Nghiên cứu sự đột biến gene k ras và mối liên quan đột biến gene k ras với một số đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng bệnh ung thư đại trực tràng

Nghiên cứu sự đột biến gene K-Ras và mối liên quan với đặc điểm lâm sàng bệnh ung thư đại trực tràng, cung cấp thông tin quan trọng cho chẩn đoán.

• Tác giả: Lê Văn Thiệu
• Trường học: Học viện Quân Y
• Chuyên ngành: Nội Tiêu Hóa
• Đề tài: Nghiên Cứu Đột Biến Gen K-RAS và Mối Liên Quan với Đặc Điểm Lâm Sàng Ung Thư Đại Trực Tràng
• Loại tài liệu: Luận Án Tiến Sĩ Y Học
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Gen và ung thư đại trực tràng
• 1.2. Gen K-RAS và ung thư đại trực tràng
• 1.2.1. Gen K-RAS
• 1.2.2. Cấu trúc gen K-RAS
• 1.2.3. Chức năng của gen K-RAS
• 1.2.4. Cơ chế sinh ung thư của gen K-RAS
• 1.2.5. Các phương pháp xác định đột biến gen K-RAS
• 1.2.5.1. Kỹ thuật giải trình tự gen
• 1.2.5.2. Kỹ thuật PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism)
• 1.2.5.3. Kỹ thuật Scorpions-Amplification Refractory Mutation System (Scorpions ARMS)
• 1.2.5.4. Kỹ thuật Smart Amplification Process (SmartAmp)

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Đột Biến Gen K RAS Trong Ung Thư

Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là một vấn đề sức khỏe toàn cầu, gây tử vong hàng thứ ba trong các bệnh ung thư. Cơ chế phát triển UTĐTT liên quan đến sự tích lũy các đột biến gen trong tế bào niêm mạc đại trực tràng trong khoảng thời gian dài, từ 10 đến 20 năm. Công nghệ y sinh hiện đại đã cho phép xác định tương đối chính xác các đột biến quan trọng trong các dòng tế bào ung thư phổ biến, bao gồm cả UTĐTT. Điều thú vị là sự phát triển của tế bào ung thư dường như phụ thuộc chủ yếu vào các tín hiệu sinh trưởng từ một hoặc một nhóm gen sinh ung thư (oncogene) nhất định. Những oncogene này mã hóa các protein đóng vai trò trong các con đường tín hiệu nội bào, cho phép tế bào ung thư tăng sinh vô hạn, phân chia liên tục, xâm lấn và di căn. Nghiên cứu về các đột biến gen, đặc biệt là K-RAS, mở ra hướng tiếp cận mới trong điều trị ung thư.

1.1. Vai Trò Của Gen Trong Phát Triển Ung Thư Đại Trực Tràng

Sự phát triển của UTĐTT liên quan mật thiết đến sự biến đổi của các gen tham gia vào quá trình chuyển đổi từ tế bào lành sang tế bào ung thư. Các gen này được phân loại thành ba nhóm chính: gen ung thư (oncogene), gen ức chế ung thư và gen sửa chữa DNA. Để hình thành ung thư, cần có sự đột biến ở cả hai nhóm gen ung thư và gen ức chế ung thư. Khi gen tiền ung thư bị đột biến thành gen ung thư và gen ức chế ung thư bị bất hoạt hoặc tổn thương, sự phát triển của tế bào sẽ vượt khỏi tầm kiểm soát, dẫn đến hình thành khối u ác tính. Sự hiểu biết sâu sắc về vai trò của từng loại gen là chìa khóa để phát triển các liệu pháp điều trị nhắm trúng đích.

1.2. Tổng Quan Về Gen K RAS Và Chức Năng Của Nó

Gen K-RAS là một oncogene, đóng vai trò quan trọng trong việc điều hành quá trình phân chia tế bào. Nó mã hóa một protein tham gia vào việc truyền tín hiệu từ bên ngoài tế bào vào nhân, kích hoạt tế bào phát triển, phân chia hoặc trưởng thành với các chức năng chuyên biệt. Protein K-RAS hoạt động như một công tắc, có thể bật (kích hoạt) hoặc tắt (bất hoạt). Để truyền tín hiệu, protein K-RAS phải được kích hoạt bằng cách gắn vào một phân tử GTP. Khi protein liên kết với GDP, nó sẽ bất hoạt và không truyền tín hiệu đến nhân tế bào. Sản phẩm protein của gen K-RAS đóng vai trò quan trọng trong phân bào, sự khác biệt tế bào và sự chết tế bào theo chương trình (apoptosis).

II. Đột Biến Gen K RAS Nguyên Nhân Cơ Chế Sinh Ung Thư ĐTTr

Đột biến gen K-RAS là một trong những đột biến phổ biến nhất trong UTĐTT, với tỉ lệ ước tính từ 37% đến 41% các trường hợp. Dưới tác động của các yếu tố môi trường như bức xạ, hóa chất, đột biến gen K-RAS có thể xảy ra, gây chuyển đổi tế bào bình thường thành tế bào ung thư. Đột biến K-RAS thường xảy ra ở các codon 12, 13 và 61. Đột biến này làm thay đổi một protein (amino acid) trong khu vực quan trọng của protein K-RAS, khiến protein luôn ở trạng thái hoạt động. Thay vì phản ứng với các tín hiệu từ bên ngoài tế bào, protein hoạt động quá mức chỉ đạo các tế bào phát triển và phân chia không ngừng. Đây là cơ chế sinh ung thư quan trọng của gen K-RAS.

2.1. Cơ Chế Hoạt Động Bất Thường Của Protein K RAS Đột Biến

Khi gen K-RAS bị đột biến, protein K-RAS mất khả năng tự bất hoạt sau khi truyền tín hiệu tăng trưởng. Protein đột biến liên tục kích hoạt các con đường tín hiệu hạ lưu, dẫn đến sự tăng sinh tế bào không kiểm soát. Các con đường tín hiệu bị ảnh hưởng bởi đột biến K-RAS bao gồm RAS/RAF/MEK/ERK, PI3K/AKT/mTOR, và RHO/ROCK. Sự kích hoạt liên tục của các con đường này thúc đẩy sự tăng trưởng, phân chia, và tồn tại của tế bào ung thư, đồng thời ức chế quá trình chết tế bào theo chương trình (apoptosis). Methyl hóa DNA có thể liên quan đến việc tăng biểu hiện K-RAS.

2.2. Mối Liên Hệ Giữa Đột Biến K RAS Và Sự Phát Triển Polype

Đột biến gen K-RAS có thể đóng vai trò quan trọng trong giai đoạn đầu của quá trình phát triển UTĐTT, đặc biệt là trong sự hình thành và tiến triển của các polyp tuyến. Tần số đột biến K-RAS tăng lên theo kích thước và độ loạn sản của polyp. Các u tuyến có đường kính lớn hơn 1cm có tần số đột biến K-RAS tương đương với đột biến trong ung thư. Ngược lại, u tuyến có đường kính nhỏ thường có tỷ lệ đột biến K-RAS thấp hơn. Điều này cho thấy đột biến K-RAS có thể là một sự kiện sớm trong quá trình phát sinh u tuyến, tạo tiền đề cho sự phát triển thành ung thư xâm lấn.

III. Phương Pháp Xác Định Đột Biến Gen K RAS Hướng Dẫn Chi Tiết

Việc xác định đột biến gen K-RAS đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán, tiên lượng và lựa chọn phương pháp điều trị UTĐTT. Hiện nay, có nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để xác định đột biến gen K-RAS, mỗi phương pháp có ưu điểm và nhược điểm riêng, cũng như độ nhạy và độ đặc hiệu khác nhau. Lựa chọn phương pháp phù hợp phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm tỉ lệ tế bào ung thư trong mẫu mô phân tích, trang thiết bị sẵn có và chi phí. Các phương pháp phổ biến bao gồm giải trình tự gen, PCR-RFLP, Scorpions ARMS, và SmartAmp.

3.1. Kỹ Thuật Giải Trình Tự Gen Để Phát Hiện Đột Biến K RAS

Kỹ thuật giải trình tự gen là phương pháp tiêu chuẩn vàng để xác định đột biến gen K-RAS, đặc biệt khi mật độ tế bào ung thư trong mô phân tích cao (≥ 30%). Phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao (lên đến 99%). DNA của bệnh nhân được tách chiết từ mẫu mô, sau đó gen K-RAS được khuếch đại bằng PCR. Sản phẩm PCR được tinh sạch và đưa vào giải trình tự trực tiếp bằng phương pháp BigDye terminator sequencing. Trình tự gen thu được được đối chiếu với trình tự gen K-RAS hoang dại trên GenBank để xác định các đột biến. Tuy nhiên, kỹ thuật này đòi hỏi trang thiết bị hiện đại và kỹ thuật viên có chuyên môn cao, cũng như thời gian phân tích tương đối dài.

3.2. Phương Pháp PCR RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

Phương pháp PCR-RFLP là một phương pháp đơn giản, rẻ tiền và hiệu quả để phát hiện các đột biến điển hình trên gen K-RAS, đặc biệt là tại codon 12. Nguyên lý của phương pháp này dựa trên việc trình tự kiểu dại của codon 12 thuộc exon 2 của gen K-RAS có vị trí nhận biết của enzyme giới hạn BstNI. Đột biến tại codon 12 làm mất vị trí cắt của enzyme này. Sản phẩm PCR khuếch đại exon 2 gen K-RAS được phân cắt bởi enzym BstNI, sau đó sản phẩm cắt được điện di phân tích trên gel agarose để xác định sự hiện diện của đột biến. Mặc dù đơn giản, phương pháp này có độ tin cậy cao trong việc xác định các đột biến điển hình.

3.3. Kỹ Thuật Scorpions ARMS Và SmartAmp Ưu Điểm Vượt Trội

Kỹ thuật Scorpions ARMS và SmartAmp là các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại được ứng dụng để phát hiện đột biến gen K-RAS với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Kỹ thuật Scorpions ARMS kết hợp khuếch đại đặc hiệu alen đột biến (ARMS) và công nghệ Scorpions trong phản ứng Real-time PCR. Kỹ thuật SmartAmp (Smart Amplification Process) là một công nghệ mới được phát triển tại Nhật Bản, cho phép phát hiện đột biến nhanh chóng và chính xác, chỉ trong khoảng 30 phút. Cả hai kỹ thuật này đều có ưu điểm vượt trội so với các phương pháp truyền thống, đặc biệt là trong việc phát hiện các đột biến hiếm gặp và trong các mẫu có tỉ lệ tế bào ung thư thấp.

IV. Liên Quan Giữa Đột Biến K RAS và Đặc Điểm Lâm Sàng UTĐTT

Nghiên cứu về mối liên quan giữa đột biến gen K-RAS và các đặc điểm lâm sàng của UTĐTT đã mang lại nhiều kết quả quan trọng. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng đột biến K-RAS có thể liên quan đến một số yếu tố như giai đoạn bệnh, vị trí khối u, mức độ biệt hóa tế bào, và đáp ứng với các phương pháp điều trị. Tuy nhiên, mối liên hệ này có thể khác nhau tùy thuộc vào quần thể nghiên cứu và phương pháp phân tích. Việc hiểu rõ mối liên quan giữa đột biến K-RAS và các đặc điểm lâm sàng có thể giúp các bác sĩ đưa ra quyết định điều trị cá nhân hóa và cải thiện tiên lượng cho bệnh nhân UTĐTT.

4.1. Tác Động Của Đột Biến K RAS Lên Đáp Ứng Với Điều Trị EGFR

Một trong những ứng dụng quan trọng nhất của việc xác định đột biến K-RAS là dự đoán đáp ứng với các thuốc ức chế EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), chẳng hạn như cetuximab và panitumumab. Các nghiên cứu đã chứng minh rằng bệnh nhân UTĐTT di căn có đột biến K-RAS không đáp ứng với các thuốc ức chế EGFR và thậm chí có thể có tiên lượng xấu hơn. Do đó, việc xét nghiệm đột biến K-RAS là bắt buộc trước khi điều trị bằng các thuốc ức chế EGFR để tránh điều trị không hiệu quả và lãng phí chi phí.

4.2. Nghiên Cứu Về Mối Liên Quan Với Tiên Lượng Bệnh UTĐTT

Mối liên quan giữa đột biến gen K-RAS và tiên lượng bệnh UTĐTT vẫn còn là một chủ đề gây tranh cãi. Một số nghiên cứu cho thấy đột biến K-RAS có liên quan đến tiên lượng xấu hơn, đặc biệt là ở những bệnh nhân đã trải qua phẫu thuật cắt bỏ khối u. Tuy nhiên, các nghiên cứu khác không tìm thấy mối liên hệ đáng kể nào giữa đột biến K-RAS và tiên lượng bệnh. Sự khác biệt này có thể do sự khác biệt trong thiết kế nghiên cứu, quần thể bệnh nhân, và phương pháp phân tích. Cần có thêm các nghiên cứu lớn hơn và được thiết kế tốt hơn để làm sáng tỏ mối liên quan này.

V. Ứng Dụng Liệu Pháp Nhắm Trúng Đích Dựa Trên Đột Biến K RAS

Việc phát hiện đột biến K-RAS đã mở ra hướng tiếp cận mới trong điều trị UTĐTT, đó là liệu pháp nhắm trúng đích. Tuy nhiên, việc phát triển các thuốc nhắm trúng đích trực tiếp vào protein K-RAS đột biến gặp nhiều khó khăn do cấu trúc protein phức tạp và thiếu các vị trí gắn thuốc phù hợp. Mặc dù vậy, các nhà khoa học vẫn đang nỗ lực nghiên cứu và phát triển các chiến lược điều trị nhắm vào các con đường tín hiệu hạ lưu của K-RAS, chẳng hạn như MEK, ERK, và PI3K. Liệu pháp nhắm trúng đích hứa hẹn sẽ mang lại hiệu quả điều trị cao hơn và ít tác dụng phụ hơn so với các phương pháp điều trị truyền thống.

5.1. Thách Thức Trong Phát Triển Thuốc Nhắm Trúng Đích K RAS

Protein K-RAS là một mục tiêu điều trị khó khăn do cấu trúc bề mặt trơn nhẵn và thiếu các túi gắn thuốc rõ ràng. Các nỗ lực phát triển thuốc nhắm trúng đích trực tiếp vào K-RAS đã gặp nhiều thất bại trong quá khứ. Tuy nhiên, gần đây đã có những tiến bộ đáng kể trong việc phát triển các chất ức chế K-RAS G12C, một đột biến phổ biến ở nhiều loại ung thư. Các chất ức chế này đã cho thấy hiệu quả hứa hẹn trong các thử nghiệm lâm sàng và có thể mở ra một kỷ nguyên mới trong điều trị ung thư mang đột biến K-RAS.

5.2. Nghiên Cứu Các Con Đường Tín Hiệu Hạ Lưu Của K RAS

Do những khó khăn trong việc nhắm trúng đích trực tiếp vào K-RAS, nhiều nhà nghiên cứu đã tập trung vào việc phát triển các thuốc nhắm vào các con đường tín hiệu hạ lưu của K-RAS, chẳng hạn như MEK, ERK, và PI3K. Các thuốc ức chế MEK đã được chứng minh là có hiệu quả trong một số loại ung thư mang đột biến K-RAS. Tuy nhiên, các thuốc ức chế ERK và PI3K vẫn đang trong giai đoạn phát triển và thử nghiệm lâm sàng. Việc kết hợp các thuốc nhắm trúng đích vào các con đường tín hiệu hạ lưu của K-RAS với các phương pháp điều trị khác, chẳng hạn như hóa trị và liệu pháp miễn dịch, có thể mang lại hiệu quả điều trị tốt hơn.

VI. Tương Lai Nghiên Cứu Về Đột Biến Gen K RAS Trong Ung Thư ĐTTr

Nghiên cứu về đột biến gen K-RAS trong UTĐTT vẫn còn nhiều tiềm năng phát triển. Các nghiên cứu trong tương lai có thể tập trung vào việc xác định các đột biến K-RAS hiếm gặp, tìm hiểu các cơ chế kháng thuốc, và phát triển các liệu pháp nhắm trúng đích mới. Việc kết hợp dữ liệu về đột biến K-RAS với các thông tin di truyền và lâm sàng khác có thể giúp các bác sĩ đưa ra quyết định điều trị cá nhân hóa và cải thiện tiên lượng cho bệnh nhân UTĐTT. Tương lai của nghiên cứu này sẽ tập trung vào các liệu pháp cá nhân hóa.

6.1. Phát Triển Các Phương Pháp Xét Nghiệm Đột Biến K RAS Nhanh Chóng

Việc phát triển các phương pháp xét nghiệm đột biến K-RAS nhanh chóng và chính xác là rất quan trọng để giúp các bác sĩ đưa ra quyết định điều trị kịp thời. Các phương pháp xét nghiệm dựa trên công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) và PCR kỹ thuật số (dPCR) có thể cung cấp kết quả nhanh chóng và chính xác với chi phí hợp lý. Các phương pháp xét nghiệm lỏng (liquid biopsy) cũng đang được phát triển để giúp theo dõi sự tiến triển của bệnh và đáp ứng với điều trị.

6.2. Cá Nhân Hóa Điều Trị Dựa Trên Hồ Sơ Di Truyền Ung Thư

Trong tương lai, điều trị UTĐTT sẽ ngày càng được cá nhân hóa dựa trên hồ sơ di truyền của từng bệnh nhân. Việc phân tích toàn bộ hệ gen của tế bào ung thư có thể giúp xác định các đột biến khác ngoài K-RAS có thể ảnh hưởng đến đáp ứng với điều trị. Các liệu pháp nhắm trúng đích có thể được lựa chọn dựa trên hồ sơ di truyền của bệnh nhân, giúp cải thiện hiệu quả điều trị và giảm thiểu tác dụng phụ. Y học cá nhân hóa là xu hướng tất yếu trong điều trị ung thư.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là một trong những bệnh lý ác tính phổ biến và là nguyên nhân gây tử vong do ung thư đứng hàng thứ 3 trên phạm vi toàn cầu. Theo số liệu từ GLOBOCAN 2008, thế giới ghi nhận khoảng 12.000 trường hợp mắc mới và 7.000 trường hợp tử vong do ung thư nói chung trong năm 2008; trong khi ước tính của Hiệp hội phòng chống ung thư quốc tế (UICC) cho thấy mỗi năm có khoảng 1.000 trường hợp UTĐTT mới phát hiện và hơn 500.000 người tử vong vì căn bệnh này. Tại Việt Nam, UTĐTT đứng thứ 5 trong các bệnh ung thư phổ biến (sau ung thư dạ dày, phổi, vú và vòm họng) và đứng thứ 2 trong nhóm ung thư đường tiêu hóa (sau ung thư dạ dày). Thống kê của Bệnh viện K Hà Nội ghi nhận UTĐTT chiếm tỷ lệ 9% tổng số bệnh nhân ung thư, song đây là nhóm bệnh có tiên lượng tương đối thuận lợi nếu được can thiệp sớm.

Về cơ chế bệnh sinh, UTĐTT hình thành qua quá trình tích lũy lâu dài (từ 10 đến 20 năm) các biến đổi di truyền trong tế bào niêm mạc đại trực tràng. Sự phát triển của công nghệ y sinh đã xác định vai trò của các gen sinh ung thư (oncogene), đặc biệt là gen K-RAS, trong việc duy trì tín hiệu tăng sinh, xâm lấn và di căn của tế bào u. Đột biến gen K-RAS là nguyên nhân trực tiếp dẫn đến tình trạng kháng các thuốc ức chế thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) như cetuximab hoặc panitumumab trong liệu pháp điều trị đích. Tại Việt Nam, phần lớn các công trình trước đây tập trung vào triệu chứng lâm sàng, hình ảnh nội soi và mô bệnh học kinh điển; các dữ liệu về đột biến sinh học phân tử còn hạn chế về số lượng mẫu.

Luận án tiến sĩ y học của nghiên cứu sinh Lê Văn Thiệu, chuyên ngành Nội tiêu hóa (mã số: 62.43), thực hiện tại Học viện Quân y năm 2013 với đề tài: "Nghiên cứu đột biến gen K-RAS và mối liên quan với một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ung thư đại trực tràng", được triển khai nhằm thực hiện hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Nghiên cứu tình trạng đột biến gen K-RAS ở bệnh nhân ung thư biểu mô đại trực tràng.
2. Tìm hiểu mối liên quan giữa đột biến gen K-RAS với một số đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi, giải phẫu bệnh và nồng độ CEA ở bệnh nhân ung thư biểu mô đại trực tràng.

Đối tượng nghiên cứu là 79 bệnh nhân được chẩn đoán xác định ung thư biểu mô đại trực tràng (UTBMĐTT) và được phẫu thuật cắt bỏ khối u triệt căn tại Bệnh viện Việt Tiệp Hải Phòng trong giai đoạn từ tháng 01/2010 đến tháng 7/2012. Bệnh phẩm mô đúc khối nến paraffin được đọc xác định mô bệnh học tại Bệnh viện Việt Tiệp Hải Phòng và Bệnh viện Trung ương Quân đội 108, đồng thời được phân tích đột biến gen K-RAS tại Trung tâm Nghiên cứu gen và protein thuộc Trường Đại học Y Hà Nội.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Quá trình hình thành UTĐTT là mô hình nhiều bước phản ánh sự tích lũy của các biến đổi di truyền bao gồm: hoạt hóa các gen sinh ung thư, bất hoạt các gen ức chế ung thư và tổn thương các gen sửa chữa DNA ghép cặp sai (DNA mismatch repair). Tổng quan tài liệu của luận án đã hệ thống hóa các nhóm gen chủ chốt:

• Họ gen RAS (H-RAS, K-RAS, N-RAS): Mã hóa protein trọng lượng phân tử 21-kDa tham gia truyền tín hiệu nội bào. Đột biến K-RAS2 xuất hiện trong 37% - 41% UTĐTT; đột biến K-RAS và N-RAS gặp trong 50% khối u đại trực tràng. Tần số đột biến K-RAS ở các u tuyến đường kính > 1 cm đạt 50%, trong khi ở u tuyến < 1 cm chỉ dưới 10%.
• Các gen sinh ung thư và biến đổi biểu sinh khác: Hiện tượng giảm methyl hóa DNA (được Bodmer, Bishop và Karran mô tả năm 1994) và sự hoạt hóa gen C-MYC (nằm trên nhánh 8q24) liên quan đến sự gia tăng phiên mã và tăng sinh tế bào.
• Các gen áp chế ung thư (Tumor suppressor genes):
  • Gen APC (vị trí 5q21, mã hóa protein 2843 axit amin): Đóng vai trò là gen giữ cổng (gatekeeper), đột biến gặp trong 70% các ca UTĐTT và là căn nguyên của bệnh đa polyp tuyến gia đình (FAP).
  • Gen P53 (vị trí 17p13, được Lane D. phát hiện năm 1979, mã hóa protein 393 axit amin): Đóng vai trò "người trông giữ bộ gen", đột biến gặp ở hơn 50% ung thư biểu mô tuyến đại trực tràng nhưng rất hiếm gặp trong polyp tuyến lành tính.
  • Các gen khác: MCC (5q21), DCC (18q21, đột biến ở 13% UTĐTT), R11 (6q26, mã hóa thụ thể TGF-β2, đột biến ở 80% - 90% khối u có mất ổn định vi vệ tinh MSI), SMAD4 (đột biến từ 10% - 30% UTĐTT).
• Các gen sửa chữa ghép cặp sai DNA: hMSH2 (2p16), hMLH1 (3p21) liên quan đến hội chứng Lynch và xuất hiện ở khoảng 15% UTĐTT tản phát.

Gen	Vị trí trên nhiễm sắc thể	Hội chứng / Vai trò	Chức năng protein
APC	5q21	Đa polyp tuyến gia đình	Kết dính tế bào, kiểm soát C-MYC, chết theo chương trình
hMSH2	2p16	UTĐTT di truyền không polyp	Sửa chữa lỗi ghép cặp DNA
hMLH1	3p21	UTĐTT di truyền không polyp	Sửa chữa lỗi ghép cặp DNA
P53	17p13	Ức chế khối u, sửa chữa DNA	Kiểm soát chu kỳ tế bào, chết theo chương trình
DCC	18q21	Gen ức chế khối u	Liên kết tế bào
MCC	5q21	Gen ức chế khối u	Chưa rõ
K-RAS	12p	Gen gây ung thư	Gắn GTP, truyền tín hiệu
C-MYC	8q24	Gen gây ung thư	Tổng hợp DNA, phiên mã
R11	6q26	Gen ức chế khối u	Tiếp nhận TGF-β2
IGF-IIR	Chưa nêu rõ	Gen ức chế khối u	Hoạt hóa TGF-β

Về phân bố dịch tễ đột biến K-RAS trên thế giới và tại Việt Nam:

Tác giả / Nghiên cứu	Cỡ mẫu ($n$)	Tỷ lệ đột biến (%)	Vị trí codon	Tỷ lệ theo vị trí u / Đặc điểm liên quan
Zulhabri O. và CS (2012)	70	20%	Codon 12	Đại tràng phải (37%) cao hơn đại tràng trái (14%) ($p < 0,05$); U > 35 mm đạt 60% ($p < 0,05$); Nam 25%, Nữ 16% ($p > 0,05$)
Karapetis và CS (2008)	394	41,6%	Exon 2	Trực tràng: 19,5%; Đại tràng: 65,9%
Beranek M. và CS (1999)	-	34%	Codon 12	UTBMT biệt hóa vừa: 38%, týp khác: 25% ($p > 0,05$)
Vaughn (2011)	-	42,4%	Codon 12, 13	Khảo sát đột biến exon 2
Breivik J. và CS (1994)	251	39,4%	Codon 12, 13	Nam 33,3%, Nữ 45,3%; Trực tràng 37%, Đại tràng 41,3%; Đột biến G→A: 57%, G→T: 34%
Bink M. và CS (2003)	737	37%	Codon 12, 13	Nam 57%, Nữ 43%; Trực tràng 42%, Đại tràng 55%; Đột biến G→A: 33%, G→T: 45%
Hà Lan (2006)	4.076	-	Exon 2	Rượu $\ge 30,0$ g/ngày không liên quan đến đột biến K-RAS dạng chuyển đổi G→A
Tạ Thành Văn và CS (2011)	10	40% (4/10 mẫu)	Exon 2	Nghiên cứu bước đầu xây dựng quy trình xác định đột biến tại Việt Nam
Hồ Hữu Thọ và CS (2011)	10	40% (4/10 mẫu)	Exon 2	Nghiên cứu đột biến gen đường tiêu hóa (trong đó có 4 mẫu UTĐTT)

Khoảng trống nghiên cứu được luận án lựa chọn giải quyết là: Thực hiện một nghiên cứu hệ thống trên cỡ mẫu đủ lớn ($n = 79$) tại Việt Nam để xác định tỷ lệ và các dạng đột biến K-RAS tại codon 12 và 13 bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp; đồng thời đối chiếu toàn diện tình trạng đột biến với các đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi, giải phẫu bệnh lý (độ biệt hóa, mức xâm lấn, di căn hạch theo Dukes, Astler - Coller, TNM) và nồng độ kháng nguyên carcinoembryonic (CEA).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và cơ chế phân tử

Gen K-RAS nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể 12 (vị trí 12p, từ nucleotid 25358179 đến 25403853 theo McGrath J.). Gen mã hóa protein K-RAS có hoạt tính GTPase, hoạt động như một công tắc phân tử điều hòa phân bào và biệt hóa tế bào:

• Trạng thái hoạt động (RAS-GTP): Được kích hoạt bởi các yếu tố chuyển đổi nucleotide guanine (GEFs).
• Trạng thái bất hoạt (RAS-GDP): Được điều hòa thông qua quá trình thủy phân GTP thành GDP dưới tác dụng của các protein hoạt hóa GTPase (GAPs).

Khi xảy ra đột biến soma—chủ yếu là đột biến thay thế nucleotid tại codon 12 (chiếm 82%) và codon 13 (chiếm 17%) thuộc exon 2—protein K-RAS bị biến đổi cấu trúc, mất khả năng tương tác với GAPs và duy trì trạng thái hoạt hóa vĩnh viễn (RAS-GTP). Tình trạng này kích hoạt liên tục dòng thác tín hiệu nội bào xuôi dòng (bao gồm con đường RAS-MAPK) mà không phụ thuộc vào tín hiệu từ thụ thể EGFR bề mặt tế bào, tạo nên cơ chế phân tử của hiện tượng kháng thuốc kháng thể đơn dòng kháng EGFR (cetuximab, panitumumab).

Mô hình phát sinh UTĐTT nhiều bước (Fearon và Vogelstein B., 1990; Smith G.) mô tả tiến trình từ niêm mạc bình thường qua biểu mô tăng sinh, polyp tuyến lành tính, u tuyến có loạn sản và chuyển thành ung thư xâm lấn, di căn. Sự tích lũy tuần tự các đột biến (APC $\rightarrow$ K-RAS $\rightarrow$ P53, kết hợp mất ổn định vi vệ tinh MSI và bất hoạt các gen sửa chữa lỗi bắt cặp hMLH1, hMSH2) thúc đẩy khối u tiến triển.

Thiết kế nghiên cứu và cỡ mẫu

Nghiên cứu được thiết kế theo phương pháp tiến cứu, mô tả, cắt ngang. Cỡ mẫu nghiên cứu được tính toán theo công thức ước lượng một tỷ lệ trong quần thể:

$$n = Z_{1-\alpha/2}^2 \cdot \frac{p(1-p)}{(p \cdot \epsilon)^2}$$

Trong đó:

• $Z_{1-\alpha/2} = 1,96$ (độ tin cậy 95%).
• $p = 0,4$ (ước tính tỷ lệ đột biến gen K-RAS là 40%, dựa trên nghiên cứu của Stefanius tại Phần Lan năm 2011 với tỷ lệ 45%).
• $q = 1 - p = 0,6$.
• $\epsilon = 0,3$ (sai số tương đối).

Thay các giá trị vào công thức:

$$n = \frac{1,96^2 \times 0,4 \times 0,6}{(0,4 \times 0,3)^2} \approx 64$$

Cỡ mẫu lý thuyết tối thiểu là 64 bệnh nhân. Nghiên cứu thực tế đã thu thập được 79 bệnh nhân đủ các tiêu chuẩn lựa chọn.

Tiêu chuẩn chọn và loại trừ bệnh nhân

• Tiêu chuẩn lựa chọn:
  1. Bệnh nhân được khám, làm xét nghiệm, chẩn đoán xác định UTBMĐTT và được phẫu thuật cắt bỏ khối u triệt căn.
  2. Kết quả xét nghiệm mô bệnh học sau mổ khẳng định là UTBMĐTT.
  3. Chưa được điều trị hóa chất hoặc xạ trị trước mổ.
  4. Có đầy đủ kết quả xét nghiệm đột biến gen K-RAS.
• Tiêu chuẩn loại trừ:
  1. Bệnh nhân UTBMĐTT ở giai đoạn không còn khả năng phẫu thuật triệt căn.
  2. Kết quả mô bệnh học sau mổ không phải là ung thư biểu mô đại trực tràng.
  3. Bệnh nhân UTBMĐTT tái phát hoặc đã tiếp nhận hóa trị, xạ trị trước phẫu thuật.
  4. Bệnh nhân có khối ung thư nguyên phát khác kèm theo.
  5. Mẫu bệnh phẩm không có kết quả xét nghiệm đột biến gen K-RAS.

Phương pháp thu thập dữ liệu và kỹ thuật xét nghiệm

1. Khám lâm sàng và xét nghiệm cận lâm sàng:
   • Khảo sát các triệu chứng cơ năng (đau bụng, rối loạn phân, đi ngoài phân máu/nhầy, bán tắc ruột theo dấu hiệu Bouveret/Koenig, tắc ruột), thời gian khởi phát bệnh (< 3 tháng, 3 - 6 tháng, 6 - 12 tháng, > 12 tháng), tiền sử bệnh viêm ruột (viêm loét đại trực tràng chảy máu, bệnh Crohn's) và các yếu tố nguy cơ.
   • Định lượng nồng độ CEA huyết thanh bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang trên máy Immuline one (Đức), lấy ngưỡng phân loại $\le 5$ ng/ml và $> 5$ ng/ml.
   • Nội soi đại trực tràng ống mềm bằng máy Olympus CF-Q150I (Nhật Bản), đánh giá vị trí u, kích thước theo chu vi lòng ruột (< 1/4, 1/4 - 1/2, 1/2 - 3/4, > 3/4 chu vi), hình thái đại thể u (thể sùi, thể loét, thể "loét + sùi", thể thâm nhiễm/thể trai, thể chít hẹp/thể nhẫn, thể dưới niêm). Sinh thiết 5 - 10 mảnh tại bờ tổn thương, tránh vùng hoại tử.
2. Quy trình phẫu thuật và kiểm tra hạch:
   • Phẫu thuật cắt đại tràng hoặc trực tràng triệt căn bảo đảm khoảng cách an toàn (cách u 5 cm đối với đại tràng; cách trên u 5 cm và dưới u ít nhất 2 cm đối với trực tràng; hoặc phẫu thuật Miles khi u cách rìa hậu môn dưới 5 cm). Vét hạch mạc treo tương ứng tới gốc mạch máu chính.
   • Phẫu tích hạch bệnh phẩm theo tiêu chuẩn khuyến cáo của AJCC và Hội giải phẫu bệnh Hoa Kỳ (CAP), bảo đảm kiểm tra tối thiểu 12 hạch bạch huyết.
3. Nghiên cứu mô bệnh học:
   • Bệnh phẩm sinh thiết nội soi và sau mổ cố định bằng dung dịch formol 10% trung tính (thể tích dung dịch gấp 20 lần thể tích bệnh phẩm), đúc khối paraffin, cắt tiêu bản dày 3 - 4 $\mu$m, nhuộm Hematoxylin - Eosin (HE) và PAS.
   • Phân loại theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO 2000): Ung thư biểu mô tuyến (biệt hóa cao, vừa, thấp); ung thư biểu mô tuyến nhầy (> 50% chất nhầy ngoài tế bào); ung thư biểu mô tế bào nhẫn (> 50% chất nhầy nội bào); ung thư biểu mô tuyến vảy, tế bào vảy, không biệt hóa.
   • Phân giai đoạn theo hệ thống Dukes cải tiến, Astler - Coller và phân loại TNM (AJCC 2006, cập nhật UICC 2010).
4. Quy trình sinh học phân tử xác định đột biến gen K-RAS:
   • Tách chiết DNA: Mẫu mô ung thư đúc paraffin được loại bỏ paraffin bằng xilen, phá vỡ tế bào bằng dung dịch Lysis buffer và SDS 10%, sau đó tách chiết DNA bằng phenol : chloroform : isoamyl (25:24:1) và chloroform : isoamyl (24:1), kết tủa bằng ethanol và natri axetat 3M (pH 5,2). Đo nồng độ và độ tinh sạch trên máy Nano-Drop, chọn các mẫu đạt chỉ số $OD_{260}/OD_{280} \ge 1,8$.
   • Phản ứng PCR và Nested PCR: Chuẩn độ DNA khuôn ở nồng độ 50 - 100 ng/$\mu$l. Thành phần hỗn hợp PCR 10 $\mu$l gồm: khuôn DNA 1 $\mu$l, ExTaq buffer 10X 1 $\mu$l, dNTP 25 mM 1 $\mu$l, Taq polymerase 0,1 $\mu$l, mồi xuôi 0,5 $\mu$l, mồi ngược 0,5 $\mu$l, nước tinh khiết 5,9 $\mu$l. Chu trình nhiệt trên máy Gen Amp PCR System 9700: 94°C trong 5 phút; 37 chu kỳ gồm (94°C trong 15 giây, 59°C trong 30 giây, 72°C trong 30 giây); kéo dài ở 72°C trong 5 phút; giữ ở 4°C.
   • Điện di kiểm tra: Điện di sản phẩm PCR kích thước 288 bp trên bản gel agarose 2% trong dung dịch đệm TBE 1X ở hiệu điện thế 90V trong 30 phút, nạp thang DNA chuẩn 100 bp, nhuộm ethidium bromide trong 5 phút và ghi hình tự động trên hệ thống Chemidoc EQ-Bio-Rad.
   • Tinh sạch và giải trình tự gen: Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit Promega Wizard SV gel clean-up. Trình tự chuỗi nucleotid được giải mã bằng phương pháp BigDye terminator sequencing trên hệ thống máy đọc tự động ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Kết quả được đối chiếu với trình tự gen K-RAS kiểu hoang dại (wild-type) trên ngân hàng dữ liệu GenBank (NCBI).

Nội dung chính theo từng chương

Đặt vấn đề

Nội dung phần Đặt vấn đề xác định bối cảnh dịch tễ học của ung thư đại trực tràng trên thế giới và tại Việt Nam. Tác giả phân tích tính chất đa bước trong cơ chế sinh ung thư qua sự tích lũy các đột biến gen trong 10 - 20 năm, nhấn mạnh hiện tượng phụ thuộc oncogene của tế bào u. Sự can thiệp vào các gen chỉ huy như K-RAS, HER2, $\beta$-catenin, cyclin E, B-Raf bằng công nghệ can thiệp RNA (iRNA) đã chứng minh khả năng ức chế tế bào ác tính in vitro, mở ra kỷ nguyên điều trị đích. Luận án chỉ rõ sự cần thiết phải xác định tình trạng đột biến gen K-RAS tại Việt Nam nhằm phục vụ chỉ định điều trị thuốc kháng EGFR và đánh giá mối tương quan với các chỉ số lâm sàng, cận lâm sàng truyền thống.

Chương 1: Tổng quan

Chương Tổng quan gồm các nội dung học thuật chính:

1. Gen và ung thư đại trực tràng: Trình bày vai trò và cơ chế của các gen sinh ung thư họ RAS (H-RAS, K-RAS, N-RAS), giảm methyl hóa DNA, C-MYC; các gen ức chế ung thư (APC, P53, MCC, DCC, R11, SMAD4); các gen sửa chữa ghép cặp sai DNA (hMSH2, hMLH1) và tình trạng mất ổn định vi vệ tinh (MSI).
2. Gen K-RAS và ung thư đại trực tràng: Cấu trúc gen trên nhiễm sắc thể 12p, chức năng điều hòa enzym GTPase trong chuyển hóa GTP/GDP. Cơ chế đột biến soma tại codon 12 (82%) và codon 13 (17%) gây hoạt hóa liên tục con đường truyền tín hiệu nội bào RAS-MAPK và đề kháng thuốc ức chế EGFR (cetuximab, panitumumab).
3. Các phương pháp xác định đột biến gen K-RAS: So sánh nguyên lý, độ nhạy và thời gian thực hiện của 4 kỹ thuật chính:
   • Giải trình tự gen trực tiếp (Direct Sequencing): Tiêu chuẩn vàng, độ nhạy và đặc hiệu đạt 99% khi tỷ lệ tế bào u $\ge 30%$, thời gian thực hiện 1 - 2 ngày.
   • Kỹ thuật PCR-RFLP: Sử dụng enzym cắt giới hạn BstNI nhận biết codon 12 kiểu dại, phân tích điện di gel agarose NuSieve GTG 3%, thời gian 1 - 2 ngày.
   • Kỹ thuật Scorpions ARMS: Kết hợp phản ứng ARMS và đầu dò huỳnh quang Scorpions trên Real-time PCR, đạt chứng chỉ chẩn đoán CE-IVD 98/79/EC, thời gian 3 - 4 giờ.
   • Kỹ thuật SmartAmp (Smart Amplification Process): Công nghệ của Viện RIKEN (Nhật Bản), kết hợp mồi thiết kế bất đối xứng và protein TaqMutS nhận biết ghép cặp sai, vận hành 1 bước đơn lẻ trong khoảng 30 phút.
4. Yếu tố nguy cơ của UTĐTT: Tuổi, giới tính (nam/nữ từ 1,1 đến 2,1), địa dư (tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi tại Hà Nội tăng từ 4,3/100.000 dân năm 1991 lên 13,3/100.000 dân năm 1999), bệnh đa polyp tuyến gia đình FAP (đột biến APC, 100% hóa ung thư ở tuổi 40), hội chứng Lynch I và II (đột biến hMLH1 50%, hMSH2 40%, hMSH6 10%), bệnh viêm ruột mạn tính (viêm loét đại trực tràng chảy máu, bệnh Crohn's), chế độ ăn nhiều chất béo động vật, amin dị vòng, béo phì, hút thuốc lá (liên quan đa hình GSTM1, GSTT1, CYP1A1, NAT1, NAT2), đái tháo đường typ 2, tăng cholesterol máu ($RR = 1,65$ khi cholesterol > 276 mg/dl).
5. Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, chẩn đoán mô bệnh học và giai đoạn bệnh: Triệu chứng đau bụng (gặp ở 60% - 80%), rối loạn bài tiết phân, xét nghiệm máu ẩn trong phân (test FOB Gaiac Hemocult II với tỷ lệ âm tính giả khoảng 40% nếu hemoglobin < 2 ml/gram phân), định lượng CEA; vai trò tiêu chuẩn vàng của nội soi ống mềm kết hợp sinh thiết; các hình thái nội soi (thể loét, sùi, loét + sùi chiếm 45%, thâm nhiễm, chít hẹp); phân loại giải phẫu bệnh theo WHO 2000; phân giai đoạn theo Dukes, Astler - Coller, TNM (AJCC 2006, UICC 2010); nguyên tắc nạo vét và kiểm tra tối thiểu 12 hạch bạch huyết (theo AJCC và CAP) hoặc $\ge 14$ hạch (theo Wong và CS).
6. Tổng quan các nghiên cứu trong nước và quốc tế: Hệ thống hóa các kết quả nghiên cứu đột biến gen K-RAS của Zulhabri O. (2012), Karapetis (2008), Beranek M. (1999), Vaughn (2011), Breivik J. (1994), Bink M. (2003), Tạ Thành Văn (2011), Hồ Hữu Thọ (2011).

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết:

1. Đối tượng nghiên cứu: 79 bệnh nhân UTBMĐTT được chỉ định phẫu thuật triệt căn tại Bệnh viện Việt Tiệp Hải Phòng, được xét nghiệm mô bệnh học khẳng định lại tại Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 và phân tích đột biến gen K-RAS tại Trung tâm Nghiên cứu gen và protein - Đại học Y Hà Nội.
2. Tiêu chuẩn chọn vào và tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân: Thiết lập chặt chẽ 4 tiêu chuẩn chọn mẫu và 5 tiêu chuẩn loại trừ nhằm loại bỏ các yếu tố gây nhiễu như hóa xạ trị tiền phẫu hoặc ung thư thứ hai.
3. Trang thiết bị và hóa chất: Danh mục chi tiết hệ thống máy giải trình tự ABI Prism 3100 Genetic Analyzer, máy luân nhiệt Gen Amp PCR System 9700, tủ lạnh âm sâu -80°C SANYO, máy điện di Mupid, máy chụp gel Chemidoc EQ-Bio-Rad; các hóa chất tách chiết của hãng Qiagen (Lysis buffer, dung dịch K, SDS 10%, phenol/chloroform) và hóa chất giải trình tự BigDye terminator của Applied Biosystems.
4. Quy trình kỹ thuật: Trình bày từng bước từ khâu chuẩn bị đại tràng nội soi (bằng Fleet phosphosoda), sinh thiết 5 - 10 mảnh mô, phẫu thuật triệt căn bảo đảm diện cắt an toàn và vét hạch, quy trình đúc paraffin cắt lát 3 - 4 $\mu$m nhuộm HE/PAS, đến quy trình sinh học phân tử chuẩn hóa gồm tách chiết DNA, đo mật độ quang học, khuếch đại PCR với thành phần phản ứng cụ thể, điện di kiểm tra đoạn 288 bp và giải trình tự gen.
5. Các chỉ tiêu nghiên cứu và biến số đánh giá: Thu thập toàn diện các nhóm biến số về lâm sàng (tuổi, giới, triệu chứng đau bụng, rối loạn phân, thể trạng, thời gian mắc bệnh), nồng độ CEA, đặc điểm nội soi (vị trí, hình thái, tỷ lệ chiếm chu vi lòng ruột), đặc điểm phẫu thuật và mô bệnh học (kích thước, mức độ xâm lấn thanh mạc, phân loại mô bệnh học theo WHO, độ biệt hóa, phân loại Dukes cải tiến, Astler - Coller, phân chia giai đoạn TNM theo AJCC 2006 và UICC 2010).

Kết quả và những đóng góp mới

Dựa trên cấu trúc và dữ liệu được trình bày trong tài liệu, luận án đã xác lập các đóng góp khoa học và thực tiễn:

• Về mặt kỹ thuật và phương pháp: Luận án đã ứng dụng thành công quy trình kỹ thuật sinh học phân tử chuẩn hóa bằng phương pháp giải trình tự gen trực tiếp (BigDye terminator sequencing trên hệ thống ABI Prism 3100) để xác định các dạng đột biến điểm tại codon 12 và 13 thuộc exon 2 gen K-RAS từ mẫu mô đúc paraffin của bệnh nhân ung thư biểu mô đại trực tràng tại Việt Nam.
• Về mặt dữ liệu thực chứng: Cung cấp bộ dữ liệu lâm sàng, cận lâm sàng và sinh học phân tử trên 79 bệnh nhân UTBMĐTT được điều trị phẫu thuật triệt căn. Dữ liệu phản ánh mối liên quan giữa tình trạng đột biến gen K-RAS với các biến số lâm sàng, nồng độ chỉ điểm u CEA, hình ảnh tổn thương nội soi và các thông số giải phẫu bệnh học chi tiết (thể mô bệnh học, độ biệt hóa tế bào, mức độ xâm lấn thành ruột và tình trạng di căn hạch bạch huyết theo các hệ thống phân loại quốc tế Dukes, Astler - Coller và TNM AJCC/UICC).
• Về mặt ứng dụng lâm sàng: Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở thực tiễn phục vụ việc sàng lọc đột biến gen K-RAS trước khi đưa ra quyết định điều trị, hỗ trợ các nhà lâm sàng tiên lượng khả năng đáp ứng và cá thể hóa chỉ định các thuốc điều trị đích kháng EGFR (như cetuximab, panitumumab).

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Từ các nội dung được phân tích trong văn bản, các giới hạn và định hướng nghiên cứu tiếp theo bao gồm:

• Hạn chế của phạm vi nghiên cứu:
  • Đối tượng nghiên cứu mới chỉ tập trung vào nhóm bệnh nhân ung thư biểu mô đại trực tràng còn giai đoạn phẫu thuật triệt căn tại một trung tâm phẫu thuật (Bệnh viện Việt Tiệp Hải Phòng), chưa bao gồm nhóm bệnh nhân ở giai đoạn muộn không còn chỉ định mổ triệt căn.
  • Phân tích đột biến gen K-RAS tập trung chủ yếu vào hai vị trí phổ biến nhất là codon 12 và codon 13 của exon 2, chưa mở rộng khảo sát các đột biến hiếm gặp hơn ở codon 61 và codon 146.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo:
  • Mở rộng phân tích các đột biến tại các codon khác của gen K-RAS (codon 61, 146) cũng như các dấu ấn sinh học phân tử liên quan khác trong con đường truyền tín hiệu nội bào (N-RAS, B-Raf, PIK3CA, tình trạng mất ổn định vi vệ tinh MSI).
  • Triển khai và đánh giá hiệu quả của các kỹ thuật xét nghiệm đột biến nhanh như Scorpions ARMS hoặc SmartAmp nhằm rút ngắn thời gian trả kết quả phục vụ thực hành lâm sàng.
  • Tiến hành các nghiên cứu theo dõi dọc đánh giá trực tiếp hiệu quả đáp ứng điều trị, thời gian sống thêm không tiến triển và sống thêm toàn bộ trên nhóm bệnh nhân có và không có đột biến gen K-RAS được điều trị bằng kháng thể đơn dòng kháng EGFR.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo dành cho nhiều nhóm đối tượng:

• Bác sĩ lâm sàng chuyên ngành Nội tiêu hóa, Ngoại tiêu hóa và Ung bướu: Cung cấp cơ sở lý luận và bằng chứng thực tiễn về mối liên quan giữa đột biến gen sinh ung thư với biểu hiện lâm sàng, hình ảnh nội soi và phân giai đoạn bệnh, hỗ trợ xây dựng chiến lược điều trị cá thể hóa và chỉ định điều trị đích.
• Chuyên viên và nhà nghiên cứu Sinh học phân tử, Giải phẫu bệnh: Tham khảo quy trình kỹ thuật tách chiết DNA từ mô đúc paraffin đạt độ tinh sạch cao ($OD_{260}/OD_{280} \ge 1,8$), quy trình phản ứng PCR/nested PCR và giải trình tự gen trực tiếp vùng exon 2 gen K-RAS.
• Giảng viên, học viên sau đại học và nghiên cứu sinh y học: Cung cấp tài liệu tổng quan hệ thống về dịch tễ học, cơ chế di truyền phân tử đa bước trong UTĐTT, các thang phân loại giải phẫu bệnh (WHO 2000, Dukes, Astler - Coller, TNM 2006/2010) và phương pháp luận thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang kết hợp y học thực nghiệm.

Câu hỏi thường gặp

1. Gen K-RAS nằm ở vị trí nào trên nhiễm sắc thể và cơ chế gây đề kháng thuốc điều trị đích kháng EGFR là gì?

Gen K-RAS nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể 12 (vị trí 12p, cụ thể từ nucleotid 25358179 đến 25403853 theo McGrath J.). Gen mã hóa protein K-RAS có hoạt tính GTPase tham gia con đường truyền tín hiệu xuôi dòng từ thụ thể EGFR vào nhân tế bào. Khi xảy ra đột biến soma (chủ yếu tại codon 12 và codon 13 thuộc exon 2), protein K-RAS mất khả năng thủy phân GTP thành GDP do kháng lại tác dụng của protein GAPs. Điều này khiến protein K-RAS luôn tồn tại ở trạng thái hoạt hóa liên tục (RAS-GTP), kích hoạt vĩnh viễn các con đường truyền tín hiệu nội bào (như RAS-MAPK) mà không cần sự gắn kết của phối tử vào thụ thể EGFR, dẫn đến việc tế bào u đề kháng với các thuốc kháng thể đơn dòng kháng EGFR như cetuximab và panitumumab.

2. Luận án áp dụng phương pháp nào để xác định đột biến gen K-RAS và quy trình kỹ thuật gồm những bước nào?

Luận án áp dụng phương pháp giải trình tự gen trực tiếp (BigDye terminator sequencing) trên hệ thống máy đọc tự động ABI Prism 3100 Genetic Analyzer. Quy trình kỹ thuật gồm 4 bước:

1. Tách chiết DNA từ mô ung thư đúc khối paraffin bằng phương pháp phenol/chloroform sau khi loại paraffin bằng xilen, đo kiểm tra độ tinh sạch trên máy Nano-Drop ($OD_{260}/OD_{280} \ge 1,8$).
2. Khuếch đại vùng exon 2 chứa codon 12 và 13 của gen K-RAS bằng kỹ thuật PCR/nested PCR trên máy Gen Amp PCR System 9700.
3. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR kích thước 288 bp trên gel agarose 2% ở hiệu điện thế 90V trong 30 phút, nhuộm ethidium bromide và chụp ảnh gel trên máy Chemidoc.
4. Tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ kit Promega Wizard SV và tiến hành giải trình tự chuỗi nucleotid, sau đó đối chiếu kết quả với trình tự gen K-RAS kiểu dại trên ngân hàng dữ liệu GenBank (NCBI).

3. Kỹ thuật SmartAmp có những đặc điểm và ưu thế gì so với các kỹ thuật phát hiện đột biến K-RAS khác theo tổng quan luận án?

Theo tổng quan luận án, kỹ thuật SmartAmp (phát triển bởi Viện RIKEN, Nhật Bản) dựa trên nguyên lý "Khuếch đại DNA = Phát hiện đột biến". Kỹ thuật sử dụng các cặp mồi bất đối xứng kết hợp với protein TaqMutS có khả năng nhận biết và bám đặc hiệu vào vị trí ghép cặp sai giữa mồi và khuôn, ngăn cản sự khuếch đại của các chuỗi không tương đồng hoàn toàn. Ưu thế nổi bật của SmartAmp là quy trình vận hành khép kín chỉ qua một bước duy nhất, cho kết quả phân tích đột biến trong thời gian rất ngắn (khoảng 30 phút), nhanh hơn đáng kể so với kỹ thuật Scorpions ARMS (3 - 4 giờ), kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp (1 - 2 ngày) và kỹ thuật PCR-RFLP (1 - 2 ngày).

4. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân vào mẫu nghiên cứu của luận án được quy định như thế nào?

Bệnh nhân được đưa vào nhóm nghiên cứu khi đáp ứng đủ 4 tiêu chuẩn lựa chọn:

1. Bệnh nhân được khám lâm sàng, làm xét nghiệm, chẩn đoán xác định ung thư biểu mô đại trực tràng và được phẫu thuật cắt bỏ khối u triệt căn tại Bệnh viện Việt Tiệp Hải Phòng.
2. Kết quả xét nghiệm mô bệnh học sau phẫu thuật khẳng định chẩn đoán ung thư biểu mô đại trực tràng.
3. Bệnh nhân chưa từng tiếp nhận bất kỳ đợt điều trị hóa chất hoặc xạ trị nào trước thời điểm phẫu thuật.
4. Mẫu bệnh phẩm được thực hiện đầy đủ xét nghiệm xác định tình trạng đột biến gen K-RAS.

5. Số lượng hạch bạch huyết tối thiểu cần nạo vét và kiểm tra mô bệnh học trong phẫu thuật triệt căn ung thư đại trực tràng là bao nhiêu?

Theo các hướng dẫn quốc tế được dẫn chứng trong luận án, Hiệp hội Ung thư Hoa Kỳ (AJCC) và Hội giải phẫu bệnh Hoa Kỳ (CAP) khuyến cáo cần phẫu tích và kiểm tra mô bệnh học tối thiểu từ 8 đến 12 hạch bạch huyết (trong đó tiêu chuẩn 12 hạch là mốc chuẩn hóa) trong mẫu bệnh phẩm phẫu thuật triệt căn để bảo đảm đánh giá chính xác tình trạng di căn hạch và phân chia giai đoạn bệnh. Ngoài ra, tác giả Wong và cộng sự qua phân tích giải phẫu bệnh 196 trường hợp UTĐTT khuyến cáo nên lấy tối thiểu 14 hạch để đánh giá giai đoạn bệnh một cách đầy đủ nhất.

Kết luận

Luận án tiến sĩ y học của Lê Văn Thiệu là công trình nghiên cứu chuyên khảo về tình trạng đột biến gen K-RAS trên 79 bệnh nhân ung thư biểu mô đại trực tràng được phẫu thuật triệt căn tại Bệnh viện Việt Tiệp Hải Phòng giai đoạn 2010 - 2012. Tác giả đã chuẩn hóa và thực hiện quy trình giải trình tự gen trực tiếp để phát hiện các đột biến điểm tại exon 2 (codon 12 và 13) của gen K-RAS, đồng thời khảo sát mối liên quan giữa biến đổi phân tử này với các biểu hiện lâm sàng, nồng độ kháng nguyên CEA, hình thái nội soi ống mềm và các tiêu chuẩn phân loại mô bệnh học, giai đoạn bệnh (WHO 2000, Dukes cải tiến, Astler - Coller, TNM AJCC/UICC). Các kết quả và quy trình được xây dựng trong luận án cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm và bằng chứng khoa học phục vụ công tác chẩn đoán phân tử, tiên lượng bệnh và định hướng ứng dụng các thuốc điều trị đích kháng EGFR trong thực hành lâm sàng tiêu hóa - ung bướu tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư (UT) là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới, bệnh có xu hướng ngày càng gia tăng. Dựa trên ước tính tình hình UT toàn cầu năm 2008 (GLOBOCAN 2008), trên thế giới có khoảng 12.000 trường hợp UT và 7.000 trường hợp tử vong do UT trong năm 2008 [75]. Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là nguyên nhân gây tử vong cao hàng thứ 3 trong các tử vong do UT nói chung. Theo Hiệp hội phòng chống UT quốc tế (Union for International Cancer Control - UICC), ước tính trên thế giới mỗi năm có khoảng 1.000 trường hợp UTĐTT mới được phát hiện và khoảng hơn 500.000 người chết vì căn bệnh này [36].

Tỉ lệ mắc bệnh giữa các vùng miền, các châu lục có sự khác nhau. Ở Việt Nam, UTĐTT đứng thứ 5 sau các UT của dạ dày, phổi, vú và vòm họng. Trong UT đường tiêu hóa thì UTĐTT đứng thứ 2, sau UT dạ dày. Theo thống kê của Bệnh viện K Hà Nội, tỉ lệ mắc UTĐTT là 9% tổng số bệnh nhân (BN) UT nói chung.

Tuy nhiên, so với các UT của đường tiêu hóa thì UTĐTT là loại có tiên lượng tốt nhất [1], [8], [18], [19]. Cơ chế hình thành và phát triển của UTĐTT là do biến đổi và tích lũy các gen trong tế bào của niêm mạc đại trực tràng (ĐTT). Sự tích lũy dần các biến dị di truyền thường phải trải qua nhiều năm (từ 10 - 20 năm), và điều này phù hợp với các nghiên cứu dịch tễ học di truyền về diễn biến của UTĐTT trải qua nhiều bước [32], [76]. Sự phát triển vượt bậc của ngành Công nghệ y sinh, hiện nay đã cho phép xác định tương đối chính xác, đầy đủ và nhanh hầu như tất cả các dạng đột biến quan trọng trong những dòng tế bào UT phổ biến như UT phổi, u lympho ác tính, UTĐTT….

Điều đáng ngạc nhiên là mặc dù mang nhiều đột 3 biến nhưng khả năng phát triển của tế bào UT dường như lại lệ thuộc chủ yếu vào nguồn tín hiệu sinh trưởng của một hoặc một nhóm gen sinh UT (oncogene) nhất định. Những oncogene này mã hóa các protein đóng vai trò mắt xích trong các con đường tín hiệu nội bào. Những đột biến này làm cho các tế bào UT có khả năng tăng sinh vô hạn, liên tục phân chia và thực hiện quá trình xâm lấn, di căn… Tuy nhiên, chính đặc điểm này cũng làm phơi bày “gót chân Achilles” của tế bào UT. Bằng việc “đánh sập” các oncogene chủ chốt như HER2, K-RAS, β-catenin, cyclin E, B-Raf… bằng công nghệ iRNA, các nhà khoa học đã thành công trong việc ức chế sự phát triển của nhiều loại tế bào UT in vitro [49].

Những nghiên cứu trên mô hình chuột biến đổi gen tiếp tục khẳng định tầm quan trọng của các gen đích trong nhiều bệnh UT, trong đó có oncogene K-ras trong UTĐTT [74]. Từ những bằng chứng trên, một thế hệ mới các thuốc điều trị UT có khả năng tác động chính xác tới các đích tiềm năng trong tế bào UT đã ra đời - đó là liệu pháp điều trị đích. Ở Việt Nam, cũng đã có nhiều nghiên cứu về UTĐTT, nhưng chủ yếu là về đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi và mô bệnh học (MBH), còn ít thấy có những nghiên cứu về đột biến gen trong UT nói chung và trong UTĐTT nói riêng. Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu đột biến gen K-RAS và mối liên quan với một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ung thư đại trực tràng” được tiến hành nhằm 2 mục tiêu chính sau: 1.

Nghiên cứu tình trạng đột biến gen K-RAS ở bệnh nhân ung thư biểu mô đại trực tràng. Tìm hiểu mối liên quan giữa đột biến gen K-RAS với một số đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi, giải phẫu bệnh và nồng độ CEA ở bệnh nhân ung thư biểu mô đại trực tràng. 4 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN 1. Gen và ung thƣ đại trực tràng Từ những nghiên cứu về cơ chế phát sinh và phát triển UTĐTT có sự liên quan đến sự biến đổi các gen tham gia vào sự chuyển dạng từ tế bào lành sang tế bào UT.

Các gen này được chia thành 3 nhóm: gen UT, gen ức chế UT và các gen sửa chữa DNA [49]. Để hình thành UT phải có sự đột biến ở cả 2 nhóm gen UT và gen ức chế UT. Khi gen tiền UT bị đột biến thành gen UT và gen ức chế UT bị bất hoạt hoặc bị tổn thương, lúc đó các tín hiệu cho tế bào phát triển vượt quá các tín hiệu điều hòa thì sự phát triển của tế bào sẽ nhanh chóng vượt khỏi tầm kiểm soát và UT hình thành [2], [29], [93]. Các gen ung thư Gen UT (oncogene) được định nghĩa là các gen đột biến mà các biến đổi của chúng gây ra nguy cơ UT hoặc thúc đẩy quá trình UT.

Bình thường các gen UT ở trạng thái gen tiền UT có vai trò trong sự điều hòa chu trình tế bào, phát triển và biệt hóa tế bào [49]. Khi bị đột biến các gen tiền UT sẽ biểu hiện quá mức các tín hiệu phân chia tế bào làm các tế bào tăng sinh thừa thãi, trở thành những gen UT (oncogene) [140]. Một số gen UT được cho là có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển UTĐTT đó là: 1. Gen RAS Các gen UT được khẳng định có liên quan đến UTĐTT là họ gen RAS bao gồm H-RAS, K-RAS, N-RAS, mã hóa cho một protein 21-kDa.

Protein RAS có vai trò trong việc truyền tín hiệu từ bề mặt tế bào vào trong nhân, điều hòa khung xương tế bào và phân chia tế bào. Dạng đột biến gen RAS, 5 gây hoạt hóa một loạt các protein kinase thành làn sóng, gây ra phosphoryl các phân tử protein truyền tín hiệu nhân. Chức năng gen RAS bị hoạt hóa cũng liên quan đến yếu tố sinh mạch và chết tế bào theo chương trình (apoptosis) [38], [144]. Đột biến K-RAS2 được phát hiện từ 37 - 41% tất cả các UTĐTT.

Đột biến gen K-RAS và N-RAS cũng được tìm thấy trong 50% các khối u ĐTT [50]. Tần số đột biến tăng theo kích thước và độ loạn sản của polype, tuy nhiên tần số này không tăng khi chuyển từ polype sang UT. Các u tuyến với đường kính > 1cm có tần số đột biến gen K-RAS là 50% [48], tương tự như đột biến gặp trong UT. Ngược lại, u tuyến có đường kính nhỏ (< 1cm) chỉ có < 10% gen RAS bị đột biến, chứng tỏ đột biến gen RAS là đột biến mắc phải trong quá trình u tuyến phát sinh, đột biến gen RAS dường như có vai trò tiên phong trong u tuyến [50].

Giảm methyl hóa DNA Methyl hóa DNA có vai trò phức tạp trong phát triển UT. Giảm methyl hóa do Bodmer, Bishop và Karran đưa ra năm 1994, liên quan đến tăng biểu hiện gen và có thể đóng vai trò hoạt hóa các gen UT như K-RAS. Tương tự như sự tăng hoạt hóa DNA có thể xảy ra đồng thời với giảm methyl hóa tại vùng khác của bộ gen trong nhiều loại UT [49], [50]. Gen C-MYC Gen MYC (Myelocytomatosis) mã hóa cho các yếu tố phiên mã trực tiếp liên quan đến sự phát triển khối u.

Sản phẩm protein mã hóa bởi gen MYC có cấu trúc bình thường, nhưng gia tăng về số lượng, hậu quả sự hoạt hóa gen MYC là tăng biểu hiện gen. Các gen MYC đôi khi cũng được coi là gen tiền UT, các tế bào mang gen tiền ung thư MYC được gọi là C-MYC [49], [50], [132]. Các gen áp chế ung thư Gen áp chế UT (tumor suppressor gene) là một loại gen UT được tạo ra do sự đột biến làm mất chức năng. Bình thường các gen này liên quan đến kiểm soát hoặc ức chế phân chia tế bào, biệt hóa tế bào hoặc mã hóa tế bào chết theo chương trình.

Sự mất hoạt tính của các gen này gây ra mất khả năng kiểm soát sự phát triển bình thường của tế bào, làm biến đổi tế bào lành thành tế bào ác tính [52]. Gen APC Sự phát hiện ra sự biến đổi di truyền trong bệnh đa polype tuyến gia đình (Familial adenomatous polyposis - FAP) là cơ sở cho sự phát minh gen đa polype tuyến ĐT (Adenomatous polyposis Coli - APC). Gen APC nằm trên 5q21, mã hóa cho một protein gồm 2843 axit amin, gen APC có chức năng ức chế UT [50]. APC là một gen đích quan trọng nhất trong sự phát triển UTĐTT và được coi là gen giữ cổng (gatekeeper) [50], giúp kiểm soát sự phát triển của tế bào theo một số cơ chế khác nhau, bao gồm điều hòa kết dính tế bào, xử lý con đường truyền tín hiệu, duy trì khung xương tế bào, phân chia tế bào và chết tế bào theo chương trình.

Mất hoặc bất hoạt gen APC dẫn đến mất cân bằng phân chia tế bào, sự chết của tế bào và rối loạn phát triển của tế bào. Đột biến gen APC gặp trong 70% tất cả các UTĐTT, các nghiên cứu đều thống nhất là sự bất hoạt chức năng gen APC tạo ra một làn sóng ban đầu cho sự lan tràn dòng tế bào tiền UT. Gen APC dường như có liên quan đến khởi phát của polype tuyến [71]. Gen P53 Protein p53 được Lane D.

phát hiện vào năm 1979. Gen P53 mã hóa cho protein p53 chứa 393 axít amin, là một gen ức chế UT [50]. Gen P53 có chức năng chủ yếu đáp ứng lại các tổn thương DNA, trong pha 7 (G1), kích thích sửa chữa DNA và thúc đẩy chết tế bào theo chương trình, gen P53 đóng vai trò chủ đạo trong việc duy trì tính ổn định của DNA nên nó được coi là “người trông giữ bộ gen” [56], [118]. Khi gen P53 bị đột biến, cơ chế này bị mất đi và các dòng tế bào có thể có thêm các đột biến khác để tiến triển UT.

Trong quá trình phát triển UTĐTT, đột biến gen P53 có thể xảy ra do sự mất đi của nhiễm sắc thể hoặc do mất tính dị hợp tử. Đột biến gen P53 gặp ở 50% trong các UT ở người và hơn 50% trong các ung thư biểu mô tuyến (UTBMT) ĐTT. Nhưng đột biến gen P53 rất hiếm gặp trong polyp tuyến [50], [73]. Như vậy, bất hoạt gen P53 có liên quan đến quá trình chuyển từ polyp tuyến lành tính sang UT.

Gen MCC Gen MCC (mutated in colon cancer), nằm trên 5q2, gần gen FAP. Gen MCC mã hóa cho một protein gồm 829 axít amin, gần giống với cấu trúc protein APC. Dường như có liên quan về vai trò của gen này với gen APC nhưng chưa được rõ [49]. Gen DCC Gen DCC (deleted in colon cancer) nằm trên vai dài nhiễm sắc thể 18 (18q21), là gen ức chế UT.