương đồng và sai lệch nằm trong giới hạn cho phép giữa các phòng thí nghiệm.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn

  1. Đóng góp về phương pháp luận và kỹ thuật phân tích:
    • Đã phát triển thành công quy trình chuẩn bị mẫu dựa trên kỹ thuật QuEChERS cải tiến kết hợp làm sạch bằng d-SPE trên nền mẫu đất nông nghiệp phức tạp, xử lý đồng thời 103 hoạt chất HCBVTV thuộc nhiều nhóm cấu trúc hóa học khác nhau.
    • Ứng dụng kỹ thuật giám sát ion chọn lọc phân đoạn (3 SIM) trên thiết bị GC/MS đơn tứ cực (QP 2010), giải quyết bài toán phân tích đồng thời số lượng lớn chất phân tích mà không cần sử dụng hệ thống sắc ký khối phổ hai lần (MS/MS) đắt tiền.
  2. Đóng góp về mặt thực tiễn:
    • Tiết kiệm thời gian và chi phí: Rút ngắn thời gian xử lý mẫu từ 16–18 giờ (chiết Soxhlet truyền thống) xuống còn dưới 1 giờ đối với kỹ thuật QuEChERS; giảm lượng dung môi hữu cơ tiêu tốn từ 150–500 mL (hoặc trên 1 lít đối với toàn bộ quy trình cũ) xuống còn 10 mL MeCN cho mỗi mẫu, giảm thiểu độc hại cho người kiểm nghiệm và môi trường.
    • Khả năng ứng dụng và độ tin cậy: Phương pháp đã được thẩm định đầy đủ theo các tiêu chuẩn phân tích vi lượng (LOD, LOQ, khoảng tuyến tính $R \ge 0,99$, độ thu hồi 60%–130%, $%RSD < 30%$) và được kiểm chứng độc lập thông qua phân tích liên phòng với các tổ chức kiểm nghiệm trong nước và quốc tế.

Bảng tổng hợp so sánh phương pháp của luận án với phương pháp truyền thống

Tiêu chí so sánh Phương pháp truyền thống (TCVN 8061, 8062) Phương pháp QuEChERS GC/MS của luận án
Kỹ thuật tách chiết Chiết Soxhlet Chiết lỏng - lỏng/lỏng - rắn (QuEChERS)
Kỹ thuật làm sạch Sắc ký cột (SPE cổ điển) Chiết pha rắn phân tán (d-SPE)
Thời gian chuẩn bị mẫu 16 – 18 giờ Dưới 1 giờ
Lượng dung môi tiêu tốn 150 – 500 mL (hoặc > 1 L cho đa nhóm) 10 mL Acetonitrile
Số chất phân tích tối đa 17 chất (cơ clo) hoặc 27 chất (cơ phốt pho) 103 hoạt chất thuộc đa nhóm
Hệ thống thiết bị GC-ECD, GC-FPD hoặc GC-MS GC-MS (Chế độ 3 SIM)

Kiến nghị và đề xuất giải pháp

  • Đề xuất áp dụng quy trình phân tích đã xây dựng vào công tác kiểm tra, quan trắc định kỳ chất lượng đất nông nghiệp tại các trung tâm kiểm nghiệm và viện nghiên cứu môi trường.
  • Chuyển giao quy trình cho các cơ quan quản lý nhà nước để phục vụ việc xây dựng tiêu chuẩn quốc gia mới về phân tích đa dư lượng HCBVTV trong đất, thay thế các quy trình đơn lẻ hiện hành.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Giới hạn về đặc tính bay hơi của hoạt chất: Quy trình chỉ áp dụng cho 103 HCBVTV có nhiệt độ bay hơi thấp (< 300°C) và bền nhiệt ở nhiệt độ dưới 350°C để phân tích được trên GC/MS. Chưa phân tích được các HCBVTV phân cực mạnh, không bay hơi hoặc kém bền nhiệt (như nhóm sulfonylurea, glyphosate hay một số carbamate phân hủy nhiệt).
  • Giới hạn phần cứng thiết bị: Việc sử dụng hệ GC/MS đơn tứ cực đòi hỏi phải tối ưu hóa ngặt nghèo về thời gian lưu để chia các phân đoạn SIM; đối với các nền mẫu đất có hàm lượng tạp chất hữu cơ quá cao, tín hiệu nền ở chế độ SIM vẫn có thể gây nhiễu so với chế độ MRM trên hệ thống GC/MS/MS.
  • Phạm vi nền mẫu thực nghiệm: Các khảo sát tối ưu hóa tập trung chủ yếu trên mẫu đất phù sa và các mẫu đất trồng trọt (lúa, rau); chưa mở rộng khảo sát chuyên sâu trên các loại đất đặc thù có tính chất hóa lý phức tạp hơn như đất phèn, đất mặn, hoặc đất đỏ bazan có dung tích hấp phụ khoáng sét cao.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Mở rộng danh mục phân tích đối với các hoạt chất bảo vệ thực vật thế hệ mới bằng cách kết hợp kỹ thuật QuEChERS với kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC/MS/MS).
  • Khảo sát và đánh giá ảnh hưởng của các loại đất khác nhau (đất đỏ bazan, đất cát ven biển, đất than bùn) đến hiệu suất thu hồi của quy trình d-SPE.
  • Nghiên cứu tự động hóa quy trình xử lý mẫu QuEChERS nhằm nâng cao năng suất phân tích trong các phòng kiểm nghiệm môi trường quy mô lớn.

Giá trị tham khảo

Đối tượng hưởng lợi

  • Học viên cao học, nghiên cứu sinh và giảng viên: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về phương pháp luận tối ưu hóa điều kiện sắc ký khí khối phổ và kỹ thuật chuẩn bị mẫu hiện đại trong hóa phân tích và hóa học môi trường.
  • Cán bộ phân tích và kiểm nghiệm viên: Cung cấp quy trình thao tác chuẩn (SOP) hoàn chỉnh từ khâu chuẩn bị mẫu đất, tỷ lệ muối, chất hấp phụ đến thông số tiêm mẫu và bảng mảnh ion định lượng/định tính để ứng dụng trực tiếp tại các phòng thử nghiệm đạt chuẩn ISO/IEC 17025.
  • Cơ quan quản lý môi trường và nông nghiệp: Cung cấp dữ liệu thực nghiệm về mức độ tồn dư của HCBVTV trong đất trồng trọt, hỗ trợ đánh giá rủi ro ô nhiễm môi trường đất và xây dựng chính sách quản lý hóa chất nông nghiệp.

Các nội dung có giá trị tham khảo chuyên sâu

  • Bảng danh mục 103 HCBVTV (Bảng 2.1) kèm đầy đủ các thông số hóa lý quan trọng ($\log K_{ow}$, $pK_a$, khối lượng phân tử, nhóm chức).
  • Bảng thông số vận hành GC/MS chi tiết (Bảng 3.10) bao gồm thời gian lưu, mảnh ion định lượng và mảnh ion định tính ($m/z$) cho từng hoạt chất.
  • Dữ liệu khảo sát so sánh hiệu quả loại tạp chất của các loại chất hấp phụ d-SPE (PSA, C18, GCB, Florisil, Alumina) trên nền mẫu đất.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án lựa chọn 103 hoạt chất bảo vệ thực vật dựa trên những tiêu chí nào?

Tác giả lựa chọn 103 HCBVTV dựa trên 3 tiêu chí chính:

  • Nằm trong danh mục HCBVTV được phép sử dụng cho đất canh tác nông nghiệp tại Việt Nam (theo Cẩm nang hướng dẫn quản lý hóa chất BVTV, phân bón ở Việt Nam, NXB Lao Động, 2010).
  • Đã và đang được sử dụng phổ biến trong canh tác nông nghiệp tại Việt Nam cũng như trên thế giới.
  • Phù hợp với kỹ thuật phân tích GC/MS: có nhiệt độ bay hơi thấp (< 300°C) và không bị phân hủy ở nhiệt độ dưới 350°C.

2. Quy trình xử lý mẫu QuEChERS cho đất trong luận án sử dụng dung môi, tỷ lệ muối và chất hấp phụ nào?

Quy trình sử dụng:

  • Dung môi chiết: 10 mL Acetonitrile (MeCN) cho 10 g mẫu đất khô đã được hydrat hóa bằng 10 mL nước cất (ủ 30 phút).
  • Hệ muối tách pha: 4 g MgSO4 khan và 1 g NaCl (tỷ lệ 4:1).
  • Làm sạch d-SPE: Dịch chiết (2 mL) được làm sạch trực tiếp bằng hỗn hợp chất hấp phụ gồm PSA (loại bỏ axit hữu cơ, axit béo), C18 (loại bỏ hợp chất không phân cực), một lượng nhỏ GCB (loại sắc tố) và MgSO4 khan.

3. Thiết bị GC/MS được thiết lập ở những điều kiện tối ưu nào để phân tích đồng thời 103 hoạt chất?

Các điều kiện vận hành GC/MS tối ưu gồm:

  • Cổng bơm mẫu duy trì ở nhiệt độ 260°C, vận hành ở chế độ bơm mẫu nhanh (fast injection), thể tích tiêm 1 µL.
  • Cột phân tích DB5-MS (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm), khí mang Helium.
  • Chương trình nhiệt độ lò được tối ưu hóa qua khảo sát 06 chương trình nhiệt khác nhau.
  • Vận hành ở chế độ giám sát ion chọn lọc phân đoạn (3 SIM); mỗi hoạt chất được giám sát bằng 01 mảnh ion định lượng và 2–3 mảnh ion định tính được định dạng thông qua phần mềm AMDIS và phổ va đập điện tử 70 eV.

4. Mẫu đất trắng dùng trong các thí nghiệm khảo sát có những đặc tính hóa lý gì?

Mẫu đất trắng được lấy từ đất phù sa tầng mặt (độ sâu 0–15 cm) tại Việt Nam, đã được kiểm nghiệm không chứa dư lượng HCBVTV, có các đặc tính:

  • Thành phần cơ giới: 52,6% sét; 10,1% cát; 37,3% bùn.
  • Độ chua: $pH(H_2O) = 6,9$.
  • Hàm lượng chất hữu cơ: 2,5%.
  • Mẫu được làm khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng, nghiền và rây qua cỡ mắt rây 2 mm, bảo quản ở 4°C.

5. Phương pháp phân tích được kiểm chứng và so sánh liên phòng như thế nào?

Phương pháp được kiểm chứng trên 30 mẫu đất trồng lúa và đất trồng rau thực tế tại Việt Nam. Độ đúng và độ tin cậy được khẳng định thông qua việc gửi các mẫu đất thực tế (như các mẫu BCT-2, BCT-3, BCT-14, BCT-15, BCT-16, BCT-25) phân tích đối chứng độc lập tại 02 phòng kiểm nghiệm uy tín tại Hàn Quốc và 02 phòng phân tích chức năng tại Việt Nam (Quatest và TTKKNPBQG). Kết quả định lượng các hợp chất phát hiện (như op-DDT, op-DDD, Cadusafos) cho thấy sự tương đồng và phù hợp giữa các phòng thí nghiệm tham gia.

Kết luận

Luận án của tác giả Phạm Tuấn Linh đã phát triển thành công quy trình QuEChERS kết hợp d-SPE và kỹ thuật GC/MS 3 SIM để phân tích đồng thời 103 hóa chất bảo vệ thực vật đa nhóm trong môi trường đất. Nghiên cứu đã giải quyết được các hạn chế lớn của phương pháp Soxhlet truyền thống khi rút ngắn thời gian chuẩn bị mẫu xuống dưới 1 giờ và giảm lượng dung môi hữu cơ tiêu tốn xuống còn 10 mL mỗi mẫu. Quy trình đáp ứng đầy đủ các tiêu chí thẩm định phân tích vi lượng về độ nhạy, độ tuyến tính, độ lặp lại và độ thu hồi, đồng thời được kiểm chứng tin cậy thông qua thử nghiệm liên phòng trong và ngoài nước. Kết quả nghiên cứu cung cấp một công cụ kỹ thuật hiệu quả phục vụ công tác quan trắc chất lượng đất và quản lý an toàn môi trường nông nghiệp tại Việt Nam.