Giới thiệu dự án

Bối cảnh ngành và thực trạng dịch bệnh

Ngành chăn nuôi gia cầm tại Việt Nam giữ vị trí chiến lược trong cơ cấu nông nghiệp, hàng năm cung cấp khoảng 350.000 – 450.000 tấn thịt xẻ và từ 2,5 – 3,5 tỷ quả trứng thương phẩm. Tuy nhiên, phương thức chăn nuôi nông hộ nhỏ lẻ, phân tán chiếm tỷ trọng lớn khiến dịch tễ vùng luôn diễn biến phức tạp. Trong số các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, bệnh Gumboro (Infectious Bursal Disease - IBD) do virus thuộc họ Birnaviridae, Serotype 1 gây ra là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng. Virus tấn công và phá hủy trực tiếp tế bào lympho B non tại túi Fabricius – cơ quan miễn dịch dịch thể trung tâm của gia cầm từ 3 – 6 tuần tuổi.

       [Virus IBDV Xâm Nhập (Đường Tiêu Hóa / Niêm Mạc)]
[Suy Giảm Miễn Dịch Nặng]          [Nhiễm Trùng Máu & Xuất Huyết]
(Thất bại vaccine Newcastle, IB)   (Tỷ lệ chết 20% - 50%, sốt 43°C)

Vấn đề nghiên cứu và các điểm nghẽn kỹ thuật (Problem Statement)

Thực trạng chẩn đoán bệnh Gumboro tại các vùng chăn nuôi trọng điểm như Thái Nguyên gặp nhiều rào cản kỹ thuật:

  • Khó phân biệt lâm sàng: Bệnh tích xuất huyết cơ đùi, ngực và hoại tử dạ dày tuyến dễ nhầm lẫn với bệnh Newcastle thể độc lực cao, viêm phế quản truyền nhiễm (Infectious Bronchitis - IB) thể thận hoặc ngộ độc độc tố nấm mốc Aflatoxin B1.
  • Hạn chế của phương pháp truyền thống: Kỹ thuật kết tủa khuếch tán trên thạch (Agar Gel Precipitation - AGP) có độ nhạy thấp ($Se < 75%$), thời gian đọc kết quả kéo dài từ 24 – 48 giờ. Kỹ thuật sinh học phân tử RT-PCR đạt độ chính xác cao nhưng đòi hỏi thiết bị đắt tiền, hóa chất tinh sạch cao và nhân lực chuyên sâu, không khả thi để sàng lọc quy mô lớn tại hiện trường.
  • Chi phí kit thương mại nhập ngoại: Các bộ kit ELISA ngoại nhập (IDEXX, Synbiotics) có giá thành cao (15 – 20 triệu VNĐ/kit 480 test), chưa được tối ưu hóa với các biến chủng virus IBDV thực địa lưu hành tại Việt Nam.

Mục tiêu dự án

  1. Phân lập, tăng sinh và tinh sạch kháng nguyên virus Gumboro cường độc từ đàn gà mắc bệnh tại tỉnh Thái Nguyên trên phôi trứng gà 9 – 10 ngày tuổi.
  2. Chuẩn hóa quy trình sản xuất bộ KIT chẩn đoán ELISA gián tiếp (Indirect ELISA Kit) phát hiện kháng thể kháng virus Gumboro.
  3. Xác định bộ thông số kỹ thuật tối ưu: nồng độ kháng nguyên cố định, độ pha loãng huyết thanh, nồng độ kháng thể cộng hợp (Conjugate), thời gian ủ và rửa đĩa.
  4. Đánh giá kiểm chứng độ nhạy ($Se$), độ đặc hiệu ($Sp$), độ lặp lại ($CV$) và độ ổn định bảo quản của KIT ELISA tự chế tạo trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Giải pháp và kết quả kỳ vọng

Dự án phát triển quy trình sản xuất bộ KIT chẩn đoán ELISA gián tiếp dựa trên kháng nguyên hòa tan được xử lý bằng phương pháp sốc nhiệt đông - tan 5 chu kỳ ($-196^\circ\text{C} / +40^\circ\text{C}$). Giải pháp mang lại khả năng phát hiện định lượng kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh với độ nhạy dự kiến $> 95%$, độ đặc hiệu $> 90%$, hệ số biến thiên ($CV$) $< 10%$, đồng thời giảm thiểu giá thành sản xuất trên 60% so với kit thương mại.

Phạm vi và giới hạn

  • Phạm vi: Đàn gà nuôi tại các huyện trọng điểm thuộc tỉnh Thái Nguyên; thử nghiệm trên các mẫu huyết thanh chuẩn và mẫu bệnh phẩm thực địa.
  • Giới hạn kỹ thuật: Kit sử dụng kháng nguyên virus toàn phần bất hoạt, chưa phân tách biểu hiện protein tái tổ hợp tiểu phần (recombinant VP2); quy mô sản xuất dừng ở cấp độ phòng thí nghiệm (Laboratory-scale batch).

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Phương pháp Nguyên lý Độ nhạy ($Se$) Độ đặc hiệu ($Sp$) Thời gian Chi phí / Test Ưu điểm Nhược điểm
Mổ khám bệnh tích Đánh giá đại thể túi Fabricius, cơ đùi, dạ dày $60 - 70%$ $50 - 65%$ 30 phút Rất thấp Thực hiện tại chuồng, nhanh Dễ nhầm với Newcastle, IB, Aflatoxin B1
Khuếch tán thạch (AGP) Kết tủa miễn dịch kháng nguyên - kháng thể $70 - 75%$ $80 - 85%$ 24 - 48 giờ Thấp Thiết bị đơn giản Độ nhạy thấp, đọc định tính chủ quan
RT-PCR chuyên sâu Khuếch đại đoạn gen VP2 (474 bp) $> 98%$ $> 99%$ 4 - 6 giờ Rất cao Độ chính xác cao, phát hiện biến chủng Cần máy PCR, gel doc, kỹ thuật viên bậc cao
Kit ELISA nhập ngoại ELISA gián tiếp thương mại (IDEXX) $> 96%$ $> 95%$ 2 - 3 giờ Cao (35k - 45k VNĐ) Độ chuẩn hóa cao, tự động hóa Đắt, phụ thuộc nguồn cung, kháng nguyên ngoại lai
Kit ELISA nội địa hóa (Đề tài) Indirect ELISA chuẩn hóa từ chủng thực địa $> 95%$ $> 92%$ 2 - 2.5 giờ Thấp (10k - 12k VNĐ) Rẻ, tương đồng kháng nguyên thực địa cao Quy mô lô sản xuất phòng lab

Yêu cầu hệ thống theo mô hình MoSCoW

  • Must have: Độ nhạy $\ge 95%$; độ đặc hiệu $\ge 90%$; phát hiện hiệu giá kháng thể từ độ pha loãng $1:100$ đến $1:1600$; đọc tín hiệu tại bước sóng $\lambda = 450\text{ nm}$.
  • Should have: Thời gian thực hiện toàn bộ quy trình phản ứng $\le 150\text{ phút}$; hệ số biến thiên giữa các giếng ($CV_{intra-assay}$) $< 8%$.
  • Could have: Độ bền nhiệt bảo quản ở $4^\circ\text{C}$ đạt tối thiểu 6 tháng không suy giảm hoạt tính $> 10%$.
  • Won't have: Tích hợp phân biệt kháng thể do vaccine nhược độc và kháng thể do virus thực địa (DIVA capability).

Thiết kế hệ thống kỹ thuật

[Rửa PBST 0.05% loại liên kết không đặc hiệu]
[Kháng thể thứ cấp: Anti-chicken IgG:HRPO Conjugate]

Bảng thông số kỹ thuật và hóa chất chuẩn hóa

Thành phần Đặc tính kỹ thuật Nồng độ / Tỷ lệ tối ưu Vai trò chức năng
Microplate Đĩa 96 giếng đáy phẳng Costar (Polypropylene) Max Binding capacity Cố định kháng nguyên bề mặt rắn
Kháng nguyên (Ag) Virus Gumboro phân lập Thái Nguyên, phá vỡ vỏ $200\ \mu\text{L/giếng}$, Protein thô Nhận diện kháng thể đặc hiệu
Dung dịch Block Skimmed milk (Casein) pha trong PBS 1X $5%\ (\text{w/v})$ Chống bám không đặc hiệu
Kháng thể 1 (Ab) Kháng huyết thanh gà chuẩn độ Pha loãng $1:200 - 1:400$ Liên kết đặc hiệu kháng nguyên
Conjugate Anti-chicken/bovine IgG gắn Enzyme Peroxidase Pha loãng $1:5000 - 1:10000$ Phát tín hiệu xúc tác enzyme
Cơ chất (Substrate) TMB ($3,3',5,5'$-Tetramethylbenzidine) + $\text{H}_2\text{O}_2$ $100\ \mu\text{L/giếng}$, $15\text{ phút}$ Sinh màu quang phổ
Stop Solution Axit Sulfuric ($\text{H}_2\text{SO}_4$) $0.1\text{M} - 2\text{M}$ Dừng phản ứng, chuyển màu $\text{OD}_{450}$

Phương pháp luận triển khai (Methodology)

Dự án áp dụng mô hình phát triển tuyến tính nghiêm ngặt theo tiêu chuẩn phòng thí nghiệm vi sinh y tế (Stage-Gate Laboratory Workflow):

  • Giai đoạn 1 (Tháng 1 - 2): Tiếp truyền hoạt hóa virus trên phôi trứng gà SPF 9 ngày tuổi, tinh chế kháng nguyên hòa tan bằng chu trình đông tan.
  • Giai đoạn 2 (Tháng 3 - 4): Gây miễn dịch động vật mô hình (gà 21 ngày tuổi, kiểm tra AGP âm tính trước tiêm), thu nhận kháng huyết thanh dương tính chuẩn.
  • Giai đoạn 3 (Tháng 5): Tối ưu hóa điều kiện phản ứng ELISA (ma trận nồng độ kháng nguyên - kháng thể, thời gian ủ, chu kỳ rửa).
  • Giai đoạn 4 (Tháng 6): Thẩm định chỉ số phân tích ($Se$, $Sp$, $CV$, Shelf-life) và kiểm chứng chéo với phương pháp PCR.

Triển khai thực nghiệm và kết quả

Quy trình phát triển kỹ thuật

Thiết kế cặp mồi PCR đối chứng nhận diện gen VP2

Phản ứng PCR khuếch đại phân đoạn bảo tồn trên gen VP2 (kích thước 474 bp) thuộc hệ gen đoạn A của virus Gumboro (vị trí nucleotide 703 đến 1176):

  • Primer Forward (P1): 5'-CCC AGA GTC TAC ACC ATA-3' ($18\text{ mer}$)
  • Primer Reverse (P2): 5'-TCC TGT TGC CAC TCT TTC-3' ($18\text{ mer}$)

Thuật toán xử lý dữ liệu quang phổ ELISA ($\text{OD}_{450}$) và xác định ngưỡng Cutoff

import numpy as np

def evaluate_elisa_plate(od_matrix, blank_val, neg_controls, pos_controls):
    """
    Tính toán chỉ số quang phổ OD450, tỷ lệ S/N và phân loại kết quả chẩn đoán.
    """
    # 1. Hiệu chỉnh đường nền (Blank baseline correction)
    corrected_matrix = od_matrix - blank_val
    corrected_neg = np.array(neg_controls) - blank_val
    corrected_pos = np.array(pos_controls) - blank_val
    
    mean_neg = np.mean(corrected_neg)
    sd_neg = np.std(corrected_neg, ddof=1)
    mean_pos = np.mean(corrected_pos)
    
    # 2. Thiết lập giá trị ngưỡng (Cutoff threshold: Mean_Neg + 3*SD)
    cutoff_threshold = mean_neg + (3 * sd_neg)
    
    # 3. Phân loại mẫu (Sample Classification)
    results = {}
    for sample_id, od_val in corrected_matrix.items():
        sn_ratio = od_val / mean_neg if mean_neg > 0 else 0
        status = "POSITIVE" if od_val >= cutoff_threshold else "NEGATIVE"
        results[sample_id] = {
            "OD_corrected": round(od_val, 4),
            "SN_ratio": round(sn_ratio, 2),
            "Diagnostic": status
        }
        
    return cutoff_threshold, results

# Dữ liệu thực nghiệm mẫu
neg_wells = [0.082, 0.088, 0.085, 0.081]
pos_wells = [1.245, 1.280, 1.210, 1.265]
blank = 0.045

samples = {"Gà_01": 0.895, "Gà_02": 0.092, "Gà_03": 0.450}
cutoff, diag_results = evaluate_elisa_plate(samples, blank, neg_wells, pos_wells)

Thử nghiệm và chuẩn hóa thông số

1. Khảo sát thời gian ủ kháng thể và cộng hợp Conjugate

OD450 vs Thời gian ủ Kháng thể & Conjugate
  • Thời gian ủ kháng thể: 30 phút ở $37^\circ\text{C}$ đạt hiệu suất gắn kết $\ge 94%$ so với ủ 60 phút, tối ưu hóa thời gian thực hiện.
  • Thời gian ủ Conjugate: 30 – 45 phút ở $37^\circ\text{C}$ cho tín hiệu $\text{OD}_{450}$ cực đại ($1.25 \pm 0.04$), nền đối chứng âm duy trì ở mức tối thiểu ($0.08 \pm 0.01$).

2. Ảnh hưởng của thời gian rửa đĩa đến hiện tượng bám không đặc hiệu (Background Spotting)

Thời gian ngâm rửa Số lần rửa Hiện tượng đốm nền (Spotting) Giá trị $\text{OD}_{450}$ Đối chứng âm Độ chênh lệch tín hiệu (S/N)
1 phút 3 lần Xuất hiện đốm giả dương $0.165 \pm 0.021$ 5.2
2 phút 5 lần Đáy giếng sạch hoàn toàn $0.082 \pm 0.005$ 15.4 (Tối ưu)
3 phút 5 lần Sạch, suy giảm nhẹ tín hiệu dương $0.078 \pm 0.004$ 14.1

Kết quả đạt được

Chỉ số kiểm định chất lượng KIT ELISA:

Đổi mới và đóng góp khoa học

Đổi mới công nghệ

  1. Quy trình ly giải kháng nguyên siêu âm kết hợp sốc nhiệt đông - tan sâu: Sử dụng chu trình 5 lần làm lạnh trong Nitơ lỏng ($-196^\circ\text{C}$, 6 giờ) và phá vỡ cấu trúc tại bể ổn nhiệt ($+40^\circ\text{C}$, 2 giờ) giúp giải phóng tối đa protein cấu trúc VP2, VP3 mà không làm biến tính các epitop kháng nguyên bề mặt.
  2. Bản địa hóa nguồn kháng nguyên chẩn đoán: Kháng nguyên virus được phân lập trực tiếp từ ổ dịch thực địa tại Thái Nguyên, bảo đảm độ tương đồng kháng nguyên 100% với chủng virus gây bệnh thực tế, khắc phục hiện tượng âm tính giả khi dùng kit nhập khẩu chứa chủng kháng nguyên ngoại lai (tính tương đồng kháng nguyên giữa các biến chủng chỉ đạt khoảng $30%$).

So sánh định lượng với các giải pháp hiện hành

Tiêu chí phân tích Phương pháp AGP truyền thống Kỹ thuật RT-PCR chuyên sâu KIT ELISA của đề tài
Giới hạn phát hiện (LOD) $1:16\ \text{Titer}$ $\approx 10^2\ \text{copies/}\mu\text{L}$ $1:1600\ \text{Titer}$ (Gấp 100 lần AGP)
Khả năng định lượng Định tính / Bán định lượng Định lượng (Realtime) Định lượng nồng độ kháng thể qua OD
Thời gian có kết quả 24 - 48 giờ 4 - 6 giờ 2 giờ 15 phút
Thông lượng (Throughput) Thấp (10 - 20 mẫu/thạch) Trung bình (24 - 96 mẫu) Cao (96 mẫu/đĩa trong 1 mẻ)
Chi phí hóa chất / Mẫu 15.000 VNĐ 120.000 - 180.000 VNĐ 11.500 VNĐ

Ứng dụng thực tế và triển khai

Kịch bản ứng dụng thực địa

  • Giám sát hiệu quả tiêm phòng vaccine: Đánh giá động thái kháng thể mẹ truyền (Maternally Derived Antibodies - MDA) ở gà con 1 – 14 ngày tuổi để xác định thời điểm tiêm phòng vaccine Gumboro thích hợp nhất, tránh hiện tượng trung hòa kháng thể vaccine.
  • Sàng lọc và chẩn đoán dịch tễ diện rộng: Phục vụ các Chi cục Thú y, trạm thú y cấp huyện kiểm tra nhanh hàng nghìn mẫu huyết thanh trong các đợt bùng phát dịch bệnh mùa đông xuân.
  • Kiểm soát chất lượng tại trang trại chăn nuôi công nghiệp: Giám sát mức độ đồng đều miễn dịch của đàn gà trước khi xuất chuồng hoặc chuyển giai đoạn nuôi.
                        [Chạy KIT ELISA Kiểm Tra Kháng Thể Mẹ Truyền]
[MDA Cao (OD450 > Cutoff)]:                                                [MDA Thấp (OD450 < Cutoff)]:
Hoãn tiêm, kiểm tra lại sau 5 ngày                                         Tiêm phòng vaccine nhược độc ngay

Yêu cầu triển khai và dự toán kinh tế

  • Trang thiết bị tối thiểu: Máy đọc đĩa ELISA bước sóng 450 nm, máy ủ nhiệt $37^\circ\text{C}$, pipet bán tự động đa kênh ($50 - 200\ \mu\text{L}$), tủ lạnh bảo quản mẫu $-20^\circ\text{C}$.
  • Phân tích chi phí - lợi ích (ROI):
    • Một trang trại quy mô 50.000 gà thịt nếu phát hiện sớm ổ dịch Gumboro và đánh giá đúng lịch vaccine sẽ giảm tỷ lệ chết từ $25%$ xuống dưới $3%$.
    • Tiết kiệm chi phí hao hụt đàn ước tính 150 – 250 triệu VNĐ/lứa nuôi so với chi phí xét nghiệm định kỳ chỉ tốn khoảng 1,5 – 2,5 triệu VNĐ/đợt kiểm tra.

Hạn chế và hướng phát triển

Hạn chế kỹ thuật

  • Kháng nguyên sử dụng là kháng nguyên virus toàn phần sau ly giải cơ học, vẫn còn chứa một tỷ lệ nhỏ protein tế bào chủ từ dịch phôi trứng, có thể gây nhiễu nhẹ đường nền đối với các mẫu huyết thanh bị vỡ hồng cầu.
  • Sản phẩm chưa được đóng gói dưới dạng kit khô thương mại hoàn chỉnh với các chất ổn định đông khô (Lyophilization stabilizers) để bảo quản dài hạn ở nhiệt độ phòng.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp: Biểu hiện protein vỏ capsid VP2 trong hệ thống nấm men Pichia pastoris hoặc E. coli để thu nhận kháng nguyên tinh khiết tuyệt đối.
  • Phát triển dạng que thử nhanh (Rapid Lateral Flow Dipstick): Gắn kháng thể đơn dòng đặc hiệu VP2 lên màng Nitrocellulose với hạt keo vàng (Colloidal Gold) phục vụ chẩn đoán tại chuồng trong 10 phút.
  • Tích hợp Kit đa bệnh (Multiplex ELISA): Phát hiện đồng thời kháng thể kháng Newcastle, Gumboro và Viêm phế quản truyền nhiễm (IB) trên cùng một đĩa phản ứng.

Đối tượng hưởng lợi

Ma trận phân bổ giá trị thực tiễn:
Nhóm đối tượng Lợi ích cụ thể được định lượng
Sinh viên & Học viên Cao học Cung cấp tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp sản xuất sinh phẩm huyết thanh học và phân tích quang phổ vi sinh.
Kỹ thuật viên Thú y Lab Làm chủ kỹ thuật pha chế dung dịch đệm, kỹ thuật block đĩa bằng sữa gầy 5% và khắc phục lỗi sai số máy đọc.
Chủ trang trại gia cầm Chủ động giám sát lịch tiêm vaccine, giảm tỷ lệ chết do bùng phát dịch từ $30%$ xuống $< 5%$.
Cơ quan quản lý dịch tễ Công cụ nội địa giá rẻ phục vụ chương trình điều tra dịch tễ học cấp tỉnh và vùng chăn nuôi.

Câu hỏi thường gặp (FAQ)

1. Điều kiện kỹ thuật tối thiểu để vận hành KIT ELISA này tại trạm thú y là gì?

Phòng thí nghiệm cần trang bị máy đọc hấp thụ quang phổ microplate (bước sóng lọc 450 nm), tủ ấm vi sinh $37^\circ\text{C}$, máy ly tâm ống máu (3000 rpm), hệ thống micropipet đơn kênh và đa kênh ($5 - 200\ \mu\text{L}$), cùng hệ thống nước cất hai lần đạt chuẩn vi sinh.

2. Sự khác biệt giữa việc dùng kháng nguyên phân lập thực địa và kháng nguyên chủng chuẩn quốc tế là gì?

Virus Gumboro có tốc độ biến dị kháng nguyên cao (tính tương đồng kháng nguyên giữa các chủng biến chủng có thể chỉ đạt $30%$). Kháng nguyên phân lập tại Thái Nguyên phản ánh chính xác cấu trúc epitop của virus đang lưu hành cục bộ, giúp tránh hiện tượng âm tính giả thường gặp khi dùng kit nhập khẩu mang kháng nguyên chủng chuẩn châu Âu hoặc Bắc Mỹ.

3. Phương pháp xử lý khi mẫu huyết thanh bị đục hoặc vỡ hồng cầu (Hemolysis)?

Huyết thanh vỡ hồng cầu chứa hàm lượng enzyme Peroxidase nội sinh tự do, có thể oxy hóa trực tiếp cơ chất TMB gây dương tính giả. Cần ly tâm lại mẫu ở tốc độ $5000\text{ rpm}$ trong 10 phút, hút phần dịch trong hoặc pha loãng mẫu thử từ $1:400$ trở lên trong dung dịch PBS-Tween chứa 0.05% sữa tách bơ.

4. Thời hạn bảo quản và độ bền nhiệt của KIT được chứng minh như thế nào?

Thử nghiệm bảo quản tại nhiệt độ $4^\circ\text{C}$ cho thấy sau 180 ngày (6 tháng), độ nhạy của kit vẫn đạt $92.4%$, độ suy giảm tín hiệu $\text{OD}_{450}$ trên mẫu chứng dương $< 8%$. Khi bảo quản ở nhiệt độ $-20^\circ\text{C}$, kháng nguyên và conjugate giữ hoạt tính ổn định trên 12 tháng.

5. Chi phí sản xuất 1 hộp KIT 96 giếng tự chế tạo là bao nhiêu và tiết kiệm bao nhiêu so với kit thương mại?

Giá thành dự toán nguyên vật liệu cho 1 đĩa 96 giếng (chạy được 88 mẫu bệnh phẩm và 8 giếng đối chứng) là khoảng 250.000 – 300.000 VNĐ (tương đương $\approx 3.000 - 3.500\text{ VNĐ/test}$). So với kit IDEXX nhập khẩu ($\approx 35.000 - 45.000\text{ VNĐ/test}$), giải pháp giúp tiết kiệm từ $90 - 92%$ chi phí hóa chất.

Kết luận

Đề tài "Nghiên cứu thử nghiệm KIT chẩn đoán bệnh Gumboro trên đàn gà nuôi tại Thái Nguyên" đã hoàn thành toàn diện các mục tiêu khoa học và thực tiễn đề ra. Nghiên cứu đã làm chủ quy trình phân lập, tinh sạch kháng nguyên virus IBDV bằng kỹ thuật đông tan sâu, chuẩn hóa thành công các thông số vận hành của phản ứng Indirect ELISA với độ nhạy đạt $95.8%$, độ đặc hiệu đạt $94.2%$ và hệ số biến thiên $CV < 8%$. Sản phẩm mang lại giải pháp kỹ thuật có tính tự chủ cao, giá thành cạnh tranh, góp phần đắc lực vào công tác giám sát dịch tễ, kiểm soát lịch tiêm phòng vaccine và giảm thiểu thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi gia cầm tại Việt Nam. Các đơn vị chăn nuôi và phòng thí nghiệm có thể ứng dụng trực tiếp quy trình này vào hoạt động kiểm soát dịch bệnh thường quy.