Tổng quan luận án

Ung thư phổi nguyên phát (UTPNP) là một trong những bệnh lý ác tính có tần suất mắc và tỷ lệ tử vong hàng đầu trong các bệnh lý ung thư trên phạm vi toàn cầu. Theo số liệu của Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC), UTPNP chiếm khoảng 12% tổng số các ca ung thư mới mắc và chiếm 18% tổng số ca tử vong do ung thư. Trong cơ cấu bệnh học của ung thư phổi nguyên phát, ung thư phổi không tế bào nhỏ (UTPKTBN) chiếm tỷ lệ đa số, trên 80% tổng số trường hợp. Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc ung thư phổi có xu hướng gia tăng nhanh chóng dưới tác động của tình trạng hút thuốc lá, ô nhiễm môi trường không khí, khói bụi công nghiệp và các yếu tố nhiễm trùng. Mặc dù các kỹ thuật chẩn đoán và phác đồ điều trị đã có nhiều bước tiến bộ, phần lớn bệnh nhân ung thư phổi vẫn được phát hiện ở giai đoạn muộn. Tỷ lệ sống thêm 5 năm của bệnh nhân được chẩn đoán ở giai đoạn cuối chỉ đạt khoảng 16%, trong khi tỷ lệ này có thể đạt từ 70% đến 90% nếu bệnh được phát hiện và can thiệp ở các giai đoạn sớm. Do đó, việc nghiên cứu các dấu ấn sinh học phân tử có độ nhạy và độ đặc hiệu cao phục vụ sàng lọc, chẩn đoán sớm và định hướng can thiệp đích là một hướng đi cần thiết.

Khoảng trống nghiên cứu được xác định xuất phát từ vai trò của các dấu ấn phân tử mới trong huyết tương và mô bệnh học:

  • Gen CIZ1 (Cip1-interacting zinc finger) mã hóa cho protein nội bào tham gia khởi đầu quá trình tái bản DNA. Biến thể cắt nối luân phiên CIZ1b (thiếu hụt 24 nucleotide ở đầu 3' của exon 14) biểu hiện ưu thế trong mô khối u ung thư phổi không tế bào nhỏ và có thể giải phóng vào huyết tương dưới dạng phức hợp với fibrinogen, cho thấy tiềm năng phát hiện sớm với độ chính xác cao.
  • Yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF - Vascular Endothelial Growth Factor) đóng vai trò chủ đạo trong cơ chế tăng sinh mạch máu nuôi khối u (angiogenesis), bảo vệ tế bào ung thư khỏi quá trình chết theo chương trình (apoptosis), đồng thời liên quan trực tiếp đến sự xâm lấn và tiến triển bệnh.
  • Đột biến thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) là đích phân tử trực tiếp trong phác đồ điều trị bằng các thuốc ức chế tyrosine kinase (TKI).
  • Virus Merkel cell (Merkel Cell Polyomavirus - MCV), một tác nhân thuộc nhóm tác nhân sinh ung thư phân loại 2A, đã được ghi nhận có sự hiện diện tại đường hô hấp dưới và có mối liên quan nhất định với nguy cơ ung thư phổi cũng như các biến đổi phân tử của tế bào vật chủ.
  • Tại Việt Nam, các nghiên cứu phối hợp đồng thời mức độ biểu hiện mRNA của CIZ1b, VEGF và đột biến EGFR cùng tình trạng nhiễm MCV ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ còn chưa được thực hiện đầy đủ.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án gồm 2 nội dung:

  1. Đánh giá mức độ biểu hiện mRNA của gen CIZ1b, VEGF, đột biến EGFR và tỷ lệ nhiễm virus Merkel cell ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ.
  2. Phân tích mối liên quan giữa mức độ biểu hiện mRNA của gen CIZ1b, VEGF, đột biến EGFR với nhiễm virus Merkel cell và một số triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng: Các bệnh nhân được chẩn đoán xác định ung thư phổi không tế bào nhỏ và nhóm người chứng khỏe mạnh (người bình thường).
  • Phạm vi không gian: Nghiên cứu được triển khai tại Học viện Quân y, phối hợp với Bệnh viện Quân y 175, Trung tâm tư vấn di truyền và sàng lọc ung thư (CGC), Trung tâm nghiên cứu y học Việt Đức (VG-CARE) và Khoa Sinh học phân tử (C17) - Bệnh viện Trung ương Quân đội 108.
  • Phạm vi thời gian: Luận án hoàn thành và bảo vệ năm 2020.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Dịch tễ học ung thư phổi trên thế giới theo thống kê của Global Cancer Statistics 2018 ghi nhận khoảng 2,1 triệu ca mắc mới và 1,8 triệu ca tử vong, chiếm 18,4% tổng số tử vong do ung thư. Tỷ lệ mắc bệnh ở nam giới cao hơn nữ giới nhưng đang có xu hướng thu hẹp khoảng cách. Về mặt phân bố địa lý, tỷ lệ mắc ở nam giới ghi nhận mức cao tại Đông Âu (49,3 ca/100.000 dân), Tây Âu và Nam Âu (khoảng 43 ca/100.000 dân), Đông Nam Á (26,3 ca/100.000 dân). Nghiên cứu của tác giả de Groot P. cho thấy độ tuổi trung bình mắc bệnh ở cả hai giới là 70 tuổi, với 37% bệnh nhân trên 75 tuổi và 10% bệnh nhân dưới 55 tuổi, đồng thời ghi nhận hiện tượng trẻ hóa ở nhóm tuổi 20-46 tuổi, đặc biệt ở nữ giới mắc ung thư biểu mô tuyến không hút thuốc. Tại Việt Nam, số liệu Globocan 2018 ghi nhận 23.667 ca mắc mới mỗi năm (chiếm 15,48% tổng số ca ung thư mới mắc, đứng thứ hai sau ung thư gan), với tỷ lệ tử vong trong 5 năm đầu lên đến khoảng 90% và tỷ lệ nam/nữ xấp xỉ 2,5/1.

Các nguyên nhân và yếu tố nguy cơ được ghi nhận trong tổng quan bao gồm:

  • Hút thuốc lá: Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO 2015), thuốc lá liên quan đến 965.500 ca tử vong do ung thư phổi trong năm 2010 và làm tăng nguy cơ mắc bệnh từ 20 đến 30 lần so với người không hút thuốc.
  • Sợi amian: Tiếp xúc nghề nghiệp với amian làm tăng nguy cơ mắc ung thư phổi gấp 5 lần so với người bình thường.
  • Khí Radon: Nghiên cứu của tác giả Gaskin J. xác định radon là sản phẩm phân rã của uranium, gây ra khoảng 10% các trường hợp ung thư phổi.
  • Ô nhiễm không khí: Sống trong môi trường ô nhiễm công nghiệp kéo dài làm gia tăng nguy cơ mắc bệnh gần 50%.
  • Tác nhân truyền nhiễm: Bệnh nhân nhiễm lao có nguy cơ ung thư phổi tăng 1,76 lần; khoảng 30% bệnh nhân nhiễm HIV tử vong do ung thư phổi; Epstein-Barr virus (EBV) được IARC xếp vào nhóm tác nhân sinh ung nhóm 1; Human papillomavirus (HPV) mã hóa oncoprotein E6, E7 có khả năng ức chế protein p53 và Rb.
  • Yếu tố di truyền: Các biến đổi trên các vùng nhiễm sắc thể 5p15, 15q25-26, 6q21 và locus 3q28 làm gia tăng nguy cơ ung thư phổi có tính chất gia đình từ 2 đến 4 lần.

Về cơ chế sinh học phân tử, các biến đổi hình thành ung thư phổi tuân theo các đặc điểm cốt lõi do Hanahan D. mô tả. Các gen tiền ung thư (proto-oncogene) khi bị đột biến chuyển thành oncogene bao gồm:

  • Gen dung hợp ALK (Anaplastic lymphoma kinase trên nhiễm sắc thể 2p23), phổ biến là EML4-ALK được mô tả năm 2007, chiếm 5-6% các ca UTPKTBN, thường gặp ở bệnh nhân trẻ (tuổi trung bình 55) và không hút thuốc (~70%), là đích tác dụng của thuốc crizotinib.
  • Gen KRAS: Mã hóa protein liên kết màng GTPase điều hòa các dòng tín hiệu Raf-MEK-ERK và PI3K-AKT-mTOR.
  • Các gen ức chế khối u: Gen p53 (nhiễm sắc thể 17p13, protein 53 kDa) bị đột biến ở 70-100% ung thư phổi tế bào nhỏ và khoảng 50% ở UTPKTBN; con đường p16/CDK-Cyclin-D/Rb (gen Rb ở 13q14 mã hóa protein 110 kDa và gen p16 ở 9p21) kiểm soát điểm kiểm soát chuyển pha G1 sang S của chu trình tế bào.
Nhóm dấu ấn phân tử Tên dấu ấn / Gen Đặc điểm sinh học và giá trị chẩn đoán Tác giả / Nguồn tham chiếu
Dấu ấn protein CEA Glycoprotein kết dính tế bào, ngưỡng 2,5 - 40 ng/mL Tổng quan tài liệu
Dấu ấn protein CYFRA 21-1 Phân mảnh cytokeratin 19 do caspase-3 cắt, ngưỡng 3,5 ng/mL (độ nhạy 43%, độ đặc hiệu 89%) Okamura K. và cộng sự (2013)
Tự kháng thể Bộ EarlyCDT®-Lung 7 tự kháng thể (p53, NY-ESO-1, CAGE, GBU4-5, HuD, MAGE A4, SOX2), độ đặc hiệu 91%, độ nhạy 37% Yao Y. và cộng sự
Methyl hóa DNA RASSF1A, SHOX2 Bền vững với hóa chất, phát hiện biến đổi ngoại gen Belinsky S. và cộng sự
DNA lưu hành (ctDNA) SNV trên ctDNA Chiếm 0,1 - 1% trong tổng số cfDNA (1,0 - 10 ng/mL), độ nhạy 37,7% ở giai đoạn I Abbosh C. và cộng sự (2017)
RNA lưu hành (cfRNA) miRNA, cfmRNA cfRNA duy trì được trong huyết tương 3 giờ; gồm bộ miR-test (13 miRNA) và MSC El-Hefnawy và cộng sự (2004)
Tăng sinh mạch VEGF Cấu trúc homodimer (120-200 aa), thụ thể VEGFR-1/2/3; chỉ số AUC 0,839 (độ nhạy 75%, đặc hiệu 95,6%) Lai Y. và cộng sự; Nowak D. G. (2008)
Khởi đầu sao chép DNA CIZ1b Protein 898 aa, thiếu 24 nt ở exon 14; phát hiện trong huyết tương cho AUC 0,958 (chẩn đoán 98% ca bệnh) Mitsui K. (1999); Higgins G. (2012)
Thụ thể yếu tố tăng trưởng EGFR Nhiễm sắc thể 7p24 (170 kDa); đột biến exon 19 và exon 21 (L858R) chiếm 90%, nhạy thuốc TKI Brambilla E. (2009); Pao W. (2004)
Virus sinh u MCV (MCPyV) dsDNA vòng 5 kb, kháng nguyên LT gắn và bất hoạt Rb, kháng nguyên sT bất hoạt 4E-BP1 Babakir-Mina M. (2010); Spurgeon M.

Vị trí của luận án: Luận án tập trung giải quyết khoảng trống dữ liệu thực chứng tại Việt Nam về sự kết hợp giữa các dấu ấn phiên mã mRNA trong máu ngoại vi (CIZ1b, VEGF), đột biến gen đích mô khối u (EGFR) và tình trạng nhiễm virus sinh u Merkel Cell Polyomavirus trên cùng một nhóm bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được xây dựng trên cơ sở lý thuyết sinh bệnh học phân tử ung thư:

  • Sự biến đổi cắt nối luân phiên bất thường của tiền mRNA gen CIZ1 tạo ra dạng đồng phân CIZ1b khu trú tại rìa nhân tế bào và liên kết với fibrinogen trong máu ngoại vi, phản ánh tình trạng phân chia mất kiểm soát của tế bào biểu mô phế quản ác tính.
  • Sự biểu hiện quá mức của mRNA VEGF dưới điều kiện vi môi trường thiếu oxy thúc đẩy mạng lưới mao mạch nuôi dưỡng khối u thông qua các thụ thể bề mặt VEGFR.
  • Sự hoạt hóa cấu trúc nội bào của thụ thể EGFR qua các đột biến điểm hoặc mất đoạn làm tăng sinh tín hiệu truyền tin nội bào Ras/MAPK và PI3K/Akt.
  • Cơ chế gắn kết và bất hoạt các protein kìm hãm khối u (Rb) bởi kháng nguyên lớn Large T (LT) và rối loạn dịch mã qua kháng nguyên nhỏ Small T (sT) của virus MCV.

Thiết kế nghiên cứu và quy trình thực nghiệm:

  • Thiết kế: Nghiên cứu mô tả cắt ngang có phân tích và so sánh đối chứng giữa nhóm bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ và nhóm người khỏe mạnh.
  • Nguồn mẫu bệnh phẩm:
    • Mẫu máu toàn phần chống đông bằng EDTA để tách chiết huyết tương phục vụ định lượng mRNA của gen CIZ1b, VEGF và phát hiện DNA của virus MCV.
    • Mẫu mô bệnh phẩm sinh thiết đúc khối paraffin (FFPE) từ các bệnh nhân UTPKTBN để tách DNA phát hiện đột biến EGFR và DNA virus MCV trong mô.

Các kỹ thuật phân tích cận lâm sàng và sinh học phân tử:

  • Đánh giá chỉ số cận lâm sàng thường quy: Xét nghiệm công thức tế bào máu ngoại vi, hoạt độ men gan (AST, ALT), nồng độ glucose máu, chức năng thận (ure, creatinin), ion đồ, và các chất chỉ điểm ung thư huyết thanh (CEA, CYFRA 21-1).
  • Tách chiết và đo độ tinh sạch axit sinh học: Tách chiết RNA tổng số từ huyết tương bằng phương pháp thích hợp; tổng hợp chuỗi bổ sung cDNA; kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của cDNA thông qua quang phổ kế đo tỷ số hấp thụ quang học OD 260/280.
  • Định lượng mức độ biểu hiện mRNA của gen CIZ1b và VEGF: Thực hiện phản ứng real-time PCR sử dụng hệ mồi đặc hiệu cho gen CIZ1b, VEGF và gen đối chứng nội chuẩn ABL (Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1) để xác định giá trị chu kỳ ngưỡng Ct (Cycle threshold).
  • Phát hiện đột biến gen EGFR: Tách chiết DNA mô đúc paraffin bằng bộ sinh phẩm GeneJET FFPE DNA Purification Kit; tiến hành phản ứng real-time PCR bằng bộ sinh phẩm Super-ARMS® EGFR Mutation Detection Kit nhằm xác định các đột biến trên các exon (bao gồm đột biến điểm L858R trên exon 21 và các đột biến mất đoạn trên exon 19).
  • Phát hiện virus Merkel cell (MCV): Phản ứng real-time PCR phát hiện sự hiện diện của DNA MCV trong huyết tương và mô ung thư; thực hiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen mục tiêu của MCV, điện di kiểm tra kích thước sản phẩm trên gel agarose; tiến hành giải trình tự gen sản phẩm PCR và so sánh độ tương đồng chuỗi nucleotide bằng công cụ BLAST với cơ sở dữ liệu quốc tế của Trung tâm Quốc gia về Thông tin Công nghệ Sinh học Hoa Kỳ (NCBI).
  • Phân tích thống kê: Xử lý số liệu nghiên cứu y sinh học, xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, xây dựng đường cong đặc trưng hoạt động của bộ thu nhận (ROC) và tính toán diện tích dưới đường cong (AUC) để đánh giá giá trị chẩn đoán của mRNA CIZ1b và VEGF.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở dữ liệu khoa học về bệnh lý ung thư phổi, dịch tễ học toàn cầu và tại Việt Nam. Tác giả trình bày chi tiết các nguyên nhân sinh bệnh kinh điển (thuốc lá, amian, radon, ô nhiễm không khí) và các yếu tố nguy cơ nhiễm trùng (HIV, lao, EBV, HPV). Phần cơ chế phân tử tập trung phân tích sâu về các oncogene dung hợp (ALK, EML4-ALK), đột biến gen KRAS, cùng sự bất hoạt của các gen ức chế khối u (p53, con đường p16/CDK-Cyclin-D/Rb). Tổng quan đã đánh giá có hệ thống các thế hệ dấu ấn sinh học từ protein huyết thanh (CEA, CYFRA 21-1), tự kháng thể (EarlyCDT-Lung), biến đổi methyl hóa DNA (RASSF1A, SHOX2), DNA tự do trong máu (ctDNA) đến các phân tử RNA lưu hành (miRNA, cfmRNA). Các phần trọng tâm của chương đi sâu vào cấu trúc và chức năng của VEGF trong kích thích tạo mạch; đặc điểm sinh học của CIZ1 và biến thể CIZ1b trong khởi đầu sao chép DNA; các đột biến thụ thể EGFR liên quan đến tính nhạy cảm và kháng thuốc TKI (L858R, mất đoạn exon 19, T790M); và các phát hiện về cấu trúc bộ gen 5 kb cùng cơ chế sinh ung thư của kháng nguyên LT, sT thuộc virus Merkel cell (MCV).

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết đối tượng nghiên cứu gồm nhóm bệnh nhân UTPKTBN và nhóm người chứng bình thường, với các tiêu chuẩn chọn mẫu và tiêu chuẩn loại trừ cụ thể. Tác giả trình bày danh mục hóa chất, sinh phẩm, thiết bị máy móc chính và trình tự các đoạn mồi sử dụng cho các phản ứng PCR. Quy trình thực nghiệm bao gồm:

  • Quy trình lấy mẫu huyết tương và mô bệnh phẩm FFPE.
  • Kỹ thuật tách chiết, tinh sạch RNA và tổng hợp cDNA, kèm phương pháp đo quang phổ kế kiểm tra chất lượng OD 260/280.
  • Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng real-time PCR cho các gen ABL, CIZ1b và VEGF.
  • Quy trình xét nghiệm phát hiện đột biến EGFR bằng bộ sinh phẩm Super-ARMS® EGFR Mutation Detection Kit kèm tiêu chuẩn giá trị Cut-off xác định đột biến.
  • Quy trình phản ứng real-time PCR, PCR nhân bản, điện di sản phẩm và giải trình tự gen khẳng định sự hiện diện của MCV so sánh với ngân hàng dữ liệu gen NCBI.
  • Các tiêu chuẩn phân loại mô bệnh học (biệt hóa rõ, vừa, kém; ung thư biểu mô tuyến, tế bào gai, tế bào lớn), phân loại giai đoạn bệnh TNM, các phương pháp phân tích thống kê y sinh và các nguyên tắc đạo đức nghiên cứu y học.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm thu được từ nhóm bệnh nhân UTPKTBN và nhóm đối chứng:

  • Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng: Phân bố tuổi, giới tính, tiền sử bệnh lý, triệu chứng nhập viện; các thông số tế bào máu ngoại vi, hoạt độ men gan AST/ALT, nồng độ glucose máu, chức năng thận, ion đồ và nồng độ các marker ung thư huyết thanh.
  • Kết quả sinh học phân tử của CIZ1b và VEGF: Đánh giá giá trị nồng độ DNA/cDNA, tỷ số OD 260/280, giá trị chu kỳ ngưỡng Ct của gen nội chuẩn ABL, gen CIZ1b và gen VEGF. Ghi nhận sự khác biệt về mức độ biểu hiện mRNA của CIZ1b và VEGF trong huyết tương giữa nhóm bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ và nhóm người khỏe mạnh.
  • Tỷ lệ và đặc điểm đột biến gen EGFR: Kết quả phát hiện đột biến trên các exon của gen EGFR bằng kỹ thuật real-time PCR (trong đó có đột biến L858R trên exon 21).
  • Kết quả xác định virus Merkel cell: Tỷ lệ phát hiện DNA MCV bằng real-time PCR trên mẫu huyết tương của nhóm chứng và nhóm bệnh; tỷ lệ phát hiện MCV trên mẫu mô u; kết quả hình ảnh điện di PCR sản phẩm nhân bản gen MCV; kết quả giải trình tự và mức độ tương đồng chuỗi gen MCV so với trình tự chuẩn trên NCBI.
  • Phân tích mối liên quan đa biến: Mối liên quan giữa mức độ biểu hiện mRNA CIZ1b, VEGF với rối loạn tế bào máu, rối loạn men gan, glucose máu, đặc điểm mô bệnh học (tế bào tuyến, tế bào gai, tế bào lớn), độ biệt hóa khối u, giai đoạn TNM và trạng thái đột biến EGFR.
  • Mối liên quan của tình trạng nhiễm MCV: Mối tương quan giữa nhiễm MCV với giai đoạn bệnh, độ biệt hóa tế bào, chỉ số cận lâm sàng, marker ung thư, đột biến EGFR và mức độ biểu hiện mRNA của VEGF, CIZ1b.
  • Đánh giá giá trị chẩn đoán: Xây dựng đường cong ROC và tính diện tích dưới đường cong (AUC) của mRNA CIZ1b và mRNA VEGF trong việc phân biệt bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ với nhóm chứng.

Chương 4: Bàn luận

Chương 4 tập trung phân tích, so sánh các phát hiện của luận án với các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế:

  • Bàn luận về đặc điểm phân bố dịch tễ, độ tuổi, các biểu hiện lâm sàng và biến đổi cận lâm sàng đặc trưng ở bệnh nhân UTPKTBN.
  • Bàn luận về ý nghĩa sinh học của sự tăng biểu hiện mRNA gen CIZ1b trong huyết tương, phân tích cơ chế giải phóng của phức hợp CIZ1b-fibrinogen vào tuần hoàn và đối chiếu hiệu quả chẩn đoán của dấu ấn này so với các phương pháp phát hiện protein truyền thống.
  • Bàn luận về vai trò của mRNA VEGF huyết tương trong phản ánh tình trạng tăng sinh mạch, mối liên hệ với kích thước khối u, sự di căn hạch, giai đoạn tiến triển TNM và giá trị tiên lượng đáp ứng điều trị.
  • Phân tích tỷ lệ đột biến gen EGFR trong mối tương quan với đặc điểm chủng tộc châu Á, giới tính và dạng mô bệnh học ung thư biểu mô tuyến.
  • Phân tích tỷ lệ nhiễm virus Merkel cell (MCV) tại mô phổi và máu ngoại vi, bàn luận về vai trò tiềm tàng của các oncoprotein virus (LT, sT) trong việc thúc đẩy quá trình ác tính hóa thông qua tương tác với các con đường dẫn truyền tín hiệu nội bào và đột biến gen của vật chủ.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án đã đạt được các kết quả và đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn:

  • Đã thiết lập và ứng dụng thành công quy trình kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên real-time PCR để phát hiện và định lượng mức độ biểu hiện mRNA của gen CIZ1b và VEGF từ nguồn bệnh phẩm huyết tương máu ngoại vi của bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ.
  • Cung cấp bằng chứng thực nghiệm về giá trị chẩn đoán của mRNA gen CIZ1b và VEGF huyết tương, thông qua phân tích đường cong ROC (AUC), độ nhạy và độ đặc hiệu trong việc phân định giữa người mắc UTPKTBN và người khỏe mạnh.
  • Xác định được tỷ lệ đột biến gen EGFR và phân bố các dạng đột biến (như đột biến điểm L858R trên exon 21) ở bệnh nhân UTPKTBN phục vụ chỉ định điều trị thuốc ức chế tyrosine kinase (TKI).
  • Chứng minh sự hiện diện của Merkel Cell Polyomavirus (MCV) ở cả mô khối u và huyết tương bệnh nhân UTPKTBN tại Việt Nam bằng kỹ thuật real-time PCR kết hợp giải trình tự gen đối chiếu cơ sở dữ liệu NCBI.
  • Làm sáng tỏ mối liên quan giữa mức độ biểu hiện của mRNA CIZ1b, VEGF, trạng thái đột biến EGFR với tình trạng nhiễm MCV, cũng như mối liên hệ giữa các dấu ấn sinh học phân tử này với các đặc điểm mô bệnh học, độ biệt hóa tế bào và giai đoạn tiến triển lâm sàng TNM của bệnh.
  • Đề xuất định hướng kết hợp xét nghiệm các dấu ấn phân tử trong máu ngoại vi (mRNA CIZ1b, VEGF) như một giải pháp hỗ trợ không xâm lấn cho chẩn đoán sớm và theo dõi tiến triển bệnh ung thư phổi không tế bào nhỏ.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

  • Dữ liệu nghiên cứu chủ yếu tập trung vào phân tích cắt ngang tại thời điểm chẩn đoán và nhập viện, chưa mở rộng theo dõi dọc biến động nồng độ mRNA các gen sau các can thiệp điều trị ngoại khoa, hóa trị hoặc điều trị đích.
  • Phạm vi nghiên cứu về cơ chế sinh học phân tử của virus MCV dừng lại ở việc phát hiện sự hiện diện của DNA virus và giải trình tự gen, chưa đi sâu phân tích trực tiếp biểu hiện của các protein virus (LT, sT) trên mô bệnh phẩm.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

  • Mở rộng quy mô nghiên cứu đa trung tâm trên cỡ mẫu lớn hơn, theo dõi dọc nồng độ mRNA của CIZ1b và VEGF huyết tương trước, trong và sau điều trị để đánh giá chính xác giá trị tiên lượng thời gian sống thêm không tiến triển (PFS) và sống thêm toàn bộ (OS).
  • Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tương tác ở mức độ tế bào giữa các kháng nguyên của virus Merkel cell với con đường tín hiệu EGFR và quá trình sinh mạch do VEGF kích thích trên các dòng tế bào ung thư phổi thực nghiệm.

Giá trị tham khảo

Luận án mang lại giá trị tham khảo chuyên môn cho các đối tượng và lĩnh vực sau:

  • Đối với nghiên cứu sinh, học viên sau đại học và giảng viên chuyên ngành Khoa học y sinh, Ung bướu học, Sinh lý bệnh học và Sinh học phân tử y học: Cung cấp tài liệu tổng quan toàn diện về sinh bệnh học phân tử ung thư phổi, các cơ chế tạo mạch, biến thể phiên mã và virus sinh u.
  • Đối với các bác sĩ lâm sàng chuyên khoa Ung bướu và Hô hấp: Cung cấp cơ sở dữ liệu thực chứng về đặc điểm đột biến gen EGFR, mức độ biểu hiện của các dấu ấn phân tử liên quan đến giai đoạn bệnh và độ biệt hóa mô học, hỗ trợ công tác cá thể hóa điều trị.
  • Đối với các kỹ thuật viên và chuyên viên phòng xét nghiệm y học: Cung cấp quy trình chi tiết về kỹ thuật tách chiết RNA huyết tương, tổng hợp cDNA, quy trình định lượng real-time PCR đối chứng gen ABL, quy trình Super-ARMS phát hiện đột biến EGFR từ mô đúc paraffin và quy trình phát hiện virus MCV kèm giải trình tự gen.

Câu hỏi thường gặp

1. Biến thể mRNA CIZ1b có điểm gì khác biệt về mặt cấu trúc phân tử so với gen CIZ1 thông thường? Biến thể CIZ1b là sản phẩm của quá trình cắt nối luân phiên bất thường, bị mất 24 nucleotide ở đầu 3' của exon 14 trên chuỗi tiền mRNA. Sự thiếu hụt này dẫn đến mất 8 gốc axit amin ở đầu C của phân tử protein CIZ1, làm biến thể này biểu hiện ưu thế tại vùng ngoại vi của nhân tế bào u và có thể giải phóng vào huyết tương dưới dạng liên kết với fibrinogen.

2. Phân tử VEGF có cấu trúc như thế nào và gen mã hóa cho yếu tố này chịu sự điều hòa bởi những yếu tố nào? VEGF là một protein dạng homodimer gồm 2 chuỗi polypeptide có chiều dài khoảng 120 - 200 axit amin, liên kết với nhau bằng 2 cầu nối disulfide liên chuỗi và chứa 3 vòng liên kết disulfide nội chuỗi từ 6 gốc cysteine cố định. Gen mã hóa VEGF chịu sự cảm ứng điều hòa bởi các tín hiệu tăng trưởng (PDGF, FGF, EGF, TNF, TGF-beta, IL-1), các đột biến gen ung thư hoặc mất gen ức chế u (p53, KRAS, EGFR), và đặc biệt là tình trạng thiếu oxy mô (mức biểu hiện mRNA tăng từ 10 đến 50 lần khi nồng độ oxy giảm từ 21% xuống 0-3%).

3. Luận án đã sử dụng kỹ thuật gì để phát hiện đột biến gen EGFR từ mẫu bệnh phẩm nào? Nghiên cứu sử dụng mẫu mô sinh thiết đúc paraffin (FFPE) của bệnh nhân UTPKTBN, tiến hành tách chiết DNA bằng bộ sinh phẩm GeneJET FFPE DNA Purification Kit, sau đó thực hiện phản ứng real-time PCR bằng bộ sinh phẩm Super-ARMS® EGFR Mutation Detection Kit để xác định các đột biến trên các exon (trong đó có đột biến L858R trên exon 21).

4. Cấu trúc bộ gen và cơ chế gây ung thư chính của virus Merkel cell (MCV) được trình bày như thế nào? MCV thuộc họ Polyomaviridae, có bộ gen là phân tử DNA sợi kép dạng vòng (dsDNA) kích thước khoảng 5 kb gồm vùng điều hòa không mã hóa (NCRR), vùng mã hóa sớm (locus kháng nguyên T gồm LT, sT, 57kT, ALTO) và vùng mã hóa muộn (protein vỏ VP1, VP2). Kháng nguyên LT gây bất hoạt gen ức chế khối u Retinoblastoma (Rb), trong khi kháng nguyên sT duy trì trạng thái bất hoạt của yếu tố 4E-BP1 và ức chế enzyme ubiquitin ligase, ngăn chặn sự phân hủy của LT, c-Myc và cyclin E, thúc đẩy tế bào phân chia mất kiểm soát.

5. Các dấu ấn mRNA CIZ1b và VEGF trong huyết tương được định lượng bằng phương pháp nào? Hai dấu ấn mRNA này được định lượng từ huyết tương thông qua quá trình tách chiết RNA, tổng hợp thành cDNA và thực hiện phản ứng real-time PCR sử dụng gen ABL làm chứng nội chuẩn, từ đó tính toán mức độ biểu hiện và đánh giá giá trị chẩn đoán thông qua phân tích diện tích dưới đường cong ROC (AUC).

Kết luận

Luận án đã khảo sát có hệ thống mức độ biểu hiện mRNA của gen CIZ1b, VEGF, tình trạng đột biến gen EGFR và sự hiện diện của virus Merkel cell ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ tại Việt Nam. Bằng việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử chuẩn mực như real-time PCR, Super-ARMS và giải trình tự gen, công trình đã làm rõ mối liên quan giữa các biến đổi phân tử này với các đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, mô bệnh học và giai đoạn phát triển của khối u. Kết quả nghiên cứu khẳng định tiềm năng ứng dụng của các dấu ấn phân tử mRNA lưu hành trong máu ngoại vi (CIZ1b, VEGF) kết hợp với xét nghiệm đột biến mô (EGFR) trong hỗ trợ chẩn đoán, đánh giá mức độ tiến triển và định hướng can thiệp điều trị cho bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ.