MỞ ĐẦU Loãng xương (osteoporosis) là bệnh xương pho biến, nhất là ở phụ nữ sau mãn kinh và người cao tuổi, biểu hiện bởi mật độ xương giảm thấp, cấu trúc xương bị phá hủy làm xương xốp, giòn và tăng nguy cơ bị gay. Bệnh có diễn tiến thầm lặng và thường chỉ được phát hiện khi xương bi gay do trượt ngã hay do tác động ngoại lực. Gẫy xương do loãng xương gây hệ lụy rất nghiêm trọng tới người bệnh, gia đình và xã hội vì bệnh nhân có thể bị tử vong hay phải sống phụ thuộc với thời gian điều trị lâu dài với chi phí rất cao [Tu; 2018]. Loãng xương được chia thành hai loại là loãng xương nguyên phát do già hóa và loãng xương thứ phát do các nguyên nhân khác.
Với tốc độ già hóa dân số tăng nhanh trên toàn cầu cũng như ở Việt Nam hiện nay, cùng với những yếu tố nguy cơ như lối sống ít vận động, dùng nhiều rượu, thuốc lá, có các bệnh lý nền cũng như việc lạm dụng thuốc (glucocorticoid), s6 lượng người bị bệnh ngày càng tăng, là thách thức rất lớn cho y tế công cộng [Tu; 2018]. Các thuốc chống loãng xương hiện nay có tác dụng theo một hoặc hai hướng ức chế hủy xương hoặc/và kích thích tạo xương, bao gồm các hormone và dẫn xuất của hormone, các kháng thể; phổ biến nhất là các thuốc thuộc nhóm bisphosphonate. Tuy nhiên, với hiệu quả còn hạn chế, mỗi loại thuốc đều có những tác dụng phụ không mong muốn [Green; 2010, Kennel;2009, Maraka; 2015, Watts; 2003]. Vì vậy nghiên cứu tìm ra các thuốc điều trị loãng xương mới hiệu quả, an toàn hơn luôn được quan tâm.
Mô hình truyền thống cho các nghiên cứu đánh giá tác dụng bảo vệ xương của các hoạt chất dé phát triển thuốc thường là động vật có vú. Tuy nhiên, gần đây, hai loài cá là cá medaka (Oryzias latipes) và cá ngựa văn (Damio rerio) được sử dụng ngày càng nhiều vì có nhiều ưu điểm của động vật thí nghiệm như đẻ nhiều, thời gian thé hệ ngăn, chi phí thấp, dé chuyên gen, tao đột biến và quan sát các quá trình sông bằng các kĩ thuật hình anh. Chúng đặc biệt phù hợp cho nghiên cứu in vivo sàng lọc hoạt chất ở những bước đầu của quá trình phát triển thuốc [Wittbrodt; 20021. Năm 2012, cá medaka chuyền gen rankl:HSE:CFP được tạo ra tại Đại học Quốc gia Singapore làm mô hình bệnh loãng xương và sàng lọc chất có hoạt tính chống loãng xương.
Kiéu hình giống loãng xương ở cá này có thé gây được bang cách sốc nhiệt vì hệ gen của cá chứa cấu trúc gen chuyển chứa gen rankl mã hóa cho yêu tố kích thích hủy xương Rankl (Receptor activator of nuclear factor kappa- B ligand) được điều khién bởi promotor cảm ứng nhiệt [To; 2012]. Tang RANKL đã được biết có liên quan đến cả loãng xương nguyên phat va thứ phát [Cheng;2022, Choi;2013], do vậy mô hình bệnh loãng xương gây ra bởi tăng RANKL có ưu thế hơn mô hình được tạo ra bởi các cách khác. Do đó, từ khi tiếp nhận cá chuyền gen ban đầu từ Đại học Quốc gia Singapore, nhóm chúng tôi đã tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện cá va và qui trình sử dung nó dé đánh giá tác dung của chất có hoạt tính chống loãng xương. Đầu tiên, nhóm nghiên cứu đã lai tách cá gốc ban đầu thành các dưới dòng cá trong đó có dòng clc6 và clc8, mỗi dòng có các cá thé có biểu hiện gen rankl và kiểu hình tôn thương xương đồng đều, chỉ thể hiện ở xương cung thần kinh ở một mức độ nhất định, làm cơ sở cho việc phát triển phương pháp định lượng mức độ ton thương xương dựa trên chiều dài của các xương này [Cường; 2015].
Luận án “Nghiên cứu mô hình bệnh loãng xương trên cá medaka chuyển gen và đánh giá tac dụng chống loãng xương của một số hoạt chất” được thực hiện với hai mục tiêu chính: 1. Nghiên cứu cá chuyên gen rankl:HSE:CFP, hoàn thiện phương pháp và quy trình sử dụng cá làm mô hình bệnh loãng xương dé đánh giá hoạt tính bảo vệ xương của các chất 2. Đánh giá tác dụng bảo vệ xương của một số hoạt chất sử dụng mô hình cá và qui trình xây dựng được. Đề thực hiện được các mục tiêu này, cá rankl:HSE:CFP dòng clc6 và clc8 tiép tục được nghiên cứu, sôc nhiệt ở các thời gian khác nhau đê chọn ra dòng ưu thế hơn; tác dụng của hai dược chất chống loãng xương nhóm bisphosphonate là alendronate và etidronate với sự ton thương xương cá được đánh giá để góp phan xây dựng phương pháp định lượng mức độ khoáng hóa và tổn thương xương cũng như tìm ra nồng độ chất phù hợp dé làm đối chứng dương cho thí nghiệm.
Thêm vào đó, ảnh hưởng của dung môi DMSO dé hòa tan các chất với sự tôn thương xương cá cũng được xác định dé hoàn thiện qui trình sử dụng dòng cá này làm mô hình bệnh loãng xương sử dụng cho việc đánh giá hoạt tính bảo vệ xương của hai hoạt chất tiềm năng là chất tự nhiên resveratrol và chất tổng hợp NecroX-5. Kết quả nghiên cứu đã hoàn thiện được phương pháp và qui trình sử dụng cá rankl:HSE:CFP làm mô hình bệnh loãng xương, lần đầu tiên phát hiện ra ảnh hưởng theo nồng độ của dung môi DMSO đến chuyền hóa xương cá cũng như cho thấy tác dụng bảo vệ xương của chất tông hợp NecroX-5. Đây cũng là nghiên cứu của nhóm đầu tiên ở Việt Nam sử dụng cá làm mô hình bệnh xương. * Tính mới của luận án 1.
Tìm được dòng cá rankl:HSE:CFP phù hợp (dòng clc8), b6 sung một số chỉ số dé hoàn thiện được qui trình sử dụng dòng cá này cho việc đánh giá tác dụng bảo vệ xương của các chất: chế độ sốc nhiệt với thời gian 90 phút ở nhiệt độ 39°C; nồng độ dung môi DMSO được dùng dé hòa tan chất có thé xử lý trên cá là dưới 0,5%; nông độ alendronate có thé được sử dung làm đối chứng đương là 25Iig/ml hay 50 ug/ml. Khang định tác dung ức chế hủy xương của hai thuốc chống loãng xương bisphosphonate thông dụng là alendronate và etidronate trên mô hình cá medaka rankl:HSE:CFP khi được phân tích bằng cách nhuộm xương cố định. Kết quả này góp phần xây dựng được phương pháp Iy xác định mức độ khoáng hóa và tổn thương xương của cá. Lần đầu tiên xác định được dung môi DMSO có thé anh hưởng đến mức độ ton thương xương gây ra bởi Rankl trên cá medaka và đưa ra khuyến cáo về việc sử dụng DMSO cho nghiên cứu trên cá này.
Khang định được resveratrol có tác dung làm giảm tốn thương xương gây ra bởi Rankl trên cá rankl: HSE:CFP mô hình bệnh loãng xương. Lần đầu tiên cho thấy chất tổng hợp NecroX-5 có tác dụng bảo vệ xương trên cá medaka thé hiện qua tác dung ức chế hủy xương và kích thích tạo xương. Điều này gợi ý tiềm năng nghiên cứu phát triển chất và các hợp chất NecroX-5 thành thuốc chống loãng xương. * Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Các kết quả nghiên cứu của luận án cũng khăng định thêm giá trị của cá medaka rankl:HSE:CFP làm mô hình bệnh loãng xương va góp phan phát triển việc dùng cá làm động vật mô hình nghiên cứu ở Việt Nam, tiệm cận với nghiên cứu trên thế giới.
TONG QUAN TÀI LIEU 1. Bệnh loãng xương và thực trạng về bệnh Loãng xương là bệnh xương phô biến đặc trưng bởi sự suy giảm mật độ và cau trúc xương, dẫn đến tăng nguy cơ gãy xương, đặc biệt là xương hông và cô xương đùi [166] (Hình 1. Thiếu xương Loãng xương T-score Hình 1.1 Mật độ xương khi bình thường (normal bone), khi thiếu xương (osteopenia) và loãng xương (osteoporosis) được đánh giá bang chỉ số T-score [127]. Tình trạng bệnh loãng xương được xác định khi người bệnh có chỉ số T (T- score) nhỏ hơn -2,5 (Hình 1).
T-score được tính dựa trên giá trị mật độ xương (Bone mineral density -BMD) đo được bằng phương pháp hấp thụ tia X năng lượng kép (dual — energy x-ray absorptiometry) DXA và giá tri mật độ xương đỉnh (pBMD) được xác định trong quan thé [35]. Trên thế giới hàng năm có khoảng 200 triệu người bị loãng xương và khoảng 8,9 triệu người bị gãy xương, trong đó chủ yếu là gãy xương hông [67]. Theo dự báo tại Mỹ, trong năm 2020 có khoảng 10 — 14 triệu người bi loãng xương với tỷ lệ người trên 50 tudi bị loãng xương tăng 60% trong giai đoạn từ năm 2000 đến năm 2025 [166]. Ước tính rằng có khoảng 50% phụ nữ và 20% nam giới trên 50 tuổi sẽ bị gãy xương trong phần đời còn lại của họ [146].
Loãng xương làm tăng nguy cơ gãy xương, đặc biệt là gãy xương hông [63]. Đáng chú ý, tỷ lệ gãy xương hông tăng theo cấp số nhân ở nữ từ 60 — 85 tuổi [36]. Ở Việt Nam, nghiên cứu cho thấy phụ nữ sau mãn kinh, cứ 100 người thì có 25 đến 30 người; nam giới trên 50 tuổi, cứ 100 người thì có 10 người bị loãng xương. Điều này cho thấy tình trạng loãng xương ở Việt Nam tương đương với các nước phương Tây [57].
Dựa vào cơ cau dân số Việt Nam năm 2010 và dự báo dân số đến năm 2050, ước tính số ca loãng xương năm 2010 là khoảng 2,9 triệu người loãng xương, trong đó có 2,36 triệu là nữ [56]. Con số loãng xương này có thể tăng lên 4,3 triệu vào năm 2020 và xấp xi 11 triệu người vào năm 2050. Tỉ lệ biến chứng gãy xương sau loãng xương ở Việt Nam cũng tương đối cao, ở Thành Phố Hồ Chí Minh cho thấy cứ 10 phụ nữ sau mãn kinh ở độ tuổi trên 50 thì có đến 2-3 người có dau hiệu gãy xương đốt sống, còn ở người trên 70 tuổi thì tỉ lệ gãy xương đốt sống có thé lên đến 40% [57]. Chi phí điều trị các biến chứng của loãng xương rất tốn kém và tăng liên tục trong những năm gan đây.
Cụ thé năm 2015 Mỹ đã tốn khoảng 637,5 triệu đô la chi phí điều trị cho các chấn thương do ngã gãy xương và biến chứng cũng như xử lý khi tử vong; trong đó, chi phí nhập viện trung bình cho một năm điều trị gãy xương đã là trên 300 triệu đô la. Đến năm 2025, chỉ phí điều trị gãy xương do loãng xương ở Mỹ dự kiến sẽ vượt 25 tỷ đô la [166]. Sinh học của mô xương Mô xương là mô liên kết đặc biệt luôn có khả năng tự đổi mới và có nhiều chức năng trong cơ thé. Xương làm khung, là chỗ dựa, bảo vệ cho các cơ quan, đặc biệt, nó phối hợp với hệ co đảm nhiệm chức năng vận động cho cơ thé.
Ngoài ra, xương còn là nơi sản xuất các tế bào tạo máu và là kho dự trữ canxi và phospho [51].