Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu tác nhân vi khuẩn và gene kháng thuốc trong viêm phổi thở máy

Luận án tiến sĩ nghiên cứu tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi thở máy và gene kháng thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử, cung cấp kiến thức chuyên sâu.

• Tác giả: Trần Minh Giang
• Người hướng dẫn: PGS. Trần Văn Ngọc
• Trường học: Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Hồi Sức Cấp Cứu Và Chống Độc
• Đề tài: Nghiên Cứu Tác Nhân Vi Khuẩn Gây Viêm Phổi Thở Máy Và Gene Kháng Thuốc Bằng Kỹ Thuật Sinh Học Phân Tử
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ y học
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tỉ lệ mới mắc của viêm phổi thở máy
• 1.2. Tỉ lệ tử vong
• 1.3. Các yếu tố nguy cơ
• 1.4. Thực hiện kháng sinh đồ trên vi khuẩn phân lập được từ VPTM
• 1.5. Ứng dụng sinh học phân tử trong phát hiện gene kháng thuốc
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thiết kế nghiên cứu
• 2.2. Địa điểm nghiên cứu
• 2.3. Thời gian nghiên cứu
• 2.4. Đối tượng nghiên cứu. Cỡ mẫu và công thức tính cỡ mẫu
• 2.5. Tiêu chuẩn chọn mẫu
• 2.6. Phương pháp tiến hành
• 2.7. Phương pháp phát hiện gene kháng thuốc
• 2.8. Thu thập số liệu và phân tích dữ liệu
• 2.9. Đạo đức trong nghiên cứu
• 2.10. Liệt kê và định nghĩa các biến số (phụ lục 11)
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đặc điểm chung. Định danh vi khuẩn dựa trên vi sinh kinh điển
• 3.2. Định danh vi khuẩn dựa trên giải trình tự gene 16S-rRNA
• 3.3. Tổng số loài vi khuẩn phát hiện được trên từng mẫu dịch rửa phế quản phế nang
• 3.4. So sánh giữa giải trình tự gene 16S-rRNA và vi sinh kinh điển trong định danh vi khuẩn
• 3.5. Tính độ nhạy và độ đặc hiệu của PGM
• 3.6. Thời gian nằm ICU và tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi thở máy
• 3.7. Kết quả kháng sinh đồ
• 3.8. Kết quả kháng sinh đồ MIC dựa trên E-test
• 3.9. Kết quả PCR tìm gene kháng thuốc
• 3.10. Kết quả điều trị
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Định danh vi khuẩn
• 4.2. Kết quả kháng sinh đồ
• 4.3. Xác định gene kháng thuốc và mối liên quan với đề kháng kháng sinh
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về vi khuẩn gây viêm phổi thở máy

Viêm phổi thở máy (VPTM) là một vấn đề nghiêm trọng trong y học, đặc biệt trong các đơn vị chăm sóc đặc biệt. Tỉ lệ mắc VPTM dao động từ 20% đến 52% tại Việt Nam, với tỉ lệ tử vong cao từ 26% đến 72%. Vi khuẩn gây bệnh thường là các chủng đa kháng, như Acinetobacter baumannii và Pseudomonas aeruginosa. Việc xác định chính xác vi khuẩn gây bệnh là rất quan trọng để điều trị hiệu quả. Phương pháp truyền thống như nuôi cấy và nhuộm Gram có thể không đủ nhạy để phát hiện tất cả các loại vi khuẩn, đặc biệt là các vi khuẩn khó nuôi cấy. Do đó, việc áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử như giải trình tự gene 16S-rRNA đã trở thành một xu hướng mới trong việc định danh vi khuẩn. Kỹ thuật này cho phép phát hiện các vi khuẩn mà phương pháp truyền thống không thể xác định.

1.1. Định nghĩa và tầm quan trọng của VPTM

VPTM được định nghĩa là viêm nhu mô phổi xảy ra sau 48 giờ thở máy. Tình trạng này không chỉ làm tăng tỉ lệ tử vong mà còn kéo dài thời gian nằm viện và tăng chi phí điều trị. Việc chẩn đoán VPTM dựa vào các tiêu chí lâm sàng và vi sinh học, trong đó việc xác định vi khuẩn gây bệnh là rất quan trọng. Các tiêu chí chẩn đoán đã được phát triển qua nhiều năm, từ các tiêu chuẩn của CDC đến các tiêu chí mới hơn như CPIS. Tuy nhiên, vẫn chưa có một tiêu chuẩn vàng nào cho chẩn đoán VPTM, điều này tạo ra thách thức cho các bác sĩ trong việc điều trị và quản lý bệnh nhân.

II. Phương pháp nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử

Nghiên cứu này áp dụng các phương pháp sinh học phân tử để xác định gene kháng thuốc trong các vi khuẩn gây VPTM. Kỹ thuật PCR được sử dụng để phát hiện các gene kháng thuốc phổ biến như SHV, TEM, IMP, OXA, và NDM. Việc phát hiện các gene này không chỉ giúp xác định khả năng kháng thuốc của vi khuẩn mà còn cung cấp thông tin quan trọng cho việc điều trị. Kết quả từ nghiên cứu cho thấy có sự khác biệt rõ rệt giữa các phương pháp định danh vi khuẩn dựa trên kiểu hình và giải trình tự gene 16S-rRNA. Điều này cho thấy rằng việc áp dụng sinh học phân tử có thể cải thiện đáng kể độ nhạy và độ chính xác trong việc xác định vi khuẩn gây bệnh.

2.1. Kỹ thuật giải trình tự gene 16S rRNA

Giải trình tự gene 16S-rRNA là một công cụ mạnh mẽ trong việc xác định vi khuẩn. Kỹ thuật này cho phép phát hiện các vi khuẩn mà phương pháp nuôi cấy truyền thống không thể xác định. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng giải trình tự gene 16S-rRNA có thể phát hiện được nhiều loài vi khuẩn hơn so với các phương pháp truyền thống. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc điều trị VPTM, vì việc xác định chính xác tác nhân gây bệnh sẽ giúp bác sĩ lựa chọn kháng sinh phù hợp hơn.

III. Kết quả nghiên cứu và phân tích gene kháng thuốc

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỉ lệ vi khuẩn mang gene kháng thuốc trong các mẫu dịch rửa phế quản phế nang là rất cao. Các vi khuẩn như Acinetobacter baumannii và Klebsiella pneumoniae thường mang các gene kháng thuốc, điều này làm tăng độ khó trong việc điều trị. Việc phân tích kháng sinh đồ cho thấy nhiều vi khuẩn có tỉ lệ kháng cao đối với các loại kháng sinh thông dụng. Điều này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc theo dõi và cập nhật thông tin về tình hình kháng thuốc trong cộng đồng.

3.1. Tác động của gene kháng thuốc đến điều trị

Sự hiện diện của gene kháng thuốc trong vi khuẩn gây VPTM có thể dẫn đến thất bại trong điều trị. Việc xác định chính xác các gene này sẽ giúp bác sĩ lựa chọn kháng sinh phù hợp hơn, từ đó cải thiện kết quả điều trị cho bệnh nhân. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng có mối liên quan giữa tỉ lệ kháng thuốc và thời gian nằm ICU, cho thấy rằng bệnh nhân nằm lâu trong ICU có nguy cơ cao hơn về nhiễm khuẩn kháng thuốc.

IV. Kết luận và khuyến nghị

Nghiên cứu này đã chỉ ra rằng việc áp dụng các phương pháp sinh học phân tử trong việc xác định vi khuẩn gây VPTM và các gene kháng thuốc là rất cần thiết. Kết quả nghiên cứu không chỉ cung cấp thông tin quan trọng về tình hình kháng thuốc mà còn giúp cải thiện quy trình điều trị cho bệnh nhân. Cần có thêm nhiều nghiên cứu để hệ thống hóa dữ liệu về vi khuẩn gây VPTM và kháng thuốc tại Việt Nam, từ đó xây dựng các hướng dẫn điều trị hiệu quả hơn.

4.1. Đề xuất cho nghiên cứu tiếp theo

Cần tiếp tục nghiên cứu để xác định rõ hơn về các gene kháng thuốc và mối liên quan của chúng với các yếu tố lâm sàng. Việc xây dựng một cơ sở dữ liệu quốc gia về tình hình kháng thuốc sẽ giúp các bác sĩ có thông tin chính xác hơn trong việc điều trị. Ngoài ra, cần có các chương trình giáo dục và nâng cao nhận thức về kháng thuốc cho các nhân viên y tế và cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Định nghĩa Viêm phổi thở máy (VPTM) được định nghĩa là viêm nhu mô phổi xảy ra sau 48 giờ thở máy qua nội khí quản hoặc qua khai khí quản [42], [61]. Ngay từ những thập niên đầu áp dụng thở máy xâm nhập đã có nhiều định nghĩa về VPTM. Từ những thập niên 70, Johanson đã áp dụng tiêu chuẩn chẩn đoán cho VPTM bao gồm thâm nhiễm mới hoặc tiến triển trên X-quang ngực; sốt; bạch cầu máu tăng và tăng tiết đàm mủ khí phế quản.

Ngoài ra tác giả này còn đưa ra định nghĩa có thể có khả năng VPTM bao gồm sốt, tăng bạch cầu máu kèm theo hoặc thâm nhiễm mới hay tiến triển trên X-quang ngực hoặc hiện diện đàm mủ. Kết quả cấy vi sinh không được áp dụng trong bộ tiêu chí này [60]. Tiêu chuẩn chẩn đoán VPTM dựa vào mô học cũng được giới thiệu trong giai đoạn này. Các tiêu chí bao gồm tích tụ bạch cầu đa nhân trong màng phế nang mao mạch và số lượng VK ≥ 103 cfu/g nhu mô phổi ở ít nhất một mẫu sinh thiết [47].

Từ khi giáo sư Shigeto Ekeda giới thiệu nội soi phế quản ống mềm, các nghiên cứu (NC) về VPTM dựa vào đó để tiếp cận chất tiết đường hô hấp dưới. Winberley áp dụng nội soi phế quản ống mềm và đề xuất tiêu chuẩn cho nội soi phế quản có nòng bảo vệ với ngưỡng 103 cfu/ml được gọi là dương tính [55], [108]. Đối với dịch rửa phế quản phế nang cần ≥ 104 cfu/ml và dịch hút qua nội khí quản cần ≥ 105 cfu/ml được gọi là dương tính [42]. Năm 1988, CDC đưa ra định nghĩa cho VP.

Bộ tiêu chí được xây dựng dựa trên hệ thống khảo sát nhiễm khuẩn bệnh viện quốc gia Hoa Kỳ (NNIS1). Các tiêu chí bao gồm ran hoặc gõ đục ở phổi kèm theo các dấu chứng sau: (a) đàm mủ mới xuất hiện; (b) phân lập được vi sinh vật từ máu; (c) phân lập được tác nhân gây bệnh từ dịch hút khí quản, chải phế quản hoặc sinh thiết. Ngoài ra, CDC còn giới thiệu NNIS2 bao gồm thâm nhiễm mới hoặc tiến triển, đông đặc, tạo hang hoặc tràn dịch màng phổi trên X-quang ngực kèm theo ít nhất một trong ba tiêu chí (a), (b), (c) của NNIS1 ở trên [51]. luan an 4 Vào thập niên 90, Pugin giới thiệu thang điểm VP trên lâm sàng (CPIS) từ 0 đến 12 điểm bao gồm nhiệt độ; bạch cầu máu kể cả dạng non; đặc tính dịch tiết khí phế quản; nhuộm Gram và cấy đàm; PaO2/FiO2; X-quang ngực [84].

Năm 2005 ATS và IDSA đưa ra định nghĩa VPTM trên lâm sàng bao gồm: thâm nhiễm mới hoặc tiến triển trên X-quang ngực kèm theo hai trong ba tiêu chí sau: T0 > 380C, bạch cầu tăng hoặc giảm và tăng tiết đàm mủ. Xác định tác nhân gây bệnh bằng cấy định lượng hoặc bán định lượng đàm hút qua nội khí quản hoặc nội soi phế quản. Tiêu chuẩn CPIS và CPIS hiệu chỉnh được khuyên áp dụng cho chẩn đoán VPTM [24]. Năm 2011 Craven đã đưa ra tiêu chuẩn chẩn đoán nhiễm khuẩn hô hấp liên quan thở máy (ventilator – associated respiratory infections: VARI), bao gồm các tiêu chí chẩn đoán VPTM như trên và viêm khí phế quản liên quan thở máy (ventilator – associated tracheobronchitis: VAT).

Các tiêu chí viêm khí phế quản liên quan thở máy bao gồm các triệu chứng cơ năng, thực thể và thời gian thở máy giống như VPTM. Nhưng không có thâm nhiễm lan tỏa hay tiến triển ở hai phổi khi dựa vào hình ảnh X-quang hoặc CT ngực và bằng chứng vi sinh khi dựa vào tiêu chí chẩn đoán xâm lấn bằng nội soi phế quản tại giường [40], [86]. CDC 2014 đưa ra khái niệm biến cố liên quan thở máy (VAE) gồm biến chứng liên quan thở máy, biến chứng liên quan nhiễm khuẩn trên BN thở máy, có thể VPTM, có thể có khả năng VPTM. Trong đó, biến chứng liên quan thở máy (VAC) bao gồm sau hai ngày thở máy, BN có ít nhất một trong hai tiêu chí sau: (1) Tăng tiêu thụ oxy: tăng FiO2 ≥ 20% mỗi ngày, liên tục trong hai ngày liên tiếp.

(2) Tăng nhu cầu PEEP: tăng PEEP ≥ 3 cmH20 mỗi ngày, liên tục trong hai ngày liền. Biến chứng liên quan nhiễm khuẩn trên BN thở máy (IVAC) bao gồm sau 3 – 4 ngày thở máy, BN có VAC kèm hai tiêu chí sau: (1) T0 > 380C hoặc < 360C, hoặc bạch cầu máu > 12. (2) Sử dụng kháng sinh ≥ 4 ngày liền. Có thể VPTM bao gồm sau 3 – 4 ngày thở máy, BN có VAC và IVAC kèm một trong các tiêu chí sau: (1) tăng tiết đàm mủ, (2) cấy đàm dương tính.

Có thể có khả năng VPTM gồm sau 3 – 4 ngày thở máy, BN có VAC và IVAC kèm một trong các tiêu chí sau: (1) tăng tiết đàm mủ kèm cấy định lượng dương tính. Tiêu chí cho luan an 5 cấy định lượng bao gồm nếu đàm hút qua nội khí quản cần ≥ 105 cfu/ml, đối với dịch rửa phế quản phế nang và mô phổi cần ≥ 104 cfu/ml, còn tiêu chí chải phế quản có nòng bảo vệ chỉ cần ≥ 103 cfu/ml. (2) Hoặc một trong các tiêu chí sau: (i) cấy dương tính dịch màng phổi, (ii) cấy dương tính mô bệnh học phổi, (iii) xét nghiệm dương tính với Legionella spp, xét nghiệm dương tính với virus từ dịch tiết phổi. Gần đây nhất, năm 2016 IDSA đưa ra hướng dẫn về VP như sau: thâm nhiễm mới trên phổi cùng với các bằng chứng lâm sàng chứng tỏ thâm nhiễm này có nguồn gốc từ nhiễm khuẩn.

Các bằng chứng lâm sàng bao gồm: mới khởi phát sốt, mới tiết đàm mủ, mới tăng bạch cầu và mới giảm oxy hóa máu. VPTM được định nghĩa như là VP trên BN thở máy > 48 giờ sau đặt nội khí quản [61]. Nói tóm lại VPTM có thể được định nghĩa là viêm nhu mô phổi xảy ra sau 48 giờ thở máy qua nội khí quản hoặc qua khai khí quản [42], [61]. Mặc dù khái niệm rõ ràng như vậy, nhưng hơn năm thập niên qua liên tiếp có rất nhiều định nghĩa VPTM được ra đời như định nghĩa của CDC 2014, nhưng không có định nghĩa nào được chấp nhận rộng rãi toàn cầu.

Thậm chí định nghĩa VPTM dựa vào các dấu hiệu mô học từ tử thiết cũng không được chắc chắn đồng thuận hoặc tán thành. VP thùy có thể bỏ sót, xét nghiệm VK học có thể cho kết quả âm tính mặc dù có sự hiện diện của VP, các nhà bệnh học có thể không đồng tình về các tiêu chuẩn đã được đưa ra [41]. Chính vì vậy, cho tới hôm nay tiêu chuẩn vàng cho chẩn đoán VPTM vẫn chưa có, sẽ có rất nhiều những NC mới đầy thuyết phục về lĩnh vực này ra đời trong tương lai [42], [61]. Tỉ lệ mới mắc của viêm phổi thở máy Có rất nhiều NC trong và ngoài nước đã được thực hiện nhằm đánh giá tỉ lệ mới mắc của VPTM.

Một NC cắt ngang tiến cứu đã thực hiện tại 1.417 trung tâm của 17 quốc gia Tây Âu (EPIC) nhằm đánh giá tỉ lệ lưu hành của VPTM ở các ICU [106].038 BN được đưa vào NC, trong đó 2.064 BN (21%) có nhiễm khuẩn mắc phải tại ICU, bao gồm VP chiếm 967 BN (47%), tỉ lệ bệnh lưu hành VP bệnh viện là 10%. NC này được lặp lại với qui mô toàn thế giới với tên gọi Extended luan an 6 Prevalence of Infection in Intensive Care II (EPIC II), trên 13.265 ICU của 75 quốc gia [105]. Kết quả cho thấy 7.087 BN (51%) bị nhiễm khuẩn, trong đó VP chiếm 64%. Một NC khác thực hiện trên 576 BN thở máy, dùng ống soi mềm có nòng bảo vệ kèm cấy đàm định lượng, kết quả cho thấy tỉ lệ VPTM là 9%.

Tùy thuộc vào thời gian thở máy, nguy cơ cộng dồn của VPTM lần lượt là 7% và 19% tương ứng cho ngày thở máy thứ 10 và 20. Hơn nữa, trong NC này cho thấy nguy cơ VPTM tăng lên 1% cho mỗi ngày thở máy [41]. Ngược lại, theo Cook và cộng sự đã tiến hành NC trên 1.014 BN thở máy, nguy cơ cộng dồn cho VPTM tăng lên theo thời gian thở máy. Nguy cơ VP giảm đi từ ngày thứ 5 thở máy trở đi.

Nguy cơ VP cho mỗi ngày thở máy như sau: trung bình 3%/ngày trong 5 ngày đầu thở máy, 2%/ngày vào ngày 10, và 1%/ngày vào ngày 15. Phân tích các yếu tố nguy cơ độc lập của VPTM dựa vào chẩn đoán ban đầu lúc nhập viện, bằng phân tích đa biến cho thấy kết quả sau đây. Nguy cơ tương đối và khoảng tin cậy 95% của VPTM do từng bệnh lý cho kết quả khác nhau. Như do bỏng, chấn thương và bệnh lý thần kinh trung ương lần lượt là (5,1; 5 – 17); (5; 1,9 – 13,1) và (3,4; 1,3 – 8,8).

Do bệnh lý hô hấp và tim mạch là (2,8; 1,1 – 7,5) và (2,7; 1,1 – 7). Tương tự do dùng thuốc dãn cơ và kháng sinh trước thở máy là (1,6; 1,1 – 2,4) và (0,4; 0,3 – 0,5). Tuy nhiên dùng kháng sinh càng lâu thì hiệu quả ngược lại [38]. Một NC được thực hiện bởi Chawla và cộng sự ở mười quốc gia Châu Á, kết quả cho thấy VPTM là 18% [43].

Các NC trong nước cho thấy VPTM dao động từ 20 đến 52% [7], [8], [11], [16]. Tỉ lệ tử vong VPTM là nguyên nhân hàng đầu gây tăng tỉ lệ tử vong, kéo dài thời gian nằm viện. Mặc dù không ngừng cải thiện trong chăm sóc BN, áp dụng thật hiệu quả các phương pháp phòng ngừa VPTM. Nhưng tỉ lệ tử vong vì VPTM tăng cao gấp 10 lần hơn so với nhóm BN nằm ICU không có VPTM [103].

Thật khó có thể qui kết nguyên nhân nào là thủ phạm. Tuy nhiên một cách lý giải tương đối hợp lý là có phải phần lớn BN nằm ICU là những BN lớn tuổi, có nhiều bệnh nền kèm theo [41]. Tỉ lệ tử vong thô ở các ICU thay đổi từ 24 – 76% của BN VPTM (Bảng 1. luan an 7 Bảng 1.

Tử suất thô theo điều trị kháng sinh ban đầu “Nguồn: Chastre (2006)” [41]. Tác giả TLTK ĐTKS K đầy đủ ĐTKS đầy đủ Giá trị P Luna [72] 92,2% (n=36) 37,5% (n=15) < 0,00 Alvarez-Lerma [23] 34,9% (n=146) 32,5% (n=284) NS Rello [90] 63,0% (n=27) 41,5% (n=58) 0,06 Kollef [63] 60,8% (n=51) 26,6% (n=79) 0,00 Sanchez-Nieto [94] 42,9% (n=14) 25,0% (n=24) NS Ruiz [93] 50,0% (n=18) 39,3% (n=28) NS Dupont [46] 60,7% (n=56) 47,3% (n=55) NS Chú thích: TLTK: tài liệu tham khảo; ĐTKS: điều trị kháng sinh, NS: không xác định; K đầy đủ: không đầy đủ. BN thở máy tại ICU bị VPTM có tỉ lệ tử vong tăng gấp từ 2 – 10 lần so với BN không có VP.