Nghiên Cứu Thử Nghiệm Kit Chẩn Đoán Bệnh Gumboro Trên Đàn Gà Nuôi Tại Thái Nguyên

Bệnh Gumboro là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi gà. 76 trang · Đại học Thái Nguyên · 2015.

• Tác giả: Nguyễn Thị Kiều Trang
• Người hướng dẫn: GS TS. Nguyễn Quang Tuyên
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Chăn nuôi thú y
• Đề tài: Nghiên Cứu Thử Nghiệm Kit Chẩn Đoán Bệnh Gumboro Trên Đàn Gà Nuôi Tại Thái Nguyên
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu của đề tài
• 1.2. Ý nghĩa của đề tài
• 1.2.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.2.2. Ý nghĩa trong thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
• 2.1. Cơ sở khoa học
• 2.2. Tổng quan về bệnh Gumboro
• 2.3. Tổng quan về phương pháp Enzym Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA)
• 2.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
• 2.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 2.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 3. PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành
• 3.3. Nội dung nghiên cứu
• 3.4. Phương pháp nghiên cứu và các chỉ tiêu theo dõi
• 3.4.1. Thiết bị và hóa chất
• 3.4.2. Phương pháp nghiên cứu
• 3.4.3. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả xác định các điều kiện sản xuất KIT chẩn đoán huyết thanh học từ kháng nguyên Gumboro
• 4.2. Xác định hàm lượng kháng nguyên và độ pha loãng kháng thể thích hợp cho phản ứng ELISA
• 4.3. Xác định sự ảnh hưởng của thời gian ủ kháng thể đến kết quả phản ứng ELISA
• 4.4. Xác định thời gian ủ đĩa ELISA với kháng thể đặc hiệu của virus Gumboro và anti-bovine IgG: HRPO
• 4.5. Xác định độ pha loãng kháng thể phù hợp để chẩn đoán bệnh Gumboro bằng KIT ELISA chế tạo
• 4.6. Xác định thời gian rửa kháng thể phù hợp để chẩn đoán bệnh Gumboro bằng KIT ELISA chế tạo
• 4.7. Xác định thời gian ủ conjugate phù hợp để chẩn đoán bệnh Gumboro bằng KIT ELISA chế tạo
• 4.8. Xác định thời gian rửa conjugate phù hợp để chẩn đoán bệnh Gumboro bằng KIT ELISA chế tạo
• 4.9. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT ELISA chế tạo
• 4.10. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT ELISA chế tạo
• 4.11. Xác định mức độ lặp lại của kết quả phản ứng
• 4.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian bảo quản đến độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT ELISA chế tạo
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC 1

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Kit Chẩn Đoán Bệnh Gumboro

Bệnh Gumboro là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi gà. Bệnh do virus Gumboro gây ra, tấn công vào túi Fabricius, làm suy giảm miễn dịch của gà. Điều này khiến gà dễ mắc các bệnh khác và làm giảm năng suất. Việc chẩn đoán sớm và chính xác bệnh Gumboro là rất quan trọng để có biện pháp phòng ngừa và điều trị kịp thời. Nghiên cứu về kit chẩn đoán Gumboro đóng vai trò then chốt trong việc kiểm soát dịch bệnh. Theo Nguyễn Thị Kiều Trang (2015), bệnh Gumboro gây suy giảm miễn dịch ở gà, tạo điều kiện cho các bệnh kế phát.

1.1. Tầm Quan Trọng Của Chẩn Đoán Sớm Bệnh Gumboro

Chẩn đoán sớm bệnh Gumboro giúp người chăn nuôi có thể áp dụng các biện pháp can thiệp kịp thời, giảm thiểu thiệt hại kinh tế. Việc sử dụng kit chẩn đoán nhanh cho phép phát hiện bệnh ngay từ giai đoạn đầu, trước khi các triệu chứng lâm sàng trở nên rõ ràng. Điều này đặc biệt quan trọng trong việc ngăn chặn sự lây lan của bệnh trong đàn gà. Chẩn đoán sớm cũng giúp phân biệt Gumboro với các bệnh khác có triệu chứng tương tự, từ đó đưa ra phác đồ điều trị phù hợp.

1.2. Giới Thiệu Về Kit Chẩn Đoán Bệnh Gumboro

Kit chẩn đoán bệnh Gumboro là một công cụ xét nghiệm nhanh, cho phép phát hiện sự hiện diện của virus Gumboro hoặc kháng thể kháng virus Gumboro trong mẫu bệnh phẩm. Các kit chẩn đoán thường dựa trên các kỹ thuật như ELISA, PCR hoặc các xét nghiệm miễn dịch sắc ký. Việc sử dụng kit chẩn đoán giúp tiết kiệm thời gian và chi phí so với các phương pháp chẩn đoán truyền thống. Độ chính xác của kit chẩn đoán là yếu tố quan trọng cần được đánh giá kỹ lưỡng trước khi đưa vào sử dụng rộng rãi.

II. Thách Thức Trong Chẩn Đoán Bệnh Gumboro Tại Thái Nguyên

Thái Nguyên là một tỉnh có ngành chăn nuôi gà phát triển, tuy nhiên, bệnh Gumboro vẫn là một thách thức lớn đối với người chăn nuôi. Việc chẩn đoán bệnh Gumboro gặp nhiều khó khăn do triệu chứng lâm sàng không đặc hiệu và sự xuất hiện của các chủng virus Gumboro biến chủng. Bên cạnh đó, việc tiếp cận các phương pháp chẩn đoán hiện đại còn hạn chế, đặc biệt ở các vùng nông thôn. Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Kiều Trang, tỷ lệ mắc bệnh Gumboro có thể lên đến 100% và tỷ lệ chết từ 10-50%, gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi.

2.1. Sự Biến Động Của Virus Gumboro Và Ảnh Hưởng Đến Chẩn Đoán

Virus Gumboro có khả năng biến đổi gen cao, dẫn đến sự xuất hiện của các chủng Gumboro biến chủng với độc lực khác nhau. Điều này gây khó khăn cho việc chẩn đoán bệnh, vì các kit chẩn đoán hiện có có thể không phát hiện được các chủng virus mới. Việc theo dõi và phân tích sự biến đổi của virus Gumboro là rất quan trọng để phát triển các kit chẩn đoán hiệu quả.

2.2. Hạn Chế Về Cơ Sở Vật Chất Và Nhân Lực Chẩn Đoán Gumboro

Tại nhiều vùng nông thôn ở Thái Nguyên, cơ sở vật chất và nhân lực cho việc chẩn đoán bệnh Gumboro còn hạn chế. Các phòng thí nghiệm thú y thường thiếu trang thiết bị hiện đại và đội ngũ kỹ thuật viên có trình độ chuyên môn cao. Điều này ảnh hưởng đến khả năng chẩn đoán chính xác và kịp thời bệnh Gumboro. Cần có sự đầu tư và nâng cấp cơ sở vật chất, cũng như đào tạo nhân lực để nâng cao năng lực chẩn đoán bệnh Gumboro.

2.3. Chi Phí Chẩn Đoán Và Khả Năng Tiếp Cận Của Người Chăn Nuôi

Chi phí chẩn đoán Gumboro có thể là một rào cản đối với nhiều người chăn nuôi, đặc biệt là các hộ chăn nuôi nhỏ lẻ. Việc sử dụng các kit chẩn đoán nhập khẩu có thể tốn kém, khiến người chăn nuôi khó tiếp cận. Cần có các giải pháp để giảm chi phí chẩn đoán và tăng cường khả năng tiếp cận của người chăn nuôi với các dịch vụ chẩn đoán bệnh Gumboro.

III. Phương Pháp ELISA Trong Chẩn Đoán Bệnh Gumboro Hiệu Quả

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) là một phương pháp xét nghiệm miễn dịch enzyme được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh Gumboro. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc phát hiện kháng nguyên hoặc kháng thể đặc hiệu của virus Gumboro trong mẫu bệnh phẩm. ELISA có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho phép chẩn đoán bệnh Gumboro một cách chính xác và nhanh chóng. Theo tài liệu, ELISA có thể được sử dụng để xác định hiệu giá huyết thanh và nồng độ kháng nguyên tối ưu.

3.1. Nguyên Tắc Hoạt Động Của Phương Pháp ELISA Trong Chẩn Đoán Gumboro

Phương pháp ELISA sử dụng enzyme để tạo ra tín hiệu màu, cho phép phát hiện và định lượng kháng nguyên hoặc kháng thể. Trong chẩn đoán Gumboro, ELISA có thể được sử dụng để phát hiện kháng thể kháng virus Gumboro trong huyết thanh gà (ELISA gián tiếp) hoặc phát hiện trực tiếp virus Gumboro trong mẫu bệnh phẩm (ELISA trực tiếp). Tín hiệu màu được đo bằng máy quang phổ, và cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ kháng nguyên hoặc kháng thể.

3.2. Ưu Điểm Của ELISA So Với Các Phương Pháp Chẩn Đoán Khác

ELISA có nhiều ưu điểm so với các phương pháp chẩn đoán khác, bao gồm độ nhạy và độ đặc hiệu cao, khả năng xử lý số lượng lớn mẫu, và chi phí tương đối thấp. ELISA cũng dễ dàng thực hiện và có thể được tự động hóa, giúp tăng năng suất và giảm sai sót. Ngoài ra, ELISA có thể được sử dụng để phát hiện cả kháng nguyên và kháng thể, cung cấp thông tin toàn diện về tình trạng nhiễm bệnh.

3.3. Các Bước Thực Hiện ELISA Trong Chẩn Đoán Bệnh Gumboro

Quy trình ELISA bao gồm nhiều bước, bao gồm phủ kháng nguyên lên đĩa ELISA, ủ mẫu bệnh phẩm, thêm kháng thể đặc hiệu gắn enzyme, rửa đĩa, thêm cơ chất, và đo tín hiệu màu. Mỗi bước cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo kết quả chính xác. Các yếu tố như thời gian ủ, nhiệt độ, và nồng độ hóa chất cần được tối ưu hóa để đạt được độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất.

IV. Nghiên Cứu Kit ELISA Chẩn Đoán Gumboro Tại Thái Nguyên

Nghiên cứu của Nguyễn Thị Kiều Trang (2015) đã thử nghiệm kit chẩn đoán bệnh Gumboro trên đàn gà nuôi tại Thái Nguyên. Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định các điều kiện sản xuất kit chẩn đoán huyết thanh học từ kháng nguyên Gumboro, bao gồm hàm lượng kháng nguyên, độ pha loãng kháng thể, thời gian ủ và thời gian rửa. Kết quả nghiên cứu cung cấp thông tin quan trọng cho việc phát triển kit ELISA Gumboro hiệu quả.

4.1. Xác Định Điều Kiện Sản Xuất Kit ELISA Chẩn Đoán Gumboro

Nghiên cứu đã xác định các điều kiện tối ưu cho việc sản xuất kit ELISA Gumboro, bao gồm hàm lượng kháng nguyên và độ pha loãng kháng thể thích hợp. Các thông số này ảnh hưởng trực tiếp đến độ nhạy và độ đặc hiệu của kit chẩn đoán. Việc tối ưu hóa các điều kiện sản xuất giúp đảm bảo kit ELISA có thể phát hiện bệnh Gumboro một cách chính xác và tin cậy.

4.2. Đánh Giá Độ Nhạy Và Độ Đặc Hiệu Của Kit ELISA Chẩn Đoán Gumboro

Nghiên cứu đã đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của kit ELISA chế tạo bằng cách so sánh kết quả với các phương pháp chẩn đoán khác. Độ nhạy cho biết khả năng của kit trong việc phát hiện các mẫu dương tính, trong khi độ đặc hiệu cho biết khả năng của kit trong việc phân biệt các mẫu dương tính và âm tính. Kết quả đánh giá cho thấy kit ELISA có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phù hợp cho việc chẩn đoán bệnh Gumboro.

4.3. Ảnh Hưởng Của Nhiệt Độ Và Thời Gian Bảo Quản Đến Kit ELISA

Nghiên cứu cũng đã đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian bảo quản đến độ nhạy và độ đặc hiệu của kit ELISA. Kết quả cho thấy nhiệt độ và thời gian bảo quản có thể ảnh hưởng đến chất lượng của kit chẩn đoán. Việc bảo quản kit ELISA ở điều kiện thích hợp là rất quan trọng để đảm bảo độ tin cậy của kết quả xét nghiệm.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Kit Chẩn Đoán Gumboro Tại Thái Nguyên

Việc ứng dụng kit chẩn đoán Gumboro trong thực tế tại Thái Nguyên mang lại nhiều lợi ích cho người chăn nuôi. Kit chẩn đoán giúp phát hiện sớm bệnh Gumboro, từ đó có biện pháp phòng ngừa và điều trị kịp thời. Điều này giúp giảm thiểu thiệt hại kinh tế do bệnh Gumboro gây ra. Ngoài ra, kit chẩn đoán cũng giúp theo dõi tình hình dịch bệnh và đánh giá hiệu quả của các biện pháp phòng chống dịch.

5.1. Chẩn Đoán Nhanh Và Chính Xác Bệnh Gumboro Tại Trang Trại

Kit chẩn đoán cho phép chẩn đoán nhanh và chính xác bệnh Gumboro ngay tại trang trại, giúp người chăn nuôi tiết kiệm thời gian và chi phí. Việc chẩn đoán nhanh giúp phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm, trước khi các triệu chứng lâm sàng trở nên nghiêm trọng. Điều này cho phép người chăn nuôi áp dụng các biện pháp can thiệp kịp thời, giảm thiểu thiệt hại kinh tế.

5.2. Theo Dõi Tình Hình Dịch Bệnh Gumboro Và Đánh Giá Hiệu Quả Phòng Bệnh

Kit chẩn đoán có thể được sử dụng để theo dõi tình hình dịch bệnh Gumboro và đánh giá hiệu quả của các biện pháp phòng bệnh. Việc xét nghiệm định kỳ giúp phát hiện sớm các trường hợp nhiễm bệnh và ngăn chặn sự lây lan của dịch bệnh. Ngoài ra, kit chẩn đoán cũng giúp đánh giá hiệu quả của vaccine Gumboro và các biện pháp phòng bệnh khác.

5.3. Hỗ Trợ Quyết Định Về Quản Lý Đàn Gà Và Phòng Chống Dịch Bệnh

Kết quả chẩn đoán từ kit chẩn đoán cung cấp thông tin quan trọng cho việc đưa ra các quyết định về quản lý đàn gà và phòng chống dịch bệnh. Thông tin này giúp người chăn nuôi lựa chọn các biện pháp phòng bệnh phù hợp, điều chỉnh chế độ dinh dưỡng và chăm sóc, và đưa ra các quyết định về việc loại thải hoặc điều trị gà bệnh.

VI. Kết Luận Và Hướng Phát Triển Kit Chẩn Đoán Gumboro

Nghiên cứu về kit chẩn đoán bệnh Gumboro đã đạt được những kết quả quan trọng, cung cấp công cụ hữu hiệu cho việc chẩn đoán và kiểm soát dịch bệnh Gumboro tại Thái Nguyên. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển kit chẩn đoán với độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn, cũng như khả năng phát hiện các chủng virus Gumboro biến chủng. Ngoài ra, cần có các giải pháp để giảm chi phí chẩn đoán và tăng cường khả năng tiếp cận của người chăn nuôi với các dịch vụ chẩn đoán bệnh Gumboro.

6.1. Tóm Tắt Kết Quả Nghiên Cứu Về Kit Chẩn Đoán Gumboro

Nghiên cứu đã thành công trong việc thử nghiệm kit chẩn đoán bệnh Gumboro trên đàn gà nuôi tại Thái Nguyên, xác định các điều kiện sản xuất kit ELISA và đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kit. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển kit chẩn đoán Gumboro hiệu quả và ứng dụng trong thực tế.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Và Phát Triển Kit Chẩn Đoán Gumboro Trong Tương Lai

Trong tương lai, cần tập trung vào việc nghiên cứu và phát triển kit chẩn đoán Gumboro với độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn, cũng như khả năng phát hiện các chủng virus Gumboro biến chủng. Ngoài ra, cần nghiên cứu các phương pháp chẩn đoán nhanh và đơn giản hơn, phù hợp với điều kiện thực tế tại các trang trại chăn nuôi.

6.3. Đề Xuất Giải Pháp Để Ứng Dụng Rộng Rãi Kit Chẩn Đoán Gumboro

Để ứng dụng rộng rãi kit chẩn đoán Gumboro, cần có các giải pháp để giảm chi phí chẩn đoán và tăng cường khả năng tiếp cận của người chăn nuôi với các dịch vụ chẩn đoán bệnh Gumboro. Các giải pháp có thể bao gồm việc sản xuất kit chẩn đoán trong nước, hỗ trợ chi phí chẩn đoán cho người chăn nuôi, và đào tạo nhân lực cho việc chẩn đoán bệnh Gumboro.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Ngành chăn nuôi gà tại Việt Nam đóng vai trò quan trọng thứ hai sau chăn nuôi lợn, hàng năm cung cấp khoảng 350.000 – 450.000 tấn thịt và hơn 2,5 – 3,5 tỷ quả trứng. Mặc dù công tác chọn tạo giống đã cải thiện đáng kể tốc độ tăng trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn và tỷ lệ thịt ngực, phương thức chăn nuôi nhìn chung vẫn còn nhỏ lẻ, phân tán, năng suất thịt xẻ bình quân chỉ đạt 4,5 – 5,4 kg/người/năm và 35 quả trứng/người/năm. Song hành với sự gia tăng về quy mô và mật độ nuôi là áp lực dịch bệnh truyền nhiễm, trong đó bệnh Gumboro (Infectious Bursal Disease - IBD) do virus thuộc họ Birnaviridae, serotype 1 gây ra là một trong những mối đe dọa nghiêm trọng nhất.

Virus Gumboro có đặc tính phá hủy túi Fabricius – cơ quan miễn dịch dịch thể trung ương ở gia cầm non, dẫn đến suy giảm miễn dịch nghiêm trọng. Gà từ 1 đến 12 tuần tuổi đều có thể nhiễm bệnh, trong đó mẫn cảm nhất là giai đoạn 3 đến 6 tuần tuổi. Ở thể cấp tính, tỷ lệ mắc trong đàn đạt 100%, tỷ lệ chết từ 10% đến 50%, thậm chí có thể lên tới 90% – 100% khi kế phát các bệnh truyền nhiễm khác. Đáng chú ý, virus có sức đề kháng rất cao với các yếu tố lý hóa ngoại cảnh, không thể điều trị bằng thuốc đặc hiệu mà chỉ có thể phòng ngừa bằng an toàn sinh học và vắc xin. Tuy nhiên, các nguồn vắc xin nhập ngoại đôi khi không hoàn toàn tương thích về mặt kháng nguyên với các biến chủng nội địa (tính tương đồng kháng nguyên thấp, khoảng 30%). Do đó, nhu cầu thiết lập một công cụ chẩn đoán nhanh, chính xác và có thể tự chủ trong nước là hết sức cấp thiết.

Khóa luận xác định các mục tiêu và nhiệm vụ cụ thể như sau:

1. Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu thành công KIT chẩn đoán nhanh bệnh Gumboro bằng kỹ thuật ELISA và đánh giá kết quả thông qua thử nghiệm ở quy mô phòng thí nghiệm.
2. Nội dung/nhiệm vụ nghiên cứu:
   • Chế tạo KIT chẩn đoán bệnh Gumboro.
   • Thử nghiệm đánh giá các chỉ tiêu kỹ thuật của KIT chẩn đoán bệnh Gumboro (độ pha loãng, thời gian ủ, thời gian rửa, độ nhạy, độ đặc hiệu, độ lặp lại).
   • Xác định điều kiện bảo quản KIT chẩn đoán bệnh Gumboro.
3. Đối tượng nghiên cứu: Chủng virus cường độc Gumboro phân lập từ đàn gà mắc bệnh tại tỉnh Thái Nguyên.
4. Phạm vi nghiên cứu:
   • Không gian: Thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Vi sinh – Viện Khoa học sự sống (Đại học Thái Nguyên) và Phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học (Viện Đại học Mở Hà Nội).
   • Thời gian: Từ ngày 03/07/2014 đến ngày 05/12/2014.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và tác nhân gây bệnh

• Tác nhân sinh học: Virus Gumboro (Infectious Bursal Disease Virus - IBDV) thuộc họ Birnaviridae. Virus có cấu trúc hình khối đa diện đối xứng đường kính khoảng 50 – 60 nm, không có vỏ bọc ngoài (dạng trần) nên đề kháng tốt với ether và chloroform, chịu được biên độ pH rộng từ 2 đến 11, bền với nhiệt độ (sống 5 giờ ở 56°C, tồn tại dai dẳng từ 54 – 122 ngày trong chuồng nuôi).
• Hệ gen và protein cấu trúc: Bộ gen gồm 2 phân đoạn ARN sợi đôi (phân đoạn A dài 3.261 nucleotide và phân đoạn B). Phân đoạn A chứa hai khung đọc mở (ORF): ORF nhỏ mã hóa protein không cấu trúc VP5 liên quan đến độc lực; ORF lớn mã hóa polyprotein 110 kDa được enzyme protease VP4 tự cắt thành các polypeptide pVP2 (tiền thân của VP2, 40 kDa) và VP3 (32 kDa). Phân đoạn B mã hóa protein VP1 (90 kDa) có hoạt tính enzyme RNA-polymerase phụ thuộc RNA (RdRp). Kháng nguyên đặc hiệu nhóm (Gs) do VP3 quy định, trong khi kháng nguyên đặc hiệu typ (Ts) nằm trên các quai bề mặt của VP2, đóng vai trò kích thích sinh kháng thể trung hòa.
• Phương pháp chẩn đoán đối chiếu: Nghiên cứu tổng quan các kỹ thuật truyền thống và phân tử gồm: chẩn đoán lâm sàng; mổ khám bệnh tích đại thể (xuất huyết cơ đùi, ngực, ranh giới dạ dày tuyến và dạ dày cơ, túi Fabricius sưng to, xuất huyết rồi teo nhỏ sau ngày thứ 5); chẩn đoán virus học qua tiêm phôi gà 9 – 10 ngày tuổi; phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch (AGP); phản ứng trung hòa virus (VN); que nhúng miễn dịch (Dipstick) và kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi P1 (5'-CCC AGA GTC TAC ACC ATA-3') và P2 (5'-TCC TGT TGC CAC TCT TTC-3') khuếch đại đoạn gen VP2 dài 474 cặp base (vị trí 703 đến 1176).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Nghiên cứu áp dụng quy trình thực nghiệm sinh học và hóa miễn dịch gồm các bước chính:

1. Hoạt hóa virus: Pha loãng giống virus ở nồng độ $10^{-1}$, tiêm vào xoang niệu mô của phôi trứng gà 9 ngày tuổi với liều lượng 0,2 ml/quả, ấp ở 37°C. Theo dõi phôi chết trong khoảng 24 – 96 giờ có bệnh tích xuất huyết đầu và chân; phôi chết trước 24 giờ bị loại bỏ.
2. Tiếp truyền và thu nhận kháng nguyên: Sử dụng giống virus pha loãng nồng độ $10^{-3}$, tiêm vào xoang niệu cho 20 phôi gà 9 – 10 ngày tuổi với liều 0,1 ml/phôi, ấp ở 37°C trong 120 giờ. Thu dịch niệu mô từ những phôi chết trong thời gian 72 giờ có bệnh tích điển hình.
3. Chế kháng nguyên hòa tan bằng phương pháp đông tan lặp lại: Dịch virus sau khi thu nhận được đưa vào bình nitơ lỏng (-196°C) trong 6 giờ, sau đó chuyển sang bể ổn nhiệt 40°C trong 2 giờ. Chu kỳ đông - tan này được lặp lại 5 lần liên tiếp. Kháng nguyên sau đó được định lượng protein tổng số và bảo quản ở tủ lạnh sâu -20°C.
4. Gây miễn dịch thực nghiệm trên gà để tạo kháng thể: Thí nghiệm chia thành 2 lô, mỗi lô 5 con gà 21 ngày tuổi chưa tiêm vắc xin Gumboro và có kết quả kiểm tra phản ứng AGP âm tính:
   • Lô I (đối chứng): Không tiêm virus Gumboro.
   • Lô II (thí nghiệm): Tiêm virus Gumboro với liều 0,2 ml/con, sau 15 ngày tiến hành tiêm nhắc lại lần 2. Định kỳ hàng tuần thu máu tĩnh mạch cánh hoặc máu tim (1 ml/lần), để đông, giữ mát 4°C trong 30 phút, để nhiệt độ phòng 30 phút, sau đó ly tâm 3.000 vòng/phút trong 5 phút để tách huyết thanh bảo quản ở -20°C.
5. Quy trình kỹ thuật ELISA gián tiếp (Indirect ELISA):
   • Cố định kháng nguyên: Hút 200 µl dung dịch kháng nguyên đã pha loãng vào đĩa Costar 96 giếng đáy phẳng, ủ qua đêm ở 4°C hoặc 2 giờ ở 37°C. Rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch PBS chứa Tween 20 (PBST) và đập khô.
   • Chặn vị trí gắn không đặc hiệu (Blocking): Bổ sung 200 µl/giếng dung dịch PBS chứa 5% sữa tách bơ (casein), ủ 2 giờ ở nhiệt độ phòng hoặc 1 giờ ở 37°C có lắc, sau đó rửa 3 lần bằng PBST 0,05% và đập khô.
   • Ủ kháng thể sơ cấp: Pha loãng huyết thanh trong dung dịch PBS - sữa tách bơ 0,05%, bổ sung 100 µl/giếng, ủ ở 37°C trong 30 phút ở chế độ lắc. Hắt dung dịch, rửa đĩa 5 lần bằng PBST và đập khô.
   • Ủ cộng hợp enzyme (Conjugate): Bổ sung 100 µl/giếng kháng thể thứ cấp gắn enzyme peroxidase (anti-bovine IgG:HRPO) pha loãng tỷ lệ 1:5.000 hoặc 1:10.000 bằng PBS, ủ ở 37°C trong 30 phút, sau đó rửa 6 lần bằng PBST 0,05% và đập khô.
   • Phản ứng tạo màu và đọc kết quả: Thêm 100 µl/giếng cơ chất TMBZ ($3,3',5,5'$-Tetramethylbenzidine), để ở nhiệt độ phòng 15 phút đến khi dung dịch chuyển màu xanh lục, dừng phản ứng bằng dung dịch $\text{H}_2\text{SO}_4$ (0,1 – 2 M) làm dung dịch chuyển sang màu vàng. Đo mật độ quang học (OD) trên máy đọc đĩa ELISA ở bước sóng 450 nm.
6. Phương pháp bố trí thí nghiệm tối ưu hóa: Thiết lập các sơ đồ đĩa ELISA 96 giếng khảo sát các yếu tố ảnh hưởng gồm: độ pha loãng huyết thanh (1/100, 1/200, 1/400, 1/800, 1/1600); thời gian rửa kháng thể (1 phút, 2 phút, 3 phút); thời gian ủ conjugate (30 phút, 45 phút, 60 phút); thời gian rửa conjugate; xác định độ lặp lại và kiểm tra độ ổn định nhiệt độ theo thời gian.

---

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu

Tác giả phân tích vị trí của ngành chăn nuôi gà tại Việt Nam (cung cấp 350 – 450 nghìn tấn thịt, 2,5 – 3,5 tỷ quả trứng/năm) gắn liền với thách thức về dịch bệnh trong chăn nuôi tập trung. Trọng tâm là bệnh Gumboro với đặc trưng lây lan nhanh, phá hủy túi Fabricius, làm suy giảm miễn dịch với tỷ lệ mắc 100% và tỷ lệ chết từ 10% đến 50%. Phần này xác định mục tiêu chế tạo KIT chẩn đoán nhanh bằng ELISA gián tiếp, nêu rõ ý nghĩa khoa học trong việc cung cấp thông số kỹ thuật sản xuất KIT và ý nghĩa thực tiễn giúp phát hiện sớm dịch bệnh, hạn chế rủi ro cho người chăn nuôi.

Phần 2: Tổng quan nghiên cứu

Chương tổng quan hệ thống hóa các tư liệu khoa học về bệnh Gumboro và phương pháp ELISA:

• Đặc điểm virus: Phân loại thuộc họ Birnaviridae, cấu trúc hạt virus dạng trần 50 – 60 nm, gồm 2 đoạn ARN sợi đôi mã hóa các protein cấu trúc VP1, VP2, VP3, VP4, VP5; phân tích vai trò của kháng nguyên nhóm Gs và kháng nguyên đặc hiệu typ Ts.
• Cơ chế sinh bệnh và bệnh tích: Virus xâm nhập qua niêm mạc, sau 16 – 18 giờ đến túi Fabricius tấn công tế bào lympho B, gây nhiễm trùng máu lần 2 sau 48 – 96 giờ, hình thành phức hợp miễn dịch dẫn đến xuất huyết cơ đùi, ngực, dạ dày tuyến và teo túi Fabricius chỉ còn 1/3 kích thước vào ngày thứ 8.
• Phương pháp chẩn đoán: Phân tích ưu nhược điểm của các phương pháp lâm sàng, giải phẫu, tiêm phôi gà 9 – 10 ngày tuổi, phản ứng AGP, phản ứng trung hòa, PCR khuếch đại gen VP2 (474 bp) và phương pháp que nhúng Dipstick.
• Nguyên lý và kỹ thuật ELISA: Khái quát lịch sử phát triển từ kỹ thuật RIA (Yalow, 1960) sang ELISA (Engvall & Perlman; Van Weemen & Schuurs, 1971), phân loại các dạng ELISA (trực tiếp, gián tiếp, sandwich, cạnh tranh) và chỉ ra các yếu tố gây nhiễu kết quả phản ứng.
• Tình hình nghiên cứu: Điểm lại các mốc lịch sử từ khi phát hiện bệnh tại Gumboro (Mỹ, 1957) đến các công bố của OIE (1992); tại Việt Nam, bệnh được ghi nhận từ 1981 (vụ dịch tại Trại gà Quân khu V làm chết 6.460 con gà, tỷ lệ chết 27%), tỷ lệ lưu hành tại một số vùng lên đến 56,98%, thúc đẩy nghiên cứu sản xuất kit chẩn đoán nội địa.

Phần 3: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Trình bày cụ thể đối tượng nghiên cứu là virus cường độc Gumboro phân lập tại Thái Nguyên; địa điểm thực hiện tại Viện Khoa học sự sống (Đại học Thái Nguyên) và Viện Đại học Mở Hà Nội từ tháng 7 đến tháng 12 năm 2014. Mô tả chi tiết trang thiết bị (đĩa Costar 96 giếng, bình nitơ lỏng $-196^\circ\text{C}$, máy đọc ELISA 450 nm, máy ly tâm, tủ lạnh sâu $-20^\circ\text{C}$) và hóa chất sử dụng (PBS, Tween 20, sữa gầy, TMBZ, $\text{H}_2\text{SO}_4$). Chi tiết hóa các bước thực nghiệm: hoạt hóa trên phôi trứng gà 9 ngày tuổi (0,2 ml nồng độ $10^{-1}$), nhân giống trên 20 phôi gà 9 – 10 ngày tuổi (0,1 ml nồng độ $10^{-3}$), phương pháp đông tan 5 chu kỳ chế kháng nguyên hòa tan, gây miễn dịch trên 2 lô gà 21 ngày tuổi (mỗi lô 5 con, tiêm 0,2 ml, nhắc lại sau 15 ngày), thu nhận huyết thanh bằng ly tâm 3.000 vòng/phút và quy trình kỹ thuật ELISA gián tiếp kèm sơ đồ bố trí giếng thí nghiệm.

Phần 4: Kết quả và thảo luận

Theo danh mục các bảng và hình trong văn bản, kết quả thực nghiệm tập trung vào các nội dung tối ưu hóa và đánh giá:

• Xác định hàm lượng kháng nguyên và độ pha loãng kháng thể tối ưu: Thông qua tỷ số tín hiệu dương/âm (S/N) và giá trị $\text{OD}_{450}$ đo được tại các nồng độ kháng nguyên và nồng độ kháng thể khác nhau (Bảng 4.1, Bảng 4.4, Hình 4.16).
• Tối ưu hóa thời gian ủ và rửa: Đánh giá sự ảnh hưởng của thời gian ủ kháng thể (Bảng 4.2, Hình 4.14); thời gian ủ kháng thể đặc hiệu và anti-bovine IgG:HRPO (Bảng 4.3, Hình 4.15); thời gian rửa kháng thể ở các mốc 1 phút, 2 phút, 3 phút nhằm tránh hiện tượng liên kết không đặc hiệu/đốm màu (Bảng 4.5); thời gian ủ conjugate ở 30, 45, 60 phút (Bảng 4.6); và thời gian rửa conjugate thích hợp (Bảng 4.7).
• Đánh giá chỉ tiêu kỹ thuật của KIT ELISA: Đánh giá độ nhạy (Sensitivity - Se) và độ đặc hiệu (Specificity - Sp) của KIT (Bảng 4.8); xác định hệ số biến thiên để đánh giá mức độ lặp lại của phản ứng giữa các giếng và giữa các lần chạy (Bảng 4.9).
• Khảo sát độ ổn định và bảo quản: Theo dõi sự biến đổi độ nhạy và độ đặc hiệu dưới tác động của nhiệt độ và thời gian bảo quản KIT (Bảng 4.10).

Phần 5: Kết luận và đề nghị

Đưa ra kết luận khẳng định việc xây dựng thành công quy trình kỹ thuật và các thông số tối ưu cho KIT chẩn đoán ELISA gián tiếp bệnh Gumboro từ chủng virus thực địa tại Thái Nguyên. Đề xuất các khuyến nghị về việc hoàn thiện quy trình bảo quản và áp dụng thử nghiệm trên diện rộng.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả kỹ thuật thực nghiệm

Nghiên cứu đã xác lập các bước và thông số kỹ thuật thực nghiệm chế tạo KIT ELISA gián tiếp chẩn đoán bệnh Gumboro:

Bước quy trình	Thông số kỹ thuật / Điều kiện thực hiện	Mục đích / Ghi chú
Hoạt hóa virus	Phôi trứng 9 ngày tuổi, liều 0,2 ml nồng độ $10^{-1}$, ấp $37^\circ\text{C}$	Chọn lọc phôi chết từ 24 – 96 giờ có bệnh tích xuất huyết
Nhân giống kháng nguyên	20 phôi gà 9 – 10 ngày tuổi, liều 0,1 ml nồng độ $10^{-3}$, ấp $37^\circ\text{C}$/120h	Thu dịch niệu mô các phôi chết trong 72 giờ
Chế kháng nguyên hòa tan	Đông tan 5 chu kỳ: Nitơ lỏng ($-196^\circ\text{C}$, 6h) $\rightarrow$ Ổn nhiệt ($40^\circ\text{C}$, 2h)	Phá vỡ cấu trúc giải phóng protein kháng nguyên, trữ $-20^\circ\text{C}$
Tạo kháng thể chuẩn	Gà 21 ngày tuổi (AGP âm tính), tiêm 0,2 ml virus, nhắc lại sau 15 ngày	Thu huyết thanh bằng ly tâm 3.000 vòng/phút trong 5 phút
Cố định kháng nguyên	Dung dịch đệm gắn, $200,\mu\text{l}$/giếng, đĩa Costar 96 giếng	Ủ qua đêm ở $4^\circ\text{C}$ hoặc 2 giờ ở $37^\circ\text{C}$, rửa PBST 3 lần
Chặn bề mặt (Blocking)	PBS chứa 5% sữa tách bơ, $200,\mu\text{l}$/giếng	Ủ 2 giờ ở nhiệt độ phòng hoặc 1 giờ ở $37^\circ\text{C}$ có lắc
Phản ứng kháng thể	Huyết thanh pha loãng PBS - sữa 0,05%, $100,\mu\text{l}$/giếng	Khảo sát độ pha loãng 1/100 đến 1/1600, ủ $37^\circ\text{C}$/30 phút
Ủ Conjugate	Anti-bovine IgG:HRPO pha loãng 1:5.000 – 1:10.000, $100,\mu\text{l}$/giếng	Khảo sát các mốc thời gian ủ 30, 45, 60 phút ở $37^\circ\text{C}$
Phản ứng sinh màu & Đọc	Cơ chất TMBZ ($100,\mu\text{l}$/giếng, 15 phút) $\rightarrow$ Dừng bằng $\text{H}_2\text{SO}_4$	Đo giá trị $\text{OD}_{450}$ trên máy đọc quang phổ đĩa ELISA

Khóa luận đã hoàn thành việc khảo sát và đo đạc các chỉ tiêu kỹ thuật bao gồm: tỷ số S/N để xác định nồng độ kháng nguyên và kháng thể tối ưu; thời gian rửa kháng thể (khảo sát ở 1, 2 và 3 phút) nhằm khắc phục hiện tượng liên kết không đặc hiệu; xác định thời gian gắn conjugate; xác lập độ nhạy (Se), độ đặc hiệu (Sp), độ lặp lại và sự ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến chất lượng KIT.

Đóng góp của đề tài

• Đóng góp khoa học: Xác lập hệ thống dữ liệu thực nghiệm về điều kiện chế tạo, thông số gắn kết kháng nguyên - kháng thể và các mốc thời gian tối ưu hóa phản ứng ELISA gián tiếp đối với chủng virus Gumboro cường độc phân lập trực tiếp tại Thái Nguyên.
• Đóng góp thực tiễn: Đặt cơ sở kỹ thuật cho việc tự chủ sản xuất bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh bệnh Gumboro trong nước, giảm phụ thuộc vào các bộ kit nhập ngoại, hỗ trợ phát hiện sớm ổ dịch và đánh giá đáp ứng miễn dịch của đàn gà sau tiêm vắc xin.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế:
  • Nghiên cứu mới dừng lại ở quy mô thử nghiệm trong điều kiện phòng thí nghiệm (tại Viện Khoa học sự sống và Viện Đại học Mở Hà Nội).
  • Quy mô động vật thực nghiệm để tạo kháng thể và kiểm tra ban đầu còn giới hạn (2 lô, mỗi lô 5 con gà 21 ngày tuổi).
  • Thời gian thực hiện đề tài diễn ra trong khoảng thời gian ngắn (từ tháng 7/2014 đến tháng 12/2014), nguồn mẫu virus cường độc chỉ thu thập cục bộ trên địa bàn tỉnh Thái Nguyên.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Mở rộng thử nghiệm kiểm chứng độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ KIT trên các mẫu huyết thanh thu thập thực địa từ các trang trại chăn nuôi gà quy mô công nghiệp tại nhiều địa phương khác nhau.
  • Tiếp tục theo dõi hạn dùng và độ bền sinh học của KIT khi bảo quản trong thời gian dài hơn ở các dải nhiệt độ khác nhau (nhiệt độ phòng, $4^\circ\text{C}$, $-20^\circ\text{C}$).

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là nguồn tài liệu tham khảo chuyên khảo dành cho:

• Đối tượng: Sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Chăn nuôi - Thú y, Công nghệ sinh học động vật, Bệnh học thú y và Vi sinh vật học.
• Nội dung giá trị:
  • Quy trình chi tiết về kỹ thuật hoạt hóa, tiếp truyền và thu nhận virus Gumboro trên phôi trứng gà 9 – 10 ngày tuổi.
  • Phương pháp phá hủy màng tế bào giải phóng kháng nguyên hòa tan bằng chu kỳ đông tan lặp lại sử dụng nitơ lỏng ($-196^\circ\text{C}$) và bể ổn nhiệt ($40^\circ\text{C}$).
  • Cách thức bố trí sơ đồ giếng trên đĩa ELISA 96 giếng để chuẩn hóa các điều kiện nồng độ, thời gian ủ và thời gian rửa trong phản ứng miễn dịch liên kết enzyme gián tiếp.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Virus Gumboro thuộc họ nào và có đặc điểm cấu trúc phân tử như thế nào?

Theo tổng quan của tác giả, virus Gumboro thuộc họ Birnaviridae, là loại virus trần (không có vỏ bọc ngoài), kích thước 50 – 60 nm, mang cấu trúc đối xứng 32 capsome hợp thành từ 5 loại protein (VP1, VP2, VP3, VP4, VP5). Hệ gen của virus gồm 2 phân đoạn ARN sợi đôi: phân đoạn A (3.261 nucleotide) mã hóa polyprotein tự xúc tác tạo ra VP2, VP3, VP4 và protein không cấu trúc VP5; phân đoạn B mã hóa protein VP1 có hoạt tính RNA-polymerase (RdRp).

2. Phương pháp chế kháng nguyên hòa tan trong khóa luận được thực hiện bằng kỹ thuật gì?

Kháng nguyên hòa tan được điều chế bằng phương pháp đông tan lặp lại 5 chu kỳ liên tiếp: virus sau khi thu hoạch từ dịch niệu mô phôi trứng được làm đông lạnh trong bình nitơ lỏng ($-196^\circ\text{C}$) trong 6 giờ, sau đó rã đông trong bể ổn nhiệt ở $40^\circ\text{C}$ trong 2 giờ. Sau 5 chu kỳ, dung dịch được xác định hàm lượng protein tổng số và bảo quản ở $-20^\circ\text{C}$.

3. Thí nghiệm gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể trên gà được bố trí ra sao?

Thí nghiệm sử dụng gà 21 ngày tuổi chưa tiêm phòng vắc xin Gumboro và có phản ứng AGP âm tính, chia làm 2 lô (mỗi lô 5 con). Lô I là đối chứng không tiêm. Lô II được tiêm virus Gumboro với liều 0,2 ml/con và tiêm nhắc lại sau 15 ngày. Định kỳ mỗi tuần lấy 1 ml máu cánh hoặc máu tim, ủ mát, để phòng rồi ly tâm 3.000 vòng/phút trong 5 phút để thu huyết thanh.

4. Phản ứng ELISA gián tiếp trong nghiên cứu sử dụng loại đĩa, cơ chất tạo màu và bước sóng đo quang nào?

Nghiên cứu sử dụng đĩa nhựa polypropylene 96 giếng đáy phẳng Costar, dung dịch ngăn bề mặt là PBS chứa 5% sữa tách bơ, chất tạo màu là cơ chất TMBZ ($3,3',5,5'$-Tetramethylbenzidine), dừng phản ứng bằng dung dịch axit $\text{H}_2\text{SO}_4$ (0,1 – 2 M) và đọc mật độ quang trên máy đo quang phổ ELISA ở bước sóng 450 nm.

5. Cặp mồi PCR nào được tác giả tổng quan dùng để phát hiện gen đặc hiệu của virus Gumboro?

Trong phần tổng quan phương pháp sinh học phân tử, tác giả giới thiệu cặp mồi đặc hiệu khuếch đại gen tổng hợp protein VP2 gồm:

• Mồi P1: 5'-CCC AGA GTC TAC ACC ATA-3' (18 base)
• Mồi P2: 5'-TCC TGT TGC CAC TCT TTC-3' (18 base) Phản ứng dương tính cho kích thước đoạn gen khuếch đại là 474 cặp base, tương ứng vị trí 703 đến 1176 trên hệ gen của virus Gumboro.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Thị Kiều Trang đã nghiên cứu thành công quy trình thực nghiệm chế tạo KIT ELISA gián tiếp chẩn đoán bệnh Gumboro từ nguồn virus cường độc phân lập tại Thái Nguyên. Đề tài đã thiết lập đầy đủ các thông số kỹ thuật tối ưu về nồng độ kháng nguyên, độ pha loãng kháng thể, thời gian ủ và thời gian rửa conjugate trên đĩa phản ứng 96 giếng. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học và thực tiễn quan trọng, mở ra khả năng tự chủ công nghệ sản xuất sinh phẩm chẩn đoán bệnh thú y tại địa phương.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Chăn nuôi gà là nghề sản xuất truyền thống lâu đời và chiếm vị trí quan trọng thứ hai sau chăn nuôi lợn trong ngành chăn nuôi của Việt Nam, hằng năm cung cấp khoảng 350 - 450 nghìn tấn thịt và hơn 2,5 - 3,5 tỷ quả trứng. Tuy nhiên, chăn nuôi gà ở nuớc ta vẫn còn trong tình trạng sản xuất nhỏ, phân tán, năng suất thấp, dịch bệnh nhiều, sản phẩm hàng hoá còn nhỏ. Bình quân sản lượng thịt xẻ, trứng chỉ đạt 4,5 - 5,4 kg/nguời/năm và 35 trứng/ nguời/ năm. Trong vài thập kỷ qua, mặc dù công tác chọn giống đã cải thiện một cách đáng kể thành tích sản xuất chăn nuôi gà như tăng trưởng nhanh, hiệu quả sử dụng thức ăn cao, khả năng sản xuất thịt tốt, tỷ lệ thịt ngực cao hơn nhưng sự tăng nhanh về năng suất sản xuất đã đi cùng với việc tăng dịch bệnh, dẫn đến gà bị mắc nhiều bệnh về rối loạn chuyển hóa và mắc nhiều bệnh truyền nhiễm, tỷ lệ chết cao.

Trong đó có thể kể đến bệnh Gumboro do một lọai virus thuộc họ Birnaviridae, serotype 1, chúng có khả năng phá huỷ túi Fabracius, do đó làm giảm khả năng miễn dịch của gà. Nhiều báo cáo khoa học đã cho biết gà ở giai đọan từ 1 - 12 tuần tuổi, nhất là ở giai đọan 3 - 6 tuần tuổi đều có khả năng mắc bệnh. Gà nhỏ hơn 3 tuần tuổi mắc bệnh không biểu hiện triệu chứng nhưng sẽ làm gà suy giảm miễn dịch. Tỷ lệ mắc bệnh là 100%, tỷ lệ chết từ 10 – 50% hoặc cao hơn nếu kết hợp với các bệnh khác.

Do tính chất gây bệnh đặc trưng của virus là lây lan rất nhanh và không thể kiểm soát bằng hóa chất hay bất kỳ phương thuốc nào mà chỉ có thể khắc phục bằng biện pháp phòng trừ. Vì vậy thiệt hại do bệnh Gumboro gây ra là 2 rất đáng kể đối với chăn nuôi gà của các nước lớn trên thế giới nói chung và của Việt Nam nói riêng. Cùng với sự phát triền vượt bậc của công nghệ sinh học, các kỹ thuật phân tử trong chẩn đoán bệnh ngày nay có thể giúp ta chẩn đoán nhanh, sớm một cách chính xác nhiều bệnh do virus. Khởi phát từ các vấn đề nêu trên, được sự nhất trí của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Chăn nuôi Thú y - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, em đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu thử nghiệm KIT chẩn đoán bệnh Gumboro trên đàn gà nuôi tại Thái Nguyên” 1.

Mục tiêu của đề tài Nghiên cứu thành công KIT chẩn đoán nhanh bệnh Gumboro và đánh giá kết quả thông qua thử nghiệm với quy mô trong phòng thí nghiệm. Ý nghĩa của đề tài 1. Ý nghĩa khoa học Kết quả của đề tài cung cấp những thông tin khoa học về điều kiện sản xuất KIT và các thông số kỹ thuật ứng dụng để sản xuất KIT chẩn đoán bệnh Gumboro. Ý nghĩa trong thực tiễn Tạo được KIT chẩn đoán nhanh bệnh Gumboro ứng dụng trong thực tế góp phần chẩn đoán sớm và điều trị kịp thời, giảm thiệt hại tới mức tối đa cho người chăn nuôi.

3 Phần 2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2. Cơ sở khoa học 2. Tổng quan về bệnh Gumboro Bệnh Gumboro là một bệnh truyền nhiễm cấp tính ở gà, nhưng chủ yếu là gà từ 3 - 6 tuần tuổi và gà tây (Hitchner, S. Bệnh do một loại virus tác động vào túi fabricius gây suy giảm miễn dịch ở gà, khiến cho gà dễ bị mắc các chứng như viêm da hoại tử, hội chứng thiếu máu - viêm gan thể bao hàm, bệnh do E.

coli và khả năng sản sinh đáp ứng miễn dịch kém sau khi sử dụng các loại vắc xin. Phân loại Theo Dobos, P (1979) [13], virus Gumboro thuộc họ Birnaviridae. Họ này gồm có 3 giống: giống Apubirnavirus gây bệnh hoại tử tuyến tụy cho cá, loài giáp xác; trong đó có IBDV gây bệnh cho gà; giống Entomobirnairus, trong đó có virus Drosophia X gây bệnh cho côn trùng (Mac Donald, R. Các virus thuộc họ này đều đặc trưng bởi cấu tạo nhân gồm 2 đoạn ARN sợi đôi vì vậy tên gọi của họ virus là Birnavirus (Bottcher, B.

Trước đây, do hình thái và cấu trúc của virus chưa được nghiên cứu đầy đủ nên IBDV đã từng được xếp vào họ Picornaviridae hoặc Reoviridae. Đặc điểm hình thái, cấu trúc của virus Gumboro Virus Gumboro hay còn gọi là virus gây viêm túi truyền nhiễm (Infectious bursal disease virus - IBDV). Virus Gumboro là một lọai virus dạng trần, không có vỏ bọc bên ngoài, kích thước khoảng 50 – 60 nm có hình khối đa diện, nhiều góc cạnh trông giống như tổ ong xếp đều đặn cạnh nhau, gồm 2 chuỗi RNA quấn chéo nhau, vỏ capsid bao bọc bên ngoài vỏ này chứa thành phần kháng nguyên của virus không có vỏ bọc bên ngoài nên nó đề kháng với việc sát trùng (Delmas, B và cs, 2004) [12]. Gelderblom, 1985) [34] cấu trúc virus đơn giản nhưng hoàn thiện vì thế nó có khả năng chống chịu lại sự tác động bất lợi của môi trường.

Mặt khác do kích thước nhỏ bé và cấu trúc linh hoạt (hệ gen rất đơn giản), virus thích ứng xâm nhập và truyền lây trong quần thể vật chủ một cách nhanh chóng và dễ dàng thoát khỏi miễn dịch tự nhiên của cơ thể.1: Hình thái của virus Gumboro Virus Gumboro có cấu tạo đối xứng, quanh nhân là vỏ capsid (vỏ protein). Lớp vỏ capsid này được hợp thành bởi 32 capsome (đơn vị hình thái). Capsid của virus là lớp vỏ protein đơn lớp. Virus không có vỏ bọc ngoài cùng mà thông thường lớp vỏ đó là lipoproterin nên nhạy cảm với formalin không nhạy cảm với ether và chloroform.

Mỗi capsome được tạo bởi 5 loại protein cấu trúc khác nhau: VP1, VP2, VP3, VP4 và VP5 (Viral Protein-VP). Về mặt di truyền học cách sắp xếp các nucleotid trong acid ribonucleic của virus Gumboro cuộn lại tạo thành sợi đôi và phân đoạn. Đây chính là tính đặc trưng của virus RNA, người ta xếp nó vào họ Birnaviridae là mới nhất trong hệ thống phân loại virus trong động vật và người Lukert, P.2: Cấu trúc phân tử virus Gumboro 5 Dobos, P. và cs (1979) [14] virus Gumboro có hệ gen chứa hai sợi RNA, đó là hai phân đoạn phân biệt gọi là phân đoạn A và B.

Phân đoạn A có độ dài 3261 nucleotid chứa hai khung đọc mở thành phần (overlapping open reading frame – ORF). ORF nhỏ sẽ mã hóa cho protein không cấu trúc VP5 không cần thiết cho quá trình sao chép virus invitro nhưng lại quan trọng đối với khả năng gây bệnh của virus (Hudson, P. ORF lớn mã hóa cho một polyprotein 110 kDa, tự xúc tác hình thành ba loại polypeptide: pVP2 (48 kDa), VP3 (32kDa), và VP4 (28 kDa) (Mundt, E. VP4, một loại enzyme protease phân cắt serine-lysine VP2 sẽ được tách thêm những RNA dư thừa tại những Carbon cuối cùng để trở thành VP2 (40kDa) VP2 và VP3 là những protein cấu trúc.

Trong đó, VP2 chứa những vị trí kháng nguyên quan trọng và hệ thống miễn dịch (Kibenge, F. Polypeptide này thực hiện dưới dạng virus nghỉ ở ngoài tế bào chủ (virion), mang bản chất của một protein tự do và của một protein liên kết genome (còn đươc gọi là VPg). VPg được cố định vào đuôi 5’ của sợi dương của hai mạch trong genome. VP1 có hoạt tính sinh học chịu trách nhiệm là enzyme RNA-polymerase (xúc tác quá trình tổng hợp RNA) của virus.3: Hệ gen của virus Gumboro 6 Theo Pan, J.

Loại này khi kết hợp với kháng thể đặc hiệu tạo nên phản ứng kết tủa, vì thế có thể làm phản ứng kết tủa khuyếch tán trong thạch (AGP) dùng để phát hiện cả kháng nguyên và kháng thể. + Loại thứ hai có tính kháng nguyên kích thích cơ thể sản sinh kháng thể trung hòa (Neutralizating antibody) được gọi là kháng nguyên đặc hiệu typ, ký hiệu Ts (Type-Secific) (thực chất của kháng nguyên này là vỏ VP2). Loại kháng nguyên này khi kết hợp với kháng thể đặc hiệu sẽ tạo nên phản ứng trung hòa virus VN. Phản ứng này vừa được dùng để định tính vừa được dùng để định lượng kháng thể đặc hiệu trong chẩn đoán và kiểm tra miễn dịch của bệnh Gumboro.

Hai loại protein Gs và Ts đan chéo vào nhau tạo nên các lớp vỏ protein bọc lấy nhân virus, trong đó Ts có xu hướng nổi lên trên bề mặt hơn, các lớp protein nối nhau, các gai, móc, các receptor thụ thể nằm ngoài cùng của bề mặt virus hay các epitop liên tục hơn. Còn Gs protein thường nằm sâu hơn xen kẽ vào các protein cấu trúc khác, gắn chặt với lớp protein liên kết với acid nucleic của nhân virus, các epitop gián đoạn. Ts protein là một phức hợp protein kết hợp trong đó có protein quyết định tính gây bệnh của virus. Ts kháng nguyên có vai trò lớn trong miễn dịch học và và quyết định tính đặc hiệu theo typ huyết thanh học, có thể giám định, phân biệt virus thuộc các họ, nhóm và typ khác nhau, thậm chí trong cùng một phân typ huyết thanh.

Gs kháng nguyên trong quá trình tạo nguyên liệu thực hiện quá trình nhân lên và gây bệnh, chúng được sản xuất rất nhiều và giải phóng ra khỏi tế bào. Gs protein quyết định tính đặc hiệu trong cùng một huyết thanh học. Trong quá trình nhân lên của virus, cả hai kháng nguyên Gs và Ts đều được sản xuất như nhau, khi có đáp ứng miễn dịch kháng thể do chúng kích 7 thích sản sinh ra cũng có quan hệ tỷ lệ thuận với nhau. Kháng thể kết tủa có sớm hơn kháng thể trung hòa.

Tính chất nuôi cấy Theo Benton, W. Virus gây chết phôi sau 3 – 5 ngày. Bệnh tích đặc trưng: màng nhung niệu xung huyết, sưng dầy lền, phôi còi cọc, xuất huyết dưới da, gan xuất huyết và hoại tử, lách nhạt màu và có các điểm hoại tử., và cs (1967) [24] cho biết nuôi cấy trên môi trường tế bào phôi gà, gà tây, vịt, thận thỏ, thận khỉ nhưng virus không thích ứng ngay trong lần nuôi cấy đầu tiên và phải qua vài lần cấy chuyển mù (blind passage) các chủng phân lập từ gà: 2 – 3 lần; các chủng phân lập từ gà tây: 3 – 10 lần. Nếu cấy chuyển tiếp đời nhiều lần trên môi trường tế bào tổ chức thì độc lực của virus giảm dần, có thể sử dụng làm vắc xin (McFerran và cs, 1980) [30].

Nuôi cấy trên động vật sống: gà 3 – 6 tuẩn tuổi, bằng cách nhỏ mắt, nhỏ mũi hoặc nhỏ vào hậu môn. Sau 2 – 3 ngày gà có các triệu chứng, bệnh tích như ngoài tự nhiên. Sức đề kháng Theo Lukert, P. Saif (1997) [26] cho biết virus Gumboro có sức đề kháng cao với điều kiện tự nhiên và các yếu tố lý hóa học.